Способ получения органной культуры тканей цилиарного тела из донорского глаза человека

Изобретение относится к клеточной биологии и медицине, в частности к офтальмологии и трансплантологии, и представляет собой способ получения органной культуры цилиарного тела (ОКЦТ) из донорского глаза человека. Для осуществления способа сначала разрезают донорский глаз по экватору, затем удаляют хрусталик и разделяют переднюю половину глаза на 4 квадранта, содержащие радужную оболочку, цилиарное тело, роговицу и соответствующую часть склеры. При этом перед разделением глаза на квадрант отсепаровывают часть склеры в 1-2 мм от зубчатой линии. А после разделения полученные образцы культивируют при температуре 37°С, 5% содержании СО² и влажности 100% среды следующего состава на 40 мл: 38,4 мл DMEM/F12, 0,8 мл эмбриональной телячьей сыворотки, 0,4 мл GlutaMAX-I, 0,4 мл раствора антибиотика-антимикотика, включающего 10000 МЕ/мл пенициллина, 10000 мкг/мл стрептомицина, 25 мкг/мл амфотерицина. Настоящее изобретение позволяет получать ОКЦТ из донорского глаза человека, содержащую неповрежденную, жизнеспособную ткань цилиарного тела с сохранением прижизненных функций для повышения достоверности результатов при моделировании эксперимента для исследований in vitro. 1 ил., 2 пр.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии и трансплантологии, а также к области биологии, а именно клеточной биологии, и может быть использовано для получения органной культуры цилиарного тела (ОКЦТ), как экспериментальной модели для исследований in vitro.

Цилиарное тело (ЦТ) является частью увеального тракта, которая расположена между хориоидеей и радужкой. ЦТ имеет сложное неоднородное строение, представляет собой треугольник, основание которого примыкает к супрасклеральному пространству, а вершина обращена в заднюю камеру глаза.

В ЦТ выделяю две основные части: отростчатую и плоскую. Отростчатая часть (pars plicata) состоит из волокон цилиарной мышцы (ЦМ), стромы и сосудов цилиарных отростков (ЦО). Плоская часть (pars plana) ЦТ прилегает непосредственно к зубчатой линией, продолжаясь в заднюю часть сосудистого тракта - хориоидею. Вся поверхность ЦТ изнутри выстлана цилиарных эпителием, состоящим из двух слоев: пигментного и беспигментного.

Ранее были успешно разработаны культуры органов цилиарного тела, которые остаются жизнеспособными не менее двух недель (Eichhorn М., Inada K., Lütjen-Drecoll Е. Human ciliary body in organ culture // Current Eye Research. - 1991. - №10(4). - P. 277-286). Эпителий цилиарного тела в органных культурах сохранял морфологические характеристики ткани, участвующей в активной секреции. Изолированные первичные цилиарные эпителиальные клетки преимущественно из слоя беспигментного эпителия могут сохраняться в культуре в течение длительных периодов времени и оставаться метаболически активными (Runyan Т.Е., McCombs W.B. 3rd, Holton O.D., McCoy С.Е., Morgan M.P. Human ciliary body epithelium in culture // Invest Ophthalmol Vis Sci. - 1983. - №24. - P. 687-696; Shahidullah M, Tamiya S., Delamere N.A. Primary culture of porcine nonpigmented ciliary epithelium. // Curr Eye Res. - №32. - P. 511-522).

Ближайшим аналогом является способ получения органной культуры цилиарного тела, описанный в статье Eichhorn М., Inada K., Lütjen-Drecoll Е. Human ciliary body in organ culture // Current Eye Research. - 1991. - №10(4). - P. 277-286. Согласно статье, органную культуру цилиарного тела получают следующим способом: глаз был разрезан по экватору, хрусталик удален путем разрезания связок с помощью микроножниц. Затем переднюю половину глаза разрезали на 4 квадранта. Далее каждый из квадрантов был разделен на небольшие клиновидные сектора шириной от 2 до 3 мм, содержащие радужную оболочку, цилиарное тело до зубчатой линии, роговицу и соответствующую часть склеры. Все образцы культивировали в модифицированной среде Eagle компании Dul-becco (DMEM) с добавлением 1,0% фетальной телячьей сыворотки (FCS), 1,0 Ед/мл пенициллина и 1,0 мг/мл стрептомицина (все Gibco/BRL, FRG) при температуре 37°С, 7% содержании CO2.

