Вакцинная композиция против вируса ящура типа а
Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Представлен полипептид, содержащий аминокислотную последовательность. Полипептид способен обеспечивать виды иммунного ответа на вирус ящура (FMDV). Представлены полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность заявленного полипептида, плазмида экспрессии, содержащая полинуклеотид, вакцинная композиция против ящура (FMD), содержащая эффективное количество плазмиды экспрессии, и способ обеспечения видов иммунного ответа на FMDV серотипа A у субъекта, включающий введение субъекту вакцинной композиции. Изобретение обеспечивает эффективную защиту от азиатского топотипа вируса ящура типа А, встречающегося в Корее и в соседних странах Восточной Азии, таких как Китай или Тайвань. 6 н. и 7 з.п. ф-лы, 10 ил., 1 табл., 5 пр.
Область техники
Настоящее изобретение относится к полипептиду, полинуклеотиду, плазмиде и вакцинной композиции, содержащей их, которые участвуют в обеспечении видов иммунного ответа на вирус ящура серотипа A. Также настоящее изобретение относится к способу обеспечения видов иммунного ответа на вирус ящура серотипа A у субъекта.
Уровень техники
Ящур (FMD) представляет собой вирусное заболевание, поражающее парнокопытных животных (Artiodactyla), включая домашний скот, такой как крупный рогатый скот, свиньи, овцы, козы, олени и т.д., и различных диких животных, характеризующееся образованием волдырей во рту, в носу, на сосках, копытах и т.д. FMD очень заразен и характеризуется уровнем смертности 40% или выше, что делает его социально-экономически значимым заболеванием. По этой причине Всемирная организация по охране здоровья животных (OIE) классифицирует и контролирует FMD как заболевание класса А, и в большинстве стран FMD был определен как инфекционное заболевание класса 1. Кроме того, за последнее десятилетие почти на каждом континенте произошла вспышка эпидемии FMD, которая привела к тяжелым экономическим потерям.
Вирус ящура (FMDV) представляет собой одноцепочечный РНК-вирус с положительной полярностью, принадлежащий к роду Aphthovirus семейства Picornaviridae. Он не только является высокоинвазивным, но и характеризуется широким спектром инфицирования. Его инкубационный период может варьироваться от животного к животному, но составляет приблизительно от 6 до 10 дней. Также, поскольку он выделяется из организма еще до появления каких-либо клинических симптомов, его распространение может происходить легко. Он передается через дыхательную, пищеварительную, репродуктивную системы и т.д. В частности, вирусы, выделяемые через дыхательную систему, могут распространяться по воздуху на расстояние вплоть до 250 км.
FMDV разделяют на семь серотипов: O, A, C, SAT1, SAT2, SAT3 и Asia 1 в соответствии с последовательностью кодирующей области VP1, и каждый серотип разделяют на вплоть до приблизительно 80 подтипов в соответствии со свойствами его генов. До настоящего времени FMD, встречающийся в Азии, включая Корею, и в Европе, относился в основном к серотипу О, и, соответственно, в Корее в основном проводилась инокуляция вакциной против серотипа О. Однако, что касается FMD, в последнее время встречающегося в некоторых частях Кореи, было подтверждено, что вирус серотипа А вызвал дополнительную инфекцию. FMDV серотипа А имеет три топотипа: ME-SA (Ближний Восток-Южная Азия), AFRICA (Африка) и ASIA (Азия). Частота мутаций высока даже среди этих топотипов, и, таким образом, во многих случаях невозможно обеспечить защиту от заражений вирусами. Следовательно, необходимо разработать различные вакцины против вируса серотипа А. В частности, FMD, возникший недавно в Корее, был вызван вирусом, принадлежащим к линии Sea-97, и инфицирование этим вирусом происходит постоянно в азиатском регионе. Хотя в настоящее время существует вакцина против FMDV серотипа А, антигенность вируса низкая, и поэтому предполагается, что защитный иммунитет будет относительно низким, даже если вакцина будет инокулирована.
Таким образом, существует большая потребность в вакцине против вирусов, принадлежащих к FMDV серотипа A, в частности к линии Sea-97, для эффективного предупреждения FMD и предотвращения экономических потерь, вызванных инфекцией.
Техническая задача
Одной из целей настоящего изобретения является обеспечение полипептида, способного обеспечивать виды иммунного ответа на FMDV серотипа A, и полинуклеотида, кодирующего его.
Другой целью настоящего изобретения является обеспечение плазмиды, способной обеспечивать виды иммунного ответа на FMDV серотипа A.
Еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение вакцинной композиции против FMDV серотипа А.
Еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение способа обеспечения видов иммунного ответа на FMDV серотипа A у субъекта.
Техническое решение
Для достижения вышеуказанных целей в аспекте настоящего изобретения предусмотрен полипептид, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 1 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся идентичностью с ней, составляющей 90% или больше.
Аминокислотная последовательность под SEQ ID NO: 1 или аминокислотная последовательность, характеризующуюся идентичностью с ней, составляющей 90% или больше, может представлять собой последовательность, соответствующую области VP1 FMDV серотипа A.
Используемый в данном документе термин «идентичность» означает степень, в которой соответствует данная полипептидная последовательность или полинуклеотидная последовательность, и может быть выражен в процентах. В настоящем описании идентичность последовательности, обладающей идентичной или сходной активностью с данной полипептидной последовательностью, может указываться как «% идентичности». Идентичность может быть идентифицирована с применением стандартного программного обеспечения, например, BLAST 2.0, которое вычисляет такие параметры, как балл, идентичность, сходство и т.д., или путем сравнения последовательностей посредством исследования с применением гибридизации, применяемого в строго определенных условиях. Подходящие условия гибридизации, которые должны быть определены, могут быть установлены любым способом, хорошо известным специалисту в данной области техники.
Предпочтительно, аминокислотная последовательность под SEQ ID NO: 1 может быть получена из азиатского топотипа FMDV серотипа A и более предпочтительно из FMDV ASIA Sea-97 серотипа A. Наиболее предпочтительно аминокислотная последовательность под SEQ ID NO: 1 может быть получена из штаммов GDMM/CHA/2013-S (KF450794), CAM/2/2008 (HQ116294), MAY/4/2012 (KT223560), A/VIT/3/2008 (HQ116371), MAY/97 или VN/T11D/2013. В одном варианте осуществления после изучения консенсусной последовательности в последовательностях областей VP1 вирусов GDMM/CHA/2013-S, CAM/2/2008, MAY/4/2012 и A/VIT/3/2008 несоответствующие сайты и последовательности, важные для выработки нейтрализующих антител, рекомбинировали на основе VP1 вируса VN/T11D/2013 для получения аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 1. Термин «рекомбинировать» или «рекомбинация» означает полусинтез или синтез полинуклеотида или полипептида с другим полинуклеотидом или полипептидом с образованием конфигурации, которая не существует в природе и не встречается в природе.
Предпочтительно аминокислотная последовательность, характеризующаяся 90% или более идентичностью последовательности аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 1, может представлять собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2. В одном варианте осуществления после изучения консенсусной последовательности в последовательностях областей VP1 вирусов GDMM/CHA/2013-S, CAM/2/2008, MAY/4/2012 и A/VIT/3/2008 несоответствующие сайты и последовательности, важные для выработки нейтрализующих антител, рекомбинировали на основе VP1 вируса MAY/97 для получения аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 2.
