Группа изобретений относится к области биотехнологии и генной инженерии. Раскрыта вирусоподобная химерная частица, содержащая один или несколько рекомбинантных S белков различных штаммов коронавируса, имеющих нуклеотидные последовательности SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, и рекомбинантные белки ротавируса VP2 и VP6, имеющие нуклеотидные последовательности SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, которые получены в бакуловирусной системе экспрессии насекомых, при этом вирусоподобная частица имитирует вирион SARS-CoV-2. Также раскрыт способ получения вирусоподобной химерной частицы, включающий получение рекомбинантных бакуловирусов, содержащих гены S белков различных штаммов коронавируса и гены белков ротавируса VP2 и VP6; коинфекцию перевиваемой линии клеток насекомых T.ni различными сочетаниями рекомбинантных бакуловирусов; получение вирусоподобных химерных частиц и их очистку. Изобретение позволяет получать вирусоподобные химерные частицы для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2. 2 н.п. ф-лы, 6 ил., 2 табл., 6 пр.

Область техники

Группа изобретений относится к области биотехнологии и генной инженерии, в частности к технологии получения вирусоподобных химерных частиц. Частицы содержат капсидные гены ротавируса (VP2 и VP6), а также S белок коронавируса разных штаммов (Уханьского, Британского, Южно-Африканского, Индийского, Омикрона), синтезированных в бакуловирусной системе экспрессии и собранных в вирусоподобные частицы (VLP). Предложенные вирусоподобные химерные частицы могут применяться для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2.

Уровень техники

Актуальность разработки антивирусных препаратов или вакцин для профилактики COVID-2019 не вызывает сомнений. Появление нового коронавируса SARS-CoV-2 с высоким эпидемическим потенциалом вызвало глобальную пандемию коронавирусной инфекции COVID-19. Вспышка данного заболевания впервые была зафиксирована в Ухане (Китай), в декабре 2019 года. 30 января 2020 года Всемирная организация здравоохранения объявила эту вспышку чрезвычайной ситуацией в области общественного здравоохранения, имеющей международное значение, а 11 марта — пандемией. В настоящее время COVID-19 зарегистрирован в 188 странах мира, при этом заболели более 36 миллионов человек, и больше миллиона умерло. В России общее количество зараженных SARS-CoV-2 достигло более миллиона человек. Вирус SARS-CoV-2 относится к семейству Coronaviridae роду Betacoronavirus.

Разработка профилактических препаратов имеет первостепенное значение. В мире на разных стадиях разработки находится более 170 вариантов вакцины, в России зарегистрированы 4 вакцины. Несмотря на то что разработан ряд вакцин, при создании профилактических препаратов для профилактики COVID-19, разработка нескольких платформ (технологий, используемых в производстве вакцины) для создания эффективных и безопасных вакцин просто необходима.

Одной из таких технологий является создание рекомбинантных вакцин на основе вирусоподобных частиц или viruslikeparticle (ВПЧ или VLP). Вирусоподобные частицы или viruslikeparticle (ВПЧ или VLP) представляют собой структуры размером порядка 100-150 нм, которые являются результатом самосборки вирусных белков без нуклеиновой кислоты генома внутри.

VLP содержат большое количество повторяющихся фрагментов вирусных поверхностных и/или коровых белков, представляющих собой конформационные вирусные эпитопы, которые могут вызывать Т-клеточный и В-клеточный иммунный ответы. При иммунизации VLP стимулируют дендритные клетки, которые захватывают соответствующие антигены для презентации T- и В-лимфоцитам [Roy P., Noad R. Virus-likeparticlesas a vaccinedeliverysystem. Mythsandfacts. Hum. Vaccines. 2008; 4 (1): 5–8.]. Поскольку VLP не могут реплицироваться, они обеспечивают более безопасную альтернативу живым вакцинам на основе аттенуированных вирусов. Вирусные структурные белки могут в процессе самосборки объединяться в организованные макромолекулярные структуры (капсиды), по своему строению и морфологии схожие с аутентичными вирионами и содержащие функционально активные и иммунологически соответствующие структурные белки.

VLP могут продуцироваться в различных экспрессионных системах. Наиболее перспективными считаются VLP на основе белков, полученных в бакуловирусной системе экспрессии. Эта системы дают высокие уровни экспрессии рекомбинантных белков и позволяют организовать последующее крупномасштабное производство вакцины. VLP, продуцируемые в клетках насекомых, считаются более безопасными, чем другие системы экспрессии, поскольку бакуловирусы обнаруживаются в овощах и не способны реплицироваться в клетках млекопитающих. Кроме того, клетки насекомых можно адаптировать для роста в бессывороточной, не содержащей животных продуктах, среде, могут быть идентифицированы с помощью анализа кариотипа и изофермента, свободны от загрязняющих микроорганизмов, случайных агентов, ретровирусов и, как было показано, не являются онкогенными. Считается, что данная технология безопасна и используется для широкомасштабного производства VLP[Rong R, Progressinvaccinedevelopmentbasedonbaculovirusexpressionvectorsystem PMID: 31001944 DOI: 10.13345/j.cjb.180301].

В данный момент на стадии доклинических и клинических исследований находятся несколько вакцин от коронавируса, основанных на бакуловирусной системе экспрессии [M. GALDIEROetal. SARS-CoV-2 vaccine development: where are we? European Review for Medical and Pharmacological Sciences 2021; 25: 2752-2784, Table VI. SARS-CoV-2 virus-like particles candidate vaccines under development.]:

1. NVX-CoV2373 (Novavax);

2. Кандидатная вакцина от Sanofi и GSK;

3. Рекомбинантная вакцина против SARS-CoV-2 (клетка Sf9) (Западно-Китайская больница Сычуаньского университета);

4. Белок RBD + адъювант FAR Сквален (FarmacológicosVeterinarios SAC (FARVET SAC)/Universidad Peruana Cayetano Heredia (UPCH)).

