Простой способ изоляции протопластов пшеницы для редактирования генома

Изобретение относится к области сельскохозяйственной биотехнологии, в частности к методам культивирования in vitro соматических клеток и геномного редактирования высших растений. Изобретение представляет собой новый способ изоляции протопластов пшеницы для редактирования генома. Данный метод включает эффективную изоляцию протопластов пшеницы из 7-10-ти дневных побегов. Эффективность изоляции достигается за счет низкотемпературной обработки растений-доноров и вакуум-инфильтрации охлажденного ферментного раствора. Во время измельчения побегов и перед обработкой ферментами ткани листьев выдерживаются на осмотической среде, для снижения повреждения клеток во время механического воздействия на клетки ткани. Трансфекция протопластов может осуществляться широким перечнем генетических конструкций. Данная система трансфекции и визуализации протопластов может быть использована с различными маркерными системами отбора, в том числе отбор с репортерными генами. Изобретение может быть использовано для сравнительной оценки эффективности редактирования генома пшеницы различными генно-инженерными конструкциями путем трансфекции протопластов с эффективностью до 40,5%. 1 ил., 1 табл.

 

Область техники. Изобретение относится к области сельскохозяйственной биотехнологии, в частности к методам культивирования in vitro соматических клеток и геномного редактирования высших растений, для сравнительной оценки эффективности редактирования генома пшеницы различными генно-инженерными конструкциями. Изобретение может быть использовано в создании новых устойчивых сортов и гибридов пшеницы и востребовано семеноводческими компаниями и селекционными станциями, научно-образовательными учреждениями биотехнологического и сельскохозяйственного профиля.

Актуальность изобретения. Редактирование генома является одним из наиболее перспективных направлений современной молекулярной биологии и биотехнологии. Недавно разработанная система CRISPR/Cas9 представляет собой универсальный инструмент геномного редактирования, позволяющий вносить точечные изменения в заданные участки эукариотического генома для повышения устойчивости растений к болезням и абиотическим стрессам, улучшения качества зерна, увеличения уровня микроэлементов и витаминов в растении и многое другое (Doudna J. А, 2014). Применение технологии CRISPR/Cas9 на растениях со сложным полиплоидным геномом требует высокой эффективности функционирования всех ее компонентов и является существенным барьером для большинства видов однодольных, в том числе кукурузы, риса, овса, ячменя, и, в частности пшеницы. Эта задача может быть решена путем создания нескольких вариантов генетических конструкций, различающихся между собой определенными параметрами, и сравнительной оценки их эффективности. Наиболее удобным способом оценки эффективности генетических конструкций для редактирования генома является трансфекция протопластов, поскольку они лишены клеточной стенки и могут быть легко трансфецированны плазмидной ДНК. Оценка эффективности редактирования осуществляется посредством выделения тотальной ДНК из суспензии протопластов и таргетного секвенирования участка генома, содержащего сайт редактирования. При этом успешность методики в значительной степени определяется эффективностью трансфекции протопластов. Но в связи с тем, что полиплоидный геномом и повышенное содержание внутриклеточных липооксигеназ пшеницы снижает выход протопластов и специфичность редактирования генома, задача создания эффективной и простой методики выделения протопластов пшеницы отечественной селекции для редактирования генома весьма актуальна.

Уровень техники. Исследование протопласта растений началось в 1960-х годах, когда британский ботаник Cocking (Cocking, 1960) использовал фермент, разрушающий клеточную стенку, для экстракции протопласта апикальной части томата из корней и плодов ферментативным путем и культивирования их в контролируемых условиях. Это открытие явилось основой для развития таких важнейших направлений биотехнологии растений, как клеточная и генная инженерия. С тех пор исследования протопластов находились на стадии бурного развития. Например, Nagata и Takeble впервые сообщили о выделенных, культивируемых и регенерированных растениях мезофилла табака, полученных в 1970 году (Nagata, Takebe, 1970). Известен способ получения протопластов злаковых растений, выбранных из группы, состоящей из Dactylis glomerata Патент US 5596131 A 1997 г "Regeneration of graminaceous plants of the subfamily pooideae from protoplasts". Основным недостатком данного способа, как, впрочем, и большинства других известных методик, является то, что он разработан для модельных сортов мелких зерновых злаков зарубежной селекции и неэффективен для продуктивных сортов отечественной селекции, районированных на территории РФ. В другом случае Патент US 5981842 A 1995 г "Production of water stress or salt stress tolerant transgenic cereal plants", где ген белка LEA, HVA1, из ячменя (Hordeum vulgare L.) был трансформирован в растения риса (Oryza sativa L.) при использовании протопластов риса и не эффективен на растениях пшеницы. Наиболее близким к данному изобретению является способ получения и трансфекции протопластов описанный в Патент US 4684611 1983 г "Process for the in-vitro transformation of plant protoplasts with plasmid DNA", где инкубация проводится в присутствии полиэтиленгликоля и ионов кальция.