Данный способ имеет ряд недостатков. Отсепаровывание тканей ЦТ непосредственно по зубчатой линии повышает риск повреждения плоской части ЦТ, наиболее близко расположенной к границе отделения тканей.

Отсутствие в питательной среде DMEM ряда аминокислот, таких как L-аланин, L-аспаргин, L-аспаргиновая кислота, L-цистеин, L-глутаминовая кислота, а также биотина, витамина В12, микроэлементов Na2HPO4, CuSO4×5H2O, FeSO4×7H2O, ZnSO4×7H2O, гипоксантина, тимидина, в значительной степени обедняет состав среды, что не позволяет в должной степени приблизить ее по составу к биологическим тканям.

Отсутствие в культивируемой жидкости стабилизатора, который минимизирует накопление токсичного аммиака, снижает степень адаптации, стабилизации и жизнеспособности культивируемых клеток.

Отсутствие антимикотического препарата в питательной среде повышает риск вероятной грибковой контаминации, что может привести к негодности такой среды и образцов.

Задачей изобретения является создание способа органной культуры тканей цилиарного тела из донорского глаза человека с наименьшей вероятностью повреждения плоской части ЦТ в питательной среде с достаточным содержанием аминокислот и микроэлементов, с повышенной антимикотической активностью и клеточной стабильностью.

Техническим результатом изобретения является получение ОКЦТ из донорского глаза человека, содержащей неповрежденную, жизнеспособную ткань цилиарного тела с сохранением прижизненных функций, что позволит повысить достоверность результатов при моделировании эксперимента.

Технический результат достигается тем, что в способе получения ОКЦТ из донорского глаза человека, включающем разрез донорского глаза по экватору, удаление хрусталика и разделение передней половины глаза на 4 квадранта, содержащие радужную оболочку, цилиарное тело, роговицу и соответствующую часть склеры и культивирование полученных образцов, согласно изобретению, перед разделением глаза на квадранты отсепаровывают часть склеры в 1-2 мм от зубчатой линии, а культивирование проводят при температуре 37°С, 5% содержании СО² и влажности 100% среды следующего состава на 40 мл: 38,4 мл DMEM/F12, 0,8 мл эмбриональной телячьей сыворотки, 0,4 мл GlutaMAX-I, 0,4 мл раствора антибиотика-антимикотика, включающего 10000 МЕ/мл пенициллина, 10000 мкг/мл стрептомицина, 25 мкг/мл амфотерицина.

Отсепаровывание части склеры в 1-2 мм от зубчатой линии предупреждает повреждение плоской части ЦТ. Рассечение полученного образца на 4 части позволяет увеличить количество исследуемых единиц в эксперименте, что повышает достоверность результатов. Культивирование ОКЦТ в обогащенной среде, обладающей антимикотической и стабилизирующей активностью, позволяет повысить жизнеспособность и сохранность полученных тканей.

На рис. 1 изображена схема получения ОКЦТ. Позицией 1 обозначена отростчатая часть цилиарного тела, 2 - плоская часть цилиарного тела с отступом 1-2 мм, 3 - прилежащая склера, 4 - часть роговицы, 5 - часть радужной оболочки.

Способ осуществляется следующим образом: донорский глаз фиксируют в специальном держателе глазного яблока с достижением достаточного тонуса, близкого к тонусу глаза живого человека. Производят скарификацию эпителия с поверхности роговицы и полностью иссекают ткань конъюнктивы. Далее при помощи лезвия микротома глазное яблоко разделяют пополам вдоль экватора во фронтальной плоскости. При помощи универсального офтальмохирургического склерального пинцета и офтальмохирургических ножниц из передней половины глаза эвакуируют стекловидное тело и хрусталик. Затем микротомом от передней половины глаза отсепаровывают часть склеры в 1-2 мм от края зубчатой линии. Полученный образец укладывают роговичной стороной вниз и рассекают меридионально на 4 равные части относительно центра роговицы. Получается образец, включающий неповрежденную ткань ЦТ (отростчатая и плоская части) с прилегающими частями склеры, сетчатки, радужки и роговицы. Затем образцы цилиарного тела помещают в раствор культуральной среды следующего состава на 40 мл: 38,4 мл DMEM/F12, 0,8 мл эмбриональной телячьей сыворотки, 0,4 мл GlutaMAX-I, 0,4 мл раствора антибиотика-антимикотика, включающего 10000 МЕ/мл пенициллина, 10000 мкг/мл стрептомицина, 25 мкг/мл амфотерицина и культивируют при температуре 37°С, 5% содержании СО² и влажности 100%.