Каждая из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 1 и аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 2 характеризуется высокой идентичностью последовательности FMDV линии Sea-97 ASIA A, которая недавно возникла в Корее, а также вирусам MAY/97 или VN/T11D/2013, находящимся под контролем Агентства карантина и инспекции животных и растений Республики Корея. В частности, аминокислотная последовательность под SEQ ID NO: 1 характеризуется даже более высокой идентичностью последовательности FMDV линии Sea-97 ASIA A, которая недавно возникла в Корее. Соответственно, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 1 или под SEQ ID NO: 2, может эффективно действовать в качестве антигена, способного обеспечивать виды иммунного ответа на FMDV серотипа A.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения в нем предусмотрен полипептид, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 1 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся идентичностью с ней, составляющей 90% или больше, и аминокислотную последовательность белков VP2-VP4 FMDV.
Предпочтительно в полипептиде аминокислотная последовательность под SEQ ID NO: 1 или аминокислотная последовательность, характеризующаяся идентичностью с ней, составляющей 90% или больше, может быть связана с аминокислотными последовательностями, соответствующими белкам VP2, VP3 и VP4, полученным из FMDV. Например, они могут быть связаны в следующем порядке: аминокислотная последовательность области VP4 - аминокислотная последовательность области VP2 - аминокислотная последовательность области VP3 - аминокислотная последовательность под SEQ ID NO: 1 (или аминокислотная последовательность под SEQ ID NO: 2). Дополнительная(-ые) аминокислотная(-ые) последовательность(-и) может(-гут) быть включена(-ы) между любыми аминокислотными последовательностями. Например, аминокислотная последовательность сайта расщепления фурином может быть включена между последовательностями любой области VP. Также полипептид может дополнительно содержать лидерную последовательность IgE и/или аминокислотную последовательность 2А. Например, полипептид может содержать лидерную последовательность IgE - аминокислотную последовательность области VP4 - аминокислотную последовательность области VP2 - аминокислотную последовательность области VP3 - аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 1 (или аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2) - аминокислотную последовательность 2А (предпочтительно в указанном выше порядке). В таком случае предпочтительно аминокислотная последовательность сайта расщепления фурином может быть дополнительно включена между последовательностями каждой области.
Предпочтительно аминокислотные последовательности белков VP2-VP4 могут быть получены из FMDV серотипа A и более предпочтительно из вируса A24/Cruzeiro. Предпочтительно каждая из аминокислотных последовательностей белков VP2-VP4 может представлять собой аминокислотную последовательность соответствующей области, включенной в аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 3. Предпочтительно аминокислотная последовательность, с которой связаны аминокислотные последовательности белков VP2-VP4, может представлять собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 3. Аминокислотная последовательность под SEQ ID NO: 3 содержит аминокислотные последовательности белков VP2, VP3 и VP4 и дополнительно содержит аминокислотную последовательность сайта расщепления фурином между каждым белком VP.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения в нем предусмотрен полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 1.
Предпочтительно полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 1, может представлять собой или содержать нуклеотидную последовательность под SEQ ID NO: 4. Более предпочтительно полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 1, может представлять собой последовательность, которая содержит нуклеотидную последовательность под SEQ ID NO: 4, модифицированную с целью оптимизации с помощью кодона для животного, у которого необходимо обеспечить виды иммунного ответа. Животное может представлять собой любое животное, у которого может возникнуть или развиться FMD, такое как свиньи, крупный рогатый скот, овцы и т.д., причем предпочтительно свиньи. Предпочтительно полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 1, может представлять собой или содержать нуклеотидную последовательность под SEQ ID NO: 5.
Также в настоящем изобретении предусмотрен полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность, характеризующуюся 90% идентичностью с последовательностью под SEQ ID NO: 1. Предпочтительно аминокислотная последовательность, характеризующаяся 90% идентичностью с последовательностью под SEQ ID NO: 1, может представлять собой аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2. Предпочтительно полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность, характеризующуюся 90% идентичностью с последовательностью под SEQ ID NO: 1, может представлять собой или содержать нуклеотидную последовательность под SEQ ID NO: 8.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения в нем предусмотрена плазмида, содержащая полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 1 или аминокислотную последовательность, характеризующуюся 90% идентичностью с последовательностью под SEQ ID NO: 1.
Термин «плазмида» означает конструкцию ДНК, содержащую последовательность ДНК, функционально связанную с подходящей регуляторной последовательностью, способной экспрессировать ДНК в подходящем хозяине. Плазмида может представлять собой вектор, фаговую частицу или просто потенциальную геномную вставку. В настоящем описании термин «плазмида» может быть взаимозаменяемо использован с термином «вектор» или «вирусный вектор».
Если не указано иное, полинуклеотиды, включенные в плазмиду по настоящему изобретению, являются такими же, как упомянутые выше. Предпочтительно включенный полинуклеотид может представлять собой нуклеотидную последовательность под SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 8 и более предпочтительно нуклеотидную последовательность под SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5.
Плазмида может дополнительно содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую белки VP2-VP4 FMDV. В этом случае нуклеотидная последовательность под SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5 в плазмиде может быть связана с нуклеотидными последовательностями, кодирующими белки VP2-VP4 FMDV, и предпочтительно может быть последовательно связана с нуклеотидными последовательностями, кодирующими белки VP2, VP3 и VP4, полученные из FMDV. Например, плазмида может содержать полинуклеотид, связанный в следующем порядке: нуклеотидная последовательность области VP4 - нуклеотидная последовательность области VP2 - нуклеотидная последовательность области VP3 - нуклеотидная последовательность под SEQ ID NO: 4 или 5 (в направлении от 5' к 3'). Дополнительная(-ые) нуклеотидная(-ые) последовательность(-и) может(-гут) быть включена(-ы) между нуклеотидными последовательностями любой области. Дополнительная нуклеотидная последовательность может представлять собой нуклеотидную последовательность, соответствующую области сайта расщепления фурином.
Предпочтительно нуклеотидная последовательность, кодирующая белки VP2-VP4, может быть получена из FMDV серотипа A и более предпочтительно из вируса A24/Cruzeiro. Предпочтительно каждая из нуклеотидных последовательностей, кодирующих белки VP2-VP4, может представлять собой нуклеотидную последовательность соответствующей области, включенной в нуклеотидную последовательность под SEQ ID NO: 6. Также предпочтительно полинуклеотидная последовательность, в которой связаны нуклеотидные последовательности областей VP2, VP3 и VP4, может представлять собой или содержать нуклеотидную последовательность под SEQ ID NO: 6.
Наиболее предпочтительно плазмида может содержать нуклеотидную последовательность под SEQ ID NO: 7. Нуклеотидная последовательность под SEQ ID NO: 7 может содержать нуклеотидные последовательности под SEQ ID NO: 4 или 5 и области VP2, VP3 и VP4, полученные из вируса A24/Cruzeiro. Также нуклеотидная последовательность под SEQ ID NO: 7 может содержать последовательность Kozak.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения в нем предусмотрена вакцинная композиция против FMD, содержащая полипептид, полинуклеотид или плазмиду по настоящему изобретению.
