Способ выведения солеустойчивого сорта риса

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу выведения солеустойчивого сорта риса. Способ выведения солеустойчивого сорта риса включает в себя следующие этапы: А) подбирают родительские формы с геном солеустойчивости и с высокой урожайностью, скрещивают их для получения гибридов; Б) анализируют гибриды со второго F₂ до шестого поколения F₆ на наличие гена Saltol методом ПЦР-анализа, оставляют доминантные гомозиготы и гетерозиготы; В) все гибридные формы, начиная с гибридов второго поколения F₂ и заканчивая гибридами шестого поколения F₆, подвергают строгому фенотипическому, генотипическому и лабораторному отбору под воздействием стресса с учетом хозяйственно-ценных признаков; отбирают лучшие линии для репродуцирования следующего поколения; Г) все гибриды каждый год изучают на солеустойчивость лабораторным способом: в рулонах из фильтровальной бумаги и полиэтилена, в 1,5% солевом растворе NaCl; отбирают лучшие образцы с солеустойчивостью свыше 70%; Д) в гибридах четвертого поколения F₄ изучают солеустойчивость семян гибридов риса от посева до созревания в условиях микрочеков, которые представляют собой наполненную почвой ёмкость размером 300 × 100 см, изолированную полиэтиленовой плёнкой от протекания для сохранения стабильных жестких условий – 1,5% концентрации соли в почве; после созревания проводят биометрический анализ растений, отбирают все выжившие гибриды для репродуцирования следующего поколения в обычных рисовых чеках; Ж) все семена гибридных форм пятого поколения F₅ после фенотипического и генотипического отборов с помощью ПЦР-анализа проходят отбор на 1,5% засолении NaCl рулонным способом, самые лучшие проростки с солеустойчивостью выше 50% и в которых присутствует искомый ген солеустойчивости переносят в стаканчики с почвой и в виде рассады пересаживают в рисовые чеки; З) для отбора устойчивых к засолению форм риса в период цветения и созревания семян гибриды шестого поколения F₆ извлекают из рисовых чеков в период трубкования и помещают в ящики с фиксированной концентрацией NaCl 1%, при этом растения шестого поколения F₆, сформировавшие максимальное количество зёрен в таких стрессовых условиях, как солевой шок перед цветением, являются самыми устойчивыми к солевому стрессу в период цветения и созревания семян; И) гибриды шестого поколения F₆ формируют максимально чистые линии, готовые к размножению и испытанию в контрольном питомнике и конкурсном сортоиспытании, а также дальнейшему государственному сортоиспытанию. Изобретение позволяет повысить урожайность риса при его возделывании на засоленных почвах и при орошении водой с массовой долей солей до 1,5%. 6 ил.

 

Заявляемое изобретение относится к новым способам выращивания растений, а именно к способу выведения солеустойчивого сорта риса.

Техническим результатом заявляемого изобретения является повышение урожайности риса при его возделывании на засоленных почвах и при орошении водой с массовой долей солей до 1,5%.

За счет скрещивания сортов риса разного экологического происхождения, относящихся к разным подвидам, происходит объединение генов, контролирующих признаки высокой солеустойчивости и урожайности.

Солеустойчивый рис может расти на засоленных почвах, таким образом, решается проблема возделывания риса на малопригодных землях. Урожайность повышается за счет устойчивости риса к неблагоприятным условиям, в том числе к наличию высокой концентрации соли в воде для полива.