Представленные выше вакцины являются субъединичными вакцинами на основе рекомбинантного S белка коронавируса, полученного в бакуловирусной системе экспрессии. Недостатком рекомбинантных субъединичных вакцин, как и традиционных субъединичных вакцин, являются то, что презентация антигена может отличаться от природного вируса и будут вырабатываться антитела, не способные эффективно нейтрализовать патоген. Решением указанного недостатка может быть получение антигенов в виде вирусоподобной частицы, которая имитирует природный вирион и презентация антигена также близка к таковой у вирусной частицы.

Наиболее близким аналогом заявленного изобретения является документ (EP 1261629 B1, опубл. 02.11.2006), в котором раскрывается техническое решение, относящиеся к рекомбинантному бакуловирусу, содержащему экспрессирующие белки VP2, VP6, VP7 и/или VP4 ротовируса, а также содержащему капсидный ген MS2. Также в материалах патента раскрыто получение вирусоподобных частиц на основе бакуловируса. Недостатком данного технического решения является то, что данная конструкция содержит поверхностные антигены ротавируса (VP7 и/или VP4) и не содержит белков S коронавируса, следовательно не вызывает образование антител против поверхностных белков коронавируса, которые и позволяют сформировать специфический иммунный ответ.

Таким образом, существует потребность в создании VLP, сформированных нуклеокапсидом ротавируса (белки VP2, VP6) и поверхностными S белками коронавируса, позволяющими эффективно формировать специфический иммунитет.

Раскрытие сущности изобретения

Технической задачей изобретения является разработка вирусоподобных химерных частиц, состоящих из S белков коронавируса SARS-CoV-2 с универсальным набором поверхностных антигенов,а также из капсидных генов ротавируса VP2 и VP6,которые способны самособираться в частицу, имитирующие вирион коронавируса и вызывать специфический иммунный ответ против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2.

Технический результат заключается в получении устойчивых вирусоподобных частиц, содержащих капсидные гены ротавируса VP2 и VP6 и актуальные антигены SARS-CoV-2, которые способны самособираться в клетках насекомых, имитирующие химерный вирион (капсидротавируса и поверхностные антигена коронавируса), который способен индуцировать специфический иммунный ответ против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2.

Указанный технический результат достигается за счет того, что создана вирусоподобная химерная частица для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2, содержащая один или несколько рекомбинантных S белков различных штаммов коронавируса, имеющие нуклеотидные последовательности SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, и рекомбинантные белки ротавируса VP2 и VP6, имеющие нуклеотидные последовательности SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, которые получены в бакуловирусной системе экспрессии насекомых, при этом вирусоподобная частица имитирует вирион SARS-CoV-2.

А также технический результат достигается за счет того, что разработан способ получения заявленной вирусоподобной химерной частицы для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2, включающий: а) получение рекомбинантных бакуловирусов, содержащих гены S белков различных штаммов коронавируса, имеющие нуклеотидные последовательности SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, и гены белков ротавируса VP2 и VP6, имеющие нуклеотидные последовательности SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7; б) коинфекцию перевиваемой линии клеток насекомых T.ni различными сочетаниями рекомбинантных бакуловирусов; в) получение вирусоподобных химерных частиц и их очистку.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 представлена схема получения бакуловирусных рекомбинантных вирусов.

На фиг. 2А показана проверка методом ПЦР 10 колоний на наличие вставки. На фиг. 2Б показана проверка рекомбинантных бакмид на наличие вставки. Показан электрофорез после проведения ПЦР на наличие вставки в геноме бакуловируса.

На фиг. 3 представлены результаты взаимодействия рекомбинантного белка VP6 со специфическими моноклональными антителами RG23B9С5Н11.

На фиг 4. показано определение антигенной активности рекомбинантного белка SSARS-CoV-2, штамма Дельта методом иммуноблоттинга. Вестерн-блот сыворотки «+» (А) и сыворотки «–» (Б). Слева отмечены молекулярные массы, кДа, Дорожка 1 – положительный контроль, Дорожка 2 – отрицательный контроль, Дорожка 3 – белок S в супернатанте клеток насекомых после инфицирования рекомбинантным бакуловирусом.

На фиг. 5 представлено изображение вирусоподобной частицы методом электронной микроскопии. А – химерная VLP, содержащая белки нуклеокапсидаротавируса VP2/VP6 и белок S коронавируса Южно-Африканского штамма, Б – химерная VLP, содержащая белки нуклеокапсидаротавируса VP2/VP6 и белок S коронавируса Английского штамма. В – химерная VLP, содержащая белки нуклеокапсидаротавируса VP2/VP6 и белок S коронавируса штамма, подобного Уханьскому. Г – химерная VLP, содержащая белки нуклеокапсидаротавируса VP2/VP6 и белок S коронавируса Индийского штамма, Д- химерная VLP, содержащая белки нуклеокапсидаротавируса VP2/VP6 и белок S коронавируса штамма Омикрон, Е - химерная VLP, содержащая белки нуклеокапсидаротавируса VP2/VP6 и 5 белков S коронавируса (штамма, подобного Уханьскому, Южно-Африканского, Английского, Индийского и Омикрон штаммов)

На фиг.6 представлены результаты испытания специфичности VLP (ВПЧ) в ИФА с сыворотками людей, охарактеризованных в реакции нейтрализации (РН).

Осуществление изобретения

Получение вирусоподобных частиц состоит из нескольких этапов.

