Средство специфической профилактики covid-19 для плотоядных животных

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Описано средство для профилактики COVID-19 для плотоядных животных. Содержит активное вещество и целевую добавку, согласно изобретению в качестве активного вещества она содержит инактивированный антигенный материал из штамма «вариант В» вируса SARS-CoV-2 коронавирусной инфекции, предпочтительно репродуцированного в культуре клеток Vero С1008 и депонированного в коллекции штаммов ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России под регистрационным номером: 1199 - ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России, и целевую добавку: 3%-ный гель гидроокиси алюминия, взятые в объемном соотношении, %: 50,0÷50,0 соответственно и в количествах, обеспечивающих протективную иммунногенную активность антигена в организме плотоядных животных после введения им целевого препарата. Изобретение расширяет арсенал средств для профилактики коронавирусной инфекции. 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 4 табл., 6 пр.

 

Изобретение относится к биотехнологии, иммунологии и вирусологии. Предложенное средство может применяться для профилактики заболеваний, вызванных вирусом тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2.

В конце 2019 г. в г. Ухань провинции Хубэй (КНР) была зафиксирована вспышка атипичной пневмонии неизвестной этиологии. Проведенные научные исследования позволили установить, что она была вызвана одноцепочечным РНК-содержащим вирусом, относящимся к семейству Coronaviridae, к линии Beta-CoV В. 11 февраля 2020 г. Всемирная Организация Здравоохранения (ВОЗ) присвоила новому вирусу официальное название SARS-CoV-2, а болезнь, возбудителем которой он является, получила название COVID-19 («Coronavirus disease 2019»).

С декабря 2019 г. по настоящее время в мире развивается пандемия новой коронавирусной инфекции COVID-19, вызванная вирусом SARS-CoV-2, которая началась как вспышка ранее неизвестной инфекции в Китайской Народной Республике (КНР), а сегодня охватила весь мир [1]. По состоянию на 15 июня 2020 г. в мире зарегистрировано свыше 8 млн инфицированных COVID-19 в большинстве стран на всех континентах на фоне ограничительных мероприятий, направленных на резкое сокращение международных и внутренних пассажиропотоков, мобильности населения на национальном уровне, социального дистанцирования и активного эпидемиологического надзора, проводимого в большинстве государств.

После крупной вспышки COVID-19 в Китае в январе-феврале 2020 г. [2], уже в марте 2020 г. общая динамика ежедневного прироста числа новых случаев заболевания продемонстрировала доминирование эпидемиологического неблагополучия в европейских странах и США на фоне относительного благополучия в других странах мира. В июне 2020 г. Южная Америка стала лидером по доле случаев от ежедневного количества зарегистрированных больных (стабильно больше 25-30%), опередив Северную Америку, которая занимала лидирующие позиции по наибольшему приросту новых случаев. Однако США сохраняют первое место по количеству зарегистрированных случаев в мире - в июне страна преодолела отметку в 2 млн случаев заражения.

В странах СНГ показатель заболеваемости на 100 тыс. населения варьирует от 18,9 в Узбекистане до 619,1 в Республике Беларусь и 684,0 в Армении.

В Российской Федерации заболеваемость COVID-19 регистрируется с 31 января 2020 г., начиная с единичных завозных случаев из Китая [3]. При этом до начала апреля 2020 г. число выявленных инфицированных лиц не превышало 500 человек в сутки, большая часть из которых приходилась на Москву. Дальнейшая динамика характеризовалась постоянным ростом ежедневно регистрируемых случаев COVID-19 до достижения пиковых значений в первой декаде мая 2020 г. (11656 случаев 11 мая 2020 г.).

Таким образом, эпидемическая ситуация по COVID-19 в Российской Федерации по основным характеристикам контингентов и факторов риска в целом соответствует наблюдаемой картине в зарубежных странах [4-7].

Весной 2020 года вирус SARS-CoV-2 начал заражать животных. Восприимчивыми оказались норки и хорьки на звероводческих фермах, кошки, собаки и обитатели зоопарков (тигры, львы и другие животные).