Карлсон в 1972 году использовал технологию слияния протопластов для получения первых межвидовых гибридов табака (Liu, Deng, 1999). Из-за отсутствия клеточной стенки растительные протопласты широко используются для генетической трансформации, что приводит к требованию большого количества высокоактивных протопластов. Первое сообщение о прямом переносе генов в протопластах пшеницы было сделано Lorz в 1985 году (Schreier P. Н. et al., 1985) из культивируемых клеток Triticum топососсит путем опосредованной PEG-трансфекции. Трансформированные клетки отбирали на среде, содержащей канамицин, и идентифицировали путем определения активности npt II. Тем не менее, эти работы привели к низкой эффективности трансформации, порядка 0,005%, и низкой способности к регенерации, затрудняющей работу с протопластами как с эксплантатами (Davey, et al., 2005, Peng, et al., 2015). Введение плазмиды E. coli, pCGN1055, содержащей ген hpt, в протопласты пшеницы путем катионной липосом-опосредованной трансформации в 1993 году привело к образованию трансгенных проростков альбиносов.

Присутствие и активность трансгенов были подтверждены анализом ферментативной активности и гибридизации по Саузерну (Southern, et al. 1975), а эффективность трансформации составила порядка 6%.

После открытия системы CRISPR/Cas9 было проведено несколько исследований по редактированию генома растений как у однодольных, так и у двудольных, таких как Nicotiana benthamiana (Li et al. 2015), Nicotiana tobaccum (Gao et al. 2014), Arabidopsis thaliana (Li et al. al. 2014), Oryza sativa (Shan et al. 2014) и Sorghum bicolor (Jiang et al. 2013) и было выяснено что полиплоидный геномом снижает специфичность редактирования генома (Peng et al. 2015, Wang et al., 2016, Liang et al., 2018). Следовательно, необходимо оптимизировать условия выделения и трансфекции протопластов для максимального числа интактных клеток. Кроме того, оптимальные условия для получения протопластов растительных клеток индивидуальны для различных видов и сортов растений, и каждом отдельном случае необходима предварительная работа по подбору состава ферментов, их концентраций и времени обработки осмотического стабилизатора.

Таким образом, задача создания эффективной методики выделения протопластов пшеницы для редактирования генома, пригодной для широкого круга генотипов отечественной селекции, сохраняет свою актуальность.

Кроме того, могут возникнуть дополнительные сложности по разработке такой методики в связи с тем, что, большинство разработанных методик осуществлены на модельных сортах с меньшей вероятностью разрыва мембран в результате сниженного действия внутриклеточных липооксигеназ с использованием дорогостоящих антиоксидантов (глутатион, трипсин или дитиотрийэтол) и требуют дополнительных экспериментальных доработок для внедрения полученных результатов в производство. Это обусловило необходимость перехода от работы с модельными генотипами к использованию продуктивных коммерческих сортов.

Недавно нами было показано положительное влияние низкотемпературной обработки растений пшеницы перед манипуляциями с зародышами и повышением их морфогенетического потенциала (Гапоненко и др., 2018 №2646108). В нашем способе был впервые использована низкотемпературная обработка для повышения целостности протопластов пшеницы отечественных сортов при выделении протопластов и их дальнейшей трансфекции с использованием вакуум-инфильтрации.

С учетом всего вышеописанного при разработке настоящего изобретения ставилась задача создания эффективного и простого способа получения протопластов пшеницы для редактирования генома, пригодного для широкого круга перспективных в коммерческом отношении отечественных яровых сортов. Ожидаемым техническим результатом было повышение эффективности и унификация процедуры выделения протопластов для эффективной доставки генетического инструментария редактирования генома.

Раскрытие изобретения

Настоящее изобретение представляет собой разработанный эффективный и простой способ изоляции протопластов пшеницы для редактирования генома, который может быть использован для широкого круга генотипов отечественной селекции.

