Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связывают тау-белок человека, его получение и применения. Антитело содержит HCDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 732, HCDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 734, HCDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 736 и LCDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 846, LCDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 848, LCDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 850, как определено в соответствии со способом по Kabat. Или тяжелая цепь содержит HCDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 1002, HCDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 1004 и HCDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 1006 и легкая цепь содержит LCDR1 в соответствии с SEQ ID NO: 1116, LCDR2 в соответствии с SEQ ID NO: 1118 и LCDR3 в соответствии с SEQ ID NO: 1120. Антитела или его антигенсвязывающий фрагмент применимы для снижения уровней саркозил-нерастворимого тау-белка у субъекта и в лечении таупатии. 12 н. и 28 з.п. ф-лы, 33 ил., 15 табл., 19 пр.

Перекрестные ссылки на родственные заявки

[0001] По настоящей заявке испрашивается приоритет согласно заявке на выдачу патента США №62/572910, поданной 16 октября 2017 года; заявке на выдачу патента США №62/577011, поданной 25 октября 2017 года; и заявке на выдачу патента США №62/697034, поданной 12 июля 2018 года. Каждая из этих заявок включена в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте.

Перечень последовательностей

[0002] Настоящая заявка включает перечень последовательностей, поданный в электронном виде как текстовый файл с названием «104018_001025_SL.txt», созданный 17 сентября 2018 года, размером 916053 байта. Перечень последовательностей включен в настоящий документ посредством ссылки.

Уровень техники настоящего изобретения

[0003] Настоящее изобретение относится к антителам, которые специфически связывают тау, и способам их применения.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

[0004] Тау человека кодируется геном ассоциированного с микротрубочками тау-белка, МАРТ, расположенным в хромосоме 17q21. Головной мозг взрослого человека содержит шесть основных изоформ тау, которые образуются в результате альтернативного сплайсинга экзона 2 (Е2), Е3 и Е10. Эти изоформы отличаются в зависимости от числа повторяющихся областей длиной 29 остатков вблизи N-конца. Изоформы тау, содержащие 0, 1 или 2 вставки, известны как 0N, 1N и 2N соответственно. «Непроцессированные» изоформы тау также содержат либо 3 («3R»), либо 4 («4R») связывающих микротрубочки повторяющихся домена. Второй из этих повторяющихся доменов кодируется Е10 и не включен в 3R-изоформы тау (фиг. 1).

[0005] Хотя тау обычно является высокорастворимым, при патологических состояниях он может агрегировать с образованием парных спиральных филаментов, нейрофибриллярных клубков и других структур, которые определяют широкий спектр нейродегенеративных заболеваний, называемых таупатиями. Таупатия, таким образом, относится к классу нейродегенеративных заболеваний, ассоциированных с агрегацией ассоциированного с микротрубочками тау-белка, включая болезнь Альцгеймера (AD), прогрессирующий надъядерный паралич (PSP) и лобно-височную деменцию (FTD).

[0006] Лежащий в основе тау-опосредованной нейротоксичности механизм слабо изучен, и триггер агрегации тау в нейронах еще предстоит выяснить. Таким образом, хотя терапевтические подходы, состоящие в нацеливании тау, уже изучены, остается потребность в специфических и эффективных терапевтических средствах, нацеленных на тау.

Краткое раскрытие настоящего изобретения

[0007] В настоящем документе представлены моноклональные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают изоформу или фрагмент тау человека. Согласно некоторым аспектам антитело представляет собой антитело мыши, химерное антитело или гуманизированное антитело. Согласно некоторым вариантам осуществления изотипом антитела является IgG1. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело содержит: определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1), определяющую комплементарность область 2 тяжелой цепи (HCDR2) и определяющую комплементарность область 3 тяжелой цепи (HCDR3), изложенные в SEQ ID NO: 196, и определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1), определяющую комплементарность область 2 легкой цепи (LCDR2) и определяющую комплементарность область 3 легкой цепи (LCDR3), изложенные в SEQ ID NO: 411; HCDR1, HCDR2 и HCDR3, изложенные в SEQ ID NO: 268, и LCDR1, LCDR2 и LCDR3, изложенные в SEQ ID NO: 465; или HCDR1, HCDR2 и HCDR3, изложенные в SEQ ID NO: 402, и LCDR1, LCDR2 и LCDR3, изложенные в SEQ ID NO: 572. Согласно некоторым вариантам осуществления моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат HCDR1, содержащую SEQ ID NO: 594, HCDR2, содержащую SEQ ID NO: 596, HCDR3, содержащую SEQ ID NO: 598, LCDR1, содержащую SEQ ID NO: 738, LCDR2, содержащую SEQ ID NO: 740, и LCDR3, содержащую SEQ ID NO: 742, как определено в соответствии со способом по Kabat; HCDR1, содержащую SEQ ID NO: 864, HCDR2, содержащую SEQ ID NO: 866, HCDR3, содержащую SEQ ID NO: 868, LCDR1, содержащую SEQ ID NO: 1008, LCDR2, содержащую SEQ ID NO: 1010, и LCDR3, содержащую SEQ ID NO: 1012, как определено согласно IMGT; HCDR1, содержащую SEQ ID NO: 642, HCDR2, содержащую SEQ ID NO: 644, HCDR3, содержащую SEQ ID NO: 646, LCDR1, содержащую SEQ ID NO: 774, LCDR2, содержащую SEQ ID NO: 776, и LCDR3, содержащую SEQ ID NO: 778, как определено в соответствии со способом по Kabat; HCDR1, содержащую SEQ ID NO: 912, HCDR2, содержащую SEQ ID NO: 914, HCDR3, содержащую SEQ ID NO: 916, LCDR1, содержащую SEQ ID NO: 1044, LCDR2, содержащую SEQ ID NO: 1046, и LCDR3, содержащую SEQ ID NO: 1048, как определено согласно IMGT; HCDR1, содержащую SEQ ID NO: 732, HCDR2, содержащую SEQ ID NO: 734, HCDR3, содержащую SEQ ID NO: 736, LCDR1, содержащую SEQ ID NO: 846, LCDR2, содержащую SEQ ID NO: 848, и LCDR3, содержащую SEQ ID NO: 850, как определено в соответствии со способом по Kabat; или HCDR1, содержащую SEQ ID NO: 1002, HCDR2, содержащую SEQ ID NO: 1004, HCDR3, содержащую SEQ ID NO: 1006, LCDR1, содержащую SEQ ID NO: 1116, LCDR2, содержащую SEQ ID NO: 1118, и LCDR3, содержащую SEQ ID NO: 1120, как определено согласно IMGT.

[0008] В соответствии с некоторыми аспектами вышеупомянутые моноклональные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты предусматривают модификации последовательности. Согласно некоторым вариантам осуществления модификация(-и) представляет(-ют) собой следующее: остаток в положении 49 легкой цепи в соответствии со способом по Kabat не является цистеином, остаток в положении 57 тяжелой цепи в соответствии со способом по Kabat не является цистеином, остаток в положении 34 легкой цепи в соответствии со способом по Kabat представляет собой глутамат, остаток в положении 36 легкой цепи в соответствии со способом по Kabat не является фенилаланином, остаток в положении 46 легкой цепи в соответствии со способом по Kabat не является аргинином, остаток в положении 94 тяжелой цепи в соответствии со способом по Kabat не является лизином, остаток в положении 71 тяжелой цепи в соответствии со способом по Kabat не является аргинином, или их комбинацию. Согласно некоторым вариантам осуществления, в которых остаток в положении 49 легкой цепи в соответствии со способом по Kabat не является цистеином, остаток представляет собой серии. Согласно некоторым вариантам осуществления, в которых остаток в положении 57 тяжелой цепи в соответствии со способом по Kabat не является цистеином, остаток представляет собой серии. Согласно некоторым вариантам осуществления, в которых остаток в положении 36 легкой цепи в соответствии со способом по Kabat не является фенилаланином, остаток представляет собой тирозин. Согласно некоторым вариантам осуществления, в которых остаток в положении 46 легкой цепи в соответствии со способом по Kabat не является аргинином, остаток представляет собой лейцин. Согласно некоторым вариантам осуществления, в которых остаток в положении 71 тяжелой цепи в соответствии со способом по Kabat не является аргинином, остаток представляет собой валин.

[0009] Согласно некоторым вариантам осуществления моноклонального антитела или антигенсвязывающего фрагмента, которые специфически связывают тау человека, антитело содержит: вариабельный домен тяжелой цепи (HCVD), содержащий SEQ ID NO: 268, и вариабельный домен легкой цепи (LCVD), содержащий SEQ ID NO: 465; HCVD, содержащий SEQ ID NO: 268, и LCVD, содержащий SEQ ID NO: 581; HCVD, содержащий SEQ ID NO: 384, и LCVD, содержащий SEQ ID NO: 545; HCVD, содержащий SEQ ID NO: 393, и LCVD, содержащий SEQ ID NO: 545; HCVD, содержащий SEQ ID NO: 402, и LCVD, содержащий SEQ ID NO: 545; HCVD, содержащий SEQ ID NO: 384, и LCVD, содержащий SEQ ID NO: 572; HCVD, содержащий SEQ ID NO: 393, и LCVD, содержащий SEQ ID NO: 572; или HCVD, содержащий SEQ ID NO: 402, и LCVD, содержащий SEQ ID NO: 572.

[0010] Согласно некоторым вариантам осуществления моноклонального антитела или антигенсвязывающего фрагмента, которые специфически связывают тау человека, антитело продуцируется клеточной линией с номером депозита в АТСС РТА-124523 или номером депозита в АТСС РТА-124524.

[0011] Согласно некоторым вариантам осуществления представленные в настоящем документе антитела или антигенсвязывающие фрагменты связывают мономерный тау 2N4R дикого типа человека с Kd, менее чем приблизительно 0,5 нМ, как измерено с помощью метода поверхностного плазмонного резонанса. Согласно некоторым вариантам осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты связывают тау человека на эпитопе, содержащем аминокислотную последовательность HVPG (SEQ ID NO: 1133). Также представлены биэпитопные антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают тау человека на эпитопе, содержащем аминокислотную последовательность HVPG (SEQ ID NO: 1133) в пределах повторяющейся области 2 или повторяющейся области 4. Согласно определенным аспектам антитела или антигенсвязывающие фрагменты связывают тау человека на эпитопе, содержащем аминокислотную последовательность HVPGG (SEQ ID NO: 79). Также представлены биэпитопные антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают тау человека на эпитопе, содержащем аминокислотную последовательность HVPGG (SEQ ID NO: 79) в пределах повторяющейся области 2 или повторяющейся области 4. Согласно некоторым вариантам осуществления моноклональное антитело или антигенсвязывающий фрагмент связывают тау человека на эпитопе, содержащем аминокислотную последовательность HVPGG (SEQ ID NO: 79) в пределах повторяющейся области 2 и/или повторяющейся области 4, с предпочтением в отношении связывания, которое по меньшей мере приблизительно 10-кратно превышает таковое в отношении связывания на эпитопе, содержащем аминокислотную последовательность HKPGG (SEQ ID NO: 182) в пределах повторяющейся области 3, или на эпитопе, содержащем аминокислотную последовательность HQPGG (SEQ ID NO: 183) в пределах повторяющейся области 1, как определено с помощью анализа связывания пептидов. Согласно некоторым аспектам представленные в настоящем документе антитела или антигенсвязывающие фрагменты не связывают тау на эпитопе, содержащем аминокислотную последовательность HVSGG (SEQ ID NO: 184) в пределах повторяющейся области 2, или на эпитопе, содержащем аминокислотную последовательность HVLGG (SEQ ID NO: 185) в пределах повторяющейся области 2.

[0012] Согласно некоторым вариантам осуществления представленные в настоящем документе моноклональные антитела или антигенсвязывающие фрагменты метят.

[0013] Также представлены молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие любые из описанных моноклональных антител или антигенсвязывающих фрагментов, векторы, содержащие молекулы нуклеиновых кислот, клетки, которые экспрессируют молекулы нуклеиновых кислот, и способы получения антител к тау или антигенсвязывающих фрагментов путем культивирования таких клеток в условиях, подходящих для их получения. Способы получения могут дополнительно включать извлечение антитела или антигенсвязывающего фрагмента.

[0014] Также в настоящем документе представлены фармацевтические композиции любых из описанных моноклональных антител или их антигенсвязывающих фрагментов, которые специфически связывают тау человека, и фармацевтически приемлемого носителя.

[0015] Способы применения описанных моноклональных антител или их антигенсвязывающих фрагментов, которые специфически связывают тау человека, также представлены в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают тау человека, предназначены для применения в качестве лекарственного препарата. Согласно некоторым аспектам антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают тау человека, предназначены для применения в лечении таупатии или в получении лекарственного препарата для лечения таупатии. Также представлены способы лечения таупатии у субъекта. Согласно некоторым вариантам осуществления способы лечения таупатии включают введение субъекту любого из описанных моноклональных антител или их антигенсвязывающих фрагментов, которые специфически связывают тау человека, в условиях, эффективных для лечения таупатии у субъекта. Согласно некоторым аспектам таупатия представляет собой болезнь Альцгеймера, лобно-височную деменцию или прогрессирующий надъядерный паралич. Лобно-височная деменция может представлять собой, например, болезнь Пика.

[0016] Также представлены способы снижения уровней саркозил-нерастворимого тау у субъекта путем введения субъекту любого из описанных моноклональных антител или их антигенсвязывающих фрагментов, которые специфически связывают тау человека. Также представлены способы ингибирования агрегации тау у субъекта путем введения субъекту любого из описанных моноклональных антител или их антигенсвязывающих фрагментов, которые специфически связывают тау человека. Способы можно осуществлять in vitro или in vivo.

Краткое описание чертежей

[0017] На фиг. 1 представлены шесть изоформ тау, экспрессируемых в головном мозге взрослого человека: 2N4R (номер доступа в UniProt PI0636-8); 1N4R (номер доступа в UniProt Р10636-7); 0N4R (номер доступа в UniProt Р10636-6); 2N3R (номер доступа в UniProt Р10636-5); 1N3R (номер доступа в UniProt Р10636-4) и 0N3R (номер доступа в UniProt Р10636-2) (Spillantini & Goedert, The Lancet, 2013, 12(6): 609-622).

[0018] На фиг. 2 представлена область белка («пептидный антиген»), выбранная для получения антител к описанному в настоящем документе тау. На фиг. 2 раскрыты SEQ ID NO. 1137, 1138 и 1138 соответственно, по порядку.

[0019] На фигурах 3А и 3В представлены результаты высокоточного картирования эпитопов антитела 7G6 мыши («ms7G6») к тау. В случае фиг. 3А, транслированные перекрывающиеся пептиды (SEQ ID NO: 1-37 соответственно) последовательности тау 2N4R дикого типа синтезировали и печатали на стеклянном чипе вместе с контрольным пептидом с НА-меткой. Связывание антитела ms7G6 (сигнал внутри фигуры) и контрольного пептида (сигнал на периферии фигуры) обнаруживали, как описано в способах. На фиг. ЗВ показана интенсивность пятен как результат связывания антитела с пептидом на чипе, определенная количественно с помощью пакетов программного обеспечения LI-COR Odyssey™ и PepSlide™ Analyser. Интенсивность флуоресценции затем откладывали в зависимости от пептидной последовательности для получения данных картирования эпитопов. На фиг. 3В раскрыты SEQ ID NO 1139-1140 и 1-37 соответственно, по порядку.