Из-за распространения COVID-19 в зверохозяйствах Дании по распоряжению правительства страны было уничтожено более 17 млн норок. Пострадали также звероводческие хозяйства Испании, Голландии и других стран.

Распространение вируса SARS-CoV-2 на норковых фермах создает новые возможности для его эволюции, т.к. появляется возможность передачи возбудителя диким видам животных, которые могут стать резервуаром COVID-19 [8].

В ВОЗ подтвердили, что изолят, вызвавший инфекцию у норок, был выявлен у 12 человек. Причем восемь из них контактировали с норками, а четыре - жители населенных пунктов, где находилась звероферма [9].

Таким образом, вопрос формирования специфической защиты против COVID-19 среди плотоядных животных имеет первостепенную актуальность как для ветеринарного благополучия РФ, так и для предотвращения распространения данного заболевания среди людей.

Филогенетические исследования позволили установить, что вирус SARS-CoV-2 более близок к коронавирусам, поражающим летучих мышей (bat-SL-CoVZC45, bat-SL-CoVZXC21), чем к коронавирусам, циркулирующим в человеческой популяции. Так, например, S белок SARS-CoV-2 гомологичен S белку SARS-CoV не более, чем на 75% [10]. Таким образом, кандидатные вакцины против заболеваний, вызываемых SARS-CoV не эффективны против COVID-19.

Известно решение, в котором для профилактики заболеваний, вызванных коронавирусом, используют живую аттенуированную вакцину [11]. Данная вакцина содержит живой аттенуированный коронавирус, который характеризуется как содержащий геном, кодирующий (i) ExoN, содержащий замену на тирозин 6398 MHV-A59 или аналогичной позиции, (и) полипептид Orf2a, содержащий замену на лейцина 106 MHV-A59 или аналогичной позиции и фармацевтически приемлемый разбавитель. При этом данное изобретение распространяется на ряд коронавирусов животных и птиц и коронавирус человека ОС34.

Известно решение, в котором для получения Рекомбинантной вакцины против нового коронавируса («Recombinant novel coronavirus vaccine composition))) используют рекомбинантный белок-шип с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 1. и фармацевтически приемлемого носителя, такого как алюминиевый адъювант в комбинации с адъювантом CpG ODN. Композиция вакцины демонстрирует достаточную иммуногенность и может побуждать организм генерировать ответ с высоким титром антител, смещенный к Th1 и высокий уровень клеточного иммунного ответа. Однако, данная вакцина предназначена для иммунизации человека [12].

Известно решение применения нуклеиновой кислоты, кодирующей шип-белок вируса SARS-CoV-2 [13]. Изобретение относится к технической области биологической медицины и использует в качестве основы венесуэльского энцефалеза лошадей (VEEV) ТС83 из семейства альфа-вирусов. Препарат предназначен исключительно для медицинского применения.

Недостатки указанных изобретений заключаются в том, что ни одно из них не предназначено к применению для плотоядных животных. Кроме того, указанные изобретения используют в качестве активного вещества либо живой аттенуированный вирус SARS-CoV-2, либо - его отдельные структурные белки.

Таким образом, в настоящее время не зарегистрировано ни одного препарата для индукции специфического иммунитета против коронавируса SARS-CoV-2 у плотоядных животных.

По данным патентной и научно-технической литературы не обнаружена аналогичная совокупность признаков, в части компонентов, что позволяет судить об изобретательском уровне заявленного технического решения.

Таким образом, в области техники существует потребность в разработке фармацевтического средства, которое является безопасным и способно индуцировать иммунный ответ против вируса SARS-CoV-2 у плотоядных животных.

Для решения этой проблемы было создано настоящее изобретение, в которое входила разработка средства специфической профилактики COVID-19 для плотоядных животных и обеспечивающее эффективную защиту восприимчивых животных против вируса SARS-CoV-2. Предлагаемое средство является уникальным, т.к. на настоящий момент в мире не существует аналогов, полностью прошедших все стадии контроля безопасности для целевых животных и эффективности против COVID-19.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала вакцин, как эффективного инструмента контроля и профилактики новой короновирусной инфекции среди животных.