На первом этапе кодирующие последовательности были получены синтетическим путем, частота использования кодонов при этом была оптимизирована для культуры клеток насекомых. В 1994 году Estes с соавторами[Crawford S.E., Labbé M., Cohen J., Burroughs M.H., Zhou Y.J., Estes M.K. Characterization of virus-like particles produced by the expression of rotavirus capsid proteins in insect cells. JVirol., 1994, 68(9):5945-52] показали, что для самосборки ВПЧ достаточно двух белков ротавируса. Мы выбрали VP2 и VP6 наиболее распространенного генотипа ротавирусов группы А (РВА) человека, циркулирующего на территории РФи восточной Европы. Последовательности S белков были также отобраны на основе молекулярно-генетического и эпидемиологического анализа.

Для получения химерных частиц были использованы следующие последовательности:

- оптимизированная последовательность гена, кодирующего S белок коронавируса (штамм, подобный Уханьскому, циркулирующий в конце 2020 г) (SEQ ID NO:1);

- оптимизированная последовательность гена, кодирующего S белок коронавируса (Индийский штамм) (SEQ ID NO:2);

- оптимизированная последовательность гена, кодирующего S белок коронавируса (Южно-Африканский штамм) (SEQ ID NO:3);

- оптимизированная последовательность гена, кодирующего S белок коронавируса (Английский штамм) (SEQ ID NO:4).

- оптимизированная последовательность гена, кодирующего S белок коронавируса (штамм Омикрон) (SEQ ID NO:5).

- оптимизированная нуклеотидная последовательность гена, кодирующего VP2 ротавируса (SEQ ID NO.6)

- оптимизированная нуклеотидная последовательность гена, кодирующего VP6 ротавируса (SEQ ID NO.7)

Следующим этапом создания вирусоподобных частиц является получение рекомбинантных белков. Для создания каждой генетической конструкции, с которой нарабатывались один или два рекомбинантных белка, мы использовали систему экспрессии Bac-to-Bac.

Пример 1. Получение рекомбинантных бакуловирусов.

Для получения бакуловируса, экспрессирующего различные белки использовали трансферный вектор (pFastBac донорную плазмиду). Схематичное получение бакуловирусных рекомбинантных вирусов представлено на фиг.1

pFastBac донорная плазмида содержит экспрессионную кассету, в которой помимо клонированных генов находится фланкирующие последовательности транспозона Tn7. Рекомбинантная трансферная плазмида используется для трансформации клеток DH10Bac E.coli, которые содержат модифицированный бакуловирусный геном в виде большой плазмиды (бакмиды) и вектор-помощник, кодирующий фермент транспозазу.

После провели клонирование ПЦР-фрагмента в плазмиду pFastBacDual (Invitrogen), после этого повторно выделили ДНК с использованием SilicaBeadDNAGelExtraction. Далее компетентные клетки TopTen трансформировали методом электропорации: 1мкл лигазной смеси, инкубировали смесь при 37°С в течение 45 минут. После инкубации высевали лигазную смесь на чашки, инкубировали ночь при 37°С. Утром 10 произвольных колоний пересевали штрихом на новую чашку и брали их же для ПЦР анализа (фиг. 2А).

Для наращивания плазмиды выбирали два клона, ставили ночную культуру при 37°С. Выделяли плазмиду набором GeneJetPlasmidMiniprepkit (ThermoFischer). Трансформировали компетентные клетки DH10Bac. Затем культуру высевали на чашки и инкубировали 48 часов при 37°С. Выросшие белые колонии повторно пересевали на чашку и параллельно ставили ПЦР(фиг. 2Б).

Для дальнейшей работы отбирали клоны, из которых выделили бакмиды. Выделенные рекомбинантные бакмиды смешивают с липосомным агентом Cellfectin для трансфекции клеток насекомых Sf-9 или Sf-21. Проникшая в клетку кольцевая молекула бакмидной ДНК инфекционна и запускает жизненный цикл бакуловируса в клетке. Таким образом, получаются рекомбинантные бакуловирусы.

Трансфекцию перевиваемой линии клеток Spodopterafrugiperda Sf-21 проводили очищенными препаратами бакмидной ДНК, содержащей оптимизированные гены коронавируса, с использованием катионного липосомного агента Cellfectin (Invitrogen, США), для каждой конструкции использовали по два клона (посевная концентрация клеток 5×10⁵/мл, 10 мкл бакмиды). После трансфекции проводили еще два пассажа на клетках Sf-9 или Sf-21.

Выделенные рекомбинантные бакмиды смешивают с липосомным агентом Cellfectin для трансфекции клеток насекомых Sf-9 или Sf-21. Проникшая в клетку кольцевая молекула бакмидной ДНК инфекциона и запускает жизненный цикл бакуловируса в клетке. Таким образом, получаются рекомбинантные бакуловирусы:

- Рекомбинантный бакуловирус, содержащий ген, кодирующий S белок коронавируса (штамм, подобный Уханьскому, циркулирующий в конце 2020 г.);

- Рекомбинантный бакуловирус, содержащий ген, кодирующий S белок коронавируса (Индийский штамм);

- Рекомбинантный бакуловирус, содержащий ген, кодирующий S белок коронавируса (Южно-Африканский штамм);

- Рекомбинантный бакуловирус, содержащий ген, кодирующий S белок коронавируса (Английский штамм);

- Рекомбинантный бакуловирус, содержащий ген, кодирующий S белок коронавируса (штамм Омикрон);

- Рекомбинантный бакуловирус, содержащий ген, кодирующий белки VP2 и VP6 ротавируса.

Рекомбинантные бакуловирусы проверяли на способность синтезировать рекомбинантные белки ротавируса и коронавируса. Концентрацию белка в растворах определяли с использованием коммерческого набора “Micro BCA ProteinAssayKit” (Thermo, США).