[0020] На фиг. 4 представлены результаты сканирования замен в эпитопе для пептидной последовательности KDNIKHVPGGGSVQI (SEQ ID NO: 26), соответствующей аминокислотам 294-308 тау-белка 2N4R человека, в случае антитела 7G6 мыши. Замещение по каждому положению аминокислоты пептида выполняли каждой возможной встречающейся в природе аминокислотой, печатали на стеклянном чипе и зондировали с использованием антитела ms7G6. На фиг. 4 представлены результаты для выбранных пептидов (SEQ ID NO 38-78 соответственно). В то время как связывание антитела ms7G6 допускает некоторую вариацию во втором положении (валин) SEQ ID NO: 79, связывание антитела полностью зависит от пролинового остатка SEQ ID NO: 79. Связывание антитела 7G6 с KDNIKHVSGGGSVQI (SEQ ID NO: 59) не наблюдалось. Последней является последовательность, присутствующая в мутантном тау-белке P301S.

[0021] На фигурах 5А и 5В представлены результаты по степени и скорости гепарин-индуцированной агрегации тау-белка дикого типа и тау-белка P301S соответственно, в присутствии и в отсутствие антитела к тау ms7G6 («7G6»). IgG мыши, неспособное связывать тау, было включено в качестве контрольного антитела.

[0022] На фигурах 6А, 6В, 6С и 6D представлены эффекты контрольной среды-носителя, IgG1k человека, антитела мыши к тау 7G6 и гуманизированного антитела 7G6-HCzu25-LCzu18 соответственно в клеточной модели диссеминации и агрегации тау in vitro.

[0023] На фиг. 7 представлены результаты предварительной инкубации «затравок» рекомбинантного тау P301S человека с одним из среды-носителя, контрольного IgG-антитела мыши и антител мыши к тау 1F1, 7G6 или 8Е5 в доклинической модели диссеминации тау in vivo.

[0024] На фиг. 8 представлена динамика распространения нерастворимого тау в гиппокампе и коре трансгенных по P301S мышей, которым путем ICV инъекции вводили «затравки» рекомбинантного тау P301S.

[0025] На фиг. 9 представлен эффект периферического однократного введения дозы антитела ms7G6 в модели диссеминации тау с P301S in vivo. ms7G6 обуславливало снижение уровней нерастворимого тау в гиппокампе и коре.

[0026] На фиг. 10 представлен эффект периферического многократного введения дозы антитела ms7G6 в модели диссеминации тау с P301S in vivo. Снижение уровней нерастворимого тау антителом 7G6 было дозозависимым.

[0027] На фиг. 11 представлены последовательности зародышевой линии человека, наиболее близкие по гомологии антителу ms7G6 мыши к тау. ms7G6 и гомологичные последовательности зародышевой линии человека были подвергнуты выравниванию. Vh- и VK-домены аннотированы согласно системам нумерации IMGT и Kabat. В последовательностях зародышевой линии человека идентичные остатки представлены как «.». На фиг. 11 раскрыты SEQ ID NO 1141-1144, 1143, 1145, 1143, 1146-1149, 1148, 1150 и 1148 соответственно, по порядку.

[0028] На фиг. 12 сравниваются последовательности тяжелой и легкой цепей антитела ms7G6 с гуманизированными Vh1- и Ук2-вариантами 7G6. 7G6 мыши и гуманизированные варианты 7G6 были подвергнуты выравниванию. Vh- и Vk-домены аннотированы согласно системам нумерации IMGT и Kabat. Мутации подчеркнуты. На фиг. 12 раскрыты SEQ ID NO 1151-1174 соответственно, по порядку.

[0029] На фигурах 13А, 13В, 13С, 13D, 13Е и 13F представлены результаты связывания в ELISA тау с гуманизированными вариантами 7G6 LCzu1 (фиг. 13А), гуманизированными вариантами 7G6 LCzu2 (фиг. 13 В), гуманизированными вариантами 7G6 LCzu3 (фиг. 13С), гуманизированными вариантами 7G6 LCzu4 (фиг. 13D), гуманизированными вариантами 7G6 LCzu5 (фиг. 13Е) и гуманизированными вариантами 7G6 с заменой Cys49 (в соответствии с Kabat) в легкой цепи и Cys57 (в соответствии с Kabat) в тяжелой цепи на Ser (фиг. 13F).

[0030] На фиг. 14 представлены результаты связывания тау гуманизированными Vh1/Vk2-вариантами 7G6, анализируемого с помощью прямого ELISA. Образцы инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре в 96-луночных планшетах, покрытых тау 2N4R. Планшеты промывали, а затем в лунки добавляли HRP-конъюгированные антитела к IgG мыши или человека. Уровень активности HRP в каждой лунке измеряли с помощью флуоресцентного субстрата QuantaBlu™ и относительные единицы флуоресценции (RFU) детектировали с помощью планшет-ридера SpectraMax М5. Для большей части mAb было показано небольшое различие в связывании тау в прямом ELISA-анализе. Примечательным исключением было 7G6-LCzu9, которое не проявляло способность к связыванию даже при наивысших концентрациях. Кроме того, для 7G6-LCzu22 была показана сниженная способность к связыванию; Tyr36 Vκ в комбинации с Arg46 обуславливал нарушение антигенсвязывающего сайта.

[0031] На фиг. 15 представлены результаты SDS-PAGE-анализа стабильности тяжелой цепи и легкой цепи для Vh1- и Vκ2-вариантов гуманизированного 7G6. Два микрограмма каждого mAb смешивали с 4× буфером для образцов NuPAGE™ LDS в отсутствие восстанавливающего средства и загружали в 4-12% Bis-Tris-гель для SDS-PAGE в буфере MOPS. Гели окрашивали с помощью InstantBlue™ и обесцвечивали в воде. Тримеры HC-HC-LC (HHL), димеры НС-НС (НН) и свободные LC (L) указаны стрелочками. Молекулярная масса маркеров указана в кДа.

[0032] На фиг. 16 представлены результаты выравнивания с помощью BLAST антитела ms7G6 («7G6») с последовательностями из базы данных последовательностей зародышевой линии человека по адресу http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/. Vh- и Vk-домены аннотированы согласно системам нумерации IMGT и Kabat. На фиг. 16 раскрыты SEQ ID NO 1175-1178, 1177, 1179, 1180-1183, 1182 и 1184 соответственно, по порядку.

[0033] На фиг. 17 представлены результаты выравнивания ms7G6 и гуманизированных Vh3/Vk1-вариантов 7G6. Vh- и VK-домены аннотированы согласно системам нумерации IMGT и Kabat. Мышиные и гуманизированные варианты 7G6 были подвергнуты выравниванию. Vh- и VK-домены аннотированы согласно системам нумерации IMGT и Kabat. Мутации подчеркнуты. На фиг. 17 раскрыты SEQ ID NO 1185-1207 соответственно, по порядку.

[0034] На фиг. 18 показаны результаты прямого связывания тау ms7G6 и гуманизированными Vh3/Vκ1-вариантами 7G6 7G6-HCzu11-LCzu11 («HCzu11-LCzu11»), 7G6-HCzu11-LCzu12 («HCzu11-LCzu12»), 7G6-HCzu12-LCzu11 («HCzu12-LCzu11») и 7G6-HCzu12-LCzu12 («HCzu12-LCzu12»). Образцы инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре в 96-луночных планшетах, покрытых рекомбинантным тау-белком 2N4R дикого типа. После промывки в лунки добавляли HRP-конъюгированные антитела к IgG мыши или человека. Уровень активности HRP в каждой лунке измеряли с помощью флуоресцентного субстрата QuantaBlu™ и RFU детектировали с помощью планшет-ридера SpectraMax М5.

[0035] На фигурах 19А и 19 В показаны результаты прямого связывания тау для ms7G6, контрольного IgG1-Ab mAb2, связывающего отличный от тау антиген, и гуманизированных Vh3/Vκ1-вариантов 7G6. На фиг. 19А показаны результаты прямого связывания тау для ms7G6, контрольного IgG1-Ab mAb2, связывающего отличный от тау антиген, и гуманизированных Vh3/Vκ1-вариантов 7G6 7G6-HCzu12-LCzu12 («HCzu12-LCzu12»), 7G6-HCzu13-LCzu12 («HCzu13-LCzu12»), 7G6-HCzu14-LCzu12 («HCzu14-LCzu12»), 7G6-HCzu15-LCzu12 («HCzu15-LCzu12»), 7G6-HCzu16-LCzu12 («HCzu16-LCzu12»), 7G6-HCzu17-LCzu12 («HCzu17-LCzu12»), 7G6-HCzu18-LCzu12 («HCzu18-LCzu12»), 7G6-HCzu19-LCzu12 («HCzu19-LCzu12») и 7G6-HCzu20-LCzu12 («HCzu20-LCzu12»). На фиг. 19 В показаны результаты прямого связывания тау для ms7G6, контрольного IgG1-Ab тАЬ2, связывающего отличный от тау антиген, и гуманизированных Vh3/Vκ1-вариантов 7G6 7G6-HCzu12-LCzu12 («HCzu12-LCzu12»), 7G6-HCzu12-LCzu13 («HCzu12-LCzu13»), 7G6-HCzu12-LCzu14 («HCzu12-LCzu14»), 7G6-HCzu12-LCzu15 («HCzu12-LCzu15»), 7G6-HCzu12-LCzu16 («HCzu12-LCzu16») и 7G6-HCzu12-LCzu17 («HCzu12-LCzu17»). Образцы инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре в 96-луночных планшетах, покрытых рекомбинантным тау-белком 2N4R дикого типа. После промывки планшетов в лунки добавляли детекторные HRP-конъюгированные антитела к IgG мыши или человека. Уровень активности HRP в каждой лунке измеряли с помощью флуоресцентного субстрата QuantaBlu™ и RFU детектировали с помощью планшет-ридера SpectraMax М5.

[0036] На фигурах 20А, 20В и 20С представлены результаты SDS-PAGE-анализа стабильности тяжелой цепи/легкой цепи для Vh3- и Vκ1-вариантов антитела 7G6 в невосстанавливающих условиях. На фиг. 20А представлены результаты SDS-PAGE-анализа стабильности тяжелой цепи/легкой цепи для Vh3- и Vκ1-вариантов 7G6-HCzu11-LCzu11 («HCzu11-LCzu11»), 7G6-HCzu11-LCzu12 («HCzu11-LCzu12»), 7G6-HCzu12-LCzu11 («HCzu12-LCzu11») и 7G6-HCzu12-LCzu12 («HCzu12-LCzu12»). На фиг. 20B показаны результаты SDS-PAGE-анализа стабильности тяжелой цепи/легкой цепи для Vh3-и Vκ1-вариантов 7G6-HCzu12-LCzu12 («HCzu12-LCzu12»), 7G6-HCzu13-LCzu12 («HCzu13-LCzu12»), 7G6-HCzu14-LCzu12 («HCzu14-LCzu12»), 7G6-HCzu16-LCzu12 («HCzu16-LCzu12»), 7G6-HCzu17-LCzu12 («HCzu17-LCzu12») и 7G6-HCzu18-LCzu12 («HCzu18-LCzu12»). На фиг. 20C показаны результаты SDS-PAGE-анализа стабильности тяжелой цепи/легкой цепи для Vh3- и Vκ1-вариантов 7G6-HCzu12-LCzu19 («HCzu12-LCzu19»), 7G6-HCzu12-LCzu13 («HCzu12-LCzu13»), 7G6-HCzu12-LCzu14 («HCzu12-LCzu14»), 7G6-HCzu12-LCzu15 («HCzu12-LCzu15»), 7G6-HCzu12-LCzu16 («HCzu12-LCzu16») и 7G6-HCzu12-LCzu17 («HCzu12-LCzu17»). Два микрограмма каждого mAb смешивали с 4х буфером для образцов NuPAGE™ LDS в отсутствие восстанавливающего средства и загружали в 4-12% Bis-Tris-гель для SDS-PAGE в буфере MOPS. Гели окрашивали с помощью InstantBlue™ и обесцвечивали в воде. Димеры HC-LC (HL) и свободные НС указаны стрелочками. Молекулярная масса маркеров указана в кДа.

[0037] На фигурах 21А и 21В представлены результаты SEC-HPLC-анализа для оценки однородности гуманизированных вариантов антитела 7G6 7G6-HCzu8-LCzu6 (фиг. 21А) и 7G6-HCzu25-LCzu18 (фиг. 21В) в растворе. Пять микрограмм гуманизированного варианта mAb 7G6 вводили в Agilent 1260 Infinity, оснащенный предколонкой AdvanceBio SEC 300А, 2,7 мкм 4,6×50, и колонкой AdvanceBio SEC 300А, 2,7 мкм 4,6×300 мм. Образцы анализировали в 0,1 М натрий-фосфатном буфере, рН 6,5, при скорости потока 0,35 мл/мин, и поглощение измеряли при 280 нм. Показаны репрезентативные данные для mAb 7G6-HCzu8-LCzu6 или 7G6-HCzu25-LCzu18.

[0038] На фигурах 22A-L представлены кривые плавления Е(ab')2-фрагментов, которые анализировали с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC). На фигурах 22A-L показаны кривые плавления для mAb1 (фиг. 22А), mAb2 (фиг. 22В), химерного («xi») 7G6 («xi7G6») (фиг. 22С), 7G6-HCzu8-LCzu6 (фиг. 22D), 7G6-HCzu8-LCzu21 (фиг. 22Е), 7G6-HCzu23-LCzu15 (фиг. 22F), 7G6-HCzu24-LCzu15 (фиг. 22G), 7G6-HCzu25-LCzu15 (фиг. 22Н), 7G6-HCzu23-LCzu18 (фиг. 221), 7G6-HCzu24-LCzu18 (фиг. 22J), 7G6-HCzu25-LCzu18 (фиг. 22К) и 7G6-HCzu8-LCzu6 (фиг. 22L). F(ab')2-фрагменты и контроли подвергали термическому анализу в диапазоне 25-100°С с применением скорости сканирования 100°С/час. Профили химерных, 7G6-HCzu8 и 7G6-HCzu25 F(ab')2 были подобны таковым в случае контрольных IgG1-антител mAb1 и mAb2, связывающих отличный от тау антиген. Для 7G6-HCzu23 и 7G6-HCzu24, однако, наблюдали второй пик, что указывает на нестабильность Е(ab')2-фрагмента, возможно, диссоциацию взаимодействия HC-LC. Точки перехода для 7G6-HCzu8-LCzu21, 7G6-HCzu25-LCzu15 и 7G6-HCzu25-LCzu18 были подобными, находясь в диапазоне 77,4-77,6°С.Точка перехода для 7G6-HCzu8-LCzu6 была на один градус выше, при 78,6°С.

