Устройство для непрерывного многопараметрического мониторинга физико-химических характеристик биологических суспензий

Изобретение относится к области аналитической химии, а именно к области средств определения состояния энергетики, концентраций растворенного кислорода, свободного кальция, мембранного потенциала на мембранах органелл и клеток, и их осмотического объема и прочих параметров в водных суспензиях биологических объектов, и может быть использовано в различных областях медико-биологических исследований. Устройство для непрерывного многопараметрического мониторинга физико-химических характеристик биологических суспензий характеризуется тем, что содержит корпус, в котором расположены ячейка с, по меньшей мере, шестью измерительными каналами, позволяющими на основе измеряемых на основе оптических характеристик определять параметры биологических суспензий, причем один из каналов предназначен для измерения кислорода, источник питания, магнитная мешалка, расположенная в ячейке, нагреватель анализируемого вещества и датчик температуры, расположенные в ячейке, электронная плата управления, пять источников оптического излучения, установленные в измерительных каналах и пять регистраторов оптического излучения, также установленных в измерительных каналах, причем регистраторы оптического излучения подключены к входам блока усилителей и аналого-цифровых преобразователей, выход которого подключен к входу регистрирующего прибора, при этом, по меньшей мере, сенсор кислорода представляет собой сборку, содержащую, по меньшей мере, один Y-образный волоконный жгут со составным сердечником, составленный из двух физически перемешанных пучков волокон, предназначенных для разделения оптических путей возбуждения и регистрации оптического сигнала, причем против торца первого пучка волокон Y-образного волоконного жгута последовательно размещены излучатель возбуждающего излучения и светофильтр, а против торца второго пучка волокон Y-образного волоконного жгута последовательно размещены светофильтр и фотоприемник, а напротив общего торца волоконного жгута расположено приспособление для размещения анализируемого образца, а источник питания подключен ко всем электропотребляющим элементам устройства. Техническим результатом является увеличение числа характеристик, получаемых одновременно с одной пробы, сокращение времени анализа. 5 з.п. ф-лы, 1 табл.

 

Изобретение относится к области приборов/устройств для одновременного и непрерывного измерения концентрации растворенного кислорода, ионов кальция, мембранного потенциала, редокс состояния у NADH/FAD, и светорассеяния и других параметров в водных растворах и суспензиях биологических объектов.

Известен (RU, патент 2225437, опубл. 10.03.2004) аппарат, содержащий термостатируемую ячейку, внутри которой выполнена кювета в виде шестигранной призмы, снабженная пробкой с отверстием для внесения проб и реагентов, датчик потребления кислорода и электронный модуль для передачи сигналов с датчика на компьютер. Термостатируемая ячейка также снабжена датчиками, позволяющими регистрировать дополнительно мембранный потенциал, концентрацию ионов кальция и набухание. Датчики имеют форму усеченного конуса и расположены горизонтально в отверстиях стенки ячейки перпендикулярно граням шестигранной кюветы.

В известном аппарате затруднена возможность многопараметрического мониторинга концентраций нескольких ионов при использовании стандартных датчиков. Известно взаимное влияние стандартных датчиков, которые генерируют большие токи (кислородный электрод) на работу высокоомных потенциометрических датчиков (Н⁺, К⁺, ТРР⁺, Са²⁺), которое препятствует мониторингу разных характеристик суспензии в одном объеме.

Известна (RU, патент 198125, опубл. 19.06.2020) ячейка для непрерывного многопараметрического мониторинга физико-химических характеристик биологических суспензий, содержащая термостатируемый рабочий объем с суспензией, магнит для перемешивания суспензии, первый канал с установленным датчиком для измерения уровня кислорода и каналы для мониторинга других параметров суспензии, причем в ячейке, изготовленной из биологически инертного материала, выполнены второй, третий, четвертый и пятый каналы, в которых установлены оптические волоконные жгуты, с возможностью доставки света возбуждения в суспензию, и сбора света флуоресценции из ячейки для регистрации 5 параметров суспензии - концентрации растворенного кислорода, и свободных ионов Н⁺, К⁺, Са²⁺ и редокс характеристики (NADH, FAD), где регистрацию изменения этих параметров биологического объекта во времени (кинетику), осуществляют путем последовательного поэтапного включения источника света, подключенного к соответствующему волоконному жгуту, размещенному во втором, третьем, четвертом и пятом каналах ячейки, и синхронизированного во времени включения устройства для соответствующего сбора света флуоресценции и передачи его к детектору, где волоконные жгуты содержат равномерно распределенные волокна для возбуждения и волокна для сбора флуоресценции, которые образуют гексагональную конфигурацию распределения волокон внутри каждого держателя жгута, выполненного с возможностью крепления держателя в канале ячейки.

Недостатком известной ячейки следует признать использование электрохимического способа измерения концентрации кислорода, который требует периодического обслуживания, потребляет кислород в процессе измерения и может значительно искажать его концентрацию при работе в ячейке небольшого объема.