Анализ структурных белков SARS-CoV-2 проводили методом электрофореза в 12% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ПААГ-ДСН) по методу Laemmli (1970) Электрофорез проводили в пластинах полиакриламидного геля размером 70 х 100 х 0,75 на приборе Mini-PROTEAN II (Bio-Rad, США) в восстанавливающих условиях при постоянном напряжении 200 V. Разделяющий гель содержал 12% акриламида, 0,5% N,N-метилен-бис-акриламида, 0,375 М трис-HCl, pH 8,8 и 0,1% ДСН. Фокусирующий гель содержал 4% акриламида, 10% N,N-метилен-бисакриламида в 0,125 М трис-HCl буфере pH 6,8. Для полимеризации в оба геля вносили по 0,025% персульфата аммония и 0,075% TEMED. Электродный буфер содержал 0,025 М трис-HCl, 0,192 М глицина, pH 8,3 и 0,1% ДСН. Все испытуемые пробы содержали лизирующий буфер с восстановителем (0,125 М трис-HCl, pH 6,8, 5% ДСН, 0,5% β -меркаптоэтанола, 10,8% глицерина, 0,01% бромфенолового синего) и были прогреты в течение 5 минут при 100°С. Заливку геля и подготовку аппарата для электрофореза к работе проводили согласно рекомендациям изготовителя. Белки в гелях окрашивали в течение 1 часа 0,1% раствором Кумасси ярко-голубого (CBB R-350) в водном растворе, содержащем 10% уксусной кислоты и 30% метанола. Избыток красителя отмывали 10% раствором уксусной кислотой такое же время с несколькими его сменами. В качестве белков-маркеров молекулярной массы использовали β-галактозидазу - 116 кД; фосфорилазу В - 94 кД, БСА- 66 кД, овальбумин - 45 кД, карбонат ангидразу - 30 кД, ингибитор трипсина - 20,1 кД.

Клетки Vero E6, инфицированные SARS-CoV-2 (положительный контроль), клетки sf9, инфицированные бакуловирусом без вставки (отрицательный контроль) клетки sf9, инфицированные рекомбинантным бакуловирусом, содержащим в геноме вставку гена белка S Sars-CoV-2 лизировали коммерческим буфером (RIPA LysisBufferKit, SantaCrusBiotechnology) на хладагенте. 10 мкг общего белка разделяли в 12% полиакриламидном геле с применением буферной системы для SDS-электрофореза по Лэммли. Для этого использовали ячейку для электрофореза Mini-PROTEAN 3 cat. № 165-330 (Bio-Rad, США) и переносили на нитроцеллюлозную мембрану (0.45 μm; «Schleicher&Schuell», Germany) в мини ячейке MiniTrans-Blot (Bio-Rad, cat. № 170-3930). Электрофорез и блоттинг проводили согласно методике, описанной в инструкции фирмы производителя. Для контроля молекулярного веса использовали маркеры молекулярного веса фирмы ThermoScientific™ cat. № 26634. Эффективность переноса белков контролировали окрашиванием мембраны 2% раствором Ponceau S (Amresco, США) в течение 30 мин. Мембраны инкубировали с сыворотками, содержащими антитела к SARS-CoV-2 (сыворотка «+») /сыворотка переболевшего SARS-CoV-2, РН ˃1:1280/ и не содержащими антитела к SARS-CoV-2 (сыворотка «–») в разведении 1:50. Блоты инкубировали в течение 1 ч с конъюгированными с пероксидазой хрена вторичными античеловеческими антителами (1:100) и проявляли с использованием SuperSignal™ WestFemtoMaximum (ThermoScientific, США) в соответствии с протоколом производителя. Для детекции сигнала хемилюминесценции на мембране экспонировали зеленочувствительную рентгеновскую фотопленку (cat. №126041, Carestream, США). Пленку проявляли с использованием проявителя и фиксажа фирмы ВИПС-МЕД (Россия) согласно методике фирмы-производителя. На рисунке приведен пример определения наличия в супернатанте клеток насекомых белка S штамма Дельта. (фиг.4)

Таким образом, было определено, что были получены S белки коронавируса.

Для определения антигенной активности структурных белков SARS-CoV-2 использовали иммуноблоттинг.

Для оценки вирусного продукта VP6 проводили иммуноферментный анализ. Рекомбинантный белок VP6 был окрашен специфическими моноклональными антителами RG23B9С5Н11(любезно предоставлены профессором LindaSaif, OSU) (фиг.3).

Поскольку белки VP2 и VP6 были клонированы в одной кассете, то экспрессия VP6 одновременно подтверждала экспрессию VP2.

Таким образом, были получены капсидные белки ротавируса VP2 и VP6.

Для определения антигенной активности структурных белков антигена РВА использовали иммуноблоттинг (ИБ).

Таким образом, были подобраны оптимальные рекомбинантные бакуловирусы для каждой конструкции, а также длительность инкубации культуры клеток насекомых, инфицированных различными рекомбинантными бакуловирусами.

Полученные данные были использованы для проведения коинфекции, то есть одновременного заражения перевиваемой линии клеток насекомых T.ni различными сочетаниями рекомбинантных бакуловирусов.

Пример 2. Получение химерных VLP на основе рекомбинантных белков, синтезированных в бакуловирусной системе экспрессии.

VLP получали методом коинфекции, то есть одновременного заражения перевиваемой линии клеток насекомых T.ni различными сочетаниями рекомбинантных бакуловирусов. Перевиваемую культуру клеток насекомых Trichoplusiani, культивировали в течение 4 суток после заражения. Был использован 2 пассаж рекомбинантных бакуловирусов. Таким образом можно получать VLPc различными поверхностными S белками.