Если не указано иное, полипептид, полинуклеотид и плазмида в вакцинной композиции против FMD являются такими же, как упомянутые выше.
Термин «вакцина» относится к биологическому препарату, содержащему антиген, обеспечивающий иммунизацию субъекта. То есть вакцина относится к иммуногенному или антигенному веществу, инъецируемому или вводимому человеку или животному для предотвращения инфицирования, в целях обеспечения иммунизации живого организма.
Вакцина может представлять собой ДНК-вакцину. Термин «ДНК-вакцина» означает вакцину, которая вызывает иммунный ответ путем искусственной репликации некоторых генов из патогенов, вирусов и т.д. и управления ними. Эти ДНК-вакцины имеют много преимуществ по сравнению с существующими белковыми вакцинами, включая такие преимущества, как (i) ДНК-вакцины могут быть синтезированы с помощью только генетической информации о чистых целевых патогенных антигенах, поэтому нет необходимости работать с самим опасным патогеном, (ii) применяются только некоторые из генов, необходимые для индукции токсичности, поэтому ДНК-вакцина не будет проявлять какой-либо неожиданной токсичности при введении субъекту и (iii) благодаря структурной простоте плазмидной ДНК можно разработать вакцину путем быстрого реагирования на различные инфекционные заболевания, возникающие внезапно.
Вакцинная композиция против FMD может обеспечивать защитный иммунитет против предпочтительно азиатского топотипа FMDV серотипа A и более предпочтительно линии Sea-97 ASIA FMDV A.
Вакцинная композиция по настоящему изобретению может содержать ветеринарно приемлемый носитель. Термин «ветеринарно приемлемый носитель» включает любые и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, иммуноадъюванты, стабилизаторы, разбавители, консерванты, антибактериальные средства, противогрибковые средства, изотонические средства, средства, замедляющие адсорбцию и т.д. Примеры носителей, вспомогательных веществ и разбавителей, которые могут содержаться в вакцинной композиции, включают лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, ксилит, мальтит, крахмал, глицерин, гуммиарабик, альгинат, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлозу, метилцеллюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, воду, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния и минеральное масло. Также вакцинная композиция по настоящему изобретению может быть составлена в виде пероральных лекарственных форм, таких как порошок, гранулы, таблетки, капсулы, суспензии, эмульсии, сиропы, аэрозоли и т.д., или в виде стерильных растворов для инъекций в соответствии с традиционным способом. При составлении вакцинной композиции композиция может быть получена с применением любого разбавителя или вспомогательного вещества, такого как обычно применяемые наполнители, добавки, связующие средства, смачивающие средства, дезинтегранты, поверхностно-активные вещества и т.д.
Вакцинная композиция может быть введена субъекту в различных формах. «Инъекция» может проводиться любым путем, выбранным из группы, состоящей из подкожной инъекции, внутримышечной инъекции, внутрикожной инъекции, внутрибрюшинной инъекции, назального введения, внутривенной инъекции, трансдермального введения и перорального введения.
Вакцинная композиция может содержать один или более адъювантов для улучшения или усиления видов иммунного ответа. Подходящие адъюванты включают пептиды, гидроксид алюминия, фосфат алюминия, оксид алюминия, минеральное масло, такое как Marcol 52, растительное масло, эмульгаторы или поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, поликатионы, полианионы и т.д.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения в нем предусмотрен способ обеспечения видов иммунного ответа на FMDV серотипа A у субъекта, включающий введение субъекту вакцинной композиции по настоящему изобретению.
Если не указано иное, вакцинная композиция в способе обеспечения видов иммунного ответа является такой же, как указанная выше.
Термин «иммунный ответ» означает активацию иммунной системы хозяина, такого как млекопитающее, в ответ на введение антигена. Иммунный ответ может происходить в виде ответа клеточного иммунитета или ответа гуморального иммунитета, или обоих.
В способе обеспечения видов иммунного ответа вакцинная композиция может содержать эффективное количество активных ингредиентов, то есть рекомбинантного полипептида, рекомбинантного полинуклеотида или содержащей их плазмиды, с фармацевтически приемлемым носителем и/или адъювантом. Субъект может представлять собой животное, предпочтительно животное, относящееся к копытным, например, свиньям, крупному рогатому скоту или овцам. Термин «эффективное количество» означает, что ингредиенты вакцины находятся в количестве, достаточном для индуцирования иммунного ответа, специфичного в отношении FMDV серотипа A, у вакцинированного животного. Специалист в данной области техники может легко определить эффективное количество, например, с помощью типичных экспериментов на животных.
Введение может осуществляться любым путем, подходящим для введения ДНК-вакцины, и может осуществляться, например, посредством подкожной, внутримышечной, внутрибрюшинной или внутривенной инъекции.
Вакцинная композиция против FMDV в соответствии с настоящим изобретением может предусматривать вакцинную композицию на основе ДНК, проявляющую высокую иммуногенность в отношении FMDV серотипа A, в частности FMDV линии Sea-97 ASIA A. Соответственно, вакцинная композиция по настоящему изобретению является широко применимой для эффективной защиты против азиатского топотипа FMDV серотипа A, встречающегося в Корее и соседних странах Восточной Азии, Китае, Тайване и т.д.
Краткое описание фигур
На фигуре 1 показан результат анализа аминокислотных последовательностей VP1 четырех типов FMDV серотипа A (номера доступа в GeneBank: HQ116371, HQ116294, KF450794 и KT223560), которые недавно возникли в Азии.
На фигуре 2 показан результат выравнивания, при котором изучали сайты (эпитопы), важные для выработки нейтрализующих антител, в несоответствующих сайтах среди аминокислотных последовательностей VP1 четырех типов FMDV серотипа A (номера доступа в GeneBank: HQ116371, HQ116294, KF450794 и KT223560) и вируса A24/Cruzeiro.
На фигуре 3 показан результат выравнивания двух типов вирусов серотипа A (MAY/97 и VN/T11D/2013), находящихся под контролем Агентства карантина и инспекции животных и растений Республики Корея, и вышеуказанных пяти серотипов FMDV.
На фигуре 4 показана новая форма аминокислотной последовательности VP1 (тип A-1), полученная на основе вируса MAY/97.
На фигуре 5 показана новая форма аминокислотной последовательности VP1 (тип A-2), полученная на основе вируса VN/T11D/2013.
Фигура 6 представляет собой диаграмму, на которой показана стратегия замены области VP1 pGX9008 новым синтетическим геном VP1.
На фигуре 7 показан результат выравнивания последовательности, идентифицированной посредством секвенирования, и последовательности нового синтетического гена VP1.
На фигуре 8 показан результат анализа эффекта образования антител у мышей в результате введения вакцины по настоящему изобретению с помощью SPC ELISA.
На фигуре 9 показан результат анализа эффекта образования антител у карликовых свиней в результате введения вакцины по настоящему изобретению с помощью SPC ELISA.
На фигуре 10 показан эффект образования нейтрализующих антител у карликовых свиней в результате введения вакцины по настоящему изобретению.