Эффективный выход протопластов данный способ обеспечивает, если в качестве доноров мезофилла используются 7-10 дневные проростки, полученные от растений-доноров после холодового шока. Проростки пшеницы должны быть выращены в асептических условиях, возникновение контаминации снижает выход целостных протопластов. Непосредственно перед выделением за 48 ч необходимо поместить проростки в холодильную камеру в темноту при+4 С для снижения воздействия внутриклеточных липооксигеназ и пероксидаз, приводящие к нарушению целостности мембран клеток. Для высокого выхода протопластов пучок побегов (30 шт.) разрезают на сегменты вместе при помощи станка с лезвиями в осмотическом растворе толщиной 0,5 мм. Конструкция станка позволяет быстро и равномерно разрезать побеги, не сдавливая ткани. Используется только средняя часть - от начала гипокотиля до середины побега. После нарезанные сегменты необходимо немедленно перенести в 0,6 М раствор осмотика на 10 мин в темноту для сохранения осмотического давления. Чаще всего в качестве осмотиков используются сахара (глюкоза, сахароза, ксилоза, сорбит, маннитол), иногда растворы солей CaCl2, Na2HPO4, KCI в концентрациях 0,3-0,8 М. Для выделения протопластов использовали ферментативный раствор (целлюлаза и мацерозим) с применением вакуума. Предполагалось, что вакуумная инфильтрация помогает проникать раствору ферментов в растительную ткань и даже в межклеточные пространства. После энзиматической обработки суспензия протопластов должна быть очищена от остатков неразрушенной ткани и осколков клеток, а также отмыта от ферментов для трансфекции протопластов при редактировании генома пшеницы в зависимости от поставленной задачи в способе по изобретению могут использоваться различные генетические конструкции. Например, для создания растений, устойчивых к мучнистой росе, может быть проведено редактировании генома при помощи генетических конструкций CRISPR/Cas9 приводящих к инактивации гена MLO (ведущая к невосприимчивости к плесени).

Представленная система получения интактных протопластов пшеницы занимает от 10-ти до 15-ти дней с момента высева семян. Концентрация интактных протопластов до 7×10⁶ мл^-1, что в 1,5-2 раза выше, чем методы, используемых в настоящее время в других лабораториях. Частота трансфекции протопластов с использованием генетической конструкции, кодирующей зеленый флюоресцирующий белок GFP составила 40%.

Данное изобретение относится к способу получения протопластов растений пшеницы, включающему следующие стадии:

1) Подбор или создание генетического инструментария (генно-инженерных конструкций);

2) Подготовку исходного материала;

3) Низкотемпературную обработку растений-доноров;

4) Изоляцию протопластов

5) Осмотическую обработку сегментов побегов;

6) Изоляцию протопластов в растворе ферментов и воздействие вакуума;

7) ПЭГ-опосредованная трансфекция протопластов;

8) Пролиферацию и детекцию трансформированных клеток;

Методика была использована на яровых сортах мягкой пшеницы отечественной селекции - Злата, Амир, Агата, Любава. Выход интактных протопластов был высоким и составил от 5×10⁵ мл^-1 до 7×10⁶ мл. Эффективность трансфекции оказалась высокой для всех исследуемых сортов, независимо от генотипа составила до от 32 до 40,5%. Данный показатель свидетельствует о высокой эффективности предлагаемого способа..

Краткое описание рисунков

Рисунок - Этапы выделения протопластов из проростков пшеницы и трансфекция.

Осуществление изобретения

Использование здоровых растений-доноров является необходимым условием для получения протопластов. Растения должны быть в условиях искусственного климата, в асептических условиях. Помимо обязательного предохранения растений от таких заболеваний как мучнистая роса, карликовая ржавчина, корневые гнили и т.д., должны быть созданы оптимальные условия вегетации - качественное освещение и питательная среда.

Изоляция протопластов с использованием станка несколькими лезвиями в осмотическом растворе или при помощи острых бритв (должна осуществляться быстро и аккуратно).

Для создания вакуума была использована пушка для биобаллистики - PIG (particle inflow gun), но может быть использована и другая камера для создания давления ниже атмосферного. При энзиматической обработки суспензия протопластов находится на шейкере-инкубаторе ES 20 BioSan, но можно использовать и другой шейкер с контролируемыми условиями.