Были получены следующие вирусоподобные частицы (фиг.5):

1. Химерная VLP, содержащая белки нуклеокапсидаротавируса VP2 и VP6 и белок S коронавируса Южно-Африканского штамма (фиг.5А)

2. Химерная VLP, содержащая белки нуклеокапсидаротавируса VP2 и VP6 и белок S коронавируса Английского штамма (фиг.5Б)

3. Химерная VLP, содержащая белки нуклеокапсидаротавируса VP2 и VP6 и белок S коронавируса штамма, подобного Уханьскому (фиг.5В).

4. Химерная VLP, содержащая белки нуклеокапсидаротавируса VP2 и VP6 и белок S коронавируса Индийского штамма (фиг.5Г)

5. Химерная VLP, содержащая белки нуклеокапсидаротавируса VP2 и VP6 и белок S коронавируса штамма Омикрон (фиг.5Д).

6. Химерная VLP, содержащая белки нуклеокапсидаротавируса VP2 и VP6 и несколько S белков коронавируса(фиг. 5Е)

Таким образом, получены рекомбинантные химерные частицы на основе ротавирусногонуклеокапсида и поверхностного белка S коронавируса, причем из различных циркулирующих штаммов.

Пример 3. Очистка химерных VLP коронавируса.

Культуральную жидкость, содержащую вирус или вирусоподобные частицы, подвергали низкоскоростному центрифугированию, освобождаясь от клеток и клеточного дебриса при 1000 об/мин в течение 5 минут и при 6000 об/мин в течение 20 минут соответственно (+4°С, ротор Sorval® SS34). После этого супернатант использовался для выделения и очистки SARS-VLP методом ультрацентрифугирования.

Полученные осветлённые суспензии наслаивали на 6 мл 25% или 35% (w/v) сахарозы, приготовленной на буфере TNС (10 mMTris–HCl, 140 mMNaCl, 10 mM CaCl2 рН 7.4). Центрифугировали в течение 2 часов при 28 000 об/мин (центрифуга Оptima XE-100, ротор SW 32Ti, BeckmanCoulter, +4°С). Полученные осадки ресуспендировали в буфере TNС, и хранили при температуре +4°С.

Таким образом, был получен препарат, содержащий очищенные VLP.

Пример 4. Определение VLP методом электронной микроскопии

3 мкл препарата, содержащего VLP, с концентрацией 12-30 мг/мл наносили на медную сетку, покрытую углеродной подложкой (TedPella, США) и обработанную в атмосфере тлеющего разряда, инкубировали 30 секунд при комнатной температуре. Затем на сетку наносили каплю 2% раствора ацетата урана, выдерживали 30 секунд, излишки раствора удаляли с сетки фильтровальной бумагой. Окрашенные сетки хранили в пластиковых контейнерах до использования. Исследование образцов производили в просвечивающем электронном микроскопе JEOL 2100 (JEOL, Япония), оборудованном катодом из гексаборита лантана, при ускоряющем напряжении 200 кВ. Изображения получали с увеличением х25000 с помощью ПЗС-камеры Gatan X100 с размером матрицы 2000х2000 пикселей (Gatan, США). Вирусоподобные частицы, визуализированные методом электронной микроскопии, представлены на фиг.5А-5Д.

Пример 5. Определение специфичности VLP (ВПЧ) в ИФА с сыворотками людей, охарактеризованных в реакции нейтрализации (РН)

В лунки планшета сорбировали VLP в разведении от 1:2 до 1:256. Планшет инкубировали ночь при +4°С. Сыворотки крови людей, отобранные на основании РН, добавляли в лунки планшета в разведении 1:100. Каждая сыворотка (отрРН1 – отрицательная в РН, 320РН – положительная в РН (титр 1:320), 20РН - положительная в РН (титр 1: 20) и отрРН2 – сыв-ка, взятая более 20 лет назад) в отдельный ряд (стрип) с раститрованным антигеном. Наличие взаимодействующих антител в сыворотках с белками вируса SARS-CoV-2 выявляли добавлением анти-IgG-человека конъюгированных с пероксидазой хрена. Результаты представлены в таблице 1 и на фиг. 6.

Таблица 1. Результаты испытания специфичности VLP (ВПЧ) в ИФА с сыворотками людей, охарактеризованных в реакции нейтрализации (РН)

Разведение VLP	ОП в лунках планшета с сыворотками
отр РН1	320РН	20РН	отр РН2
2	0,058	0,426	0,238	0,059
4	0,108	0,523	0,247	0,065
8	0,086	0,569	0,376	0,069
16	0,097	0,544	0,322	0,078
32	0,098	0,597	0,429	0,093
64	0,107	0,614	0,444	0,112
128	0,119	0,653	0,482	0,095
256	0,127	0,626	0,398	0,161

Исследование специфичности вирусоподобных частиц (VLP) показало, что полученные частицы эффективно связывают антитела в сыворотке крови людей, перенесших COVID-19. При этом наблюдается корреляция между титром в реакции нейтрализации и оптической плотностью в иммуноферментном анализе, что доказывает наличие специфически взаимодействующих антител с полученными VLP. Таким образом, подтверждается презентация антигенных детерминант в антигене, подобная той, которая наблюдается в вирионе SARS-CoV-2.

Пример 6. Индукция специфического иммунного ответа in vivo против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2.

Полученные VLP, содержащие различные S смешивали в равных долях и использовали в препарате с общим содержанием антигена 40 мкг/доза. При этом добавляли адъювант SWE фирмы SEPPIC, составляющее 50% от общего объема дозы.

Для оценки иммуногенности в качестве моделей использовали следующие модели лабораторных животных:

сирийских хомячков (Mesocricetusauratus)[Imai M., Iwatsuki-Horimoto K., Hatta M., Loeber S., Halfmann P.J., Nakajima N., et al. Syrian hamsters as a small animal model for SARS-CoV-2 infection and countermeasure development. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2020; 117(28): 16587-95. https://doi.org/10.1073/pnas.2009799117].