На данный момент известны следующие способы, наиболее схожие с заявляемым:

1. Метод быстрого размножения солеустойчивых сортов риса по патенту CN103262788. Данное изобретение относится к способу быстрого размножения солеустойчивого сорта риса и относится к технической области селекции растений. Способ быстрого размножения включает следующие стадии: гибридизацию сортов и проведение ускоренного размножения гибридов; проведение идентификации на стадии проращивания семян в поколении F₁ и выявление солеустойчивых зародышей в условиях лаборатории и прибрежной засоленной почвы с концентрацией солевого раствора 0,4-0,5% для скрининга отдельных растений риса. Растения с урожайностью и качеством выше, чем у Yancheng 156, пересаживаются отдельно в естественных условиях. Далее происходит выборочное традиционное размножение нового толерантного к засолению сорта риса индика с солеустойчивостью 0,4-0,5%, высокой урожайностью и хорошим качеством риса, названного солеустойчивым рисом 3931. Отличается от заявленного способа тем, что использует только генетический метод - для уже выведенных сортов, в то время как заявленный способ нацелен на первоначальное выведение солеустойчивых сортов риса.

2. Применение гена OsPIL13 в повышении солеустойчивости риса по патенту CN105002212. Изобретение раскрывает применение гена OsPIL13 для улучшения устойчивости риса к солевому стрессу. Специфический фрагмент гена OsPIL13 сорта риса Nipponbare принимается в качестве последовательности нуклеотидов, которая переносится в рис, уровень экспрессии гена OsPIL13 понижается, а солеустойчивость повышается. В условиях солевого стресса (200 мМ NaCl) выживаемость контрольных проростков риса составляет около 11,0%, а трансгенных - 71-90%. Новые генные ресурсы представляются как возможность выращивания солеустойчивых сортов сельскохозяйственных культур с высокой устойчивостью к данному стрессору, а также предоставляется поддержка для изучения солеустойчивости у других видов зерновых культур. Данный способ отличается от заявляемого тем, что использует метод редактирования генов, требующий использования дорогостоящего оборудования, которое не доступно большинству научных центров и сельских хозяйств при массовом выведения сортов риса.

3. Метод селекции для направленной и эффективной селекции солеустойчивых сортов риса по патенту CN109207509. Настоящее изобретение относится к способу направленной и эффективной селекции сортов риса с высокой солеустойчивостью и гетерозисом. Способ основан на методике редактирования гена CRISPR/Cas9 в сочетании с методами повышения гетерозиса. Метод включает выбор конкретной последовательности-мишени в соответствии с последовательностью экзонов риса OsRR22, одновременное редактирование родителей гибридного риса, создание мутантных линий со значительно улучшенной солеустойчивостью в качестве превосходных солеустойчивых родителей, а затем проведение теста на скрещивание и селекцию новых гибридных сортов риса с высокой солеустойчивостью и сильным гетерозисом. Отличается от заявляемого способа тем, что использует более низкую концентрацию соли 0,5%, что не позволяет отобрать наиболее устойчивые к солевому стрессу образцы и повысить урожайность, а также использует дорогостоящий метод редактирования генов.

Осуществление заявляемого способа выведения солеустойчивого сорта риса иллюстрируется следующими фигурами:

фиг. 1 Закладка семян риса на солеустойчивость рулонным способом;

фиг. 2 Сравнение проростков риса в соленой и дистиллированной воде для анализа солеустойчивости;

фиг. 3 Образцы микрочеков с размеченными рядками риса;

фиг. 4 Изучение солеустойчивости риса в условиях микрочеков (контрольный/опытный образец);

фиг. 5 Отбор лучших проростков риса на соленом фоне в стаканчики с целью дальнейшей пересадки в чеки в виде рассады;

фиг. 6 Изучение солеустойчивости риса в период трубкования;

Суть заявляемого способа состоит в следующем: сначала подбирают родительские формы с геном солеустойчивости и высокой урожайностью, далее их скрещивают и из каждой гибридной комбинации все линии пересевают из года в год, подвергая массовым отборам: фенотипическим, генотипическим, лабораторным под воздействием стресса. Каждая линия из первоначальной комбинации изучается 7-8 лет, пока не выделится лучшая по хозяйственно-ценным и генотипическим признакам, с урожайностью выше стандартного сорта. Такая линия имеет право называться солеустойчивым сортом риса.