[0039] На фигурах 23А и 23 В показаны результаты анализа иммунореактивных Т-клеточных эпитопов, в которых представлены предполагаемые проблемные участки (SEQ ID NO: 80-94 на фиг. 23A; SEQ ID NO: 95-111 на фиг. 23 В) в тяжелых цепях гуманизированного антитела 7G6. Пептиды в таблицах идентифицированы как характеризующиеся идентичностью 5% или меньшей идентичностью с последовательностями зародышевой линии человека. Процент гомологии пептидов с последовательностями вариабельного домена зародышевой линии также учитывался. Пептиды с ~5% или меньшей гомологией с последовательностями вариабельного домена зародышевой линии и/или таковые, для которых было предсказано, что они связывают три или более аллельных вариантов HLA, идентифицированы как пептиды высокого риска (выделено серым цветом).

[0040] На фигурах 24A-24D показаны результаты анализа иммунореактивных Т-клеточных эпитопов, в которых представлены предполагаемые проблемные участки в легких цепях гуманизированного антитела 7G6 (SEQ ID NO: 112-130 на фиг. 24А; SEQ ID NO: 131-150 на фиг. 24В; SEQ ID NO: 151-165 на фиг. 24С и SEQ ID NO: 166-180 на фиг. 24D). Пептиды в таблицах идентифицированы как характеризующиеся идентичностью 5% или меньшей идентичностью с последовательностями зародышевой линии человека. Процент гомологии пептидов с последовательностями вариабельного домена зародышевой линии также учитывался. Пептиды с ~5% или меньшей гомологией с последовательностями вариабельного домена зародышевой линии и/или таковые, для которых было предсказано, что они связывают три или более аллельных варианта HLA, идентифицированы как пептиды высокого риска (выделено серым цветом).

[0041] На фиг. 25 показаны изображения иммуногистохимического окрашивания образцов тканей, пораженных AD, PSP и PiD, с использованием антитела 7G6-HCzu25-LCzu1S. Антитело 7G6-HCzu25-LCzu18 выраженно и специфически распознает патологический тау (показано черными стрелочками на каждом изображении) в полученном после вскрытия головном мозге человека, пораженном заболеванием.

[0042] На фигурах 26А и 26В показаны результаты высокоточного картирования эпитопов для гуманизированных антител 7G6-HCzu8/LCzu6 и 7G6-HCzu25/LCzu18 соответственно. На флуоресцентных изображениях чипов и полученных в результате графиках интенсивности показано, что оба антитела 7G6-HCzu8-LCzu6 (фиг. 26А) и 7G6-HCzu25/LCzu18 (фиг. 26В) связываются с двумя основными сайтами на полноразмерном тау-белке. На фиг. 26А раскрыты SEQ ID NO 1-37 соответственно, по порядку. На фиг. 26 В раскрыты SEQ ID NO 1-37 соответственно, по порядку.

[0043] На фиг. 27 представлены результаты по степени и скорости гепарин-индуцированной агрегации тау-белка 2N4R дикого типа в присутствии и в отсутствие антитела 7G6-HCzu25-LCzu18. Агрегацию рекомбинантного тау 2N4R дикого типа индуцировали в условиях, описанных в примере 15. Реакционные смеси содержали либо контрольное IgG1-антитело человека (закрашенный ромб), либо антитело 7G6-HCzu25-LCzu1S (незакрашенный круг), или не содержали антитело (только буфер; незакрашенный треугольник). Флуоресценцию тиофлавина S (ThS) измеряли сразу же после добавления гепарина (день 0), а затем в дни 1, 2, 5 и 6. Данные представлены как среднее ± SD из четырех независимых экспериментов. Статистический анализ (множественные t-критерии для сравнения IgG-контроля и антитела 7G6-HCzu25-LCzu18) осуществляли для каждого момента времени (р≤0,01**; р≤0,001***). На фиг. 27 показано, что антитело 7G6-HCzu25-LCzu1S эффективно ингибирует агрегацию тау in vitro. Эффект был статистически значимым при сравнении IgG-контроля и антитела 7G6-HCzu25-LCzu18 для дней 1, 2, 5 и 6 после инкубации при 37°С. Никакой значимой разницы не наблюдалось в день 0 сразу после начала реакций после добавления гепарина.

[0044] На фиг. 28 представлены результаты по степени и скорости гепарин-индуцированной агрегации тау-белка 2N4R дикого типа в присутствии и в отсутствие антитела 7G6 или антитела 7G6-HCzu25-LCzu18. Агрегацию рекомбинантного тау 2N4R дикого типа индуцировали в условиях, описанных в разделе «Материалы и способы». Реакционные смеси содержали одно из контрольного IgG1-антитела человека (закрашенный ромб); антитела 7G6 (закрашенный квадрат); антитела 7G6-HCzu25-LCzu18 (незакрашенный круг), или не содержали антитело (только буфер; незакрашенный треугольник). Флуоресценцию тиофлавина S (ThS) измеряли сразу же после добавления гепарина (день 0), а затем в дни 1, 2, 5 и 6. На фиг. 28 показано, что в случае, когда как антитело 7G6, так и антитело 7G6-HCzu25-LCzu18 тестировали в соответствии с приведенными в примере 5 условиями анализа, оба антитела эффективно ингибировали агрегацию тау in vitro. Аналогичная величина эффекта наблюдалась при сравнении между антителами 7G6 и 7G6-HCzu25-LCzu18.

[0045] На фиг. 29 показан нормализованный коэффициент позитивности ThS в клеточном анализе диссеминации фибрилл К18 после иммуноистощения образцов с использованием антитела 7G6-HCzu25-LCzu18. Антитело 7G6-HCzu25-LCzu18 в концентрации 1,5 и 15 мкг/мл обеспечивало устранение эффектов диссеминации фибрилл К18 (>70% снижение в сравнении с контрольным IgG1 человека, каппа).

[0046] На фигурах 30A-30D представлен эффект антитела 7G6 в отношении саркозил-нерастворимого тау головного мозга, индуцированного инъекцией «затравок» тау внутрь гиппокампа у трансгенных по тау P301S человека мышей. «Затравку» тау или раствор без «затравки» (ацетат натрия в концентрации 100 ммоль/л, рН 7,0) стереотаксическим методом путем инъекции вводили в левый гиппокамп.7G6 или контрольное IgG при 40 мг/кг вводили внутрибрюшинно один раз в неделю в течение 3 недель. Контрольное IgG = IgG2b-антитело мыши в качестве изотипического контроля, 7G6 = моноклональное IgG2b-антитело мыши к тау человека. Данные представлены как среднее ± SEM (n=6 для группы, не получающей «затравку», n=11 для групп контрольного IgG, 7G6). ****Р<0,0001, *Р<0,05 в сравнении с контрольным IgG (анализировали с использованием однофакторного дисперсионного анализа с критерием Фишера). Внутрибрюшинное введение 7G6 один раз в неделю в течение 3 недель при 40 мг/кг обеспечивало значимое подавление повышения количества саркозил-нерастворимого тау в контралатеральном гиппокампе, индуцированного инъекцией «затравок» тау внутрь гиппокампа у трансгенных по тау P301S мышей.

[0047] На фигурах 31А и 31В показан MTBR-тау в цереброспинальной жидкости от яванского макака, обработанного антителом 7G6-HCzu25-LCzu18. На фиг. 31А показан связанный MTBR-тау. На фиг. 31В показан свободный MTBR-тау. Среднее ± SEM. Самец яванского макака, N=3 (среда-носитель, 10 мг/кг, 30 мг/кг, 100 мг/кг).

[0048] На фиг. 32 показан связанный MTBR-тау в цереброспинальной жидкости человека, в которую добавляли антитело 7G6-HCzu25-LCzu18 (10, 100, 500, 1000 и 2000 нг/мл).

[0049] На фигурах 33А и 33В показана эффективность поглощения мономера или фибрилл тау соответственно в клетках СНО, сверхэкспрессирующих CD32A. Антитело 7G6-HCzu25-LCzu18 (3 мкг/мл) значимо повышало поглощение мономера тау в сравнении с IgG1-контролем человека (3 мкг/мл) (фиг. 33А). Аналогичным образом, антитело 7G6-HCzu25-LCzu18 (0,3 и 3 мкг/мл) также значимо повышало поглощение фибрилл тау в сравнении с IgG1-контролем человека (3 мкг/мл) (фиг. 33В). В обоих случаях обработка ингибитором FcR обеспечивала значимое блокирование эффекта индуцированного антителом 7G6-HCzu25-LCzu18 поглощения тау в этой клеточной системе анализа.

Подробное раскрытие иллюстративных вариантов осуществления

[0050] В нижеследующем описании определены характеристики антител и их антигенсвязывающих фрагментов, которые специфически связываются с тау. Также описаны относящиеся к ним полинуклеотиды, кодирующие такие антитела и антигенсвязывающие фрагменты, клетки, экспрессирующие антитела и антигенсвязывающие фрагменты, а также ассоциированные векторы. Кроме того, описаны способы применения антител и антигенсвязывающих фрагментов. Например, представленные антитела и антигенсвязывающие фрагменты можно применять для лечения таупатии у субъекта.

[0051] В настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения применяются различные термины, относящиеся к аспектам настоящего описания. Такие термины должны иметь свое обычное значение в данной области, если не указано иное. Другие особо определенные термины должны толковаться таким образом, чтобы соответствовать определениям, представленным в настоящем документе.

[0052] В контексте настоящего описания и прилагаемой формулы изобретения формы единственного числа включают определяемые объекты во множественном числе, если контекстом явно не указано иное. Таким образом, например, упоминание «клетки» включает комбинацию двух или более клеток и т.д.

[0053] Подразумевается, что в контексте настоящего документа термин «приблизительно», когда речь идет о измеряемом значении, таком как количество, продолжительность времени и т.д., охватывает отклонения до ±10% от указанного значения, следовательно, такие отклонения являются подходящими для осуществления раскрытых способов. Если не указано иное, все числа, выражающие количества ингредиентов, свойства, такие как молекулярная масса, условия реакции и т.п., применяемые в настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения, следует понимать как модифицируемые во всех случаях термином «приблизительно». Соответственно, если не указано иное, числовые параметры, изложенные в нижеследующем описании и прилагаемой формуле изобретения, являются приблизительными значениями, которые могут варьироваться в зависимости от требуемых свойств, которые должны быть получены с помощью настоящего изобретения. По крайней мере, и не в качестве попытки ограничить применение доктрины эквивалентов до объема формулы изобретения, каждый числовой параметр должен, по меньшей мере, истолковываться с учетом числа сообщаемых значащих цифр и путем применения стандартных способов округления.

[0054] Несмотря на то, что числовые диапазоны и параметры, определяющие широкий объем настоящего изобретения, являются приблизительными, числовые значения, изложенные в конкретных примерах, указываются настолько точно, насколько это возможно. Однако любое числовое значение по своему существу предусматривает определенные ошибки, неизбежно обусловленные стандартным отклонением, наблюдающимся в соответствующих измерениях в рамках испытаний.

[0055] «Выделенный» означает, что биологический компонент (такой как нуклеиновая кислота, пептид или белок) был по существу отделен, продуцирован отдельно или очищен от других биологических компонентов организма, в котором компонент встречается в природе, т.е. других хромосомных и внехромосомных ДНК и РНК и белков. Таким образом, нуклеиновые кислоты, пептиды и белки, которые были «выделены», включают нуклеиновые кислоты и белки, очищенные с помощью стандартных способов очистки. «Выделенные» нуклеиновые кислоты, пептиды и белки могут быть частью композиции, и все еще считаться выделенными, если такая композиция не является частью нативной среды нуклеиновой кислоты, пептида или белка. Термин также охватывает нуклеиновые кислоты, пептиды и белки, полученные в результате рекомбинантной экспрессии в клетке-хозяине, а также химически синтезированные нуклеиновые кислоты.

[0056] «Полинуклеотид», синонимично называемый «молекулой нуклеиновой кислоты» или «нуклеиновыми кислотами», относится к любому полирибонуклеотиду или полидезоксирибонуклеотиду, который может представлять собой немодифицированную РНК или ДНК или модифицированную РНК или ДНК. «Полинуклеотиды» включают без ограничения одно- и двунитевую ДНК, ДНК, которая является комбинацией одно- и двунитевых областей, одно- и двунитевую РНК и РНК, которая является комбинацией одно- и двунитевых областей, гибридные молекулы, предусматривающие ДНК и РНК, которые могут быть однонитевыми или чаще двунитевыми, или комбинацию одно- и двунитевых областей. «Полинуклеотид» также охватывает относительно короткие цепи нуклеиновых кислот, зачастую называемые олигонуклеотидами.

[0057] Значение выражения «практически такой же» может отличаться в зависимости от контекста, в котором применяется термин. Ввиду естественной вариации последовательностей, которая, вероятно, существует между тяжелыми и легкими цепями и кодирующими их генами, можно было бы ожидать определенный уровень вариации в пределах аминокислотных последовательностей или генов, кодирующих описанные в настоящем документе антитела или антигенсвязывающие фрагменты, при этом влияние на их уникальные свойства связывания (например, специфичность и аффинность) является незначительным, или вовсе отсутствует. Такое ожидание отчасти связано с вырожденностью генетического кода, а также с эволюционным успехом консервативных вариаций аминокислотных последовательностей, которые существенно не изменяют природу кодируемого белка. Соответственно, в контексте последовательностей нуклеиновых кислот «практически такой же» означает по меньшей мере 65% идентичность между двумя или более последовательностями. Предпочтительно термин относится по меньшей мере к 70% идентичности между двумя или более последовательностями, более предпочтительно по меньшей мере 75% идентичности, более предпочтительно по меньшей мере 80% идентичности, более предпочтительно по меньшей мере 85% идентичности, более предпочтительно по меньшей мере 90% идентичности, более предпочтительно по меньшей мере 91% идентичности, более предпочтительно по меньшей мере 92% идентичности, более предпочтительно по меньшей мере 93% идентичности, более предпочтительно по меньшей мере 94% идентичности, более предпочтительно по меньшей мере 95% идентичности, более предпочтительно по меньшей мере 96% идентичности, более предпочтительно по меньшей мере 97% идентичности, более предпочтительно по меньшей мере 98% идентичности и более предпочтительно по меньшей мере 99% или большей идентичности. Такая идентичность может быть определена с применением алгоритма nBLAST (Altschul et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-8; Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-7).

[0058] Степень вариации, которая может иметь место в пределах аминокислотной последовательности белка без существенного влияния на функцию белка, значительно ниже таковой последовательности нуклеиновой кислоты, поскольку те же принципы вырожденности не применимы к аминокислотным последовательностям. Соответственно, в контексте антитела или антигенсвязывающего фрагмента «практически такой же» означает, что последовательности имеют «несущественные различия». Несущественные различия представляют собой замены 1, 2, 3, 4, 5 или 6 аминокислот в аминокислотной последовательности антитела или фрагмента антитела. Аминокислотные последовательности, практически такие же, как и раскрытые в настоящем документе последовательности, также являются частью настоящей заявки. Согласно некоторым вариантам осуществления идентичность последовательностей может составлять приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более. Другие варианты осуществления включают тау-специфические антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые имеют каркасные, скаффолдные или другие несвязывающие области, которые не характеризуются значимой идентичностью с описанными в настоящем документе антителами и антигенсвязывающими фрагментами, но включают одну или несколько CDR или другие последовательности, необходимые для обеспечения связывания, которые на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичны таким описанным в настоящем документе последовательностям.