Указанный технический результат достигнут созданием средства специфической профилактики COVID-19 для плотоядных животных, охарактеризованной следующей совокупностью признаков, отраженных ниже.

Разработанное средство (вакцина) в 1,0 см³ препарата содержит следующие компоненты: активное вещество в виде инактивированного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма «вариант В» вируса SARS-CoV-2 коронавирусной инфекции, репродуцированного в культуре клеток Vero С1008 и целевая добавка в виде гидроокиси алюминия (производство «ВНИИЗЖ»), взятых в равных количествах, обеспечивающих протективную иммунную активность в организме животного после введении ему целевого препарата. В предлагаемом средстве (вакцине) активное вещество и целевая добавка объединены в соотношении: об. %: 50,0÷50,0, или смешиваются в соотношении 1:1.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые спрашивается правовая охрана:

1. Средство специфической профилактики COVID-19 для плотоядных животных.

2. Активное вещество в виде инактивированного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма «вариант В» вируса SARS-CoV-2 коронавирусной инфекции, коллекция ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России под регистрационным номером: 1199 - ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России.

3. Целевые добавки.

Существенные отличительные признаки предлагаемой вакцины заключаются в том, что в качестве активного вещества она содержит инактивированный очищенный антигенный материал из штамма «вариант В» вируса SARS-CoV-2 коронавирусной инфекции, используемое для плотоядных животных.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:

1. Антигенный материал из штамма «вариант В» вируса SARS-CoV-2 коронавирусной инфекции, репродуцированного в культуре клеток Vero С1008, в эффективном количестве, не менее 50,0 об. %.

2. Из целевых добавок вакцина содержит гидроокись алюминия.

3. 3%-ный гель гидроокиси алюминия.

4. Средство (вакцина) содержит 3%-ный гель гидроокиси алюминия в количестве не менее 50,0 об. %.

5. Смесь из инактивированного и очищенного антигенного материала из штамма «вариант В» вируса SARS-CoV-2 коронавирусной инфекции и целевой добавки: адъювант гидроокись алюминия в равном количестве, об. %:

Антигенный материал из штамма «вариант В»
вируса SARS-CoV-2 коронавирусной инфекции	50,0
Адъювант 3%-ный гель гидроокиси алюминия	50,0

Предлагаемое средство (вакцина) обеспечивает надежную защиту против вируса SARS-CoV-2 коронавирусной инфекции COVID-19, циркулирующего на территории Российской Федерации.

По внешнему виду препарат представляет собой однородную суспензию розового или светло-розового цвета. При хранении допускается выпадение рыхлого осадка. При взбалтывании однородность суспензии восстанавливается. По лекарственной форме изобретение является суспензией для инъекции.

Изолят возбудителя COVID-19, послуживший источником для получения штамма «вариант В» коронавируса SARS-CoV-2, был выделен из проб биологического материала, полученного от туриста, приехавшего из Италии с клиническими признаками коронавирусной инфекции. Штамм относится к классу Pisoniviricetes, отряду Nidovirales, семейству Coronaviridae, подсемейству Coronavirinae, роду Betacoronavirus, виду SARS-CoV-2.

Штамм адаптирован в культуре клеток Vero С1008 в условиях ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России. Штамм депонирован 15.03.2020 под регистрационным номером: 1199 - ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России.

Культивирование штамма SARS-CoV-2 осуществляют с использованием культуры клеток почки зеленой мартышки Vero, обладающей высокой чувствительностью к возбудителю заболевания COVID-19. Перед использованием для получения вирусного сырья серии клеточных культур контролируют по морфологии клеток, полноценности сформированного монослоя клеток, отсутствию контаминации микроорганизмами. Инокуляцию возбудителя COVID-19 в культуру клеток Vero производят в дозе 0,001 БОЕ/клетку. Культивирование инфицированного монослоя проводят при температуре (37±0,5)°С в течение 48 часов, после чего материал подвергают однократному циклу замораживания-оттаивания, что необходимо для окончательного разрушения клеточного монослоя. Полученное вирусное сырье очищают об баластных белков с помощью центрифугирования при 3000 об./мин в течение 15 минут.