Техническая проблема, решаемая использованием разработанного устройства, состоит в расширении ассортимента средств проведения одновременной и непрерывной регистрации оптических характеристик суспензии микроорганизмов в водной среден устранении недостатков имеющихся средств измерений.

Технический результат, достигаемый при реализации устройства разработанной конструкции состоит в повышения точности измерений, а также получении экспериментальных данных в медико-биологических исследованиях.

Для достижения указанного технического результата предложено использовать устройство для непрерывного многопараметрического мониторинга физико-химических характеристик биологических суспензий, разработанной конструкции. Оно содержит корпус, в котором расположены ячейка с, по меньшей мере, шестью измерительными каналами, позволяющими на основе оптических и температурных характеристик определять параметры биологических суспензий, причем один из каналов предназначен для измерения кислорода, источник питания, магнитную мешалку, расположенную в ячейке, нагреватель анализируемого вещества и датчик температуры, расположенные в ячейке, электронную плату управления, по меньше мере, пять источников оптического излучения, установленные в измерительных каналах и, по меньшей мере, пять регистраторов оптического излучения, также установленных в измерительных каналах, причем регистраторы оптического излучения подключены ко входам блока усилителей и аналого-цифровых преобразователей, выходы которых подключены к входу регистрирующего прибора, при этом, по меньшей мере, сенсор кислорода представляет собой сборку, содержащую, по меньшей мере, один Y-образный оптоволоконный жгут со составным сердечником, составленный из, по меньшей мере, двух физически перемешанных пучков оптических волокон, предназначенных для разделения оптических путей возбуждения и регистрации оптического сигнала, причем против торца первого пучка волокон Y-образного оптоволоконного жгута последовательно размещены излучатель возбуждающего излучения и светофильтр, а против торца второго пучка волокон Y-образного оптоволоконного жгута последовательно размещены светофильтр и фотоприемник, а напротив общего торца оптоволоконного жгута расположено приспособление для размещения сменного элемента с нанесенным слоем материала чувствительного к кислороду, а источник питания подключен ко всем электропотребляющим элементам устройства.

Разработанное устройство использует известные измерительные средства и подходы для обеспечения проведения одновременной и непрерывной регистрации 6-ти оптических характеристик суспензии клеток или выделенных митохондрий в водной среде инкубации, их хранения и анализа. Оптические характеристики, регистрируемые прибором, в некоторых вариантах реализации отражают уровень и кинетику изменения следующих параметров суспензии:

1. Состояние эндогенного NADH, соединения отражающего энергетику клетки

2. Концентрация растворенного кислорода

3. Состояние эндогенного FAD, соединения отражающего энергетику клетки

4. Концентрация свободного кальция

5. Величина мембранного потенциала

6. Осмотический объем биологических объектов

Разработанное устройство состоит из:

а) ячейки, в которой создан измерительный объем, который снабжен крышкой, обеспечивающей герметичную изоляцию содержания измерительного объема от окружающего воздуха, и снабженную отверстием(ями)для внесения реактивов, отбора проб и манипуляций с биологической суспензией.

б) корпуса обеспечивающего/предназначенного для монтажа источника питания, электронной платы управления независимыми световыми потоками (возбуждения и флуоресценции/фосфоресценции) по каждому из измерительных каналов, механических монтажных элементов, обеспечивающих крепление и монтаж измерительной ячейки со световодами, монтаж нагревателя и механической магнитной мешалки.

в) источника питания от сети 220 В, обеспечивающего электрическим питанием электронную плату управления устройством, магнитную мешалку и нагревательные элементы.

Далее приведены основные принципы работы разработанного прибора и краткое описание тех функций, которыми он обладает.

Канал # 1 (NADH)

Измерение уровня и кинетики (изменения во времени) уровня флуоресценции NADH в растворах и суспензиях биологических объектов (клетках, дрожжах, митохондриях) от 0 до 100%.

Канал # 2 (Кислород, O₂)

Измерение уровня и кинетики (изменения во времени) уровня фосфоресценции от сенсора, чувствительного к концентрации растворенного кислорода в растворах и суспензиях биологических объектов (клетках, дрожжах, митохондриях) в пределах от 0 до 100% насыщения.

Канал # 3 (FAD)

Измерение уровня и кинетики (изменения во времени) уровня флуоресценции FAD в растворах и суспензиях биологических объектов (клетках, дрожжах, митохондриях) от 0 до 100%.

Канал # 4 (Кальций, Са²⁺)

Измерение уровня и кинетики (изменения во времени) уровня флуоресценции флуоресцентного красителя с Са²⁺ -зависимой флуоресценцией (Fluo-5N), для определения концентрации свободных ионов Са²⁺ в растворах и суспензиях биологических объектов (клетках, дрожжах, митохондриях) в диапазоне от 0.0 до 1000 μМ.

Канал # 5 (мембранный потенциал, TMRM, SafraninO)

Измерение уровня и кинетики (изменения во времени) уровня флуоресценции потенциал-зависимых флуоресцентных красителей (ТМРМ, SafraninO), для определения мембранного потенциала в суспензиях биологических объектов (клетках, дрожжах, митохондриях).