[0059] «Вектор» представляет собой репликон, такой как плазмида, фаг, космида или вирус, в которые может быть функционально вставлен другой сегмент нуклеиновой кислоты для осуществления репликации или экспрессии сегмента.

[0060] Термины «экспрессировать» и «продуцировать» в настоящем документе применяют как синонимы, и они относятся к биосинтезу генного продукта. Эти термины охватывают транскрипцию гена в РНК. Эти термины также охватывают трансляцию РНК в один или несколько полипептидов, и дополнительно охватывают все встречающиеся в природе посттранскрипционные и посттрансляционные модификации. Экспрессия или продукция антитела или его антигенсвязывающего фрагмента может происходить в пределах цитоплазмы клетки, или осуществляться во внеклеточное пространство, такое как среда для выращивания культуры клеток.

[0061] Термин «лечить» или «лечение» относится к любому успеху или признакам успеха в отношении ослабления или устранения повреждения, патологии или состояния, включая любой объективный или субъективный параметр, такой как смягчение, ремиссия, уменьшение интенсивности симптома или приведение состояния в более переносимую пациентом форму, уменьшение скорости дегенерации или ухудшения, приведение конечной стадии дегенерации в менее изнурительную форму, повышение физического или психологического благополучия субъекта или продление выживания. Лечение можно оценивать по объективным или субъективным параметрам, включая результаты физикального обследования, неврологического обследования или психиатрического освидетельствования. Согласно конкретному варианту осуществления симптомом таупатии является ухудшение когнитивных функций. Согласно конкретному варианту осуществления симптомом таупатии является ухудшение научения и/или памяти. Согласно конкретному варианту осуществления симптомом таупатии является потеря долгосрочной памяти. Согласно конкретному варианту осуществления симптомом таупатии является деменция. Согласно некоторым вариантам осуществления симптомом таупатии является спутанность сознания, раздражительность, агрессия, перепады настроения или нарушение речи. Согласно некоторым вариантам осуществления симптомом таупатии является ухудшение или утрата одной или нескольких когнитивных функций, таких как логическое мышление, ситуативное умозаключение, способность к запоминанию и/или научение.

[0062] Термин «антитело» в контексте настоящего документа подразумевается в широком смысле и включает молекулы иммуноглобулинов или антител, включая поликлональные антитела, моноклональные антитела, в том числе антитела мыши, человека, подогнанные под человеческие, гуманизированные и химерные моноклональные антитела и фрагменты антител. В целом антитела представляют собой белки или пептидные цепи, которые характеризуются специфичностью связывания в отношении конкретного антигена. Интактные антитела представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины, состоящие из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей. Как правило, каждая легкая цепь соединена с тяжелой цепью посредством одной ковалентной дисульфидной связи, тогда как число дисульфидных связей между тяжелыми цепями иммуноглобулинов других изотипов может отличаться. Каждая тяжелая и легкая цепь также имеет регулярно расположенные внутрицепочечные дисульфидные мостики. Каждая тяжелая цепь содержит на одном конце вариабельный домен (вариабельную область) (VH), за которым расположен ряд константных доменов (константных областей). Каждая легкая цепь содержит вариабельный домен на одном конце (VL) и константный домен на другом своем конце; константный домен легкой цепи расположен параллельно первому константному домену тяжелой цепи, а вариабельный домен легкой цепи расположен параллельно вариабельному домену тяжелой цепи. Легкие цепи антитела любого вида позвоночных можно отнести к одному из двух четко различимых типов, а именно каппа (κ) и лямбда (λ), исходя из аминокислотных последовательностей их константных доменов.

[0063] Иммуноглобулины можно отнести к пяти основным классам или изотипам в зависимости от типа константного домена, принадлежащего его тяжелой цепи, а именно IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, в зависимости от аминокислотной последовательности константного домена тяжелой цепи. IgA и IgG дополнительно подразделяются на изотипы IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют разным классам иммуноглобулинов, называются α, δ, ε, γ и μ соответственно.

[0064] Вариабельная область легкой цепи или вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина состоит из «каркасной» области, прерываемой тремя «антигенсвязывающими сайтами». Антигенсвязывающие сайты определяют с применением различных терминов следующим образом: (i) термин «определяющие комплементарность области» (CDR) основывается на вариабельности последовательностей (Wu and Kabat, J. Exp. Med. 132:211-250, 1970). В целом антигенсвязывающий сайт содержит шесть CDR; три в VH (HCDR1, HCDR2, HCDR3) и три в VL (LCDR1, LCDR2, LCDR3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991). «IMGT-CDR», как предлагает Lefranc (Lefranc et al., Dev. Comparat. Immunol. 27:55-77, 2003), основывается на сравнении V-доменов иммуноглобулинов и Т-клеточных рецепторов. В международной базе данных ImMunoGeneTics (IMGT) (http://www_imgt_org) представлены стандартизированная нумерация и определение таких областей. Соответствие между CDR и определением границ согласно IMGT описано в Lefranc et al., Dev. Comparat. Immunol. 27:55-77, 2003.

[0065] Антигенсвязывающие фрагменты представляют собой любую белковую структуру, которая может характеризоваться аффинностью связывания в отношении конкретного антигена. Некоторые антигенсвязывающие фрагменты состоят из участков интактных антител, которые сохраняют антигенсвязывающую специфичность исходной молекулы антитела. Например, антигенсвязывающие фрагменты могут содержать по меньшей мере одну вариабельную область (вариабельную область либо тяжелой цепи, либо легкой цепи) или одну или несколько CDR антитела, о котором известно, что оно связывает конкретный антиген. Примеры подходящих антигенсвязывающих фрагментов включают без ограничения диатела и одноцепочечные молекулы, а также Fab-, F(ab')2-, Fc-, Fabc- и Fv-молекулы, одноцепочечные (Sc) антитела, отдельные легкие цепи антител, отдельные тяжелые цепи антител, химерные продукты слияния цепей антител или CDR и других белков, белковые скаффолды, мономеры или димеры тяжелых цепей, мономеры или димеры легких цепей, димеры, состоящие из одной тяжелой и одной легкой цепи и т.д. Для получения антигенсвязывающих фрагментов можно применять все изотипы антител. Кроме того, антигенсвязывающие фрагменты могут включать белковые каркасы, происходящие не из антител, которые могут успешно включать полипептидные сегменты в ориентации, обеспечивающей аффинность в отношении данного представляющего интерес антигена, такие как белковые скаффолды. Антигенсвязывающие фрагменты могут быть получены с применением рекомбинантной технологии, или могут быть получены путем ферментативного или химического расщепления интактных антител. Фразу «антитело или его антигенсвязывающий фрагмент» можно применять для обозначения того, что данный антигенсвязывающий фрагмент включает один или несколько аминокислотных сегментов антитела, упоминаемого в указанной фразе.

[0066] «Специфическое связывание» или «специфически связывает» относится к связыванию антитела или антигенсвязывающего фрагмента с антигеном с большей аффинностью, чем в случае других антигенов. Как правило, антитело или антигенсвязывающий фрагмент связываются с антигеном с равновесной константой диссоциации K_D приблизительно 5×10^-8 М или меньше, например, приблизительно 5×10^-9 М или меньше, приблизительно 1×10^-9 М или меньше, приблизительно 1×10^-10 М или меньше или приблизительно 1×10^-11 М или меньше.

[0067] «Биэпитопный» при применении в контексте антител или фрагментов антител относится к способности антитела или фрагмента к специфическому связыванию двух неперекрывающихся эпитопов на одной и той же целевой молекуле антигена, причем не обязательно одновременному.

[0068] Термин «субъект» относится к человеку и отличным от человека животным, включая всех позвоночных, например, млекопитающих и отличных от млекопитающих животных, таких как отличные от человека приматы, мыши, кролики, овцы, собаки, кошки, лошади, коровы, куры, амфибии и рептилии. Согласно множеству вариантов осуществления описанных способов субъектом является человек.

[0069] Описанные в настоящем документе варианты осуществления не ограничиваются конкретными способами, реагентами, соединениями, композициями или биологическими системами, которые, разумеется, могут отличаться.

[0070] В настоящем документе описаны выделенные моноклональные антитела и антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают тау, предпочтительно тау человека («антитела к тау»). Тау 2N4R человека (также называемый Таи441) изложен в настоящем документе как SEQ ID NO: 181:

Тау человека также относится к вариантам тау, например, встречающимся в природе аллельным вариантам, включая таковые, показанные на фиг. 1 [2N4R (номер доступа в UniProt Р10636-8); 1N4R (номер доступа в UniProt Р10636-7); 0N4R (номер доступа в UniProt Р10636-6); 2N3R (номер доступа в UniProt Р10636-5); 1N3R (номер доступа в UniProt Р10636-4); и 0N3R (номер доступа в UniProt Р10636-2)], или последовательностям, предусматривающим по меньшей мере одну аминокислотную замену относительно них. Согласно некоторым вариантам осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты представляют собой IgG мыши или их производные. Хотя антитела к тау или антигенсвязывающие фрагменты могут быть человеческими, гуманизированными или химерными, приведенные в настоящем документе в качестве примера антитела или антигенсвязывающие фрагменты являются мышиными и гуманизированными антителами.

[0071] Согласно любому из описанных в настоящем документе вариантов осуществления антитело, которое специфически связывает тау, предпочтительно представляет собой IgG1, более предпочтительно IgG1 человека. Антитела и антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают тау, как раскрыто в разделе Примеры, получены от мышей. Подобные антитела могут быть получены от любого вида с помощью рекомбинантных способов. Например, антитела, или антигенсвязывающие фрагменты, могут быть химерными антителами крысы, козы, лошади, свиньи, представителей бычьих, курицы, кролика, представителей верблюдовых, осла, человека и т.д. Для применения при введении людям происходящие не из организма человека антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут быть генетически или структурно изменены так, чтобы они были менее антигенными при введении пациенту-человеку.

[0072] Согласно некоторым вариантам осуществления антитела к тау или антигенсвязывающие фрагменты являются химерными. В контексте настоящего документа термин «химерный» относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, содержащим по меньшей мере некоторый участок по меньшей мере одного вариабельного домена, происходящего из аминокислотной последовательности антитела отличного от человека млекопитающего, грызуна или рептилии, тогда как остальные участки антитела или его антигенсвязывающего фрагмента происходят из организма человека. Например, химерное антитело может содержать антигенсвязывающий домен мыши с Fc человека или другим подобным структурным доменом. Химерные антитела обозначаются термином «xi».

Согласно некоторым вариантам осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают тау, представляют собой гуманизированные антитела или фрагменты. Гуманизированные антитела могут представлять собой химерные иммуноглобулины, цепи иммуноглобулинов или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ или другие антигенсвязывающие подпоследовательности антител), которые содержат минимальную последовательность, происходящую из иммуноглобулина отличного от человека животного. По большей части гуманизированные антитела представляют собой иммуноглобулины человека (антитело-реципиент), в которых остатки из определяющей комплементарность области (CDR) реципиента замещены остатками из CDR вида, отличного от человека (антитело-донор), такого как мышь, крыса или кролик, обладающей требуемыми специфичностью, аффинностью и способностью. В целом гуманизированное антитело будет содержать практически все по меньшей мере из одного и, как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или практически все из CDR областей соответствуют таковым иммуноглобулина отличного от человека животного, и все или практически все из каркасных областей являются таковыми последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело может включать по меньшей мере участок константной области (Fc) иммуноглобулина, как правило, иммуноглобулина человека. Тяжелые или легкие цепи гуманизированного антитела в настоящем документе обозначены термином «zu».

[0073] Описанные в настоящем документе антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут находиться в различных формах, но будут включать один или несколько из сегментов вариабельного домена или CDR антитела, показанных в таблице 1.

[0074] Согласно некоторым вариантам осуществления антитела к тау или их антигенсвязывающие фрагменты включают определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1), определяющую комплементарность область 2 тяжелой цепи (HCDR2) и определяющую комплементарность область 3 тяжелой цепи (HCDR3), изложенные в SEQ ID NO: 196, и определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1), определяющую комплементарность область 2 легкой цепи (LCDR2) и определяющую комплементарность область 3 легкой цепи (LCDR3), изложенные в SEQ ID NO: 411. Согласно некоторым вариантам осуществления антитела к тау или их антигенсвязывающие фрагменты включают HCDR1, HCDR2 и HCDR3, изложенные в SEQ ID NO: 268, и LCDR1, LCDR2 и LCDR3, изложенные в SEQ ID NO: 465. Согласно некоторым вариантам осуществления антитела к тау или их антигенсвязывающие фрагменты включают HCDR1, HCDR2 и HCDR3, изложенные в SEQ ID NO: 402, и LCDR1, LCDR2 и LCDR3, изложенные в SEQ ID NO: 572.

[0075] Согласно некоторым вариантам осуществления антитела к тау или антигенсвязывающие фрагменты могут включать аминокислотную последовательность CDR1 легкой цепи, практически такую же, как SEQ ID NO: 738, или идентичную ей, как определено в соответствии со способом по Kabat. Согласно некоторым вариантам осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут включать аминокислотную последовательность CDR2 легкой цепи, практически такую же, как SEQ ID NO: 740, или идентичную ей, как определено в соответствии со способом по Kabat. Согласно некоторым вариантам осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут включать аминокислотную последовательность CDR3 легкой цепи, практически такую же, как SEQ ID NO: 742, или идентичную ей, как определено в соответствии со способом по Kabat. Согласно некоторым вариантам осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут включать аминокислотную последовательность CDR1 тяжелой цепи, практически такую же, как SEQ ID NO: 594, или идентичную ей, как определено в соответствии со способом по Kabat. Согласно некоторым вариантам осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут включать аминокислотную последовательность CDR2 тяжелой цепи, практически такую же, как SEQ ID NO: 596, или идентичную ей, как определено в соответствии со способом по Kabat. Согласно некоторым вариантам осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут включать аминокислотную последовательность CDR3 тяжелой цепи, практически такую же, как SEQ ID NO: 598, или идентичную ей, как определено в соответствии со способом по Kabat. Антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут включать легкую цепь с аминокислотной последовательностью CDR1, практически такой же, как SEQ ID NO: 738, или идентичной ей, как определено в соответствии со способом по Kabat; аминокислотной последовательностью CDR2, практически такой же, как SEQ ID NO: 740, или идентичной ей, как определено в соответствии со способом по Kabat; и аминокислотной последовательностью CDR3, практически такой же, как SEQ ID NO: 742, или идентичной ей, как определено в соответствии со способом по Kabat. Антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут включать тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью CDR1, практически такой же, как SEQ ID NO: 594, или идентичной ей, как определено в соответствии со способом по Kabat; аминокислотной последовательностью CDR2, практически такой же, как SEQ ID NO: 596, или идентичной ей, как определено в соответствии со способом по Kabat; и аминокислотной последовательностью CDR3, практически такой же, как SEQ ID NO: 598, или идентичной ей, как определено в соответствии со способом по Kabat. Антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут включать легкую цепь с аминокислотной последовательностью CDR1, практически такой же, как SEQ ID NO: 738, или идентичной ей, как определено в соответствии со способом по Kabat; аминокислотной последовательностью CDR2, практически такой же, как SEQ ID NO: 740, или идентичной ей, как определено в соответствии со способом по Kabat; и аминокислотной последовательностью CDR3, практически такой же, как SEQ ID NO: 742, или идентичной ей, как определено в соответствии со способом по Kabat, а также содержат тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью CDR1, практически такой же, как SEQ ID NO: 594, или идентичной ей, как определено в соответствии со способом по Kabat; аминокислотной последовательностью CDR2, практически такой же, как SEQ ID NO: 596, или идентичной ей, как определено в соответствии со способом по Kabat; и аминокислотной последовательностью CDR3, практически такой же, как SEQ ID NO: 598, или идентичной ей, как определено в соответствии со способом по Kabat.