Инактивацию вируса проводят с использованием β-пропиолактона. Для этого подготовленный, как описано выше, вирусный материал подогревают до температуры (25±0,5)°С, после чего в него добавляю 10%-ный раствор β-пропиолактона в соотношении 99:1. Таким образом, конечная концентрация инактиванта в полученной системе составляет 0,1% от общего объема. Процесс инактивации вируса длится 24 часа при температуре (25±0,5)°С.

Контроль полноты инактивации вируссодержащего сырья проводят с помощью трех последовательных пассажей в культуре клеток Vero с последующим определением биологической активности вируса SARS-CoV-2 методом подсчета образования негативных колоний под агаровым покрытием. Критерием качества инактивации является отсутствие негативных колоний во флаконах с материалом, содержащим инактивированный вирус SARS-CoV-2, штамм «вариант В», и во флаконах с пробами его трех последовательных пассажей. Инактивированный вирусный материал, содержащий возбудитель COVID-19, хранят при температуре (4±2)°С.

Инактивированный антиген штамма «вариант В» представляет собой суспензию, содержащую цельновирионные капсиды возбудителя COVID-19, которые полностью сохранили свою белковую и антигенную структуру, но в результате разрушения генетического аппарата потерявшие вирулентность и способность к размножению.

В качестве адъюванта активного компонента препарата используется водный раствор гидроокиси алюминия (Al(OH)₃), который благодаря выраженной способности адсорбировать антигенные структуры вирусных организмов усиливает силу и продолжительность иммунного ответа организма-реципиента. Сорбцию производят путем объединения инактивированного вируссодержащего сырья и 3% раствора гидроокиси алюминия в соотношении 1:1. Полученный материал непрерывно перемешивают при температуре от 4°С до 8°С. Соблюдение температурного режима необходимо в связи с термолабильностью белково-антигенной структуры инактивированного вирусного капсида.

Сущность изобретения отражена на графических изображениях:

Фиг. 1. - Результаты определения оптимальной иммунизирующей дозы.

Фиг. - 2. - Продолжительность иммунитета к COVID-19 у иммунизированных животных, представлены исследования сывороток крови от разных видов плотоядных животных.

Таким образом, в результате проведенной работы разработано эффективное и безопасное для человека и целевых животных средство специфической профилактики COVID-19 для плотоядных животных: сорбированная инактивированная вакцина, содержащая в своем составе цельновирионные структуры вируса SARS-CoV-2 в качестве активного вещества и гидроокись алюминия в качестве целевой добавки, в равном количестве 1:1.

Кроме того определены условия хранения разработанного средства ветеринарного применения и разработан способ применения средства для выработки специфического иммунитета против заболевания COVID-19 у плотоядных животных.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Изучение острой токсичности препарата при однократном введении и выявления зависимости от концентрации.

В опыте использовали 30 голов хорьков, 30 голов норок, 30 голов собак, 30 голов кошек и 30 голов белых мышей, из которых были сформированы следующие группы: №1, №2, №3, №4 и №5 (по 5 хорьков в каждой); №6, №7, №8, №9 и №10 (по 5 норок в каждой); №11, №12, №13, №14 и №15 (по 5 собак в каждой); №16, №17, №18, №19 и №20 (по 5 кошек в каждой); №21, №22; №23, №24 и №25 (по 5 мышей в каждой).

Препарат вводили внутримышечно:

группы №1, №6, №11, №16, №21 - рекомендуемую дозу препарата; группы №2, №7, №12, №17, №22 - дозу, превышающую рекомендуемую в 5 раза;

группы №3, №8, №13, №18, №23 - дозу, превышающую рекомендуемую в 10 раз;

группы №4, №9, №14, №19, №24 - дозу, превышающую рекомендуемую в 50 раз.

Животным групп №5, №10, №15, №20 и №25 препарат не вводили, для исключения возможности влияния всех побочных факторов, не связанных с препаратом.