Примеры
Далее в данном документе настоящее изобретение описано более подробно с помощью примеров. Однако примеры предназначены только для иллюстрации настоящего изобретения и объем настоящего изобретения не ограничивается ими.
Пример 1. Анализ идентичности между FMDV серотипа A из Йончхона и pGX9008
С помощью генетического анализа FMD, возникший в Йончхоне, Корея, в феврале 2017 года, идентифицировали как вызванный вирусом серотипа А, и при этом вирус FMD идентифицировали как принадлежащий к линии Sea-97 ASIA A. Кроме того, в результате анализа идентичности вирусу серотипа А, который обнаружили в Азии, провели сравнение 633 нуклеотидных последовательностей области VP1, и результаты показывают 99,8% идентичность вирусу VIT/14/2016, обнаруженному у крупного рогатого скота и свиней во Вьетнаме в 2016 году; 99,7% идентичность вирусу VIT/16/2016 у крупного рогатого скота в Мьянме в 2016 году; и 99,5% идентичность вирусу GDMM/CHA/2013-S у свиней в провинции Гуандун, Китай, в 2013 году.
Чтобы проанализировать идентичность между FMDV из Йончхона и pGX9008, на основе которого создана вакцина против FMDV из Южной Америки, использовали последовательность GDMM/CHA/2013-S, доступную из базы данных GB (NCBI). Примерно три нуклеотидные последовательности в FMDV серотипа A из Йончхона отличаются от GDMM/CHA/2013-S, который на 99,5% идентичен FMDV серотипа A из Йончхона. При трансляции в аминокислотные последовательности не более одной последовательности FMDV серотипа A из Йончхона отличается от GDMM/HA/2013-S, но их определяли как практически одинаковые. В результате сравнения аминокислотных последовательностей сайта VP1, который является частью структурного белка P1, у pGX9008 и GDMM/CHA/2013-S идентичность составила 178/211 (84%).
Это означает, что вакцина на основе pGX9008 против FMDV из Южной Америки, используемая в данной области техники, не будет демонстрировать вакцинный эффект против FMD серотипа А, встречающегося в Юго-Восточной Азии, включая Корею, и, следовательно, необходимо разработать вакцину для Кореи или Азии.
Пример 2. Анализ последовательности FMDV серотипа A, встречающегося в Азии, для рекомбинации области VP1 pGX9008
Проанализировали отчеты ME о VP1 FMDV серотипа A, в последнее время встречающегося в Азии, с веб-сайта WRLFMD. Отчет об исследовании охватывает в общей сложности 17 стран, включая Вьетнам, Тайвань, Корею, Россию, Лаос, Мьянму, Казахстан, Камбоджу, Малайзию, Монголию, Филиппины, Таиланд, Непал, Японию, Гонконг, Бутан и Бангладеш. Подтверждено, что среди вышеперечисленных стран FMDV серотипа А в последнее время не встречался на Филиппинах, в Тайване, Непале, Японии, Гонконге, Бутане и Бангладеш. Учитывая результаты из отчетов ME, в качестве штамма для рекомбинации области VP1 pGX9008 выбирали четыре штамма, информация о нуклеотидных последовательностях которых доступна из NCBI GeneBank, то есть доступны их номера доступа в GeneBank (см. таблицу 1).
Таблица 1
Среди исследованных штаммов нуклеотидные последовательности четырех штаммов GDMM/CHA/2013-S (KF450794), CAM/2/2008 (HQ116294), MAY/4/2012 (KT223560), A/VIT/3/2008 (HQ116371) транслировали в аминокислотные последовательности. В результате выравнивания транслированных аминокислотных последовательностей с применением CLUSTAL/MUSCLE подтверждали 22 несовпадения аминокислот. На фигуре 1 показаны данные, резюмирующие результаты выравнивания посредством Jalview.
Пример 3. Анализ области, представляющей собой эпитоп, важной для выработки нейтрализующих антител
Выравнивание осуществляли путем изучения сайтов (эпитопов), важных для выработки нейтрализующих антител, среди несовпадающих последовательностей, подтвержденных в примере 2, как описано в публикациях (Res Vet Sci. 2017 Dec; 115:374-381., Arch Virol. 2016 Oct; 161(10):2705-16., Virus Res. 2014 Mar 6; 181:72-6. и Vet Microbiol. 2011 Apr 21; 149(1-2):242-7. и т.д.). На фигуре 2 показан результат выравнивания эпитопов в отношении выработки нейтрализующих антител.
Кроме того, два штамма FMDV серотипа A, находящиеся под контролем Агентства карантина и инспекции животных и растений Республики Корея, т.е. MAY/97 и VN/T11D/2013, выравнивали вместе, и результаты показаны на фиг. 3.
Пример 4. Синтез новой области VP1 FMDV серотипа A
4.1. Определение новой последовательности области VP1
С GDMM/CHA/2013-S в качестве вируса-мишени для сравнения определяли последовательность области, представляющей собой эпитоп, для MAY/97 и VN/T11D/2013, подлежащих инокуляции, представляющей собой контрольное заражение, и, соответственно, выбирали два типа аминокислотных последовательностей области VP1, содержащих соответствующие им аминокислотные последовательности, в качестве кандидатов для рекомбинации области VP1 pGX9008. Аминокислотную последовательность VP1 на основе вируса MAY/97 называли «A-1 нового типа», и аминокислотную последовательность VP1 на основе VN/T11D/2013 называли «A-2 нового типа».
В результате анализа идентичности последовательностей A-1 нового типа и A-2 нового типа и последовательности традиционного вируса серотипа A получали следующие результаты.
В случае рекомбинации с применением A-2 нового типа можно подтвердить, что идентичность MAY/97 и VN/T11D/2013, подлежащих инокуляции, представляющей собой контрольное заражение, является высокой, и идентичность штамму, недавно возникшему в Корее, также является высокой. Соответственно, получали новую ДНК-вакцину путем рекомбинации области VP1 pGX9008 с применением A-2 нового типа, и подтверждали ее эффективность.
4.2. Рекомбинация новой последовательности области VP1
Последовательность оснований под SEQ ID NO: 4 VP1 FMDV, подлежащая конструированию в качестве нового серотипа А, оптимизировали с помощью кодона свиньи. Последовательность гена под SEQ ID NO: 5, оптимизированную с помощью кодона свиньи, применяли для замещения последовательности VP1 pGX9008. На фигуре 6 показана стратегия замещения сайта VP1 pGX9008 сайтом VP1 синтетического гена, оптимизированного с помощью кодона свиньи, в качестве нового серотипа А.
Получали плазмиду pUC57-FMD A-2 нового типа, в которой клонирован сайт VP1 синтетического гена, оптимизированного с помощью кодона свиньи, в качестве нового серотипа A. Несколько клонов получали путем лигирования вставки (774 п.о.), полученной путем воздействия на плазмиду pUC57-FMD A-2 нового типа рестриктазы BstBI/XhoI, и векторной основной цепи, полученной путем воздействия на плазмиду pGX9008 рестриктазы BstBI/XhoI.