Для детекции трансфецированных трансгенных клеток можно воспользоваться различными репортерными генами (GFP, DsRed, X-gal и др.). Концентрацию клеток определяют с использованием гематоцитометра или под микроскопом (×100). В примерах приведенных ниже был использован плазмидный вектор pUBarGFP, несущий кассету экспрессии гена bar под контролем промотора Ubil-гена кукурузы и Tnos терминатора гена нопалинсинтазы и ген gfp, кодирующий зеленый флуоресцентный белок.

Методика:

1) Подбор или создание генетического инструментария (генно-инженерных конструкций):

Был использован плазмидный вектор pUBarGFP, несущий ген gfp, кодирующий зеленый флуоресцентный белок, так как экспрессия проявляется в появлении зеленого свечения при освещении синим светом и ее легко обнаружить.

2) Подготовка исходного материала:

Очищенные семена пшеницы стерилизуют с помощью 75% этанола в течение 1 мин. Эти семена далее стерилизуют 2,5% гипохлоридом натрия, в течение 20 мин, затем промывают пять раз стерильной водой.

Семена инкубируют на среде с 1/2 MS ((Murashige Т. & Skoog F. 1962)) с фотопериодом 12 (16) ч света/темноты при 26°С в течение 7-10 дней. Зеленые проростки в количестве 60 штук используются далее.

3) Низкотемпературная обработка растений-доноров:

Пробирки с растениями помещают в холодильную камеру при 4±2°С на 48 ч.

4) Изоляция протопластов:

Пучок побегов (30 штук) разрезают вместе, используется только средняя часть - от начала гипокотиля до середины побега. Далее побеги разрезают на полоски шириной 0,5 мм при помощи станка с лезвиями в осмотическом растворе в небольшом количестве 0,6 М маннитола +4°С - рекомендуется нарезать вдоль и поперек побега.

5) Осмотическая обработка сегментов побегов:

Сегменты листьев немедленно переносят в охлажденный до +4°С 0,6 М раствор маннитола на 30 мин для быстрого плазмолиза. После плазмолиза ткани листа фильтруют через нейлоновые сетки.

6) Изоляцию протопластов в растворе ферментов и воздействие вакуума; Сегменты листьев переносят в коническую колбу емкостью 150 мл, содержащую 50

мл стерилизованного фильтром раствора фермента (1,5% целлюлазы RS, 0,75% мацерозим R-10, 0,6 М маннитол, 10 мМ MES при рН 5,7, 10 мМ CaCl2 и 0,1% BSA), основанном на протоколе Shan Q. с соавторами (Shan Q. et al., 2014) и охлажденного до +4°С. Далее вакуум-инфильтрируют сегменты листьев ферментами путем применения вакуума (~ 380-508 мм рт.ст.) в течение 30 мин. в темноте или сразу оборачивают колбу алюминиевой фольгой. Затем инкубируют полоски в темноте в течение 4-6 ч при осторожном смешивании (60-80 об/мин) при пониженной до +4 С температуре.

После ферментативного расщепления добавляют 50 мл раствора В5 (154 MMNaCl, 125 мМ CaCl2,5 мМ КСl и 2 мМ MES при рН 5,7), основанном на протоколе Shan Q. с соавторами (Shan Q. et al., 2014) в коническую колбу и затем осторожно встряхивают его вручную в течение 10 секунд для выхода протопластов. Фильтруют смесь через 40 мкм нейлоновые сетки и промывают полоски листьев на поверхности нейлоновой сетки 3-5 раз с помощью раствора В5.

Отмытые протопласты собирают в три или четыре круглодончатые центрифужные пробирки объемом 30-50 мл, и центрифугируют при 80g в течение 3 мин при комнатной температуре, и удаляют супернатант с помощью пипетки. Протопласты очень хрупкие, поэтому необходима аккуратность.

После центрифугирования протопласты повторно аккуратно суспендируют в 10 мл раствора В5, собирают их в одну круглодонную пробирку объемом 50 мл и держат их на льду в течение 30 мин. Интактные протопласты должны оседать на дно пробирки под действием силы тяжести через 30 мин. После удаляют только супернатант, непосредственно без центрифугирования с помощью пипетки Ресуспендируют протопласты в 4 мл раствора кальция и магния (0,4 М маннит, 15 мМ MgCl2 и 4 мМ MES при рН 5,7) при конечной концентрации 2,5 × 106 клеток на мл. Определяют концентрацию протопластов под микроскопом (×100) или с помощью гемоцитометра.