В течение 35 суток, после первичного введения препарата, за животными всех групп вели клиническое наблюдение, отмечая их поведение и состояние, а также проводя ежедневную термометрию.

По окончании срока наблюдения животных подвергли диагностическому убою с последующим патологоанатомическим вскрытием, обращая внимание на возможные изменения в органах и тканях.

Изучение острой токсичности препарата при однократном введении и выявление зависимости от концентрации установило, что препарат в исследуемом диапазоне концентраций не сопровождается местно-раздражающим действием и не вызывает летальных эффектов. Общее состояние, поведение и состояние органов животных всех испытуемых групп носили нормальный характер и не отличались от таковых у животных контрольной группы (табл. 1).

Пример 2. Изучение токсичности препарата при многократном введении.

В опыте было использовано 10 хорьков, из которых сформировали 2 равные группы по 5 голов (группы №1 и №2); 10 норок, из которых сформировали 2 равные группы по 5 голов (группы №3 и №4); 10 собак, из которых сформировали 2 равные группы по 5 голов (группы №5 и №6); 10 кошек, из которых сформировали 2 равные группы по 5 голов (группы №7 и №8); 10 мышей, из которых сформируют 2 равные группы по 5 голов (группы №9 и №10). Животным групп №1, №3, №5, №7 и №9 внутримышечно вводили рекомендуемую дозу препарата (испытуемые группы). Процедуру проводили три раза, через каждые 6 часов, в течение суток. Животные групп №2, №4, №6, №8 и №10 оставались интактными (контрольные группы).

В течение 14 суток, после введения препарата, за животными всех групп вели клиническое наблюдение, отмечая поведение и состояние животных, и проводя ежедневную термометрию.

На 15 сутки после начала опыта животных подвергли диагностическому убою, после которого произвели патологоанатомическое вскрытие, обращая внимание на возможные изменения в органах и тканях.

В ходе исследований по изучению токсических свойств препарата при многократном введении признаков интоксикации у животных испытуемой группы выявлено не было: общее состояние, температура тела, потребление воды и корма и т.д. не отличались от состояния животных контрольных групп. Многократное введение препарата не сопровождалось местно-раздражающим действием и не вызывало осложнений (табл. 2).

Пример 3. Обоснование иммунизирующей дозы вакцины и способа введения.

Опыт по определению иммунизирующей дозы проводили на 35 хорьках, 35 норках, 35 собаках и 35 кошках двухмесячного возраста. Животных разделили на изолированные группы: №1, №2, №3, №4, №5, №6 и №7 (по 5 хорьков в каждой); №8, №9, №10, №11, №12, №13 и №14 (по 5 норок в каждой); №15, №16, №17, №18, №19, №20 и №21 (по 5 собак в каждой); №22, №23, №24, №25, №26, №27 и №28 (по 5 кошек в каждой).

Исследования были проведены следующим образом:

- животным групп №1, №8, №15, №22 вакцину вводили однократно внутримышечно, в дозе 0,5 см³;

- животным групп №2, №9, №16, №23 вакцину вводили внутримышечно в дозе 0,5 см³, двукратно с интервалом 21 сутки;

- животным групп №3, №10, №17, №24 вакцину вводили однократно внутримышечно, в дозе 1,0 см³;

- животным групп №4, №11, №18, №25 вакцину вводили внутримышечно в дозе 1,0 см³, двукратно с интервалом 21 сутки;

- животным групп №5, №12, №19, №26 вакцину вводили однократно внутримышечно, в дозе 2,0 см³;

- животным групп №6, №13, №20, №27 вакцину вводили внутримышечно в дозе 2,0 см³, двукратно с интервалом 21 сутки;

- животные групп №7, №14, №21, №28 не подвергались иммунизации.

В течение всего срока исследования (от 14 до 35 суток, в зависимости от группы) за животными всех групп вели клиническое наблюдение, с ежедневной термометрией.

Через 14 суток после последнего введения испытуемого препарата от всех животных произвели отбор проб сыворотки крови, которые исследовали методом ИФА для определения уровня специфических антител к коронавирусу SARS-CoV-2.