Для полученных клонов посредством секвенирования подтвердили, что предполагаемая последовательность pGX-FMD A-2 нового типа включена в клон. В результате выравнивания последовательности, подтвержденной секвенированием, и последовательности FMD A-2 нового типа с оптимизацией с помощью кодона свиньи, подтвердили, что последовательности идентичны на 100% (фиг. 7). Оптимизированную с помощью кодона свиньи последовательность FMD A-2 нового типа в дальнейшем применяли для получения вакцины на основе плазмиды ДНК FMD.
Пример 5. Подтверждение эффекта образования антител новой ДНК-вакцины
5.1. Получение вакцины на основе плазмиды ДНК FMD
2,5 л среды LB инокулировали E. coli, содержащей плазмиду ДНК FMD, которая содержит оптимизированную с помощью кодона свиньи последовательность FMD A-2 нового типа, и затем культивировали в течение ночи при 37°С. Затем плазмиду извлекали из культивируемой E. coli с применением набора EndoFree Plasmid Giga kit (QIAGEN, № по кат. 12391). Извлеченную плазмиду растворяли в воде, не содержащей эндотоксинов, и хранили при -70°С. После хранения плазмиду затем применяли в эксперименте для измерения эффекта образования антител у животных (для подтверждения эффекта вакцинации). Далее в данном документе новая ДНК-вакцина, полученная, как указано выше, называется «PLS-A».
5.2. Подтверждение эффекта образования антител вакцины у мыши
5.2.1. ДНК-вакцинация
Пятнадцать мышей C57BL/6 (самок возрастом 6 недель) разделяли на три группы по пять мышей в группе, и каждую группу инокулировали вакциной по настоящему изобретению, традиционной вакциной и имитационной плазмидой три раза с интервалами, составляющими две недели, как показано ниже. Инокуляцию проводили с применением устройства для электропорации (CELLECTRA 2000), и ДНК-вакцину вводили при концентрации 30 мкг на мышь.
Группа 1 (контрольная группа) - имитационная плазмидная ДНК
Группа 2 (группа сравнения) - ДНК FMD серотипа A (A24 cruzeiro из Южной Америки, традиционная вакцина)
Группа 3 (экспериментальная группа) - ДНК FMD серотипа A (PLS-A, азиатский тип, вакцина по настоящему изобретению)
Кровь собирали с применением ретроорбитального метода отбора проб крови до введения (неделя 0), после второго введения (неделя 3) и после третьего введения (неделя 5). Сыворотку крови отделяли от собранной крови и хранили при -80°С. После хранения сыворотку крови растворяли и подвергали анализу SPC (твердофазная конкуренция) ELISA.
5.2.2. Измерение образования антител - анализ SPC ELISA
SPC ELISA проводили с применением набора PrioCHECK FMDV Type A ELISA (Prionics Lelystad B.V / Нидерланды) в соответствии с экспериментальным протоколом, предоставленным изготовителем набора.
Результаты показаны на фигуре 8. Как можно увидеть на фиг. 8, вакцина PLS-A по настоящему изобретению была значительно менее времязатратной, чем традиционная вакцина против A24 из Южной Америки в отношении образования антитела и характеризовалась более высоким значением PI ингибирования реакции. В данном случае, чем выше значение PI ингибирования реакции, тем больше продуцировалось антител, специфичных к FMDV серотипа А.
Как указано выше, FMD очень заразен и, поскольку вирус FMD выделяется из организма еще до появления каких-либо клинических симптомов, распространение от животного к животному может происходить легко. Также, FMD имеет очень короткий инкубационный период. Следовательно, чтобы продемонстрировать эффективное функциональное действие вакцины против FMD, не только эффект подавления вируса FMD должен быть превосходным, но также к вирусу FMD должны быстро вырабатываться антитела. В случае введения вакцины в соответствии с настоящим изобретением вакцина не только значительно превосходит традиционную вакцину в подавлении вируса FMD, но также обеспечивает выработку антител значительно быстрее, и, таким образом, возможно подавлять инфекцию FMD на ранней стадии. Следовательно, вакцина в соответствии с настоящим изобретением является очень эффективной вакциной против FMD.
5.3. Подтверждение эффекта образования антител вакцины у карликовой свиньи
5.3.1. ДНК-вакцинация
Девять карликовых свиней 
(самцов возрастом 4 месяца) разделяли на три группы по три карликовые свиньи в группе, и каждую группу инокулировали вакциной три раза с интервалами, составляющими 3 недели, как показано ниже. Вакцину вводили в мышцы внутренней поверхности задних конечностей при концентрации 0,5 мг на карликовую свинью с применением устройства для электропорации (CELLECTRA 2000), и инактивированную вакцину вводили в мышцу задней поверхности шеи в количестве 2 мл. На неделе 9 каждую вакцину дополнительно вводили при концентрации 3 мг на карликовую свинью.
Группа 1 (отрицательный контроль) - имитационная плазмидная ДНК
Группа 2 (положительный контроль) - инактивированная вакцина (доступная от Komipharm, бивалентная вакцина против серотипа O/A)
Группа 3 (экспериментальная группа) - ДНК FMD типа A (PLS-A, серотип A, вакцина по настоящему изобретению)
Кровь собирали до введения (неделя 0), после первого введения (неделя 3), после второго введения (неделя 6) и после четвертого введения (неделя 12). Плазму крови отделяли от собранной крови и отделенную плазму крови хранили при -80°С. После хранения плазму крови растворяли и подвергали анализу SPC (твердофазная конкуренция) ELISA.
5.3.2. Измерение образования антител - анализ SPC ELISA
SPC ELISA проводили с применением набора PrioCHECK FMDV Type A ELISA (Prionics Lelystad B.V / Нидерланды) в соответствии с экспериментальным протоколом, предоставленным изготовителем набора.
Результаты показаны на фигуре 9. В случае вакцины PLS-A по настоящему изобретению на фиг. 9 показано, что значение PI ингибирования реакции заметно увеличилось на неделе 12 после четвертого введения. В частности, значение PI ингибирования реакции было даже выше, чем таковое для инактивированной вакцины, которая представляет собой положительный контроль.
5.4. Подтверждение эффекта образования нейтрализующих антител у карликовой свиньи в результате введения вакцины
5.4.1. ДНК-вакцинация
Девять карликовых свиней (самок возрастом 4 месяца) разделяли на три группы по три карликовые свиньи в группе, и каждую группу инокулировали вакциной три раза с интервалами, составляющими 3 недели, как показано ниже. ДНК-вакцину вводили в мышцы внутренней поверхности задних конечностей при концентрации 6 мг на карликовую свинью с применением устройства для электропорации (CELLECTRA 2000), и инактивированную вакцину вводили в мышцу задней поверхности шеи в количестве 2 мл.
Группа 1 (отрицательный контроль) - имитационная плазмидная ДНК
Группа 2 (положительный контроль) - инактивированная вакцина (доступная от Komipharm, бивалентная вакцина против серотипа O/A)
Группа 3 (экспериментальная группа) - трехвалентная ДНК-вакцина против FMD (PLS-A, серотип А + серотип О + серотип Asia1)
Для получения трехвалентных вакцин для группы 3 применяли коммерчески доступные серотипы О и Asia1. Кровь собирали после введения (неделя 9). Плазму крови отделяли от собранной крови и отделенную плазму крови хранили при -80°С. В анализе SPC ELISA и реакции нейтрализации отделенную плазму крови растворяли и подвергали реакции нейтрализации VNT.