[0076] Согласно некоторым вариантам осуществления антитела к тау или антигенсвязывающие фрагменты могут включать аминокислотную последовательность CDR1 легкой цепи, практически такую же, как SEQ ID NO: 1008, или идентичную ей, как определено согласно IMGT. Согласно некоторым вариантам осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут включать аминокислотную последовательность CDR2 легкой цепи, практически такую же, как SEQ ID NO: 1010, или идентичную ей, как определено согласно IMGT. Согласно некоторым вариантам осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут включать аминокислотную последовательность CDR3 легкой цепи, практически такую же, как SEQ ID NO: 1012, или идентичную ей, как определено согласно IMGT. Согласно некоторым вариантам осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут включать аминокислотную последовательность CDR1 тяжелой цепи, практически такую же, как SEQ ID NO: 864, или идентичную ей, как определено согласно IMGT. Согласно некоторым вариантам осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут включать аминокислотную последовательность CDR2 тяжелой цепи, практически такую же, как SEQ ID NO: 866, или идентичную ей, как определено согласно IMGT. Согласно некоторым вариантам осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут включать аминокислотную последовательность CDR3 тяжелой цепи, практически такую же, как SEQ ID NO: 868, или идентичную ей, как определено согласно IMGT. Антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут включать легкую цепь с аминокислотной последовательностью CDR1, практически такой же, как SEQ ID NO: 1008, или идентичной ей, как определено согласно IMGT; аминокислотной последовательностью CDR2, практически такой же, как SEQ ID NO: 1010, или идентичной ей, как определено согласно IMGT; и аминокислотной последовательностью CDR3, практически такой же, как SEQ ID NO: 1012, или идентичной ей, как определено согласно IMGT. Антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут включать тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью CDR1, практически такой же, как SEQ ID NO: 864, или идентичной ей, как определено согласно IMGT; аминокислотной последовательностью CDR2, практически такой же, как SEQ ID NO: 866, или идентичной ей, как определено согласно IMGT; и аминокислотной последовательностью CDR3, практически такой же, как SEQ ID NO: 868, или идентичной ей, как определено согласно IMGT. Антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут включать легкую цепь с аминокислотной последовательностью CDR1, практически такой же, как SEQ ID NO: 1008, или идентичной ей, как определено согласно IMGT; аминокислотной последовательностью CDR2, практически такой же, как SEQ ID NO: 1010, или идентичной ей, как определено согласно IMGT; и аминокислотной последовательностью CDR3, практически такой же, как SEQ ID NO: 1012, или идентичной ей, как определено согласно IMGT, а также содержат тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью CDR1, практически такой же, как SEQ ID NO: 864, или идентичной ей, как определено согласно IMGT; аминокислотной последовательностью CDR2, практически такой же, как SEQ ID NO: 866, или идентичной ей, как определено согласно IMGT; и аминокислотной последовательностью CDR3, практически такой же, как SEQ ID NO: 868, или идентичной ей, как определено согласно IMGT.

[0077] Согласно некоторым вариантам осуществления антитела к тау или антигенсвязывающие фрагменты могут включать аминокислотную последовательность CDR1 легкой цепи, практически такую же, как SEQ ID NO: 774, или идентичную ей, как определено в соответствии со способом по Kabat. Согласно некоторым вариантам осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут включать аминокислотную последовательность CDR2 легкой цепи, практически такую же, как SEQ ID NO: 776, или идентичную ей, как определено в соответствии со способом по Kabat. Согласно некоторым вариантам осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут включать аминокислотную последовательность CDR3 легкой цепи, практически такую же, как SEQ ID NO: 778, или идентичную ей, как определено в соответствии со способом по Kabat. Согласно некоторым вариантам осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут включать аминокислотную последовательность CDR1 тяжелой цепи, практически такую же, как SEQ ID NO: 642, или идентичную ей, как определено в соответствии со способом по Kabat. Согласно некоторым вариантам осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут включать аминокислотную последовательность CDR2 тяжелой цепи, практически такую же, как SEQ ID NO: 644, или идентичную ей, как определено в соответствии со способом по Kabat. Согласно некоторым вариантам осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут включать аминокислотную последовательность CDR3 тяжелой цепи, практически такую же, как SEQ ID NO: 646, или идентичную ей, как определено в соответствии со способом по Kabat. Антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут включать легкую цепь с аминокислотной последовательностью CDR1, практически такой же, как SEQ ID NO: 774, или идентичной ей, как определено в соответствии со способом по Kabat; аминокислотной последовательностью CDR2, практически такой же, как SEQ ID NO: 776, или идентичной ей, как определено в соответствии со способом по Kabat; и аминокислотной последовательностью CDR3, практически такой же, как SEQ ID NO: 778, или идентичной ей, как определено в соответствии со способом по Kabat. Антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут включать тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью CDR1, практически такой же, как SEQ ID NO: 642, или идентичной ей, как определено в соответствии со способом по Kabat; аминокислотной последовательностью CDR2, практически такой же, как SEQ ID NO: 644, или идентичной ей, как определено в соответствии со способом по Kabat; и аминокислотной последовательностью CDR3, практически такой же, как SEQ ID NO: 646, или идентичной ей, как определено в соответствии со способом по Kabat. Антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут включать легкую цепь с аминокислотной последовательностью CDR1, практически такой же, как SEQ ID NO: 774, или идентичной ей, как определено в соответствии со способом по Kabat; аминокислотной последовательностью CDR2, практически такой же, как SEQ ID NO: 776, или идентичной ей, как определено в соответствии со способом по Kabat; и аминокислотной последовательностью CDR3, практически такой же, как SEQ ID NO: 778, или идентичной ей, как определено в соответствии со способом по Kabat, а также содержат тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью CDR1, практически такой же, как SEQ ID NO: 642, или идентичной ей, как определено в соответствии со способом по Kabat; аминокислотной последовательностью CDR2, практически такой же, как SEQ ID NO: 644, или идентичной ей, как определено в соответствии со способом по Kabat; и аминокислотной последовательностью CDR3, практически такой же, как SEQ ID NO: 646, или идентичной ей, как определено в соответствии со способом по Kabat.

[0078] Согласно некоторым вариантам осуществления антитела к тау или антигенсвязывающие фрагменты могут включать аминокислотную последовательность CDR1 легкой цепи, практически такую же, как SEQ ID NO: 1044, или идентичную ей, как определено в соответствии со способом IMGT. Согласно некоторым вариантам осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут включать аминокислотную последовательность CDR2 легкой цепи, практически такую же, как SEQ ID NO: 1046, или идентичную ей, как определено в соответствии со способом IMGT. Согласно некоторым вариантам осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут включать аминокислотную последовательность CDR3 легкой цепи, практически такую же, как SEQ ID NO: 1048, или идентичную ей, как определено в соответствии со способом IMGT. Согласно некоторым вариантам осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут включать аминокислотную последовательность CDR1 тяжелой цепи, практически такую же, как SEQ ID NO: 912, или идентичную ей, как определено в соответствии со способом IMGT. Согласно некоторым вариантам осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут включать аминокислотную последовательность CDR2 тяжелой цепи, практически такую же, как SEQ ID NO: 914, или идентичную ей, как определено в соответствии со способом IMGT. Согласно некоторым вариантам осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут включать аминокислотную последовательность CDR3 тяжелой цепи, практически такую же, как SEQ ID NO: 916, или идентичную ей, как определено в соответствии со способом IMGT. Антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут включать легкую цепь с аминокислотной последовательностью CDR1, практически такой же, как SEQ ID NO: 1044, или идентичной ей, как определено в соответствии со способом IMGT; аминокислотной последовательностью CDR2, практически такой же, как SEQ ID NO: 1046, или идентичной ей, как определено в соответствии со способом IMGT; и аминокислотной последовательностью CDR3, практически такой же, как SEQ ID NO: 1048, или идентичной ей, как определено в соответствии со способом IMGT. Антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут включать тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью CDR1, практически такой же, как SEQ ID NO: 912, или идентичной ей, как определено в соответствии со способом IMGT; аминокислотной последовательностью CDR2, практически такой же, как SEQ ID NO: 914, или идентичной ей, как определено в соответствии со способом IMGT; и аминокислотной последовательностью CDR3, практически такой же, как SEQ ID NO: 916, или идентичной ей, как определено в соответствии со способом IMGT. Антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут включать легкую цепь с аминокислотной последовательностью CDR1, практически такой же, как SEQ ID NO: 1044, или идентичной ей, как определено в соответствии со способом IMGT; аминокислотной последовательностью CDR2, практически такой же, как SEQ ID NO: 1046, или идентичной ей, как определено в соответствии со способом IMGT; и аминокислотной последовательностью CDR3, практически такой же, как SEQ ID NO: 1048, или идентичной ей, как определено в соответствии со способом IMGT, а также содержат тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью CDR1, практически такой же, как SEQ ID NO: 912, или идентичной ей, как определено в соответствии со способом IMGT; аминокислотной последовательностью CDR2, практически такой же, как SEQ ID NO: 914, или идентичной ей, как определено в соответствии со способом IMGT; и аминокислотной последовательностью CDR3, практически такой же, как SEQ ID NO: 916, или идентичной ей, как определено в соответствии со способом IMGT.

[0079] Согласно некоторым вариантам осуществления антитела к тау или антигенсвязывающие фрагменты могут включать аминокислотную последовательность CDR1 легкой цепи, практически такую же, как SEQ ID NO: 846, или идентичную ей, как определено в соответствии со способом по Kabat. Согласно некоторым вариантам осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут включать аминокислотную последовательность CDR2 легкой цепи, практически такую же, как SEQ ID NO: 848, или идентичную ей, как определено в соответствии со способом по Kabat. Согласно некоторым вариантам осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут включать аминокислотную последовательность CDR3 легкой цепи, практически такую же, как SEQ ID NO: 850, или идентичную ей, как определено в соответствии со способом по Kabat. Согласно некоторым вариантам осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут включать аминокислотную последовательность CDR1 тяжелой цепи, практически такую же, как SEQ ID NO: 732, или идентичную ей, как определено в соответствии со способом по Kabat. Согласно некоторым вариантам осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут включать аминокислотную последовательность CDR2 тяжелой цепи, практически такую же, как SEQ ID NO: 734, или идентичную ей, как определено в соответствии со способом по Kabat. Согласно некоторым вариантам осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут включать аминокислотную последовательность CDR3 тяжелой цепи, практически такую же, как SEQ ID NO: 736, или идентичную ей, как определено в соответствии со способом по Kabat. Антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут включать легкую цепь с аминокислотной последовательностью CDR1, практически такой же, как SEQ ID NO: 846, или идентичной ей, как определено в соответствии со способом по Kabat; аминокислотной последовательностью CDR2, практически такой же, как SEQ ID NO: 848, или идентичной ей, как определено в соответствии со способом по Kabat; и аминокислотной последовательностью CDR3, практически такой же, как SEQ ID NO: 850, или идентичной ей, как определено в соответствии со способом по Kabat. Антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут включать тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью CDR1, практически такой же, как SEQ ID NO: 732, или идентичной ей, как определено в соответствии со способом по Kabat; аминокислотной последовательностью CDR2, практически такой же, как SEQ ID NO: 734, или идентичной ей, как определено в соответствии со способом по Kabat; и аминокислотной последовательностью CDR3, практически такой же, как SEQ ID NO: 736, или идентичной ей, как определено в соответствии со способом по Kabat. Антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут включать легкую цепь с аминокислотной последовательностью CDR1, практически такой же, как SEQ ID NO: 846, или идентичной ей, как определено в соответствии со способом по Kabat; аминокислотной последовательностью CDR2, практически такой же, как SEQ ID NO: 848, или идентичной ей, как определено в соответствии со способом по Kabat; и аминокислотной последовательностью CDR3, практически такой же, как SEQ ID NO: 850, или идентичной ей, как определено в соответствии со способом по Kabat, а также содержат тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью CDR1, практически такой же, как SEQ ID NO: 732, или идентичной ей, как определено в соответствии со способом по Kabat; аминокислотной последовательностью CDR2, практически такой же, как SEQ ID NO: 734, или идентичной ей, как определено в соответствии со способом по Kabat; и аминокислотной последовательностью CDR3, практически такой же, как SEQ ID NO: 736, или идентичной ей, как определено в соответствии со способом по Kabat.

[0080] Согласно некоторым вариантам осуществления антитела к тау или антигенсвязывающие фрагменты могут включать аминокислотную последовательность CDR1 легкой цепи, практически такую же, как SEQ ID NO: 1116, или идентичную ей, как определено согласно IMGT. Согласно некоторым вариантам осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут включать аминокислотную последовательность CDR2 легкой цепи, практически такую же, как SEQ ID NO: 1118, или идентичную ей, как определено согласно IMGT. Согласно некоторым вариантам осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут включать аминокислотную последовательность CDR3 легкой цепи, практически такую же, как SEQ ID NO: 1120, или идентичную ей, как определено согласно IMGT. Согласно некоторым вариантам осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут включать аминокислотную последовательность CDR1 тяжелой цепи, практически такую же, как SEQ ID NO: 1002, или идентичную ей, как определено согласно IMGT. Согласно некоторым вариантам осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут включать аминокислотную последовательность CDR2 тяжелой цепи, практически такую же, как SEQ ID NO: 1004, или идентичную ей, как определено согласно IMGT. Согласно некоторым вариантам осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут включать аминокислотную последовательность CDR3 тяжелой цепи, практически такую же, как SEQ ID NO: 1006, или идентичную ей, как определено согласно IMGT. Антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут включать легкую цепь с аминокислотной последовательностью CDR1, практически такой же, как SEQ ID NO: 1116, или идентичной ей, как определено согласно IMGT; аминокислотной последовательностью CDR2, практически такой же, как SEQ ID NO: 1118, или идентичной ей, как определено согласно IMGT; и аминокислотной последовательностью CDR3, практически такой же, как SEQ ID NO: 1120, или идентичной ей, как определено согласно IMGT. Антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут включать тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью CDR1, практически такой же, как SEQ ID NO: 1002, или идентичной ей, как определено согласно IMGT; аминокислотной последовательностью CDR2, практически такой же, как SEQ ID NO: 1004, или идентичной ей, как определено согласно IMGT; и аминокислотной последовательностью CDR3, практически такой же, как SEQ ID NO: 1006, или идентичной ей, как определено согласно IMGT. Антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут включать легкую цепь с аминокислотной последовательностью CDR1, практически такой же, как SEQ ID NO: 1116, или идентичной ей, как определено согласно IMGT; аминокислотной последовательностью CDR2, практически такой же, как SEQ ID NO: 1118, или идентичной ей, как определено согласно IMGT; и аминокислотной последовательностью CDR3, практически такой же, как SEQ ID NO: 1120, или идентичной ей, как определено согласно IMGT, а также содержат тяжелую цепь с аминокислотнойпоследовательностью CDR1, практически такой же, как SEQ ID NO: 1002, или идентичной ей, как определено согласно IMGT; аминокислотной последовательностью CDR2, практически такой же, как SEQ ID NO: 1004, или идентичной ей, как определено согласно IMGT; и аминокислотной последовательностью CDR3, практически такой же, как SEQ ID NO: 1006, или идентичной ей, как определено согласно IMGT.