Проведенные исследования проб сыворотки крови показало, что у животных группы №1, №2, №3, №5, №8, №9, №10, №12, №15, №16, №17, №19, №22, №23, №24, №26 средний уровень специфических к коронавирусу SARS-CoV-2 нейтрализующих антител был достоверно ниже аналогичного показателя проб сывороток крови, отобранных от особей других групп №4, №6, №11, №12, №18, №20, №25 и №27 (фиг. 1).

Таким образом, результаты исследований показали, что минимальной иммунизирующей дозой испытуемого препарата является 1 см³ при бустерной вакцинации с интервалом 21 сутки.

Пример 4. Изучение продолжительности иммунитета.

Продолжительность иммунитета проверяли с использованием 13 хорьков, 13 норок, 13 собак и 13 кошек, разделенных на изолированные друг от друга группы: №1 - 10 хорьков, №2 - 3 хорька; №3 - 10 норок, №4 - 3 норки; №5 - 10 собак, №6 - 3 собаки; №7 - 10 кошек, №8 - 3 кошки.

Особи испытуемых групп №1, №3, №5, №7 были иммунизированы двукратного (с интервалом 21 сутки) внутримышечного путем введения 1 см³ испытуемого препарата (предлагаемое изобретение). Животные групп №1, №4, №6 и №8 не подвергались вакцинации.

Отбор проб сыворотки крови от животных всех групп осуществляли через 2, 4 и 6 месяцев после иммунизации особей групп №1, №3, №5, №7. Отобранные пробы исследовали методом ИФА для определения уровня специфических антител к коронавирусу SARS-CoV-2.

Исследование проб сывороток крови показали, что средний уровень специфических к коронавирусу SARS-CoV-2 антител в образцах, отобранных от иммунизированных животных (испытуемые группы) в течение 6 месяцев составлял от 1:200 до 1:800. При этом, в пробах сыворотки крови, отобранных от невакцинированных животных (контрольные группы) специфические к коронавирусу SARS-CoV-2 антитела обнаружены не были (Фиг. 2).

Таким образом, в результате проведенных исследований было доказано, что средство специфической профилактики COVID-19 для плотоядных животных формирует у иммунизированных плотоядных стойкий иммунный ответ против возбудителя коронавирусной инфекции (COVID-19) продолжительностью не менее 6 месяцев.

Пример 5. Изучение стабильности средства при длительном хранении.

Флаконы с разработанным препаратом хранили при температуре от 2 до 8°С в течение 6 месяцев. Контроль показателей качества вакцины осуществляли при закладке на хранение, через 2, 4 и 6 месяцев хранения.

Контроль внешнего вида препарата осуществлялся с помощью визуального осмотра.

При закладке на хранение средство по внешнему виду представляло собой однородную суспензию светло-розового цвета. При хранении выпадал рыхлый осадок, при взбалтывании однородность суспензии восстанавливается.

Контроль стерильности препарата проводили путем высева на питательные среды согласно требованиям ГФ XIV том I, с. 1201-122 ОФС.1.2.4.0003.15 «Стерильность» [15]. Во всех посевах не наблюдалось роста микроорганизмов на питательных средах. Рост микроорганизмов отсутствовал -средство было стерильно.

Контроль безвредности препарата проводили на 10 хорьках. Препарат вводили внутримышечно в область бедра в объеме 2 см (две прививные дозы).

В течение 10 суток после введения все животные оставались клинически здоровыми, без каких-либо патологических изменений. У животных не наблюдалось какой-либо местной реакции на введение препарата. Средство было безвредно.

Контроль антигенных свойств препарата проводили путем иммунизации 5 голов лабораторной модели плотоядных животных (хорьки), с последующим получением от иммунизированных животных проб сыворотки крови. Полученные пробы сыворотки крови исследовались методом ИФА для определения уровня специфических антител к вирусу SARS-CoV-2.