Канал # 6 (Осмотический объем)

Измерение уровня и кинетики (изменения во времени) интенсивности рассеянного света (осмотического объема) в суспензиях биологических объектов (клетках, дрожжах, митохондриях) от 0 до 100%.

Разработанное устройство обеспечивает регулируемую скорость перемешивания суспензии магнитным перемешивателем в объеме реактора с использованием вращающегося внешнего магнита - скорость перемешивания суспензии от 0 до 1500 оборотов в минуту. Температура суспензии биологических объектов (клетках, дрожжах, митохондриях) в объеме измерительной ячейки поддерживается в диапазоне от комнатной температуры до 50°С, с точностью ± 0.5°С во всем диапазоне температур.

Заявляемая абсолютная погрешность измерений±1% по всем каналам (аналоги 0.5%-1%) достаточна для решения прикладных задач. Габариты и масса прибора в сочетании с надежностью механической конструкции узлов позволяют легко транспортировать прибор. Применение в конструкции маломощных потребителей электрической энергии 100-150 Вт создает перспективу разработки прибора автономного питания. Чрезвычайно простая конструкция устройства, в которой подавляющее большинство деталей изготавливается стандартными методами механической обработки, делает прибор дешевым при массовом производстве.

Прибор прост в эксплуатации и не требует специфического обучения пользователя, операции управления и регистрации интуитивно прозрачны в эксплуатации и не требуют особенного квалифицированного обслуживания. Настройка и калибровка прибора по силам специалистам средней квалификации, и не требует сложного оборудования. Оригинальное использование современных методов измерения позволило создать простой, дешевый и неприхотливый прибор.

В состав прототипа прибора для непрерывного многопараметрического мониторинга физико-химических характеристик биологических суспензий входят блоки источника питания, блоки источников и регистрации излучения (света), узлы контроля и поддержания температуры и магнитной мешалки, блоки усилителей сигналов, АЦП и электронная плата управления. Источник питания обеспечивает и поддерживает работу всех узлов прибора. Регистрируемые и преобразованные сигналы передаются на компьютер с монитором, где производится дальнейшая обработка информации.

В табл. 1 приведены используемые в некоторых вариантах реализации каналы регистрации и характеристики световых интерференционных узкополосных фильтров, использованных в приборе. В других вариантах реализации измеряемые параметры нескольких или всех каналов могут быть измерены, в зависимости от потребностей пользователя, при этом характеристики источника возбуждения и характеристики световых интерференционных узкополосных фильтров подбираются индивидуально, в зависимости от используемого индикатора(ов).

1. Устройство для непрерывного многопараметрического мониторинга физико-химических характеристик биологических суспензий, характеризуемое тем, что оно содержит корпус, в котором расположены ячейка с, по меньшей мере, шестью измерительными каналами, позволяющими на основе измеряемых на основе оптических характеристик определять параметры биологических суспензий, причем один из каналов предназначен для измерения кислорода, источник питания, магнитная мешалка, расположенная в ячейке, нагреватель анализируемого вещества и датчик температуры, расположенные в ячейке, электронная плата управления, пять источников оптического излучения, установленные в измерительных каналах, и пять регистраторов оптического излучения, также установленных в измерительных каналах, причем регистраторы оптического излучения подключены ко входам блока усилителей и аналого-цифровых преобразователей, выход которого подключен к входу регистрирующего прибора, при этом, по меньшей мере, сенсор кислорода представляет собой сборку, содержащую, по меньшей мере, один Y-образный волоконный жгут со составным сердечником, составленный из двух физически перемешанных пучков волокон, предназначенных для разделения оптических путей возбуждения и регистрации оптического сигнала, причем против торца первого пучка волокон Y-образного волоконного жгута последовательно размещены излучатель возбуждающего излучения и светофильтр, а против торца второго пучка волокон Y-образного волоконного жгута последовательно размещены светофильтр и фотоприемник, а напротив общего торца волоконного жгута расположено приспособление для размещения анализируемого образца, а источник питания подключен ко всем электропотребляющим элементам устройства.

2. Устройство по п. 1, отличающееся тем, что оно выполнено с возможностью добавления чувствительного к кислороду (или любого иного необходимого) индикатора непосредственно в анализируемую пробу, помещенную в измерительную ячейку.

3. Устройство по п. 1, отличающееся тем, что источник излучения, датчик регистрации и необходимые светофильтры для единичного измерительного канала расположены в едином сменном блоке.

4. Устройство по п. 1, отличающееся тем, что часть измерительных каналов могут быть временно отключены на программном или физическом уровне. В последнем случае вместо Y-образного оптоволоконного жгута устанавливается заглушка.

5. Устройство по п. 1, отличающееся тем, что порядок опроса измерительных каналов может изменяться пользователем, включая сопряжение источников излучения и/или датчиков регистрации из разных измерительных каналов с целью расширения числа регистрируемых параметров с учетом геометрического расположения каналов в ячейке.

6. Устройство по п. 1, отличающееся тем, что используется модуляция возбуждающего источника излучения, т.е. меняется алгоритм работы электронной схемы возбуждения и обработки регистрируемого сигнала.