Скрещивают родительские формы: Российский высокоурожайный скороспелый сорт и Зарубежный сорт с геном солеустойчивости Saltol. Используют минимум три сорта донора солеустойчивости. Гибридизацию проводят твел-методом в тепличных условиях. Гибриды первого поколения F₁ выращивают в поле.

Гибриды второго поколения F₂ анализируют на наличие гена Saltol методом ПЦР-анализа. При проведении маркерного анализа используют 2 пары маркеров, сцепленных с локусом солеустойчивости: RM493 и RM7075.

Амплификацию проводят в термоциклере PalmCyclerCorbettResearch. ПЦР продукты разделяют с помощью электрофореза в 2% агарозном геле с бромистым этидием.

Для дальнейшей работы оставляют доминантные гомозиготы и гетерозиготы, рецессивные гомозиготы выбраковывают, поскольку они не несут искомого гена. Все гибридные формы, начиная с гибридов второго поколения F₂ и заканчивая гибридами шестого поколения F₆, подвергают строгому фенотипическому отбору с учетом хозяйственно-ценных признаков.

Параллельно каждый год все гибриды изучают на солеустойчивость лабораторным способом - в рулонах из фильтровальной бумаги и полиэтилена 1, в 1,5% солевом растворе NaCl. На контроле семена проращивают в дистиллированной воде. Все растения выращивают в термостате при температуре 25°С, влажности 70%. Через 10 дней определяют всхожесть, измеряют длину и массу проростков риса, рассчитывают процент солеустойчивости 2.

Солеустойчивость определяют как соотношение длины ростков и корешков риса на солевом растворе к таковым показателям на дистиллированной воде, выраженное в процентах. Для отбора лучших форм риса опираются не только на относительные величины, но и на абсолютные. Отбирают лучшие образцы с солеустойчивостью свыше 70%.

Таким образом, изучают гибриды третьего поколения F₃ и четвертого поколения F₄. В гибридах четвертого поколения F₄ ключевым моментом является изучение солеустойчивости семян гибридов риса от посева до созревания в условиях микрочеков 3. Гибриды риса высевают в почву микрочеков. Микрочеки представляют собой наполненную почвой емкость размером 300×100 см, изолированную полиэтиленовой пленкой от протекания для сохранения стабильных жестких условий - 1,5% концентрации соли в почве микрочека.

Схема опыта включает в себя: контроль - вода без засоления, опыт - засоление 0,5% раствором NaCl. Полив производится водопроводной водой до фиксированного уровня 10 см. Повторность двухкратная, в микрочеке размещают по 25 рядов с 50 семенами риса в каждом ряду.

После созревания проводят биометрический анализ растений по следующим признакам: высота растения, масса снопа с делянки, кустистость, длина метелки, масса метелки, количество выполненных зерен, количество пустых колосков, общее число колосков, фертильность.

Отбирают все выжившие гибриды и пересевают для репродуцирования следующего поколения в обычных рисовых чеках. Лучшие по общему индексу солеустойчивости гибриды риса отбирают в селекционный питомник в качестве кандидатов в будущие солеустойчивые сорта.

Все семена гибридных форм пятого поколения F₅ после фенотипического отбора проходят генотипический отбор с помощью ПЦР-анализа. Параллельно все гибриды пятого поколения F₅ закладывают в рулоны фильтрованной бумаги для проращивания в 1,5% растворе NaCl, контроль - дистиллированная вода во всех случаях. На 10-й день проращивания отбирают линии риса с максимальной длиной ростков более 7 см и длины корешков более 10 см, а также имеющие искомый ген солеустойчивости. Их помещают в стаканчики 4 с почвой и удобрением нитроаммофоска, а именно 2 гранулы на 300-граммовый стакан с почвой, для восстановления, при этом поливают дистиллированной водой. Через неделю укрепившуюся рассаду высаживают вручную в чеки, разрезая пластиковый стакан по одному краю и вставляя образец с почвой в чек квадратно-гнездовым способом.