[0081] Антигенсвязывающие композиции CDR также могут быть сконструированы с применением антитело-подобных белков в виде CDR-скаффолдов. Такие сконструированные антигенсвязывающие белки включены в объем настоящего раскрытия.

[0082] Согласно некоторым вариантам осуществления антител или антигенсвязывающих фрагментов, которые специфически связывают описанный в настоящем документе тау, определенные остатки изменяют для улучшения характеристик связывания и/или сворачивания антитела или антигенсвязывающего фрагмента. Например, согласно некоторым вариантам осуществления раскрытых моноклональных антител и антигенсвязывающих фрагментов остаток в положении 49 легкой цепи в соответствии со способом по Kabat не является цистеином. Согласно некоторым вариантам осуществления раскрытых моноклональных антител и антигенсвязывающих фрагментов остаток в положении 49 легкой цепи в соответствии со способом по Kabat представляет собой серии. Согласно некоторым вариантам осуществления антител или антигенсвязывающих фрагментов, которые специфически связывают описанный в настоящем документе тау, остаток в положении 57 тяжелой цепи в соответствии со способом по Kabat не является цистеином. Согласно некоторым вариантам осуществления остаток в положении 57 тяжелой цепи в соответствии со способом по Kabat представляет собой серии. Согласно некоторым вариантам осуществления антител или антигенсвязывающих фрагментов, которые специфически связывают описанный в настоящем документе тау, остаток в положении 34 легкой цепи в соответствии со способом по Kabat представляет собой глутамат. Согласно некоторым вариантам осуществления антител или антигенсвязывающих фрагментов, которые специфически связывают описанный в настоящем документе тау, остаток в положении 36 легкой цепи в соответствии со способом по Kabat не является фенилаланином. Остаток в положении 36 легкой цепи в соответствии со способом по Kabat может представлять собой тирозин. Согласно некоторым вариантам осуществления антител или антигенсвязывающих фрагментов, которые специфически связывают описанный в настоящем документе тау, остаток в положении 46 легкой цепи в соответствии со способом по Kabat не является аргинином. Остаток в положении 46 легкой цепи в соответствии со способом по Kabat может представлять собой лейцин. Согласно некоторым вариантам осуществления антител или антигенсвязывающих фрагментов, которые специфически связывают описанный в настоящем документе тау, остаток в положении 94 тяжелой цепи в соответствии со способом по Kabat не является лизином. Согласно некоторым вариантам осуществления антител или антигенсвязывающих фрагментов, которые специфически связывают описанный в настоящем документе тау, остаток в положении 71 тяжелой цепи в соответствии со способом по Kabat не является аргинином. Остаток в положении 71 тяжелой цепи в соответствии со способом по Kabat может представлять собой валин.

[0083] Описанные антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают тау, могут включать вариабельный домен легкой цепи, который включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 411, или идентичную ей. Согласно некоторым аспектам представлен выделенный полинуклеотид, который кодирует последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 411, или идентичную ей. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенный полинуклеотид, который включает последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 410, или идентичную ей, может кодировать такую аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи. Описанные антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают тау, могут включать вариабельный домен тяжелой цепи, который включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 196, или идентичную ей. Согласно некоторым аспектам представлен выделенный полинуклеотид, который кодирует последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 196, или идентичную ей. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенный полинуклеотид, который включает последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 195, или идентичную ей, может кодировать такую аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи. Описанные антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают тау, могут включать вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, где вариабельный домен легкой цепи включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 411, или идентичную ей, а вариабельный домен тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 196, или идентичную ей. Согласно некоторым аспектам представлен выделенный полинуклеотид, который кодирует последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 411, или идентичную ей, и последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 196, или идентичную ей. Согласно некоторым вариантам осуществления представлен выделенный полинуклеотид, который включает последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 410, или идентичную ей, и последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 195, или идентичную ей.

[0084] Описанные антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают тау, могут включать вариабельный домен легкой цепи, который включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 465, или идентичную ей. Согласно некоторым аспектам представлен выделенный полинуклеотид, который кодирует последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 465, или идентичную ей. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенный полинуклеотид, который включает последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 464, или идентичную ей, может кодировать такую аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи. Описанные антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают тау, могут включать вариабельный домен тяжелой цепи, который включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 268, или идентичную ей. Согласно некоторым аспектам представлен выделенный полинуклеотид, который кодирует последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 268, или идентичную ей. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенный полинуклеотид, который включает последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 267, или идентичную ей, может кодировать такую аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи. Описанные антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают тау, могут включать вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, где вариабельный домен легкой цепи включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 465, или идентичную ей, а вариабельный домен тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 268, или идентичную ей. Согласно некоторым аспектам представлен выделенный полинуклеотид, который кодирует последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 465, или идентичную ей, и последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 268, или идентичную ей. Согласно некоторым вариантам осуществления представлен выделенный полинуклеотид, который включает последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 464, или идентичную ей, и последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 267, или идентичную ей.

[0085] Описанные антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают тау, могут включать вариабельный домен легкой цепи, который включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 581, или идентичную ей. Согласно некоторым аспектам представлен выделенный полинуклеотид, который кодирует последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 581, или идентичную ей. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенный полинуклеотид, который включает последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 580, или идентичную ей, может кодировать такую аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи. Описанные антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают тау, могут включать вариабельный домен тяжелой цепи, который включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 268, или идентичную ей. Согласно некоторым аспектам представлен выделенный полинуклеотид, который кодирует последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 268, или идентичную ей. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенный полинуклеотид, который включает последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 267, или идентичную ей, может кодировать такую аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи. Описанные антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают тау, могут включать вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, где вариабельный домен легкой цепи включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 581, или идентичную ей, а вариабельный домен тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 268, или идентичную ей. Согласно некоторым аспектам представлен выделенный полинуклеотид, который кодирует последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 581, или идентичную ей, и последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 268, или идентичную ей. Согласно некоторым вариантам осуществления представлен выделенный полинуклеотид, который включает последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 580, или идентичную ей, и последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 267, или идентичную ей.

[0086] Описанные антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают тау, могут включать вариабельный домен легкой цепи, который включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 545, или идентичную ей. Согласно некоторым аспектам представлен выделенный полинуклеотид, который кодирует последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 545, или идентичную ей. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенный полинуклеотид, который включает последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 544, или идентичную ей, может кодировать такую аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи. Описанные антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают тау, могут включать вариабельный домен тяжелой цепи, который включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 384, или идентичную ей. Согласно некоторым аспектам представлен выделенный полинуклеотид, который кодирует последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 384, или идентичную ей. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенный полинуклеотид, который включает последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 383, или идентичную ей, может кодировать такую аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи. Описанные антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают тау, могут включать вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, где вариабельный домен легкой цепи включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 545, или идентичную ей, а вариабельный домен тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 384, или идентичную ей. Согласно некоторым аспектам представлен выделенный полинуклеотид, который кодирует последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 545, или идентичную ей, и последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 384, или идентичную ей. Согласно некоторым вариантам осуществления представлен выделенный полинуклеотид, который включает последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 544, или идентичную ей, и последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 383, или идентичную ей.

[0087] Описанные антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают тау, могут включать вариабельный домен легкой цепи, который включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 545, или идентичную ей. Согласно некоторым аспектам представлен выделенный полинуклеотид, который кодирует последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 545, или идентичную ей. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенный полинуклеотид, который включает последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 544, или идентичную ей, может кодировать такую аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи. Описанные антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают тау, могут включать вариабельный домен тяжелой цепи, который включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 393, или идентичную ей. Согласно некоторым аспектам представлен выделенный полинуклеотид, который кодирует последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 393, или идентичную ей. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенный полинуклеотид, который включает последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 392, или идентичную ей, может кодировать такую аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи. Описанные антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают тау, могут включать вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, где вариабельный домен легкой цепи включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 545, или идентичную ей, а вариабельный домен тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 393, или идентичную ей. Согласно некоторым аспектам представлен выделенный полинуклеотид, который кодирует последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 545, или идентичную ей, и последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 393, или идентичную ей. Согласно некоторым вариантам осуществления представлен выделенный полинуклеотид, который включает последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 544, или идентичную ей, и последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 392, или идентичную ей.

[0088] Описанные антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают тау, могут включать вариабельный домен легкой цепи, который включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 545, или идентичную ей. Согласно некоторым аспектам представлен выделенный полинуклеотид, который кодирует последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 545, или идентичную ей. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенный полинуклеотид, который включает последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 544, или идентичную ей, может кодировать такую аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи. Описанные антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают тау, могут включать вариабельный домен тяжелой цепи, который включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 402, или идентичную ей. Согласно некоторым аспектам представлен выделенный полинуклеотид, который кодирует последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 402, или идентичную ей. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенный полинуклеотид, который включает последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 401, или идентичную ей, может кодировать такую аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи. Описанные антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают тау, могут включать вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, где вариабельный домен легкой цепи включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 545, или идентичную ей, а вариабельный домен тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 402, или идентичную ей. Согласно некоторым аспектам представлен выделенный полинуклеотид, который кодирует последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 545, или идентичную ей, и последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 402, или идентичную ей. Согласно некоторым вариантам осуществления представлен выделенный полинуклеотид, который включает последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 544, или идентичную ей, и последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 401, или идентичную ей.

[0089] Описанные антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают тау, могут включать вариабельный домен легкой цепи, который включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 572, или идентичную ей. Согласно некоторым аспектам представлен выделенный полинуклеотид, который кодирует последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 572, или идентичную ей. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенный полинуклеотид, который включает последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 571, или идентичную ей, может кодировать такую аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи. Описанные антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают тау, могут включать вариабельный домен тяжелой цепи, который включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 384, или идентичную ей. Согласно некоторым аспектам представлен выделенный полинуклеотид, который кодирует последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 384, или идентичную ей. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенный полинуклеотид, который включает последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 383, или идентичную ей, может кодировать такую аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи. Описанные антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают тау, могут включать вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, где вариабельный домен легкой цепи включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 572, или идентичную ей, а вариабельный домен тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 384, или идентичную ей. Согласно некоторым аспектам представлен выделенный полинуклеотид, который кодирует последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 572, или идентичную ей, и последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 384, или идентичную ей. Согласно некоторым вариантам осуществления представлен выделенный полинуклеотид, который включает последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 571, или идентичную ей, и последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 383, или идентичную ей.

[0090] Описанные антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают тау, могут включать вариабельный домен легкой цепи, который включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 572, или идентичную ей. Согласно некоторым аспектам представлен выделенный полинуклеотид, который кодирует последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 572, или идентичную ей. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенный полинуклеотид, который включает последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 571, или идентичную ей, может кодировать такую аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи. Описанные антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают тау, могут включать вариабельный домен тяжелой цепи, который включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 393, или идентичную ей. Согласно некоторым аспектам представлен выделенный полинуклеотид, который кодирует последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 393, или идентичную ей. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенный полинуклеотид, который включает последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 392, или идентичную ей, может кодировать такую аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи. Описанные антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают тау, могут включать вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, где вариабельный домен легкой цепи включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 572, или идентичную ей, а вариабельный домен тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 393, или идентичную ей. Согласно некоторым аспектам представлен выделенный полинуклеотид, который кодирует последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 572, или идентичную ей, и последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 393, или идентичную ей. Согласно некоторым вариантам осуществления представлен выделенный полинуклеотид, который включает последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 571, или идентичную ей, и последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 392, или идентичную ей.

[0091] Описанные антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают тау, могут включать вариабельный домен легкой цепи, который включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 572, или идентичную ей. Согласно некоторым аспектам представлен выделенный полинуклеотид, который кодирует последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 572, или идентичную ей. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенный полинуклеотид, который включает последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 571, или идентичную ей, может кодировать такую аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи. Описанные антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают тау, могут включать вариабельный домен тяжелой цепи, который включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 402, или идентичную ей. Согласно некоторым аспектам представлен выделенный полинуклеотид, который кодирует последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 402, или идентичную ей. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенный полинуклеотид, который включает последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 401, или идентичную ей, может кодировать такую аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи. Описанные антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают тау, могут включать вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, где вариабельный домен легкой цепи включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 572, или идентичную ей, а вариабельный домен тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 402, или идентичную ей. Согласно некоторым аспектам представлен выделенный полинуклеотид, который кодирует последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 572, или идентичную ей, и последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 402, или идентичную ей. Согласно некоторым вариантам осуществления представлен выделенный полинуклеотид, который включает последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 571, или идентичную ей, и последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 401, или идентичную ей.

[0092] Согласно некоторым вариантам осуществления антитела, которые специфически связывают тау, продуцируются антитело-продуцирующими клетками, депонированными в Американской коллекции типовых культур (10801 Университетский Бульвар, Манассас, Вирджиния 20110-2209) 11 октября 2017 года, и им был присвоен номер доступа РТА-124523 или РТА-124524. Согласно некоторым вариантам осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты характеризуются аффинностью связывания в отношении мономерного тау 2N4R дикого типа антител, продуцируемых депонированными антитело-продуцирующими клетками, как измерено с помощью метода поверхностного плазмонного резонанса. Согласно некоторым вариантам осуществления раскрытые антитела или их антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR легкой и тяжелой цепей антител, продуцируемых депонированными антитело-продуцирующими клетками. Согласно некоторым вариантам осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельные области легкой и тяжелой цепей антител, продуцируемых депонированными антитело-продуцирующими клетками.

[0093] Антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают описанный в настоящем документе тау, включают варианты с одной или несколькими аминокислотными заменами, делециями или добавлениями, у которых сохраняются биологические свойства (например, аффинность связывания или иммуноэффекторная активность) описанных антител или антигенсвязывающих фрагментов. Специалист в данной области может получить варианты с одной или несколькими аминокислотными заменами, делециями или добавлениями. Такие варианты могут включать: (а) варианты, в которых один или несколько аминокислотных остатков заменены консервативными или неконсервативными аминокислотами, (b) варианты, в которых одна или несколько аминокислот добавлены или удалены из полипептида, (с) варианты, в которых одна или несколько аминокислот включают замещающую группу, и (d) варианты, в которых полипептид слит с другим пептидом или полипептидом, таким как партнер по слиянию, белковая метка или другой химический фрагмент, который может придавать пригодные свойства полипептиду, такие как, например, эпитоп для антитела, полигистидиновая последовательность, биотиновый фрагмент и т.д. Описанные в настоящем документе антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут включать варианты, в которых аминокислотные остатки из одного вида заменены соответствующим остатком другого вида, либо в консервативных, либо неконсервативных положениях. Согласно другим вариантам осуществления аминокислотные остатки в неконсервативных положениях заменены консервативными или неконсервативными остатками. Методики получения таких вариантов, включая генетические (супрессии, делеции, мутации и т.д.), химические и ферментативные методики известны среднему специалисту в данной области.

