Биопрепарат для утилизации нефтесодержащих отходов, способ его получения и применения

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены биопрепарат для утилизации нефтесодержащих отходов, содержащий нефтеокисляющие микроорганизмы Rhodococcus degradans VS-16.1 BKM Ac-2730D, Microbacterium aerolatum VS-16.2 BKM Ac-2731D, Pseudomonas meridiana TS-9 BKM B-3040D, Rhodococcus jialingiae SVS-5 BKM Ac-2732D, Rhodococcus jialingiae TRV-8 BKM Ac-2733D, смешанных в равном соотношении с титром клеток не менее 10-15×10⁷ КОЕ/мл, способ его получения и способ утилизации нефтесодержащих отходов, включающий послойное внесение очищаемых отходов слоем 18 см, минерального удобрения в количестве 10-20 г/м², биопрепарата из расчета 4 л/м², повторение этих слоев 5 раз с последующим ежедневным рыхлением и периодическим увлажнением грунта до 2 раз в неделю. Изобретения обеспечивают расширение арсенала средств для утилизации нефтесодержащих отходов в широком диапазоне температур окружающей среды. 3 н.п. ф-лы, 2 табл., 3 пр.

 

Изобретение относится к биотехнологии утилизации нефтесодержащих отходов промышленных предприятий, предприятий нефтегазового комплекса и предприятий по обращению отходов нефтяной промышленности, в частности к микробиологическому обезвреживанию нефтесодержащих отходов от нефти и нефтепродуктов.

Известен способ обработки нефтяного шлама путем внесения в нефтешлам чистой почвы, древесных опилок, штамма бактерий Bacillus sp.ВНИИСХМ 132, белковой кормовой добавки «Биотрин» (патент RU 2198747 от 20.02.2003) [1]. При этом нефтешлам, почву и опилки смешивают в массовом соотношении 1:2:1, после 50 суток инкубации проводят дополнительную обработку белковой добавкой. Недостатком данного способа является загрязнение чистой почвы нефтепродуктами, а также использование в качестве биостимулятора белковой добавки «Биотрин», что удорожает процесс очистки нефтешлама.

Наиболее близким по технической сути, является «Способ обезвреживания нефтезагрязненных земель и нефтешламов» (патент RU 2431532, от 20.10.2011), включающий смешивание нефтезагрязненных земель и нефтешламов со структуратором (таким как песок или опилки), удобрением и биодеструктором, в качестве биодеструктора применяют биопрепарат «Дестройл», на основе штамма бактерий Acinetjbacter sp.JN-2.

Недостатком данного способа является то, что в состав биопрепарата входит только один штамм бактерий. Как известно биопрепараты, состоящие из микроорганизмов разных таксономических групп, более эффективно утилизируют нефть и нефтепродукты.

Задача данного изобретения состоит в создании эффективного способа очистки нефтесодержаших отходов от загрязнения нефтью и нефтепродуктами с использованием нового биопрепарата.

Технический результат, который может быть достигнут при использовании данного изобретения, состоит в том, чт микроорганизмы, входящие в состав биопрепарата, способны работать в широком диапазоне температур окружающей среды (10-45°С), а также в условиях низкой влажности и засоленности нефтесодержащих отходов.

Поставленная задача решается за счет способа обезвреживания нефтесодержащих отходов, путем введения в них суспензии биопрепарата «ЭКО», содержащего микроорганизмы-деструкторы нефти родов Rhodococcus, Microbacterium и Pseudomonas.

В состав биопрепарата входят следующие микроорганизмы-деструкторы углеводородов нефти: штаммы бактерий Rhodococcus erythropolis VS-16.1 BKM Ac-2730D, Microbacterium aerolatum VS-16.2 BKM Ac-2731D, Pseudomonas gessardii TS-9 BKM B-3040D, Rhodococcus erythropolis SVS-5 BKM Ac-2732D, Rhodococcus erythropolis TRV-8 BKM Ac-2733D, которые депонированы во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов. Данные штаммы бактерий выделены из глубинных слоев (до 10 м) нефтезагрязненных почв Соколовских нефтяных ям, расположенных в Приволжском районе Астраханской области. Идентификация выделенных штаммов осуществлена на основании результатов анализа методом МАЛДИ-ВП МС масс-спектрометрии и секвенирования фрагментов генов 16S рРНК и gyrB.