Иммунизацию животных проводили путем двукратного внутримышечного введения разработанного препарата в дозе 1 см. Временной интервал между первым и вторым введением составлял 21 сутки. Отбор проб сыворотки крови осуществляли через 14 суток после второго введения препарата. Полученные пробы исследовали методом ИФА для определения уровня специфических антител к коронавирусу SARS-CoV-2.

Результаты проведенных исследований показали, что предлагаемое изобретение сохранило свои антигенные свойства в течение всего срока хранения.

Таким образом, результаты проведенных исследований показали, что при температуре от 2°С до 8°С разработанное средство специфической профилактики COVID-19 для плотоядных животных стабильно в течение не менее 6 месяцев (табл. 3).

Пример 6. Изучение стабильности средства при вскрытии флакона.

Вскрытые флаконы с разработанным препаратом выдерживали при комнатной температуре в течение 16 часов. Контроль показателей качества вакцины осуществляли при начале опыта, через 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 и 16 часов хранения.

Контроль внешнего вида препарата осуществлялся с помощью визуального осмотра.

При закладке на хранение, через 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 и 16 часов хранения средство специфической профилактики по внешнему виду представляло собой однородную суспензию светло-розового цвета. При хранении выпадал рыхлый осадок, при взбалтывании однородность суспензии восстанавливается.

Контроль стерильности препарата проводили путем высева на питательные среды согласно требованиям ГФ XIV том I, с. 1201-122 ОФС.1.2.4.0003.15 «Стерильность» [15]. Во всех посевах не наблюдалось роста микроорганизмов на питательных средах - средство было стерильно.

Контроль безвредности препарата проводили на 10 хорьках. Препарат вводили внутримышечно в область бедра в объеме 2 см³ (две прививные дозы).

В течение 10 суток после введения все животные оставались клинически здоровыми, без каких-либо патологических изменений. У животных не наблюдалось какой-либо местной реакции на введение препарата. Средство было безвредно.

Контроль антигенных свойств препарата проводили путем иммунизации 5 голов лабораторной модели плотоядных животных (хорьки), с последующим получением от иммунизированных животных проб сыворотки крови. Полученные пробы сыворотки крови исследовались методом ИФА для определения уровня специфических к вирусу SARS-CoV-2 антител.

Иммунизацию животных проводили путем двукратного внутримышечного введения препарата в дозе 1 см³. Временной интервал между первым и вторым введением составлял 21 сутки. Отбор проб сыворотки крови осуществляли через 14 суток после второго введения препарата. Полученные пробы исследовали методом ИФА для определения уровня специфических к коронавирусу SARS-CoV-2 антител.

Результаты проведенных исследований показали, что разработанное средство специфической профилактики COVID-19 для плотоядных животных стабильно в течение 12 часов после вскрытия флакона (табл.4).

Таким образом, поставленная техническая задача, а именно, создание средства специфической профилактики COVID-19 для плотоядных животных, обеспечивающее эффективную индукцию иммунного ответа против вируса SARS-CoV-2, достигнута, что подтверждается приведенными примерами.

Все приведенные примеры подтверждают эффективность фармацевтического средства и его промышленную применимость.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Средство специфической профилактики COVID-19 для плотоядных животных»:

1. Novel Coronavirus - China. (Cited 15 June 2020). [Internet]. Available from: h1xps://www.who.int/csr/don^

2. Report of the WHO-China Joint Mission on Coronavirus Disease 2019 (COVID-19). (Cited 15 June 2020). [Internet]. Available from: https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/who-china-joint-mission-on-covid-19-final-report.pdf.

3. Federal Service for Surveillance in the Sphere of Consumers Rights Protection and Human Welfare. COVID-19 Coronavirus. Information for citizens. (Cited 15 June 2020). [Internet]. Available from: https://www.rospotrebnadzor.ru/about/info/news_time/news_details.php?ELEMENT _ID=13566.

4. Kutyrev V.V., Popova A.Yu., Smolensky V.Yu., Ezhlova E.B., Demina Y.V., Safronov V.A., Karnaukhov I.G., Ivanova A.V., Shcherbakova S.A. Epidemiological Features of New Coronavirus Infection (COVID-19). Communication 1: Modes of Implementation of Preventive and Anti-Epidemic Measures. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections], 2020; (1):6-13. DOI: 10.21055/0370-1069-2020-1-6-13.