[0094] Описанные в настоящем документе антитела или антигенсвязывающие фрагменты характеризуются показателями аффинности связывания (в нМ) в отношении мономерного тау 2N4R дикого типа, которые включают константу диссоциации (K_D) менее чем приблизительно 1×10^-8 М, как измерено с помощью метода поверхностного плазмонного резонанса. Согласно определенным вариантам осуществления описанные в настоящем документе антитела или антигенсвязывающие фрагменты характеризуются показателями аффинности связывания (в нМ) в отношении мономерного тау 2N4R дикого типа, которые включают константу диссоциации (K_D) менее чем приблизительно 0,5 нМ, как измерено с помощью метода поверхностного плазмонного резонанса. Согласно определенным вариантам осуществления описанные в настоящем документе антитела или антигенсвязывающие фрагменты характеризуются показателями аффинности связывания (в нМ) в отношении мономерного тау 2N4R дикого типа, которые включают константу диссоциации (K_D) менее чем приблизительно 0,3 нМ, как измерено с помощью метода поверхностного плазмонного резонанса. Согласно определенным вариантам осуществления описанные в настоящем документе антитела или антигенсвязывающие фрагменты характеризуются показателями аффинности связывания (в нМ) в отношении мономерного тау 2N4R дикого типа, которые включают константу диссоциации (K_D) менее чем приблизительно 0,2 нМ, как измерено с помощью метода поверхностного плазмонного резонанса. Согласно определенным вариантам осуществления описанные в настоящем документе антитела или антигенсвязывающие фрагменты характеризуются показателями аффинности связывания (в нМ) в отношении мономерного тау 2N4R дикого типа, которые включают константу диссоциации (K_D) менее чем приблизительно 0,15 нМ, как измерено с помощью метода поверхностного плазмонного резонанса. Согласно определенным вариантам осуществления описанные в настоящем документе антитела или антигенсвязывающие фрагменты характеризуются показателями аффинности связывания (в нМ) в отношении мономерного тау 2N4R дикого типа, которые включают константу диссоциации (K_D) менее чем приблизительно 0,1 нМ, как измерено с помощью метода поверхностного плазмонного резонанса.

[0095] Согласно любому из вариантов осуществления антител или антигенсвязывающих фрагментов, которые специфически связывают описанный в настоящем документе тау, антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут связывать эпитоп, содержащий HVPG (SEQ ID NO: 1133). Согласно некоторым вариантам осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают описанный в настоящем документе тау, являются биэпитопными. Согласно определенным аспектам антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают описанный в настоящем документе тау, связывают один или несколько эпитопов в пределах тау, содержащих HVPG (SEQ ID NO: 1133). Эта последовательность в тау 2N4R человека встречается дважды. Первый сайт находится в тау 2N4R в пределах второй повторяющейся области, охватывая остатки 299-302, а второй сайт находится в пределах четвертой повторяющей области, охватывая остатки 362-365.

[0096] Согласно любому из вариантов осуществления антител или антигенсвязывающих фрагментов, которые специфически связывают описанный в настоящем документе тау, антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут связывать эпитоп, содержащий HVPGG (SEQ ID NO: 79). Согласно некоторым вариантам осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают описанный в настоящем документе тау, являются биэпитопными. Согласно определенным аспектам антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают описанный в настоящем документе тау, связывают один или несколько эпитопов в пределах тау, содержащих HVPGG (SEQ ID NO: 79). Эта последовательность в тау 2N4R человека встречается дважды. Первый сайт находится в тау 2N4R в пределах второй повторяющейся области, охватывая остатки 299-303, а второй сайт находится в пределах четвертой повторяющей области, охватывая остатки 362-366. Согласно определенным аспектам антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают тау, связывают эпитоп в пределах тау, содержащий HVPGG (SEQ ID NO: 79) в пределах повторяющейся области 2 или повторяющейся области 4, с предпочтением в отношении связывания пептида, которое по меньшей мере 10-кратно, предпочтительно по меньшей мере 20-кратно и более предпочтительно по меньшей мере 30-кратно превышает таковое в отношении связывания с эпитопом в пределах тау, содержащим HKPGG (SEQ ID NO: 182) в пределах повторяющейся области 3, как определено с помощью анализа связывания пептидов (например, анализа связывания пептидов, описанного в примере 3). Согласно определенным аспектам антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают тау, связывают эпитоп в пределах тау, содержащий HVPGG (SEQ ID NO: 79) в пределах повторяющейся области 2 или повторяющейся области 4, с предпочтением в отношении связывания пептида, которое по меньшей мере 10-кратно, предпочтительно по меньшей мере 20-кратно и более предпочтительно по меньшей мере 30-кратно превышает таковое в отношении связывания с эпитопом в пределах тау, содержащим HQPGG (SEQ ID NO: 183) в пределах повторяющейся области 1, как определено с помощью анализа связывания пептидов (например, анализа связывания пептидов, описанного в примере 3). Согласно определенным аспектам антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают тау, связывают эпитоп в пределах тау, содержащий HVPGG (SEQ ID NO: 79) в пределах повторяющейся области 2 или повторяющейся области 4, с предпочтением в отношении связывания пептида, которое по меньшей мере 10-кратно, предпочтительно по меньшей мере 20-кратно и более предпочтительно по меньшей мере 30-кратно превышает таковое в отношении связывания с эпитопом в пределах тау, содержащим HKPGG (SEQ ID NO: 182) в пределах повторяющейся области 3, и которое по меньшей мере 10-кратно, предпочтительно по меньшей мере 20-кратно и более предпочтительно по меньшей мере 30-кратно превышает связывание с эпитопом, содержащим HQPGG (SEQ ID NO: 183) в пределах повторяющейся области 1, как определено с помощью анализа связывания пептидов (например, анализа связывания пептидов, описанного в примере 3). Согласно определенным аспектам антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают тау, не связывают эпитоп в пределах встречающегося в природе мутантного тау P301S, содержащий HVSGG (SEQ ID NO: 184) в пределах повторяющейся области 2, как определено с помощью анализа связывания пептидов (например, анализа связывания пептидов, описанного в примере 4). Согласно определенным аспектам антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают тау, не связывают эпитоп в пределах встречающегося в природе мутантного тау P301L, содержащий HVLGG (SEQ ID NO: 185) в пределах повторяющейся области 2, как определено с помощью анализа связывания пептидов (например, анализа связывания пептидов, описанного в примере 4). Аминокислотная последовательность HVSGG (SEQ ID NO: 184) присутствует в пределах остатков 299-303 в последовательности тау 2N4R моделей таупатий с мутацией P301S in vitro и in vivo. Аминокислотная последовательность HVLGG (SEQ ID NO: 185) присутствует в пределах остатков 299-303 последовательности тау 2N4R моделей таупатий с мутацией P301L in vitro и in vivo. Представленные в настоящем документе антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые предпочтительно связывают один или несколько эпитопов в пределах тау, содержащих HVPGG (SEQ ID NO: 79) в пределах повторяющейся области 2 или повторяющейся области 4, по сравнению с эпитопом, содержащим HKPGG (SEQ ID NO: 182 в пределах повторяющейся области 3 или HQPGG (SEQ ID NO: 183) в пределах повторяющейся области 1, и не связывают эпитоп, содержащий HVSGG (SEQ ID NO: 184) или HVLGG (SEQ ID NO: 185) в пределах повторяющейся области 2, связывают тау 2N4R P301S/L по остаткам 362-366. Неожиданно, как продемонстрировано в настоящем документе, описанные антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые предпочтительно связывают один или несколько эпитопов в пределах тау, содержащих HVPGG (SEQ ID NO: 79) в пределах повторяющейся области 2 или повторяющейся области 4, по сравнению с эпитопом, содержащим HKPGG (SEQ ID NO: 182) в пределах повторяющейся области 3 или HQPGG (SEQ ID NO: 183) в пределах повторяющейся области 1, и которые не связываются с эпитопом, содержащим HVSGG (SEQ ID NO: 184) или HVLGG (SEQ ID NO: 185) в пределах повторяющейся области 2, снижают диссеминацию и распространение тау in vivo.

[0097] Согласно определенным вариантам осуществления представлены меченые антитела к тау. Метки включают без ограничения метки или фрагменты, которые обнаруживаются прямо (например, флуоресцентные, хромофорные, электронно-плотные, хемилюминесцентные и радиоактивные метки) и метки и фрагменты (например, ферменты или лиганды), которые обнаруживают опосредованно (например, посредством ферментативной реакции или молекулярного взаимодействия). Иллюстративные метки включают без ограничения радиоактивные метки (например, ³²Р, ¹⁴С, ¹¹¹I, ¹²⁵I, ³Н, ¹³¹I), флуоресцентные метки (такие как DyLight™ 649), эпитопные метки, биотин, хромофорные метки, ECL-метки или ферменты. Более конкретно, описанные метки включают рутений, ¹¹¹In-DOTA, ¹¹¹In-диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTPA), пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу и бета-галактозидазу, полигистидин (HIS-метка), акридиновые красители, цианиновые красители, флуороновые красители, оксазиновые красители, фенантридиновые красители, родаминовые красители, красители Alexafluor™ и т.д.

[0098] Также раскрыты выделенные полинуклеотиды, которые кодируют антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связываются с тау. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенные полинуклеотиды кодируют антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с последовательностью CDR1 легкой цепи, определенной в соответствии с Kabat, практически такой же, как SEQ ID NO: 738, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 737. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенные полинуклеотиды кодируют антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с CDR2 легкой цепи, определенной в соответствии с Kabat, практически такой же, как SEQ ID NO: 740, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 739. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенные полинуклеотиды кодируют антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с CDR3 легкой цепи, определенной в соответствии с Kabat, практически такой же, как SEQ ID NO: 742, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 741. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенные полинуклеотиды кодируют антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с CDR1 тяжелой цепи, определенной в соответствии с Kabat, практически такой же, как SEQ ID NO: 594, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 593. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенные полинуклеотиды кодируют антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с CDR2 тяжелой цепи, определенной в соответствии с Kabat, практически такой же, как SEQ ID NO: 596, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 595. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенные полинуклеотиды кодируют антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с CDR3 тяжелой цепи, определенной в соответствии с Kabat, практически такой же, как SEQ ID NO: 598, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 597. Выделенные полинуклеотиды могут кодировать антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющие легкую цепь с CDR1, практически такой же, как SEQ ID NO: 738, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 737; CDR2, практически такой же, как SEQ ID NO: 740, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 739; и CDR3, практически такой же, как SEQ ID NO: 742, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 741, определенными в соответствии с Kabat. Выделенные полинуклеотиды могут кодировать антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с CDR1 тяжелой цепи, практически такой же, как SEQ ID NO: 594, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 593; CDR2, практически такой же, как SEQ ID NO: 596, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 595; и CDR3, практически такой же, как SEQ ID NO: 598, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 597, определенными в соответствии с Kabat. Выделенные полинуклеотиды могут кодировать антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с CDR1 легкой цепи, практически такой же, как SEQ ID NO: 738, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 737; CDR2, кодируемой нуклеотидной последовательностью, практически такой же, как SEQ ID NO: 740, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 739; и CDR3, кодируемой нуклеотидной последовательностью, практически такой же, как SEQ ID NO: 742, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 741; и CDR1 тяжелой цепи, практически такой же, как SEQ ID NO: 594, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 593; CDR2, практически такой же, как SEQ ID NO: 596, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 595; и CDR3, практически такой же, как SEQ ID NO: 598, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 597, определенными в соответствии с Kabat.

[0099] Согласно некоторым вариантам осуществления выделенные полинуклеотиды кодируют антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с последовательностью CDR1 легкой цепи, определенной в соответствии IMGT, практически такой же, как SEQ ID NO: 1008, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 1007. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенные полинуклеотиды кодируют антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с CDR2 легкой цепи, определенной в соответствии IMGT, практически такой же, как SEQ ID NO: 1010, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 1009. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенные полинуклеотиды кодируют антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с CDR3 легкой цепи, определенной в соответствии IMGT, практически такой же, как SEQ ID NO: 1012, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 1011. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенные полинуклеотиды кодируют антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с CDR1 тяжелой цепи, определенной в соответствии IMGT, практически такой же, как SEQ ID NO: 864, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 863. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенные полинуклеотиды кодируют антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с CDR2 тяжелой цепи, определенной в соответствии IMGT, практически такой же, как SEQ ID NO: 866, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 865. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенные полинуклеотиды кодируют антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с CDR3 тяжелой цепи, определенной в соответствии IMGT, практически такой же, как SEQ ID NO: 868, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 867. Выделенные полинуклеотиды могут кодировать антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющие легкую цепь с CDR1, практически такой же, как SEQ ID NO: 1008, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 1007; CDR2, практически такой же, как SEQ ID NO: 1010, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 1009; и CDR3, практически такой же, как SEQ ID NO: 1012, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 1011, определенной в соответствии с IMGT. Выделенные полинуклеотиды могут кодировать антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с CDR1 тяжелой цепи, практически такой же, как SEQ ID NO: 864, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 863; CDR2, практически такой же, как SEQ ID NO: 866, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 865; и CDR3, практически такой же, как SEQ ID NO: 868, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 867, определенной в соответствии с IMGT. Выделенные полинуклеотиды могут кодировать антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с CDR1 легкой цепи, практически такой же, как SEQ ID NO: 1008, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 1007; CDR2, кодируемой нуклеотидной последовательностью, практически такой же, как SEQ ID NO: 1010, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 1009; и CDR3, кодируемой нуклеотидной последовательностью, практически такой же, как SEQ ID NO: 1012, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 1011; и CDR1 тяжелой цепи, практически такой же, как SEQ ID NO: 864, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 863; CDR2, практически такой же, как SEQ ID NO: 866, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 865; и CDR3, практически такой же, как SEQ ID NO: 868, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 867, определенной в соответствии с IMGT.