Также использовали крыс и кроликов, поскольку данные модели используются для проведения ряда доклинических исследований, поэтому необходимо было проверить, вызывают ли химерные VLP специфический иммунный ответ.

Определение антител к S-белку SARS-CoV-2

Уровень антител к S-белку вируса SARS-CoV-2 после иммунизации определяли методом непрямого ИФА. Для этого рекомбинантный белок RBD (иммуногенный фрагмент S-белка вируса SARS-CoV-2) сорбировали в лунках микропланшета в 0,1 М карбонатном буфере, рН=9,5 в концентрации 5 мкг/мл по 100 мкл в лунку в течение ночи при 4⁰С. После 4-кратной отмывки планшета в лунки вносили по 100 мкл исследуемой сыворотки мыши, разведенной в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) рН=7.5, содержащим 0.01% Твин 20 и 0.5% бычьего сывороточного альбумина (БСА). Инкубировали планшет 1 час при +37°С. После промывания планшета вносили по 0.1 мл пероксидазного конъюгата антител к IgG мыши или хомяка. Инкубировали планшет 1 час при +37°С. После промывания планшета вносили по 0.1 мл субстратного раствора с тетраметилбензидином. Инкубировали 15 мин при комнатной температуре в темноте и добавляли 0.1 мл 1 М H₂SO₄ для остановки реакции. Оптическую плотность при 450 нм (А₄₅₀) измеряли на спектрофотометре с вертикальным лучом Multiscan ЕХ (Thermo, США). О

Определение нейтрализующих антител к SARS-CoV-2

Реакцию нейтрализации проводили микрометодом в 96-луночных планшетах (Costar, США) на перевиваемой культуре клеток Vero E6, выращенной на среде Игла с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки. Поддерживающая среда содержала 1% сыворотки. При постановке реакции нейтрализации (РН) использовали разведение КЖ, содержащее 100 ТЦИД₅₀в 100 мкл.

Из сывороток вакцинированных животных готовили разведения от 1:10 до 1:1280 и вносили по 100 мкл в лунки 96-луночного планшета. К разведениям сывороток добавляли по 100 мкл вируссодержащей суспензии и инкубировали смесь в течение часа при 37°С. Затем смесь переносили в 96-ти луночный планшет с монослоем клеток VeroE6. Через 72 часа реакцию учитывали, просматривая лунки планшета в микроскоп. Если в сыворотке крови есть нейтрализующие вирус антитела, вирус не будет вызывать ЦПД клеток. Титром сыворотки (последним нейтрализующим разведением) считали разведение, при котором обеспечивается 100% защита клеток (нет ЦПД). Реакцию нейтрализации с сыворотками животных проводили аналогичным образом. Первым разведением, как правило, было 1:5. Реакцию нейтрализации против штамма Дельта и Омикрон вируса SARS-CoV-2 проводили аналогичным образом.

Полученные результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2. Результаты выявления специфических антител и нейтрализующих у сирийских хомячков, крыс и кроликов после двукратной иммунизации.

Животные	Средний титр в ИФА	Средний титр в нейтрализации штамма Ухань	Средний титр в нейтрализации штамма Дельта	Средний титр в нейтрализации штамма Омикрон
Сирийские хомячки	3200	320	320	320
Крысы	800	80	80	80
Кролики	400	40	40	40

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD

Sequence Listing 1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing originalFreeTextLanguageCode="ru"

dtdVersion="V1_3" fileName="chimeric coronavirus

rotavirus.xml" softwareName="WIPO Sequence"

softwareVersion="2.1.1" productionDate="2022-07-15">

</ApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">федеральное государственное

бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр

эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи»

Министерства здравоохранения Российской Федерации</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>federalnoe gosudarstvennoe biudzhetnoe

uchrezhdenie Natsionalnyi issledovatelskii tsentr epidemiologii i

mikrobiologii imeni pochetnogo akademika N F Gamalei Ministerstva

zdravookhraneniia Rossiiskoi Federatsii</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Вирусоподобные химерные

частицы для индукции специфического иммунитета против вируса

тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2,

содержащие белки коронавируса и ротавируса</InventionTitle>

<INSDSeq_length>3822</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..3822</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atgttcgttttcctcgtgctcctccccctcgtttcctcccaatgcgtcaacctc