5.4.2. Реакция нейтрализации вируса (реакция нейтрализации VNT)
Реакцию нейтрализации проводили в Центре исследования вакцин против FMD Агентства карантина и инспекции животных и растений Республики Корея с применением анализируемой сыворотки крови в соответствии с руководством OIE.
FMDV серотипа А MAY/97 использовали для VNT для подтверждения титра нейтрализации. A/MAY/97 100 TCID50 разбавляли анализируемой сывороткой крови, положительной сывороткой крови и отрицательной сывороткой крови при соответствующей степени разбавления и проводили реакцию в течение 1 часа. Цитопатический эффект наблюдали после посева клеточной линии LFBK (фетальной клеточной линии почки свиньи) и проведения реакции в течение 2~3 дней. Положительный стандарт титра нейтрализующего антитела составляет 1:16 по стандарту OIE (логарифмическое значение 1,20) и 1:32 у свиней по стандарту Республики Корея (логарифмическое значение 1,51).
Результаты показаны на фигуре 10. Как можно увидеть на фиг. 10, на неделе 9 после введения трехвалентная ДНК-вакцина, включая PLS-A, показала титр нейтрализующего антитела, составляющий по меньшей мере 1:200 у всех субъектов, что определили как положительный результат.
Также на фиг. 9 показано сравнение ингибирования реакции (значения PI) между группой положительного контроля с применением бивалентной вакцины и вакциной в соответствии с настоящим изобретением, тогда как на фиг. 10 показано сравнение ингибирования реакции (значения PI) между группой положительного контроля с применением бивалентной вакцины и трехвалентной вакциной, предусматривающей вакцину в соответствии с настоящим изобретением. Подтвердили, что вакцина в соответствии с настоящим изобретением не только оказывает превосходные эффекты в отношении FMDV серотипа A при действии отдельно, но также оказывает превосходные эффекты в отношении FMDV серотипа A даже при действии в форме трехвалентной вакцины в комбинации с другими серотипами. Это означает, что вакцина в соответствии с настоящим изобретением является широко применимой как в виде моновалентной вакцины, так и в виде поливалентной вакцины.
--->
<110> Пламблайн Лайф Сайенсиз, Инк.
<120> ВАКЦИННАЯ КОМПОЗИЦИЯ ПРОТИВ ВИРУСА ЯЩУРА ТИПА А
<130> PCT18011
<150> KR 10-2017-0184875
<151> 2017-12-29
<150> KR 10-2018-0149242
<151> 2018-11-28
<160> 8
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 212
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> VP1 A-2 нового типа
<400> 1
Thr Thr Ala Thr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Thr Thr Val Glu
1 5 10 15
Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Ala Gln Arg Arg His His Thr Asp Val
20 25 30
Gly Phe Leu Met Asp Arg Phe Val Gln Ile Lys Pro Val Ser Pro Thr
35 40 45
His Val Ile Asp Leu Met Gln Thr His Gln His Gly Leu Val Gly Ala
50 55 60
Met Leu Arg Ala Ala Thr Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Glu Ile Val Val
65 70 75 80
Asn His Thr Gly Asn Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu Ala
85 90 95
Ala Leu Asn Asn Thr Ser Asn Pro Thr Ala Tyr His Lys Ala Pro Phe
100 105 110
Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala Thr
115 120 125
Val Tyr Ser Gly Thr Ser Lys Tyr Ser Thr Pro Gln Thr Arg Arg Gly
130 135 140
Asp Leu Gly Pro Leu Ala Ala Arg Leu Ala Ala Gln Leu Pro Ala Ser
145 150 155 160
Phe Asn Phe Gly Ala Ile Arg Ala Thr Glu Ile Gln Glu Leu Leu Val
165 170 175
Arg Met Lys Arg Ala Glu Leu Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu Ala Val
180 185 190
Glu Val Ser Ser Gln Asp Arg His Lys Gln Lys Ile Ile Ala Pro Ala
195 200 205
Lys Gln Leu Leu
210
<210> 2
<211> 212
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> VP1 A-1 нового типа
<400> 2
Thr Thr Ala Thr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Thr Thr Val Glu
1 5 10 15
Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Ala Gln Arg Arg His His Thr Asp Val
20 25 30
Ser Phe Ile Met Asp Arg Phe Val Arg Ile Lys Pro Val Ser Pro Thr
35 40 45
His Val Ile Asp Leu Met Gln Thr His Gln His Gly Leu Val Gly Ala
50 55 60
Met Leu Arg Ala Ala Thr Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Glu Ile Val Val
65 70 75 80
Asn His Thr Gly Asn Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu Ala
85 90 95
Ala Leu Asp Asn Thr Ser Asn Pro Thr Ala Tyr His Lys Ala Pro Phe
100 105 110
Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala Thr
115 120 125
Val Tyr Asn Gly Thr Ser Lys Tyr Ser Thr Pro Gly Ala Arg Arg Gly
130 135 140
Asp Leu Gly Ser Leu Ala Ala Arg Leu Ala Ala Gln Leu Pro Ala Ser
145 150 155 160
Phe Asn Phe Gly Ala Ile Arg Ala Thr Glu Ile Gln Glu Leu Leu Val
165 170 175
Arg Met Lys Arg Ala Glu Leu Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu Ala Val
180 185 190
Glu Val Leu Ser Gln Asp Arg His Lys Gln Lys Ile Ile Ala Pro Ala
195 200 205
Lys Gln Leu Leu
210
<210> 3
<211> 446
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> PGX9008 VP4-VP2-VP3
<400> 3
Asp Lys Lys Thr Glu Glu Thr Thr Leu Leu Glu Asp Arg Ile Leu Thr
1 5 10 15
Thr Arg Asn Gly His Thr Thr Ser Thr Thr Gln Ser Ser Val Gly Val
20 25 30
Thr His Gly Tyr Ser Thr Glu Glu Asp His Val Ala Gly Pro Asn Thr
35 40 45
Ser Gly Leu Glu Thr Arg Val Val Gln Ala Glu Arg Phe Tyr Lys Lys
50 55 60
Tyr Leu Phe Asp Trp Thr Thr Asp Lys Ala Phe Gly His Leu Glu Lys
65 70 75 80