7) ПЭГ-опосредованная трансфекция протопластов:

Для трансфекции пшеницы добавляют 40 мкг плазмиды в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл, а затем добавляют 200 мкл протопластов (5×105 клеток) и осторожно смешивают их, постукивая по пробирке или слегка пипетируя.). Температура растворов должна быть +4 градуса.

После плазмиды добавляют свежеприготовленный раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ) (40%, PEG 4000, 0,2 М маннитол и 0,1 М CaCl2) и тщательно перемешивают, осторожно постукивая по пробирке или слегка пипетируя.

Затем инкубируют смесь в течение 15-20 мин в темноте, обязательно оборачивают пробирки в алюминиевую фольгу. Добавляют 880 мкл раствора В5 в пробирку и хорошо перемешивают, инвертируя чтобы остановить процесс трансформации. Протопласты пшеницы центрифугируют при 80 g в течение 3 мин и удаляют супернатант. Повторно суспендируют протопласты в 2 мл раствора В5.

8) Пролиферацию и детекцию трансформированных клеток:

Переносят протопласты в 6-луночные планшеты, оборачивают планшеты в алюминиевую фольгу и инкубируют их при 23°С не менее 48 часов (максимум 72 ч).

Проверяют состояние протопластов под микроскопом, здоровые клетки должны казаться полными и круглыми. Эффективность трансфекции можно узнать, подсчитав количество флуоресцирующих клеток GFP.

Далее приведены конкретные примеры осуществления изобретения, которые не могут рассматриваться как ограничивающие его объем.

Пример 1. Получение трансфецированных протопластнов яровой пшеницы сорта Злата, содержащих ген gfp.

Очищенные семена пшеницы сорта Злата в количестве 50 штук стерилизовали 75% этанолом в течение 1 мин. Эти семена далее стерилизовали 2,5% гипохлоридом натрия, в течение 20 мин, затем промывали пять раз стерильной водой. Семена инкубировали на среде с 1/2 MS с фотопериодом 12 (16) ч света/темноты при 26°С в течение 9 дней. Зеленые проростки в пробирках колличестве 30 штук помещали в холодильную камеру при 4±2°С на 48 ч. После холодового шока побеги разрезали вдоль и поперек побега на полоски шириной 0,5 мм при помощи станка с лезвиями в осмотическом растворе в небольшом количестве охлажденного до +4°С 0,6 М маннитола. Сегменты листьев немедленно переносили в охлажденного до +4°С 0,6 М раствор маннитола на 30 мин для быстрого плазмолиза. После плазмолиза ткани листа фильтровали через нейлоновые сетки и переносили в коническую колбу емкостью 150 мл, содержащую 50 мл стерилизованного фильтром раствора фермента, охлажденного до +4°С. Сегменты листьев сорта Злата подвергали вакуум-инфильтрации (~ 500 мм рт.ст.) в течение 30 мин. в темноте при +4°С, и сразу оборачивали колбу алюминиевой фольгой. Затем инкубировали полоски в темноте в течение 5 ч при осторожном смешивании (80 об/мин) при +4°С. Затем добавляли 50 мл раствора В 5 в коническую колбу и встряхивали его вручную в течение 10 секунд для выхода протопластов. Фильтровали смесь через 40 мкм нейлоновые сетки и 3 раза с помощью раствора В5. Потом отмытые протопласты собирали в три круглодончатые центрифужные пробирки объемом 30 мл, и центрифугировали при 80g в течение 3 мин при комнатной температуре, удаляли супернатант с помощью пипетки. Затем повторно суспендировали в 10 мл раствора В5, собирали их в одну кругл о донную пробирку объемом 50 мл и держали их на льду в течение 30 мин. Интактные протопласты осаждались на дно пробирки под действием силы тяжести через 25 мин. После 30 минут удаляли супернатант. Ресуспендировали протопласты в 4 мл раствора кальция и магния. Определили концентрацию протопластов с помощью гемоцитометра - 7×10⁶. Приготовили раствор ПЭГ за 3 ч до трансфекции. Протопласты довели до нужной концентрации 5×10⁵ клеток. Для трансфекции пшеницы добавили 40 мкг плазмиды в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл, а затем добавили 200 мкл протопластов. После плазмиды добавляли раствор полиэтиленгликоля. Все растворы для трансфекции были температурой +4С. Затем инкубировали смесь в течение 20 мин в темноте в алюминиевой фольге. Добавляли 880 мкл раствора В5 в пробирку перемешивали инвертируя. Протопласты пшеницы Злата центрифугировали при 80 g в течение 3 мин и удаляли супернатант. Повторно суспендировали протопласты в 2 мл раствора В5. Эффективность трансфекции составила 40,5%.