actacccgtacccagctcccaccagcctacaccaacagcttcactcgcggtgtgtactaccccgacaaggtc

ttccgttccagcgtgctgcacagcactcaggacctgttcctgccattcttctctaacgtgacctggttccac

gccatccacgtgagcggcaccaacggcactaagcgcttcgacaaccctgtgctgcccttcaacgacggtgtc

tacttcgcttccaccgagaagtctaacatcatccgtggatggatcttcggcaccactctggactcaaagact

cagtccctgctgatcgtcaacaacgccaccaacgtggtcatcaaggtgtgcgagttccagttctgcaacgac

cctttcctgggcgtctactaccacaagaacaacaagagctggatggagtctgagttccgcgtctactcttca

gctaacaactgcactttcgagtacgtgagccagcccttcctgatggacctggaaggaaagcagggtaacttc

aagaacctgagggagttcgtgttcaagaacatcgacggatacttcaagatttactcaaagcacacccctatc

aacctggtgcgcgacctgccacagggtttctccgctctggagcctctggtggacctgcccatcggcatcaac

atcacccgcttccagactctgctggctctgcaccgttcctacctgactcctggcgactccagctctggatgg

accgccggagctgccgcttactacgtgggttacctgcaacccaggaccttcctgctgaagtacaacgaaaac

ggaaccatcacagacgctgtggactgcgctctggaccccctgagcgaaaccaagtgcactctgaagtctttc

accgtggagaagggcatctaccagactagcaacttcagggtgcagccaaccgaatctatcgtcagattcccc

aacatcactaacctgtgcccattcggagaggtcttcaacgccaccagattcgcttccgtgtacgcctggaac

aggaagagaatcagcaactgcgtcgctgactactctgtgctgtacaacagcgcctctttctcaaccttcaag

tgctacggcgtgagccctactaagctgaacgacctgtgcttcaccaacgtctacgccgactctttcgtgatc

aggggagacgaggtcagacagatcgctcccggccagactggaaagatcgccgactacaactacaagctgcca

gacgacttcaccggctgcgtcatcgcttggaactcaaacaacctggactccaaagtgggtggcaactacaac

tacctgtaccgcctgttccgtaagagcaacctgaagcctttcgagagggacatctcaactgaaatctaccag

gctggttccaccccctgcaacggtgtcgagggcttcaactgctacttcccactgcaatcttacggtttccag

cctactaacggtgtgggctaccagccctacagagtggtcgtgctgtcattcgaactgctgcacgccccagct

actgtgtgcggtcctaagaagtccaccaacctggtcaagaacaagtgcgtgaacttcaacttcaacggcctg

accggaactggtgtcctgaccgagtcaaacaagaagttcctgccattccagcagttcggaagggacatcgct

gacaccactgacgctgtgcgcgaccctcagaccctggaaatcctggacatcactccttgcagcttcggaggt

gtctctgtgatcacccctggcaccaacacttccaaccaggtcgctgtgctgtaccaggacgtcaactgcacc

gaggtgcctgtggctatccacgctgaccagctgaccccaacttggcgcgtgtactccaccggctccaacgtc

ttccagactcgtgctggttgcctgatcggcgccgagcacgtgaacaactcatacgaatgcgacatcccaatc

ggcgctggaatctgcgcctcctaccagacccagactaactcacctcgccgtgctcgctccgtcgcctcccag

agcatcatcgcttacaccatgagcctgggcgctgaaaactctgtggcctactccaacaacagcatcgccatc

ccaaccaacttcactatctcagtgaccactgagatcctgcctgtctcaatgaccaagacttccgtggactgc

actatgtacatctgcggagactcaaccgaatgctccaacctgctgctgcaatacggctccttctgcacccag

ctgaaccgtgctctgactggaatcgccgtggagcaggacaagaacactcaggaagtcttcgctcaggtgaag

caaatctacaagacccctcccatcaaggacttcggcggattcaacttctcccagatcctgcccgacccatct

aagccttcaaagcgctccttcatcgaggacctgctgttcaacaaggtcaccctggccgacgctggattcatc

aagcagtacggagactgcctgggtgacatcgccgctcgtgacctgatctgcgctcagaagttcaacggtctg

accgtgctgccacctctgctgactgacgaaatgatcgcccagtacacttcagccctgctggctggaaccatc

acttccggttggaccttcggtgctggtgctgctctgcaaatccccttcgctatgcagatggcctacaggttc

aacggaatcggtgtcacccagaacgtgctgtacgagaaccagaagctgatcgctaaccagttcaacagcgcc

atcggaaagatccaggactcactgtcatccactgcctccgctctgggcaagctgcaagacgtcgtgaaccag

aacgcccaggctctgaacaccctggtcaagcagctgtcctccaacttcggtgctatctcatccgtgctgaac

gacatcctgtctcgcctggacaaggtcgaggccgaagtgcagatcgaccgcctgatcaccggccgcctgcaa

tccctgcaaacctacgtgactcagcagctgatcagggccgctgaaatcagagcctctgctaacctggccgct

accaagatgtcagagtgcgtcctgggtcagtccaagcgtgtggacttctgcggcaagggataccacctgatg

agcttcccccagtctgctccacacggcgtcgtgttcctgcacgtcacctacgtgcctgcccaggagaagaac

ttcaccactgcccccgctatctgccacgacggcaaggctcacttcccaagggaaggtgtcttcgtgtcaaac

ggcacccactggttcgtcactcagagaaacttctacgagcctcagatcatcaccactgacaacactttcgtg

tccggaaactgcgacgtcgtgatcggtatcgtcaacaacaccgtgtacgacccactgcaacctgagctggac

agcttcaaggaggaactggacaaatacttcaagaaccacacctctcccgacgtggacctgggtgacatcagc

ggaatcaacgcttctgtcgtgaacatccagaaggagatcgaccgtctgaacgaagtggctaagaacctgaac

gaatccctgatcgacctgcaagagctgggcaagtacgaacagtacatcaagtggccttggtacatctggctg

ggtttcatcgctggcctgatcgccatcgtcatggtgaccatcatgctgtgctgcatgactagctgctgctct

tgcctgaagggctgctgctcatgcggttcctgctgcaagttcgatgaagacgattccgagcccgttctcaaa

ggagtgaagttgcattacacataa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>3786</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..3786</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tcctcccaatgcgtcaacctcactacccgtacccagctcccaccagcctacacc