Leu Glu Leu Pro Ser Asp His His Gly Val Phe Gly His Leu Val Asp
85 90 95
Ser Tyr Ala Tyr Met Arg Asn Gly Trp Asp Val Glu Val Ser Ala Val
100 105 110
Gly Asn Gln Phe Asn Gly Gly Cys Leu Leu Val Ala Met Val Pro Glu
115 120 125
Trp Lys Glu Phe Asp Thr Arg Glu Lys Tyr Gln Leu Thr Leu Phe Pro
130 135 140
His Gln Phe Ile Ser Pro Arg Thr Asn Met Thr Ala His Ile Thr Val
145 150 155 160
Pro Tyr Leu Gly Val Asn Arg Tyr Asp Gln Tyr Lys Lys His Lys Pro
165 170 175
Trp Thr Leu Val Val Met Val Val Ser Pro Leu Thr Val Asn Asn Thr
180 185 190
Ser Ala Ala Gln Ile Lys Val Tyr Ala Asn Ile Ala Pro Thr Tyr Val
195 200 205
His Val Ala Gly Glu Leu Pro Ser Lys Glu Arg Gly Arg Lys Arg Arg
210 215 220
Ser Gly Ile Phe Pro Val Ala Cys Ala Asp Gly Tyr Gly Gly Leu Val
225 230 235 240
Thr Thr Asp Pro Lys Thr Ala Asp Pro Ala Tyr Gly Lys Val Tyr Asn
245 250 255
Pro Pro Arg Thr Asn Tyr Pro Gly Arg Phe Thr Asn Leu Leu Asp Val
260 265 270
Ala Glu Ala Cys Pro Thr Phe Leu Cys Phe Asp Asp Gly Lys Pro Tyr
275 280 285
Val Thr Thr Arg Thr Asp Asp Thr Arg Leu Leu Ala Lys Phe Asp Leu
290 295 300
Ser Leu Ala Ala Lys His Met Ser Asn Thr Tyr Leu Ser Gly Ile Ala
305 310 315 320
Gln Tyr Tyr Thr Gln Tyr Ser Gly Thr Ile Asn Leu His Phe Met Phe
325 330 335
Thr Gly Ser Thr Asp Ser Lys Ala Arg Tyr Met Val Ala Tyr Ile Pro
340 345 350
Pro Gly Val Glu Thr Pro Pro Asp Thr Pro Glu Arg Ala Ala His Cys
355 360 365
Ile His Ala Glu Trp Asp Thr Gly Leu Asn Ser Lys Phe Thr Phe Ser
370 375 380
Ile Pro Tyr Val Ser Ala Ala Asp Tyr Ala Tyr Thr Ala Ser Asp Thr
385 390 395 400
Ala Glu Thr Ile Asn Val Gln Gly Trp Val Cys Ile Tyr Gln Ile Thr
405 410 415
His Gly Lys Ala Glu Asn Asp Thr Leu Val Val Ser Val Ser Ala Gly
420 425 430
Lys Asp Phe Glu Leu Arg Leu Pro Ile Asp Pro Arg Gln Gln
435 440 445
<210> 4
<211> 636
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> ДНК VP1 A-2 нового типа
<400> 4
accaccgcca ccggggaatc agcagaccct gtcacaacca ccgttgagaa ctacggtggc 60
gagacacaag cacagcggcg tcaccacacc gacgtcggct tcttaatgga caggttcgtg 120
cagatcaagc ctgtgagccc cacacatgtc attgacctca tgcagacaca ccaacacggg 180
ctggtgggcg ccatgttgcg cgcggccacc tactactttt ctgatcttga gattgtggtg 240
aaccacacgg gtaacctaac gtgggtaccc aatggagcac ccgaggcagc actgaacaac 300
acgagcaacc ccactgctta ccacaaagcg ccgttcacga ggcttgcgct cccctacacc 360
gcgccacacc gcgtgctggc aactgtgtac agcgggacga gcaagtactc cacacctcaa 420
acacggcgag gtgacctggg tcctctcgcg gcgaggctcg ctgcacagct ccctgcctcc 480
ttcaacttcg gtgcaattcg ggccacggag atccaagaac tccttgtgcg catgaagcgc 540
gccgagctct actgccccag gccactgttg gcggtggagg tgtcgtcgca agacagacac 600
aagcagaaaa tcattgcccc tgcaaaacaa ctcctg 636
<210> 5
<211> 636
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> Оптимизация с помощью кодона свиньи ДНК VP1 A-2 нового типа
<400> 5
acaacagcca caggagaatc cgccgaccca gtgacaacca ccgtggagaa ctacggagga 60
gagacacagg ctcagcgccg gcaccacacc gacgtgggct tcctgatgga caggttcgtg 120
cagatcaagc ccgtgagccc aacccacgtg atcgacctga tgcagaccca ccagcacggc 180
ctggtgggag ctatgctgag ggctgccacc tactacttct ccgacctgga gatcgtggtg 240
aaccacaccg gaaacctgac ctgggtgcca aacggagctc cagaggccgc cctgaacaac 300
accagcaacc ccaccgccta ccacaaggct ccattcacca ggctggccct gccatacacc 360
gctccacacc gggtgctggc taccgtgtac tccggcacca gcaagtactc caccccacag 420
accaggagag gcgacctggg accactggct gctaggctgg ctgctcagct gccagcctcc 480
ttcaacttcg gagctatcag ggctaccgag atccaggagc tgctggtgag gatgaagaga 540
gccgagctgt actgccccag gccactgctg gctgtggagg tgtccagcca ggacagacac 600
aagcagaaga tcatcgcccc agccaagcag ctgctg 636
<210> 6
<211> 1338
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> ДНК VP4-VP2-VP3 pGX9008
<400> 6
gataagaaaa cagaggaaac caccctgctg gaggacagaa tcctgaccac aagaaacggg 60
cacactacca gcacaactca gtcttcagtg ggcgtcacac acggatactc aactgaggaa 120
gaccatgtgg ccgggccaaa taccagtggc ctggagacac gagtggtcca ggctgaaagg 180
ttctacaaga aatatctgtt tgactggacc acagataagg ccttcggcca cctggagaaa 240
ctggaactcc cctcagacca ccacggcgtg ttcggccatc tggtcgatag ctacgcctat 300
atgagaaacg gatgggacgt ggaggtctcc gctgtgggca accagttcaa tggcggatgc 360
ctgctcgtgg ctatggtgcc cgagtggaag gaatttgata ccagggaaaa ataccagctg 420
acactcttcc cacaccagtt tatctctcct agaactaaca tgaccgccca tattaccgtg 480
ccttatctgg gcgtcaatcg gtacgaccag tataagaaac acaaaccttg gaccctggtg 540
gtcatggtgg tcagtcccct cacagtgaac aatactagcg ccgctcagat caaggtctac 600
gccaacattg ctccaaccta tgtgcacgtc gcaggagagc tgccttccaa ggaacgggga 660
cgcaaacggc gctctgggat cttcccagtg gcatgtgctg acggatacgg agggctggtc 720
actaccgacc ctaagaccgc agatcccgcc tacggaaaag tgtataaccc acccaggact 780
aattacccag ggcggttcac caacctgctc gatgtggcag aggcctgccc caccttcctg 840
tgctttgacg atggcaagcc atacgtgaca actcggacag acgatactcg cctgctcgcc 900
aagtttgacc tgagcctcgc agccaaacac atgtcaaaca cctacctgag tggaatcgcc 960
cagtactata ctcagtattc cgggaccatt aatctgcatt tcatgtttac cggctctaca 1020
gactcaaagg ctcgctacat ggtggcatat atccctcccg gcgtcgagac cccacctgat 1080
acacctgaaa gggctgcaca ctgcatccat gccgagtggg acacaggact gaacagcaag 1140
ttcacttttt ccattcccta cgtgtctgcc gctgactacg cttataccgc atccgatact 1200
gccgaaacca ttaacgtgca gggatgggtc tgtatctacc agattactca cgggaaagcc 1260
gagaatgaca ccctggtggt ctccgtgtct gctggcaagg acttcgaact gcgcctccct 1320
atcgatcccc gacagcag 1338
<210> 7
<211> 2400