Штамм бактерий Rhodococcus degradans VS-16.1, BKM Ac-2730D - неподвижны и окрашиваются по Граму положительно. Спор не образуют, некислотоустойчивы. Морфогенетический цикл начинается со стадии кокков, через 18-20 час роста при температуре 30°С на мясо-пептонном агаре - МПА клетки образуют слабо ветвящиеся нити, которые через 48-72 часа распадаются на палочковидные и кокковидные элементы. В старых культурах наблюдаются плеоморфные клетки в виде колб, груш, булав. На плотных питательных средах (мясо-пептонный агар, агар Хотингера) через 48 часов роста при температуре 30°С заявляемый штамм образует выпуклые, гладкие, блестящие, непрозрачные колонии диаметром от 1 мм, цвет колоний бежевый. Аэроб, хемоорганотроф. Не нуждается в факторах роста. Растет в температурном диапазоне от 8°С до 45°С.

Штамм Microbacterium aerolatum VS-16.2, BKM Ac-2731D - тонкие палочки неправильной формы, 05-0,8×1,0-3,5 мкм, одиночные и в парах V-образные. В старых культурах клетки становятся короче, но четкого цикла палочки-кокки не выявлено. Неподвижны и окрашиваются по Граму положительно. Спор не образуют, некислотоустойчивы. На стандартных питательных средах (МПА, LB) образуют колонии непросвечивающие, блестящие, желтого цвета. Растет в температурном диапазоне от 10°С до 45°С.Оптимум рН для роста 6,0-8,5.

Штамм Pseudomonas meridiana TS-9, BKM B-3040D - прямые палочки, 0,4-0,8-1,6-3,2 мкм. Грамотрицательные. Подвижность за счет одного жгутика. Аэробы, способны развиваться в микроаэрофильных условиях. Оптимальный рН штамма находится в диапазоне 5,5-8,0. Растет при температуре от 10°С до 45°С.

Штамм Rhodococcus jialingiae SVS-5, BKM Ac-2732D - неподвижны и окрашиваются по Граму положительно. Спор не образуют, некислотоустойчивы. Морфогенетический цикл включает только палочковидную форму, в старых культурах наблюдается наличие ветвящихся форм. Деление клеток происходит по раскалывающемуся и сгибающему типам. На стандартных питательных средах (МПА, LB) образуют выпуклые, шероховатые, блестящие, непрозрачные колонии диаметром от 1 мм, цвет колоний розовый. Аэроб, способный к росту в микроаэрофильных условиях, хемоорганотроф. Оптимальный pH штамма находится в диапазоне 6,5-8,5. Растет при температуре от 10°С до 45°С.

Штамм Rhodococcus jialingiae TRV-8, BKM Ac-2733D - подвижны за счет 1 жгутика и окрашиваются по Граму положительно. Спор не образуют, некислотоустойчивы. Морфогенетический цикл включает кокковидные и палочковидные формы, в старых культурах наблюдается наличие ветвящихся форм. На стандартных питательных средах (МПА, LB) образуют выпуклые, гладкие, блестящие, непрозрачные колонии диаметром от 1 мм, цвет колоний молочно-розовый. Аэроб, способный к росту в микроаэрофильных условиях, хемоорганотроф. Оптимальный рН штамма находится в диапазоне 6,5-8,5. Растет при температуре от 10°С до 45°С.

Данные штаммы бактерий способны к деградации нефти и нефтепродуктов в широком температурном диапазоне (10-45°С), а также процесс обезвреживания может проходить в условиях низкой влажности места загрязнения. Изучение способности микроорганизмов к росту на нефти и дизельном топливе в присутствии 3-5% NaCl в жидкой минеральной среде при 24°С показало, что все штаммы-деструкторы способны к деградации нефти и дизельного топлива в присутствии соли. Также была изучена эмульгирующая активность данных штаммов, установлено, что микроорганизмы, входящие в состав биопрепарата, способны продуцировать биоэмульгаторы, повышающие доступность трудноразлагаемых субстратов (нефть и нефтепродукты) и увеличивающие эффективность деградации таких загрязнителей.