aacagcttcactcgcggtgtgtactaccccgacaaggtcttccgttccagcgtgctgcacagcactcaggac

ctgttcctgccattcttctctaacgtgacctggttccacgccatccacgtgagcggcaccaacggcactaag

cgcttcgacaaccctgtgctgcccttcaacgacggtgtctacttcgcttccaccgagaagtctaacatcatc

cgtggatggatcttcggcaccactctggactcaaagactcagtccctgctgatcgtcaacaacgccaccaac

gtggtcatcaaggtgtgcgagttccagttctgcaacgaccctttcctgggcgtctactaccacaagaacaac

aagagctggatggagtctgagttccgcgtctactcttcagctaacaactgcactttcgagtacgtgagccag

cccttcctgatggacctggaaggaaagcagggtaacttcaagaacctgagggagttcgtgttcaagaacatc

gacggatacttcaagatttactcaaagcacacccctatcaacctggtgcgcgacctgccacagggtttctcc

gctctggagcctctggtggacctgcccatcggcatcaacatcacccgcttccagactctgctggctctgcac

cgttcctacctgactcctggcgactccagctctggatggaccgccggagctgccgcttactacgtgggttac

ctgcaacccaggaccttcctgctgaagtacaacgaaaacggaaccatcacagacgctgtggactgcgctctg

gaccccctgagcgaaaccaagtgcactctgaagtctttcaccgtggagaagggcatctaccagactagcaac

ttcagggtgcagccaaccgaatctatcgtcagattccccaacatcactaacctgtgcccattcggagaggtc

ttcaacgccaccagattcgcttccgtgtacgcctggaacaggaagagaatcagcaactgcgtcgctgactac

tctgtgctgtacaacagcgcctctttctcaaccttcaagtgctacggcgtgagccctactaagctgaacgac

ctgtgcttcaccaacgtctacgccgactctttcgtgatcaggggagacgaggtcagacagatcgctcccggc

cagactggaaagatcgccgactacaactacaagctgccagacgacttcaccggctgcgtcatcgcttggaac

tcaaacaacctggactccaaagtgggtggcaactacaactacctgtaccgcctgttccgtaagagcaacctg

aagcctttcgagagggacatctcaactgaaatctaccaggctggttccaccccctgcaacggtgtcgagggc

ttcaactgctacttcccactgcaatcttacggtttccagcctactaacggtgtgggctaccagccctacaga

gtggtcgtgctgtcattcgaactgctgcacgccccagctactgtgtgcggtcctaagaagtccaccaacctg

gtcaagaacaagtgcgtgaacttcaacttcaacggcctgaccggaactggtgtcctgaccgagtcaaacaag

aagttcctgccattccagcagttcggaagggacatcgctgacaccactgacgctgtgcgcgaccctcagacc

ctggaaatcctggacatcactccttgcagcttcggaggtgtctctgtgatcacccctggcaccaacacttcc

aaccaggtcgctgtgctgtaccaggacgtcaactgcaccgaggtgcctgtggctatccacgctgaccagctg

accccaacttggcgcgtgtactccaccggctccaacgtcttccagactcgtgctggttgcctgatcggcgcc

gagcacgtgaacaactcatacgaatgcgacatcccaatcggcgctggaatctgcgcctcctaccagacccag

actaactcacctcgccgtgctcgctccgtcgcctcccagagcatcatcgcttacaccatgagcctgggcgct

gaaaactctgtggcctactccaacaacagcatcgccatcccaaccaacttcactatctcagtgaccactgag

atcctgcctgtctcaatgaccaagacttccgtggactgcactatgtacatctgcggagactcaaccgaatgc

tccaacctgctgctgcaatacggctccttctgcacccagctgaaccgtgctctgactggaatcgccgtggag

caggacaagaacactcaggaagtcttcgctcaggtgaagcaaatctacaagacccctcccatcaaggacttc

ggcggattcaacttctcccagatcctgcccgacccatctaagccttcaaagcgctccttcatcgaggacctg

ctgttcaacaaggtcaccctggccgacgctggattcatcaagcagtacggagactgcctgggtgacatcgcc

gctcgtgacctgatctgcgctcagaagttcaacggtctgaccgtgctgccacctctgctgactgacgaaatg

atcgcccagtacacttcagccctgctggctggaaccatcacttccggttggaccttcggtgctggtgctgct

ctgcaaatccccttcgctatgcagatggcctacaggttcaacggaatcggtgtcacccagaacgtgctgtac

gagaaccagaagctgatcgctaaccagttcaacagcgccatcggaaagatccaggactcactgtcatccact

gcctccgctctgggcaagctgcaagacgtcgtgaaccagaacgcccaggctctgaacaccctggtcaagcag

ctgtcctccaacttcggtgctatctcatccgtgctgaacgacatcctgtctcgcctggacaaggtcgaggcc

gaagtgcagatcgaccgcctgatcaccggccgcctgcaatccctgcaaacctacgtgactcagcagctgatc

agggccgctgaaatcagagcctctgctaacctggccgctaccaagatgtcagagtgcgtcctgggtcagtcc

aagcgtgtggacttctgcggcaagggataccacctgatgagcttcccccagtctgctccacacggcgtcgtg

ttcctgcacgtcacctacgtgcctgcccaggagaagaacttcaccactgcccccgctatctgccacgacggc

aaggctcacttcccaagggaaggtgtcttcgtgtcaaacggcacccactggttcgtcactcagagaaacttc

tacgagcctcagatcatcaccactgacaacactttcgtgtccggaaactgcgacgtcgtgatcggtatcgtc

aacaacaccgtgtacgacccactgcaacctgagctggacagcttcaaggaggaactggacaaatacttcaag

aaccacacctctcccgacgtggacctgggtgacatcagcggaatcaacgcttctgtcgtgaacatccagaag

gagatcgaccgtctgaacgaagtggctaagaacctgaacgaatccctgatcgacctgcaagagctgggcaag

tacgaacagtacatcaagtggccttggtacatctggctgggtttcatcgctggcctgatcgccatcgtcatg

gtgaccatcatgctgtgctgcatgactagctgctgctcttgcctgaagggctgctgctcatgcggttcctgc

tgcaagttcgatgaagacgattccgagcccgttctcaaaggagtgaagttgcattacaca</INSDSeq_sequenc