Пример 2. Получение трансфецированных протопластнов яровой пшеницы сорта Агата, содержащих ген gfp.

Семена пшеницы сорта Агата в количестве 70 штук стерилизовали этанолом в течение 1 мин, далее стерилизовали 2,5% гипохлоридом натрия, в течение 20 мин, затем промывали пять раз стерильной водой. Семена сорта Агата инкубировали на среде с 1/2 MS с фотопериодом 12 (16) ч света/темноты при 26°С в течение 7 дней. Зеленые проростки в пробирках количестве 33 штук помещали в холодильную камеру при 4±2°С на 48 ч. После холодового шока побеги разрезали вдоль и поперек побега на полоски шириной 0,5 мм при помощи станка с лезвиями в осмотическом растворе в небольшом количестве охлажденного до +4°С 0,6 М маннитола. Сегменты листьев немедленно переносили в 0,6 М раствор маннитола на 30 мин для быстрого плазмолиза. После плазмолиза ткани листа фильтровали через нейлоновые сетки и переносили в коническую колбу емкостью 150 мл, содержащую 50 мл стерилизованного фильтром раствора фермента. Сегменты листьев подвергали вакуум-инфильтрации (~450 мм рт.ст.) в течение 30 мин и затем инкубировали полоски в темноте в течение 5 ч при осторожном смешивании (60 об/мин) +4°С. Затем добавляли 50 мл раствора В5 в коническую колбу и встряхивали его вручную в течение 10. Фильтровали смесь через 40 мкм нейлоновые сетки и 4 раза раствором В5. Потом отмытые протопласты собирали в три круглодончатые центрифужные пробирки объемом 50 мл, и центрифугировали при 80g в течение 3 мин при комнатной температуре, удаляли супернатант с помощью пипетки. Затем суспендировали в 10 мл раствора В5, собирали их в одну круглодонную пробирку объемом 50 мл и держали их на льду в течение 30 мин. Интактные протопласты осаждались на дно пробирки под действием силы тяжести через 30 мин. После 30 минут удаляли супернатант. Ресуспендировали протопласты в 4 мл раствора кальция и магния Определили концентрацию протопластов с помощью гемоцитометра - 6,6×10⁵. Приготовили раствор ПЭГ за 5 ч до трансфекции. Протопласты довели до концентрации 5×10⁵ клеток. Для трансфекции пшеницы добавили 40 мкг плазмиды в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл, а затем добавили 200 мкл протопластов. После плазмиды добавляли раствор полиэтиленгликоля. Затем инкубировали смесь в течение 15 мин в темноте в алюминиевой фольге. Добавляли 880 мкл раствора В5 в пробирку перемешивали инвертируя. Протопласты пшеницы Агата центрифугировали при 80 g в течение 3 мин и удаляли супернатант. Повторно суспендировали протопласты в 2 мл раствора В5. Эффективность трансфекции составила 36%.

Пример 3. Получение трансфецированных протопластнов яровой пшеницы сорта Амир, содержащих ген gfp.