Для получения биопрепарата «ЭКО» для утилизации нефтесодержащих отходов проводят раздельное глубинное культивирование индивидуальных штаммов бактерий, входящих в состав биопрепарата, на минеральной среде с добавлением нормальных парафинов C₁₂-C₁₈.

Способ получения биопрепарата нефтеокисляющих микроорганизмов на основе указанных выше штаммов Pseudomonas, Microbacterium и Rhodococcus включает следующие стадии:

- получение рабочей культуры на скошенном агаре;

- приготовление глубинных посевных культур в колбах;

- раздельное выращивание маточных культур каждого вида микроорганизма в ферментерах;

- смешивание биомассы индивидуальных штаммов в единый консорциум, получение жидкой формы препарата.

В процессе выращивания величину рН в интервале 6,5-8,5 поддерживают автоматически подачей раствора аммиака. Наращивание биомассы осуществляют в течении 120 ч при температурах от 15 до 40°С. Хранение биопрепарата при температуре 4-6°С до 1 месяца, при -20°С до 1 года. Доставку изготовленного биопрепарата до места утилизации нефтезагрязненных отходов осуществляют в виде концентрированной суспензии с плотностью микроорганизмов 10-15×10⁷ КОЕ/мл.

Для утилизации нефтезагрязненных отходов предлагается следующий способ с использованием заявленного биопрепарата:

1) равномерное распределение нефтесодержащего отхода слоем 18 см на специально подготовленной гидроизолированной площадке;

2) внесение предлагаемого биопрепарата в нефтесодержащий отход;

3) внесение минерального удобрения (азофоска или др.);

4) п. 1-3 повторяются до 5 раз с внесением биопрепарата или индивидуальных штаммов последовательно на каждый слой;

5) ежедневное рыхление (с помощью экскаваторной техники);

6) периодическое орошение нефтесодержащего отхода водой (1-2 раза в неделю).

Нефтесодержащий отход с содержанием нефтепродукта 60000-110000 мг/кг равномерно распределяется по гидроизолированной площадке слоем 18 см с помощью специальной техники (экскаватор или др.). На слой нефтесодержащего отхода вносится комплексное минеральное удобрение (например, Азофоска) в количестве 10-20 г на 1 м². Далее на очищаемый слой вносится биопрепарат или компонент биопрепарата (при раздельном культивировании и не смешивании биомассы штаммов) в виде суспензии с титром клеток не менее 10-15×10⁷ КОЕ/мл из расчета 4 л/м². Внесение биопрепарата на нефтесодержащий отход осуществляют дождеванием с помощью любых средств, предназначенных для этого процесса.

Полностью данную процедуру повторяют еще 4 раза до получения слоя нефтесодержащего отхода с биопрепаратом и минеральным удобрением 90 см. После проведения данных процедур производится ежедневное рыхление нефтесодержащих отходов, что необходимо для увеличения воздушного объема отхода и более эффективной аэрации внесенных клеток микроорганизмов. В процессе утилизации нефтесодержащего отхода проводится регулярное увлажнение обрабатываемой поверхности для поддержания постоянной влажности. Осуществляется метом полива из расчета 10 л/м². Периодичность полива - 2 раза в неделю.

После окончания процесса утилизации нефтесодержащего отхода производится анализ остаточного содержания нефтепродуктов. При содержании нефтепродукта в отходе 1000 мг/кг и ниже грунту присваивается название Грунт (ТУ 5716-008-27042995-2017). Грунт вывозится с гидроизолированной площадки, в дальнейшем используется для отсыпки дорог, обваловки кустовых площадок, засыпки карьеров и т.д. В случае не достаточной степени очистки и превышения предельно допустимых концентраций по нефтепродуктам цикл работ по утилизации нефтесодержащего отхода повторяется еще раз.