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> VP нового типа для вакцины против FMDV серотипа 2
<400> 7
gccaccatgg attggacatg gattctgttc ctggtggctg ctgctactag agtgcattca 60
ggggccggac agtcttcacc cgcaaccgga tcacagaacc agagtggaaa taccgggagc 120
atcattaaca attactatat gcagcagtac cagaacagca tggacacaca gctgggggat 180
aacgccatca gcggcggcag caatgagggc tccacagata ccacatctac tcacactacc 240
aatacccaga acaatgactg gttctctaaa ctggcaagct ccgccttcac cggcctcttt 300
ggagctctgc tcgcaagggg aagaaagagg agaagcgata agaaaacaga ggaaaccacc 360
ctgctggagg acagaatcct gaccacaaga aacgggcaca ctaccagcac aactcagtct 420
tcagtgggcg tcacacacgg atactcaact gaggaagacc atgtggccgg gccaaatacc 480
agtggcctgg agacacgagt ggtccaggct gaaaggttct acaagaaata tctgtttgac 540
tggaccacag ataaggcctt cggccacctg gagaaactgg aactcccctc agaccaccac 600
ggcgtgttcg gccatctggt cgatagctac gcctatatga gaaacggatg ggacgtggag 660
gtctccgctg tgggcaacca gttcaatggc ggatgcctgc tcgtggctat ggtgcccgag 720
tggaaggaat ttgataccag ggaaaaatac cagctgacac tcttcccaca ccagtttatc 780
tctcctagaa ctaacatgac cgcccatatt accgtgcctt atctgggcgt caatcggtac 840
gaccagtata agaaacacaa accttggacc ctggtggtca tggtggtcag tcccctcaca 900
gtgaacaata ctagcgccgc tcagatcaag gtctacgcca acattgctcc aacctatgtg 960
cacgtcgcag gagagctgcc ttccaaggaa cggggacgca aacggcgctc tgggatcttc 1020
ccagtggcat gtgctgacgg atacggaggg ctggtcacta ccgaccctaa gaccgcagat 1080
cccgcctacg gaaaagtgta taacccaccc aggactaatt acccagggcg gttcaccaac 1140
ctgctcgatg tggcagaggc ctgccccacc ttcctgtgct ttgacgatgg caagccatac 1200
gtgacaactc ggacagacga tactcgcctg ctcgccaagt ttgacctgag cctcgcagcc 1260
aaacacatgt caaacaccta cctgagtgga atcgcccagt actatactca gtattccggg 1320
accattaatc tgcatttcat gtttaccggc tctacagact caaaggctcg ctacatggtg 1380
gcatatatcc ctcccggcgt cgagacccca cctgatacac ctgaaagggc tgcacactgc 1440
atccatgccg agtgggacac aggactgaac agcaagttca ctttttccat tccctacgtg 1500
tctgccgctg actacgctta taccgcatcc gatactgccg aaaccattaa cgtgcaggga 1560
tgggtctgta tctaccagat tactcacggg aaagccgaga atgacaccct ggtggtctcc 1620
gtgtctgctg gcaaggactt cgaactcaga ctccccattg acccaagaca gcagagaggc 1680
agaaaaagac gcagcacaac agccacagga gaatccgccg acccagtgac aaccaccgtg 1740
gagaactacg gaggagagac acaggctcag cgccggcacc acaccgacgt gggcttcctg 1800
atggacaggt tcgtgcagat caagcccgtg agcccaaccc acgtgatcga cctgatgcag 1860
acccaccagc acggcctggt gggagctatg ctgagggctg ccacctacta cttctccgac 1920
ctggagatcg tggtgaacca caccggaaac ctgacctggg tgccaaacgg agctccagag 1980
gccgccctga acaacaccag caaccccacc gcctaccaca aggctccatt caccaggctg 2040
gccctgccat acaccgctcc acaccgggtg ctggctaccg tgtactccgg caccagcaag 2100
tactccaccc cacagaccag gagaggcgac ctgggaccac tggctgctag gctggctgct 2160
cagctgccag cctccttcaa cttcggagct atcagggcta ccgagatcca ggagctgctg 2220
gtgaggatga agagagccga gctgtactgc cccaggccac tgctggctgt ggaggtgtcc 2280
agccaggaca gacacaagca gaagatcatc gccccagcca agcagctgct gcgcggccgg 2340
aaacgacgct ctaattttga cctcctgaaa ctggctggcg atgtggaatc taaccctggc 2400
2400
<210> 8
<211> 636
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> ДНК A-1 нового типа
<400> 8
accaccgcca ccggggaatc agcagaccct gtcacaacca ccgttgagaa ctacggtggc 60
gagacacaag cacagcggcg tcaccacacc gacgtcagct tcataatgga caggttcgtg 120
cggatcaagc ctgtgagccc cacacatgtc attgacctca tgcagacaca ccaacacggg 180
ctggtgggcg ccatgttgcg cgcggccacc tactactttt ctgatcttga gattgtggtg 240
aaccacacgg gtaacctaac gtgggtaccc aatggagcac ccgaggcagc actggataac 300
acgagcaacc ccactgctta ccacaaagcg ccgttcacga ggcttgcgct cccctacacc 360
gcgccacacc gcgtgctggc aactgtgtac aatgggacga gcaagtactc cacacctgga 420
gcccggcgag gtgacctggg ttctctcgcg gcgagactcg ctgcacagct ccctgcctcc 480
ttcaacttcg gtgcaattcg ggccacggag atccaggaac tccttgtgcg catgaagcgc 540
gccgagctct actgccccag gccactgttg gcggtggagg tgctgtcgca agacagacac 600
aagcagaaaa tcattgcccc tgcaaaacaa ctcctg 636
<---
1. Полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2,
причем полипептид способен обеспечивать виды иммунного ответа на вирус ящура (FMDV).
2. Полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO:2 и аминокислотную последовательность белков VP2-VP4 FMDV, причем полипептид способен обеспечивать виды иммунного ответа на вирус ящура (FMDV).
3. Полипептид по п. 2, где белки VP2-VP4 FMDV получены из FMDV серотипа А.
4. Полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2,
причем полинуклеотид способен обеспечивать виды иммунного ответа на FMDV.
5. Плазмида экспрессии, содержащая полинуклеотид по п. 4.
6. Плазмида экспрессии по п. 5, дополнительно содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую белки VP2-VP4 FMDV.
7. Плазмида экспрессии по п. 6, где белки VP2-VP4 FMDV получены из FMDV серотипа А.
8. Плазмида экспрессии по п. 5, содержащая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 7.
9. Вакцинная композиция против ящура (FMD), содержащая эффективное количество плазмиды экспрессии по п. 5.
10. Вакцинная композиция по п. 9, где вакцина обеспечивает защитный иммунитет против FMDV серотипа А.
11. Вакцинная композиция по п. 10, где FMDV серотипа А относится к азиатскому топотипу.
12. Вакцинная композиция по п. 9, где вакцина представляет собой моновалентную вакцину или поливалентную вакцину.
13. Способ обеспечения видов иммунного ответа на FMDV серотипа А у субъекта, включающий введение субъекту вакцинной композиции по п. 9.