Семена пшеницы сорта Амир в колличестве 45 штук стерилизовали этанолом в течение 1 мин, далее стерилизовали 2,5% гипохлоридом натрия, в течение 20 мин, затем промывали пять раз стерильной водой. Семена сорта Амир инкубировали на среде с 1/2 MS с фотопериодом 12 (16) ч света/темноты при 26°С в течение 7 дней. Зеленые проростки в пробирках количестве 30 штук помещали в холодильную камеру при 4±2°С на 48 ч. После холодового шока побеги разрезали вдоль и поперек побега на полоски шириной 0,5 мм в 30 мл охлажденного до +4°С 0,6 М маннитола. Сегменты листьев немедленно переносили в 100 мл 0,6 М раствор маннитола на 30 мин для быстрого плазмолиза. После плазмолиза ткани листа фильтровали через нейлоновые сетки и переносили в коническую колбу емкостью 150 мл, содержащую 50 мл стерилизованного фильтром раствора фермента. Сегменты листьев подвергали вакуум-инфильтрации (~ 400 мм рт.ст.) в течение 30 мин и затем инкубировали полоски в темноте в течение 5 ч при осторожном смешивании (80 об/мин) при +4°С. Затем добавляли 50 мл раствора В5 в коническую колбу и встряхивали его вручную в течение 10. Фильтровали смесь через 40 мкм нейлоновые сетки и 3 раза раствором В5. Потом отмытые протопласты собирали в четыре круглодончатые центрифужные пробирки объемом 50 мл, и центрифугировали при 80g в течение 3 мин при комнатной температуре, удаляли супернатант с помощью пипетки. Затем суспендировали в 10 мл раствора В5, собирали их в одну круглодонную пробирку объемом 50 мл и держали их на льду в течение 30 мин. Интактные протопласты осаждались на дно пробирки под действием силы тяжести через 30 мин. После 30 минут удаляли супернатант. Ресуспендировали протопласты в 4 мл раствора кальция и магния. Определили концентрацию протопластов с помощью гемоцитометра - 6,2×10⁶. Приготовили раствор ПЭГ за 4 ч до трансфекции. Протопласты довели до концентрации 5×10⁵ клеток. Для трансфекции пшеницы добавили 40 мкг плазмиды в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл, а затем добавили 200 мкл протопластов. После плазмиды добавляли раствор полиэтиленгликоля. Затем инкубировали смесь в течение 15 мин в темноте в алюминиевой фольге. Добавляли 880 мкл раствора В5 в пробирку перемешивали инвертируя. Протопласты пшеницы Агата центрифугировали при 80 g в течение 3 мин и удаляли супернатант. Повторно суспендировали протопласты в 2 мл раствора В5. Эффективность трансфекции составила 34%.

Пример 4. Получение трансфецированных протопластнов яровой пшеницы сорта Любава, содержащих ген gfp.

Семенной материал пшеницы сорта Любава в количестве 80 штук стерилизовали этанолом в течение 1 мин, далее стерилизовали 2,5% гипохлоридом натрия, в течение 20 мин, затем промывали шесть раз стерильной водой. Семена инкубировали на среде с 1/2 MS с фотопериодом 12 (16) ч света/темноты при 26°С в течение 8 дней. Зеленые проростки в пробирках количестве 34 штук помещали в холодильную камеру при 4±2°С на 48 ч. После холодового шока побеги разрезали вдоль и поперек побега на полоски шириной 0,5 мм в 20 мл 0,6 М маннитола +4°С. Сегменты листьев немедленно переносили в 100 мл 0,6 М раствор маннитола на 30 мин для быстрого плазмолиза при температуре +4°С. После плазмолиза ткани листа фильтровали через нейлоновые сетки и переносили в коническую колбу емкостью 150 мл, содержащую 50 мл стерилизованного фильтром раствора фермента. Сегменты листьев подвергали вакуум-инфильтрации (~ 380 мм рт.ст.) в течение 30 мин и затем инкубировали полоски в темноте в течение 5 ч при осторожном смешивании (70 об/мин) при температуре +4°С. Затем добавляли 50 мл раствора В5 в коническую колбу и встряхивали его вручную в течение 10. Фильтровали смесь через 40 мкм нейлоновые сетки и 5 раз раствором В5. Потом отмытые протопласты собирали в четыре круглодончатые центрифужные пробирки объемом 50 мл, и центрифугировали при 80g в течение 3 мин при комнатной температуре, удаляли супернатант с помощью пипетки. Затем суспендировали в 10 мл раствора В5, собирали их в одну кругл о донную пробирку объемом 50 мл и держали их на льду в течение 30 мин. Интактные протопласты осаждались на дно пробирки под действием силы тяжести через 20 мин. После 30 минут удаляли супернатант. Ресуспендировали протопласты в 4 мл раствора кальция и магния. Концентрация протопластов определялась с помощью гемоцитометра - 5×10⁵. Приготовили раствор ПЭГ за 4,5 ч до трансфекции. Для трансфекции пшеницы добавили 40 мкг плазмиды в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл, а затем добавили 200 мкл протопластов. После плазмиды добавляли раствор полиэтиленгликоля. Затем инкубировали смесь в течение 20 мин в темноте в алюминиевой фольге. Добавляли 880 мкл раствора В5 в пробирку перемешивали инвертируя. Протопласты центрифугировали при 80 g в течение 3 мин и удаляли супернатант. Повторно суспендировали протопласты в 2 мл раствора В5. Эффективность трансфекции протопластов Любава составила 32%.