Изобретение подтверждается следующими примерами. Пример 1. Получение биопрепарата в жидком виде. Для получения биомассы препарата производят раздельное культивирование каждого микроорганизма. Для культивирования микроорганизмов-деструкторов используют ферментеры вместительностью 120 л и 8000 л с коэффициентом заполнения 0,6-0,7. Ферментеры оснащены аэратором, фильтрами тонкой очистки сжатого воздуха, датчиками температуры, электрическим миксером и датчиком расхода воздуха на аэрацию. Внесение посевного материала в ферментер производится из соотношения 6 л микробной суспензии с концентрацией клеток 10⁷ КОЕ/мл на 60 л питательной среды. Выращивание культур микроорганизмов осуществляется в ферментере на питательной среде следующего состава (г/л):

Na₂HPO₄ - 12,

KH₂PO₄ -6,

NH₄Cl - 4,

NaCl - 2,

Глюкоза - 10,

Нефтепродукт (топливо топочное) - 10,

Вода водопроводная - 60-6000 л, в зависимости от размера ферментера.

рН среды 6,5-8,5 ед. рН.

Значения технологических параметров процесса культивирования поддерживаются следующими:

Температура, °С	30±2
рН, ед.рН	7,0±0,5
Перемешивание, об/мин	90,0±5,0
Аэрация, об/об/мин	1,0±0,2

Продолжительность процесса культивирования - 120 часов.

Жидкую форму биопрепарата получают путем механического смешивания в равной пропорции концентрированной биомассы выращенных раздельно штаммов микроорганизмов.

Биопрепарат хранится в виде суспензии при температуре 4-6°С до 30 суток.

Пример 2. Моделирование процесса утилизации нефтесодержащих отходов в лабораторных условиях.

Эксперимент проводили в лабораторных условиях в модельных системах (пластиковые емкости). Объем вносимого нефтесодержащего отхода составлял 300 кг в каждой емкости. Всего устанавливалось 4 микрокосма:

1 емкость - контроль (в ней находился нефтесодержащий отход, и производилось ежедневное перемешивание),

2 емкость - нефтесодержащий отход 300 кг с добавлением биопрепарата 6 л, минерального удобрения Азофоски - 20 г, производилось ежедневное рыхление и увлажнение до 30% 2 раза в неделю,

3 емкость - нефтесодержащий отход 300 кг с добавлением биопрепарата 6 л, минерального удобрения Азофоски - 20 г, увлажненный на 70%). Производилось ежедневное перемешивание,

4 емкость - нефтесодержащий отход 150 кг, глина - 150 кг, добавление биопрепарата 6 л, минерального удобрения Азофоски - 20 г, производилось ежедневное рыхление и увлажнение до 30% 2 раза в неделю.

Эксперимент проводили при температуре 18-22°С. Начальное содержание нефтепродуктов определяли по ПНД Ф 16.1:2.2.22-98 на приборе Анализатор нефтепродуктов в воде АН-2, зав №1230. В 1-3 емкостях содержание нефтепродуктов составляло 194700,0 мг/кг, в 4 емкости - 74700 мг/кг.

Определение концентрации нефтепродуктов в эксперименте производили на 28 и 90 сутки эксперимента. Результаты представлены в табл. 1.

Во всех вариантах модельных систем отмечено снижение концентрации нефтепродуктов. В контрольной емкости снижение концентрации отмечается на уровне погрешности испытания, кроме этого объяснить снижение концентрации нефтепродукта в данном микрокосме можно за счет естественной убыли нефтепродукта в результате протекания физико-химических процессов.

Сравнение степени утилизации нефтепродукта в экспериментальных модельных системах с биопрепаратом - емкость 2, 3, 4 демонстрирует, что снижение нефтяной нагрузки отхода (перемешивание нефтесодержащего отхода с глиной) приводит к значительному увеличению степени утилизации нефтепродукта до 99,5% за 120 суток. В результате проведенного опыта произведена утилизация нефтесодержащего отхода с получением побочной продукции Грунт (ТУ 5716-008-27042995-2017).