Гибриды шестого поколения F₆ высевают на размножение в селекционном питомнике. Выборочно, лучшие по признаку солеустойчивости линии риса извлекают из чеков в период трубкования и помещают в ящики 5 размером 100 × 50 × 50 см с полиэтиленовой пленкой на дне для защиты от протекания, в качестве контроля для полива используют обычную водопроводную воду.

Схема опыта аналогична схеме с использованием микрочеков: контроль - без засоления, опыт - засоление 1,0% раствором NaCl. Полив производят водопроводной водой до фиксированного уровня 10 см. Повторность двухкратная, в каждом ящике размещают по 50 кустов - по 3-4 растения в каждом, согласно схеме 5×10.

После созревания проводят биометрический анализ растений по следующим признакам: высота растения, длина метелки, масса метелки, количество выполненных зерен, количество пустых колосков, общее число колосков, фертильность, масса 1000 зерен. Рассчитывают соотношение опыт/контроль (О/К) по каждому признаку и выводят средний процент солеустойчивости.

Растения, формирующие максимальное количество зерен в таких стрессовых условиях как солевой шок перед цветением, являются самыми устойчивыми к солевому стрессу во время цветения и созревания.

В гибридах шестого поколения F₆ уже сформировано достаточно семян для размножения, и лучшие линии передают в контрольный питомник, где изучают их урожайность. После этого гибриды седьмого поколения F₇ определяют в контрольный питомник второго года и далее в конкурсное сортоиспытание для определения лучших линий по урожайности. Гибриды восьмого поколения F₈ передают в конкурсное сортоиспытание и далее на государственное сортоиспытание.

Способ выведения солеустойчивого сорта риса, включающий в себя следующие этапы:

А) подбирают родительские формы с геном солеустойчивости и с высокой урожайностью, скрещивают их для получения гибридов;

Б) анализируют гибриды со второго F₂ до шестого поколения F₆ на наличие гена Saltol методом ПЦР-анализа, оставляют доминантные гомозиготы и гетерозиготы;

В) все гибридные формы, начиная с гибридов второго поколения F₂ и заканчивая гибридами шестого поколения F₆, подвергают строгому фенотипическому, генотипическому и лабораторному отбору под воздействием стресса с учетом хозяйственно-ценных признаков; отбирают лучшие линии для репродуцирования следующего поколения;

Г) все гибриды каждый год изучают на солеустойчивость лабораторным способом: в рулонах из фильтровальной бумаги и полиэтилена, в 1,5% солевом растворе NaCl; отбирают лучшие образцы с солеустойчивостью свыше 70%;

Д) в гибридах четвертого поколения F₄ изучают солеустойчивость семян гибридов риса от посева до созревания в условиях микрочеков, которые представляют собой наполненную почвой ёмкость размером 300 × 100 см, изолированную полиэтиленовой плёнкой от протекания для сохранения стабильных жестких условий – 1,5% концентрации соли в почве; после созревания проводят биометрический анализ растений, отбирают все выжившие гибриды для репродуцирования следующего поколения в обычных рисовых чеках;

Ж) все семена гибридных форм пятого поколения F₅ после фенотипического и генотипического отборов с помощью ПЦР-анализа проходят отбор на 1,5% засолении NaCl рулонным способом, самые лучшие проростки с солеустойчивостью выше 50% и в которых присутствует искомый ген солеустойчивости переносят в стаканчики с почвой и в виде рассады пересаживают в рисовые чеки;

З) для отбора устойчивых к засолению форм риса в период цветения и созревания семян гибриды шестого поколения F₆ извлекают из рисовых чеков в период трубкования и помещают в ящики с фиксированной концентрацией NaCl 1%, при этом растения шестого поколения F₆, сформировавшие максимальное количество зёрен в таких стрессовых условиях, как солевой шок перед цветением, являются самыми устойчивыми к солевому стрессу в период цветения и созревания семян;

И) гибриды шестого поколения F₆ формируют максимально чистые линии, готовые к размножению и испытанию в контрольном питомнике и конкурсном сортоиспытании, а также дальнейшему государственному сортоиспытанию.