Полученная таким образом ОКЦТ может быть использована для проведения экспериментальных исследований in vitro.

Способ поясняется примерами.

Пример 1. Глазное яблоко донора-трупа мужчины, 50 лет, фиксировали в специальном держателе глазного яблока с достижением достаточного тонуса, близкого к тонусу глаза живого человека. Производили скарификацию эпителия с поверхности роговицы и полностью иссекали ткань конъюнктивы. Далее при помощи лезвия микротома глазное яблоко разделяли пополам вдоль экватора во фронтальной плоскости. При помощи универсального офтальмохирургического склерального пинцета и офтальмохирургических ножниц из передней половины глаза эвакуировали стекловидное тело и хрусталик. Затем микротомом от передней половины глаза отсепаровывали часть склеры в 1 мм от зубчатой линии. Полученный образец укладывали роговичной стороной вниз и рассекали меридионально на 4 равные части относительно центра роговицы. Таким образом получали образец, включающий неповрежденную ткань ЦТ (отростчатая и плоская части) с прилегающими частями склеры, сетчатки, радужки и роговицы. Затем образцы цилиарного тела помещали в раствор культуральной среды следующего состава на 40 мл: 38,4 мл DMEM/F12, 0,8 мл эмбриональной телячьей сыворотки, 0,4 мл GlutaMAX-I, 0,4 мл раствора антибиотика-антимикотика, включающего 10000 МЕ/мл пенициллина, 10000 мкг/мл стрептомицина, 25 мкг/мл амфотерицина, и культивировали при температуре 37°С, 5% содержании СО² и влажности 100%.

Пример 2. Глазное яблоко донора-трупа женщины, 67 лет, фиксировали в специальном держателе глазного яблока с достижением достаточного тонуса, близкого к тонусу глаза живого человека. Производили скарификацию эпителия с поверхности роговицы и полностью иссекали ткань конъюнктивы. Далее при помощи лезвия микротома глазное яблоко разделяли пополам вдоль экватора во фронтальной плоскости. При помощи универсального офтальмохирургического склерального пинцета и офтальмохирургических ножниц из передней половины глаза эвакуировали стекловидное тело и хрусталик. Затем микротомом от передней половины глаза отсепаровывали часть склеры в 2 мм от зубчатой линии. Полученный образец укладывали роговичной стороной вниз и рассекали меридионально на 4 равные части относительно центра роговицы. Таким образом получали образец, включающий неповрежденную ткань ЦТ (отростчатая и плоская части) с прилегающими частями склеры, сетчатки, радужки и роговицы. Затем образцы цилиарного тела помещали в раствор культуральной среды следующего состава на 40 мл: 38,4 мл DMEM/F12, 0,8 мл эмбриональной телячьей сыворотки, 0,4 мл GlutaMAX-I, 0,4 мл раствора антибиотика-антимикотика, включающего 10000 МЕ/мл пенициллина, 10000 мкг/мл стрептомицина, 25 мкг/мл амфотерицина, и культивировали при температуре 37°С, 5% содержании СО² и влажности 100%.

Способ получения органной культуры тканей цилиарного тела из донорского глаза человека, включающий разрез донорского глаза по экватору, удаление хрусталика и разделение передней половины глаза на 4 квадранта, содержащие радужную оболочку, цилиарное тело, роговицу и соответствующую часть склеры, и культивирование полученных образцов, отличающийся тем, что перед разделением глаза на квадранты отсепаровывают часть склеры в 1-2 мм от зубчатой линии, а культивирование проводят при температуре 37°С, 5% содержании СО² и влажности 100% среды следующего состава на 40 мл: 38,4 мл DMEM/F12, 0,8 мл эмбриональной телячьей сыворотки, 0,4 мл GlutaMAX-I, 0,4 мл раствора антибиотика-антимикотика, включающего 10000 МЕ/мл пенициллина, 10000 мкг/мл стрептомицина, 25 мкг/мл амфотерицина.