Пример 3. Моделирование процесса утилизации нефтесодержащего отхода на опытно-производственных площадках ООО «ПК ЭКО+»

Опытно-промышленные испытания проводили на «складе временного накопления отходов производства и потребления III-IV класса опасности №1» ООО «ПК «ЭКО+» август-октябрь 2021 г. Площадь склада составляет 1490 м², представляет собой бетонное гидроизолированное основание. Суточное колебание температур составило 7-35°С. Нефтесодержащий отход равномерно распределяли по гидроизолированной площадке слоем 18 см с помощью специальной техники (экскаватор или др.). На слой нефтесодержащего отхода вносили комплексное минеральное удобрение Азофоска в количестве 10-20 г на 1 м². Далее на очищаемый слой вносили биопрепарат в виде суспензии с титром клеток не менее 10-15×10⁷ КОЕ/мл из расчета 4 л/м² методом дождевания. Производили полив из расчета 10 л/м². Затем процедуру повторяли в том же порядке: внесение нефтесодержащего отхода слоем 18 см, внесение минерального удобрения, внесение препарата. Процедуру повторяли 5 раз до получения общего слоя нефтесодержащего отхода 90 см. Объем утилизируемых отходов 268,2 м³. После проведения данных процедур производили ежедневное рыхление нефтезагрязненных отходов с регулярным (1-2 раза в неделю) увлажнением обрабатываемой поверхности. Содержание нефтепродуктов и микроорганизмов в полученной смеси контролировали в течение 2 месяцев. Результаты испытания представлены в табл. 2.

Из табл. 2 видно, что степень утилизации нефтепродуктов в примере достигает 99,1% за 90 суток наблюдения. Отмечено, крайне низкое 7 КОЕ/мл содержание аборигенных микроорганизмов в отходе до внесения биопрепарата. Внесение биопрепарата приводит к увеличению численности микроорганизмов в нефтесодержащем отходе до 7,4×10⁷ КОЕ/г.

Полученный грунт (побочный продукт процесса утилизации) применяют для санитарной отсыпки полигонов для размещения твердых промышленных отходов, отсыпки дорог, благоустройства территорий и т.д. Таким образом, жидкая форма биопрепарата при опытно-промышленных испытаниях по утилизации нефтесодержащего отхода показывает свою высокую эффективность, разработан способ получения и применения данного препарата.

Основным преимуществом предлагаемого биопрепарата является его высокая эффективность при утилизации нефтесодержащих отходов с начальной концентрацией нефтепродуктов более 100000 мг/кг.

1. Биопрепарат, используемый для утилизации нефтесодержащих отходов, содержащий нефтеокисляющие микроорганизмы Rhodococcus degradans VS-16.1 BKM Ac-2730D, Microbacterium aerolatum VS-16.2 BKM Ac-2731D, Pseudomonas meridiana TS-9 BKM B-3040D, Rhodococcus jialingiae SVS-5 BKM Ac-2732D, Rhodococcus jialingiae TRV-8 BKM Ac-2733D, смешанных в равном соотношении с титром клеток не менее 10-15×10⁷ КОЕ/мл.

2. Способ получения биопрепарата по п. 1, включающий раздельное культивирование штаммов микроорганизмов Rhodococcus degradans VS-16.1 BKM Ac-2730D, Microbacterium aerolatum VS-16.2 BKM Ac-2731D, Pseudomonas meridiana TS-9 BKM B-3040D, Rhodococcus jialingiae SVS-5 BKM Ac-2732D, Rhodococcus jialingiae TRV-8 BKM Ac-2733D и приготовление биопрепарата путем смешивания в одной емкости культуральных жидкостей штаммов в равном соотношении с получением суспензии с титром клеток не менее 10-15×10⁷ КОЕ/мл.

3. Способ утилизации нефтесодержащих отходов, включающий послойное внесение очищаемых отходов слоем 18 см, минерального удобрения в количестве 10-20 г на 1 м² , биопрепарата по п. 1 с титром клеток не менее 10-15×10⁷ КОЕ/мл из расчета 4 л/м², повторение этих слоев 5 раз с последующим ежедневным рыхлением и периодическим увлажнением грунта до 2 раз в неделю.