Список литературы

1. Cocking Е. С., Gregory D. W. Organized Protoplasmic Units of the Plant Cell: I. Their Occurrence, Origin, and Structure // Journal of Experimental Botany. - 1963. - T. 14. - №. 3. - C. 504-511.

2. Doudna J. A., Charpentier E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9 // Science. - 2014. - T. 346. - №. 6213. - C. 1258096.

3. Guo Y. et al. CRISPR inversion of CTCF sites alters genome topology and enhancer/promoter function // Cell. - 2015. - T. 162. - №. 4. - C. 900-910.

4. Horn M. E., Harms С.Т., Shillito R. D. Regeneration of graminaceous plants of the subfamily pooideae from protoplasts: пат. 5596131 США. - 1997.

5. Li W. et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knockout screens // Genome biology. - 2014. - T. 15. - №. 12. - C. 554.

6. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiologia plantarum. - 1962. - T. 15. - №. 3. - C. 473-497.

7. Nagata Т., Takebe I. Cell wall regeneration and cell division in isolated tobacco mesophyll protoplasts // Planta. - 1970. - T. 92. - №. 4. - С. 301-308.

8. Peng D., Tarleton R. EuPaGDT: a web tool tailored to design CRISPR guide RNAs for eukaryotic pathogens // Microbial genomics. - 2015. - Т. 1. - №. 4.

9. Sander J. D., Joung J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes // Nature biotechnology - 2014. - Vol. 32, No. 4, P. 347.

10. Schilperoort R. A., Krens F. A., Wullems G. J. Process for the in-vitro transformation of plant protoplasts with plasmid DNA: пат. 4684611 США. - 1987.

11. Schreier P. H. et al. The use of nuclear-encoded sequences to direct the light-regulated synthesis and transport of a foreign protein into plant chloroplasts // The EMBO Journal. - 1985. - Т. 4. - №. 1. - C. 25-32.

12. Shan Q. et al. Genome editing in rice and wheat using the CRISPR/Cas system // Nature protocols. - 2014. - T. 9. - №. 10. - C. 2395-2410.

13. Shan Q. et al. Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system // Nature biotechnology - 2013. - Vol. 31, No. 8, P. 686.

14. Southern E. M. et al. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis III mol biol. - 1975. - T. 98. -№. 3. - C. 503-517.

15. Wu R. J., Но Т. H. D. Production of water stress or salt stress tolerant transgenic cereal plants: пат.5981842 США. - 1999.

16. Yang X. et al. Angiogenesis defects and mesenchymal apoptosis in mice lacking SMAD5 //Development. - 1999. - T. 126. - №. 8. - C. 1571-1580.

17. Zhu X. et al. An efficient genotyping method for genome-modified animals and human cells generated with CRISPR/Cas9 system //Scientific reports. - 2014. - T. 4. - №. 1. - C. 1-8.

18. Гапоненко A.K., Я.В. Мишуткина, А.А. Тимошенко, О.А. Шульга, Н.А. Спеченкова, Патент РФ №2646108 РФ на изобретение «Способ получения трансгенных растений пшеницы с использованием биобаллистики». 07 декабря 2016 г.»

Способ изоляции протопластов пшеницы для редактирования генома, включающий в себя холодовой шок растений-доноров, измельчение побегов от гипокотиля до середины листа и изоляцию протопластов в осмотическом растворе, вакуум-инфильтрацию сегментов листьев в ферментном растворе при пониженной температуре, фильтрацию и промывку раствором солей, отбор целостных протопластов при помощи центрифугирования и осаждение протопластов на льду под действием силы центра тяжести, ПЭГ-опосредованную трансфекцию протопластов, и отличающийся тем, что для побегов растений мягкой яровой пшеницы используют холодовой шок в пробирках на 7-9 день после посева при температуре +4°С в течение 48 часов, изоляцию протопластов во время измельчения побегов проводят в охлажденном осмотическом растворе до +4°С, вакуум-инфильтрируют сегменты листьев в течение 30 минут в ферментном растворе при температуре +4°С.