5. Zhongwei Huang, Jianping Huang, Qianqing Gu, Pengyue Du, Hongbin Liang, Qing Dong Optimal temperature zone for the dispersal of COVID-19. (Cited 15 June 2020). [Internet]. Available from: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0048969720330047.

6. de Lusignan S., Dorward J., Correa A., Jones N., Akinyemi O., Amirthalingam G., Andrews N., Byford R., Dabrera G., Elliot A., Ellis J., Ferreira F., Bernal J.L., Okusi C., Ramsay M., Sherlock J., Smith G., Williams J., Howsam G., Zambon M., Joy M., Hobbs R. Risk factors for SARS-CoV-2 among patients in the Oxford Royal College of General Practitioners Research and Surveillance Centre primary care network: a cross-sectional study. (Cited 15 June 2020). [Internet], Available from: https://www.thelancet.com/journals/laninf/article/PIIS 1473-3099(20)30371-6/fulltext.

7. Coelho M.T.P., Rodrigues J.F.M., Medina A.M., Scalco P., Terribile L.C., Bruno Vilela В., Diniz-Filho J.A.F., Dobrovolski R. Exponential phase of covidl9 expansion is driven by airport connections. (Cited 15 June 2020). [Internet]. Available from: https://www.medrxiv.Org/content/10.l 101/2020.04.02.20050773v2.

8. Zou J., Bretin A., Gewirtz A. Antibodies to SARS/CoV-2 in arbitrarily-selected Atlanta residents. (Cited 15 June 2020). [Internet]. Available from: https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.05.01.20087478vl.

9. Работа на опережение // Ветеринария и жизнь. - 2021. - №5. - С. 4-5.

10. ВОЗ предупредила о риске передачи коронавируса от норки к человеку / И.А. Чвала // Ветеринария и жизнь. - 2020. - №12. - С. 8.

11. Zhou Р, Yang XL, Wang XG, et al. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature. 2020;579(7798):270-273. doi: 10.103 8/s41586-020-2012-7).

12. Патент US 7452542B2, «Живые аттенуированные вакцины против коронавируса», от 21.05.2004 г.

13. Патент CN 202011195131. «Рекомбинантной вакцины против нового коронавируса» («Recombinant novel coronavirus vaccine composition))) от 20201030.

14. Патент CN 202011127475. Нуклеиновая кислота для кодирования спайкового белка вируса SARS-CoV-2 и применение нуклеиновой кислоты («Nucleic acid for encoding SARS-CoV-2 virus spike protein and application of nucleic acid») от 20201020.

15. ОФС.1.2.4.0003.15 «Стерильность», ГФ XIV том I, с. 1201-122.

1. Средство специфической профилактики COVID-19 для плотоядных животных, содержащее активное вещество и целевую добавку, отличающееся тем, что в качестве активного вещества она содержит инактивированный антигенный материал из штамма «вариант В» вируса SARS-CoV-2 коронавирусной инфекции, предпочтительно репродуцированного в культуре клеток Vero С1008 и депонированного в коллекции штаммов ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России под регистрационным номером: 1199 - ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России, и целевую добавку: 3%-ный гель гидроокиси алюминия, взятые в объемном соотношении, %: 50,0÷50,0 соответственно и в количествах, обеспечивающих протективную иммунногенную активность антигена в организме плотоядных животных после введения им целевого препарата.

2. Средство по п. 1, отличающееся тем, что оно содержит смесь из инактивированного и очищенного антигенного материала из штамма «вариант В» вируса SARS-CoV-2 коронавирусной инфекции и целевой добавки: адъювант гидроокиси алюминия в равном количестве, об. %:

Антигенный материал из штамма «вариант В»
вируса SARS-CoV-2 коронавирусной инфекции	50,0
Адъювант 3%-ный гель гидроокиси алюминия	50,0

3. Средство по п. 1, отличающееся тем, что препарат имеет однокомпонентный состав.