[0100] Согласно некоторым вариантам осуществления выделенные полинуклеотиды кодируют антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с последовательностью CDR1 легкой цепи, практически такой же, как SEQ ID NO: 774, или идентичной ей, определенной в соответствии с Kabat, например, SEQ ID NO: 773. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенные полинуклеотиды кодируют антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с CDR2 легкой цепи, практически такой же, как SEQ ID NO: 776, или идентичной ей, определенной в соответствии с Kabat, например, SEQ ID NO: 775. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенные полинуклеотиды кодируют антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с CDR3 легкой цепи, практически такой же, как SEQ ID NO: 778, или идентичной ей, определенной в соответствии с Kabat, например, SEQ ID NO: 777. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенные полинуклеотиды кодируют антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с CDR1 тяжелой цепи, практически такой же, как SEQ ID NO: 642, или идентичной ей, определенной в соответствии с Kabat, например, SEQ ID NO: 641. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенные полинуклеотиды кодируют антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с CDR2 тяжелой цепи, практически такой же, как SEQ ID NO: 644, или идентичной ей, определенной в соответствии с Kabat, например, SEQ ID NO: 643. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенные полинуклеотиды кодируют антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с CDR3 тяжелой цепи, практически такой же, как SEQ ID NO: 646, или идентичной ей, определенной в соответствии с Kabat, например, SEQ ID NO: 645. Выделенные полинуклеотиды могут кодировать антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющие легкую цепь с CDR1, практически такой же, как SEQ ID NO: 774, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 773; CDR2, практически такой же, как SEQ ID NO: 776, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 775; и CDR3, практически такой же, как SEQ ID NO: 778, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 777, определенными в соответствии с Kabat. Выделенные полинуклеотиды могут кодировать антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с CDR1 тяжелой цепи, практически такой же, как SEQ ID NO: 642, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 641; CDR2, практически такой же, как SEQ ID NO: 644, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 643; и CDR3, практически такой же, как SEQ ID NO: 646, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 645, определенными в соответствии с Kabat. Выделенные полинуклеотиды могут кодировать антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с CDR1 легкой цепи, практически такой же, как SEQ ID NO: 774, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 773; CDR2, кодируемой нуклеотидной последовательностью, практически такой же, как SEQ ID NO: 776, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 775; и CDR3, кодируемой нуклеотидной последовательностью, практически такой же, как SEQ ID NO: 778, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 777; и CDR1 тяжелой цепи, практически такой же, как SEQ ID NO: 642, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 641; CDR2, практически такой же, как SEQ ID NO: 644, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 643; и CDR3, практически такой же, как SEQ ID NO: 646, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 645, определенными в соответствии с Kabat.

[0101] Согласно некоторым вариантам осуществления выделенные полинуклеотиды кодируют антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с последовательностью CDR1 легкой цепи, практически такой же, как SEQ ID NO: 1044, или идентичной ей, определенной в соответствии с IMGT, например, SEQ ID NO: 1043. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенные полинуклеотиды кодируют антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с CDR2 легкой цепи, практически такой же, как SEQ ID NO: 1046, или идентичной ей, определенной в соответствии с IMGT, например, SEQ ID NO: 1045. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенные полинуклеотиды кодируют антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с CDR3 легкой цепи, практически такой же, как SEQ ID NO: 1048, или идентичной ей, определенной в соответствии с IMGT, например, SEQ ID NO: 1047. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенные полинуклеотиды кодируют антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с CDR1 тяжелой цепи, практически такой же, как SEQ ID NO: 912, или идентичной ей, определенной в соответствии с IMGT, например, SEQ ID NO: 911. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенные полинуклеотиды кодируют антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с CDR2 тяжелой цепи, практически такой же, как SEQ ID NO: 914, или идентичной ей, определенной в соответствии с IMGT, например, SEQ ID NO: 913. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенные полинуклеотиды кодируют антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с CDR3 тяжелой цепи, практически такой же, как SEQ ID NO: 916, или идентичной ей, определенной в соответствии с IMGT, например, SEQ ID NO: 915. Выделенные полинуклеотиды могут кодировать антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющие легкую цепь с CDR1, практически такой же, как SEQ ID NO: 1044, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 1043; CDR2, практически такой же, как SEQ ID NO: 1046, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 1045; и CDR3, практически такой же, как SEQ ID NO: 1048, например, SEQ ID NO: 1047, определенными в соответствии с IMGT. Выделенные полинуклеотиды могут кодировать антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с CDR1 тяжелой цепи, практически такой же, как SEQ ID NO: 912, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 911; CDR2, практически такой же, как SEQ ID NO: 914, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 913; и CDR3, практически такой же, как SEQ ID NO: 916, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 915, определенными в соответствии с IMGT. Выделенные полинуклеотиды могут кодировать антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с CDR1 легкой цепи, практически такой же, как SEQ ID NO: 1044, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 1043; CDR2, кодируемой нуклеотидной последовательностью, практически такой же, как SEQ ID NO: 1046, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 1045; и CDR3, кодируемой нуклеотидной последовательностью, практически такой же, как SEQ ID NO: 1048, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 1047; и CDR1 тяжелой цепи, практически такой же, как SEQ ID NO: 912, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 911; CDR2, практически такой же, как SEQ ID NO: 914, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 913; и CDR3, практически такой же, как SEQ ID NO: 916, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 915, определенными в соответствии с IMGT.

[0102] Согласно некоторым вариантам осуществления выделенные полинуклеотиды кодируют антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с последовательностью CDR1 легкой цепи, практически такой же, как SEQ ID NO: 846, или идентичной ей, определенной в соответствии с Kabat, например, SEQ ID NO: 845. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенные полинуклеотиды кодируют антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с CDR2 легкой цепи, практически такой же, как SEQ ID NO: 848, или идентичной ей, определенной в соответствии с Kabat, например, SEQ ID NO: 847. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенные полинуклеотиды кодируют антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с CDR3 легкой цепи, практически такой же, как SEQ ID NO: 850, или идентичной ей, определенной в соответствии с Kabat, например, SEQ ID NO: 849. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенные полинуклеотиды кодируют антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с CDR1 тяжелой цепи, практически такой же, как SEQ ID NO: 732, или идентичной ей, определенной в соответствии с Kabat, например, SEQ ID NO: 731. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенные полинуклеотиды кодируют антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с CDR2 тяжелой цепи, практически такой же, как SEQ ID NO: 734, или идентичной ей, определенной в соответствии с Kabat, например, SEQ ID NO: 733. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенные полинуклеотиды кодируют антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с CDR3 тяжелой цепи, практически такой же, как SEQ ID NO: 736, или идентичной ей, определенной в соответствии с Kabat, например, SEQ ID NO: 735. Выделенные полинуклеотиды могут кодировать антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющие легкую цепь с CDR1, практически такой же, как SEQ ID NO:846, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 845; CDR2, практически такой же, как SEQ ID NO: 848, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 847; и CDR3, практически такой же, как SEQ ID NO: 850, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 849, определенными в соответствии с Kabat. Выделенные полинуклеотиды могут кодировать антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с CDR1 тяжелой цепи, практически такой же, как SEQ ID NO: 732, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 731; CDR2, практически такой же, как SEQ ID NO: 734, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 733; и CDR3, практически такой же, как SEQ ID NO: 736, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 735, определенными в соответствии с Kabat. Выделенные полинуклеотиды могут кодировать антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с CDR1 легкой цепи, практически такой же, как SEQ ID NO: 846, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 845; CDR2, кодируемой нуклеотидной последовательностью, практически такой же, как SEQ ID NO: 848, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 847; и CDR3, кодируемой нуклеотидной последовательностью, практически такой же, как SEQ ID NO: 850, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 849; и CDR1 тяжелой цепи, практически такой же, как SEQ ID NO: 732, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 731; CDR2, практически такой же, как SEQ ID NO: 734, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 733; и CDR3, практически такой же, как SEQ ID NO: 736, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 735, определенными в соответствии с Kabat.

[0103] Согласно некоторым вариантам осуществления выделенные полинуклеотиды кодируют антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с последовательностью CDR1 легкой цепи, практически такой же, как SEQ ID NO: 1116, или идентичной ей, определенной в соответствии с IMGT, например, SEQ ID NO: 1115. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенные полинуклеотиды кодируют антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с CDR2 легкой цепи, практически такой же, как SEQ ID NO: 1118, или идентичной ей, определенной в соответствии с IMGT, например, SEQ ID NO: 1117. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенные полинуклеотиды кодируют антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с CDR3 легкой цепи, практически такой же, как SEQ ID NO: 1120, или идентичной ей, определенной в соответствии с IMGT, например, SEQ ID NO: 1119. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенные полинуклеотиды кодируют антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с CDR1 тяжелой цепи, практически такой же, как SEQ ID NO: 1002, или идентичной ей, определенной в соответствии с IMGT, например, SEQ ID NO: 1001. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенные полинуклеотиды кодируют антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с CDR2 тяжелой цепи, практически такой же, как SEQ ID NO: 1004, или идентичной ей, определенной в соответствии с IMGT, например, SEQ ID NO: 1003. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенные полинуклеотиды кодируют антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с CDR3 тяжелой цепи, практически такой же, как SEQ ID NO: 1006, или идентичной ей, определенной в соответствии с IMGT, например, SEQ ID NO: 1005. Выделенные полинуклеотиды могут кодировать антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющие легкую цепь с CDR1, практически такой же, как SEQ ID NO: 1116, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 1115; CDR2, практически такой же, как SEQ ID NO: 1118, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 1117; и CDR3, практически такой же, как SEQ ID NO: 1120, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 1119, определенными в соответствии с IMGT. Выделенные полинуклеотиды могут кодировать антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с CDR1 тяжелой цепи, практически такой же, как SEQ ID NO: 1002, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 1001; CDR2, практически такой же, как SEQ ID NO: 1004, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 1003; и CDR3, практически такой же, как SEQ ID NO: 1006, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 1005, определенными в соответствии с IMGT. Выделенные полинуклеотиды могут кодировать антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с CDR1 легкой цепи, практически такой же, как SEQ ID NO: 1116, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 1115; CDR2, кодируемой нуклеотидной последовательностью, практически такой же, как SEQ ID NO: 1118, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 1117; и CDR3, кодируемой нуклеотидной последовательностью, практически такой же, как SEQ ID NO: 1120, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 1119; и CDR1 тяжелой цепи, практически такой же, как SEQ ID NO: 1002, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 1001; CDR2, практически такой же, как SEQ ID NO: 1004, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 1003; и CDR3, практически такой же, как SEQ ID NO: 1006, или идентичной ей, например, SEQ ID NO: 1005, определенными в соответствии с IMGT.

[0104] Описанные в настоящем документе полинуклеотиды могут кодировать антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат сегмент вариабельного домена легкой цепи, который включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 411, или идентичную ей, например, SEQ ID NO: 410. Согласно некоторым вариантам осуществления описанные выделенные полинуклеотиды могут кодировать антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат сегмент вариабельного домена тяжелой цепи, который включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 196, или идентичную ей, например, SEQ ID NO: 195. Согласно некоторым вариантам осуществления описанные выделенные полинуклеотиды могут кодировать антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат сегмент вариабельного домена легкой цепи, который включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 411, или идентичную ей, например, SEQ ID NO: 410; и сегмент вариабельного домена тяжелой цепи, который включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 196, или идентичную ей, например, SEQ ID NO: 195. Выделенные полинуклеотиды, способные кодировать представленные в настоящем документе сегменты вариабельного домена, могут быть включены в один и тот же, или в разные векторы для получения антител или антигенсвязывающих фрагментов.

[0105] Описанные в настоящем документе полинуклеотиды могут кодировать антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат сегмент вариабельного домена легкой цепи, который включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 465, или идентичную ей, например, SEQ ID NO: 464. Согласно некоторым вариантам осуществления описанные выделенные полинуклеотиды могут кодировать антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат сегмент вариабельного домена тяжелой цепи, который включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 268, или идентичную ей, например, SEQ ID NO: 267. Согласно некоторым вариантам осуществления описанные выделенные полинуклеотиды могут кодировать антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат сегмент вариабельного домена легкой цепи, который включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 465, или идентичную ей, например, SEQ ID NO: 464; и сегмент вариабельного домена тяжелой цепи, который включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 268, или идентичную ей, например, SEQ ID NO: 267. Выделенные полинуклеотиды, способные кодировать представленные в настоящем документе сегменты вариабельного домена, могут быть включены в один и тот же, или в разные векторы для получения антител или антигенсвязывающих фрагментов.

[0106] Описанные в настоящем документе полинуклеотиды могут кодировать антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат сегмент вариабельного домена легкой цепи, который включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 581, или идентичную ей, например, SEQ ID NO: 580. Согласно некоторым вариантам осуществления описанные выделенные полинуклеотиды могут кодировать антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат сегмент вариабельного домена тяжелой цепи, который включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 268, или идентичную ей, например, SEQ ID NO: 267. Согласно некоторым вариантам осуществления описанные выделенные полинуклеотиды могут кодировать антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат сегмент вариабельного домена легкой цепи, который включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 581, или идентичную ей, например, SEQ ID NO: 580; и сегмент вариабельного домена тяжелой цепи, который включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 268, или идентичную ей, например, SEQ ID NO: 267. Выделенные полинуклеотиды, способные кодировать представленные в настоящем документе сегменты вариабельного домена, могут быть включены в один и тот же, или в разные векторы для получения антител или антигенсвязывающих фрагментов.

[0107] Описанные в настоящем документе полинуклеотиды могут кодировать антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат сегмент вариабельного домена легкой цепи, который включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 545, или идентичную ей, например, SEQ ID NO: 544. Согласно некоторым вариантам осуществления описанные выделенные полинуклеотиды могут кодировать антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат сегмент вариабельного домена тяжелой цепи, который включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 384, или идентичную ей, например, SEQ ID NO: 383. Согласно некоторым вариантам осуществления описанные выделенные полинуклеотиды могут кодировать антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат сегмент вариабельного домена легкой цепи, который включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 545, или идентичную ей, например, SEQ ID NO: 544; и сегмент вариабельного домена тяжелой цепи, который включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 384, или идентичную ей, например, SEQ ID NO: 383. Выделенные полинуклеотиды, способные кодировать представленные в настоящем документе сегменты вариабельного домена, могут быть включены в один и тот же, или в разные векторы для получения антител или антигенсвязывающих фрагментов.

[0108] Описанные в настоящем документе полинуклеотиды могут кодировать антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат сегмент вариабельного домена легкой цепи, который включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 545, или идентичную ей, например, SEQ ID NO: 544. Согласно некоторым вариантам осуществления описанные выделенные полинуклеотиды могут кодировать антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат сегмент вариабельного домена тяжелой цепи, который включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 393, или идентичную ей, например, SEQ ID NO: 392. Согласно некоторым вариантам осуществления описанные выделенные полинуклеотиды могут кодировать антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат сегмент вариабельного домена легкой цепи, который включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 545, или идентичную ей, например, SEQ ID NO: 544; и сегмент вариабельного домена тяжелой цепи, который включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 393, или идентичную ей, например, SEQ ID NO: 392. Выделенные полинуклеотиды, способные кодировать представленные в настоящем документе сегменты вариабельного домена, могут быть включены в один и тот же, или в разные векторы для получения антител или антигенсвязывающих фрагментов.

[0109] Описанные в настоящем документе полинуклеотиды могут кодировать антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат сегмент вариабельного домена легкой цепи, который включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 545, или идентичную ей, например, SEQ ID NO: 544. Согласно некоторым вариантам осуществления описанные выделенные полинуклеотиды могут кодировать антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат сегмент вариабельного домена тяжелой цепи, который включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 402, или идентичную ей, например, SEQ ID NO: 401. Согласно некоторым вариантам осуществления описанные выделенные полинуклеотиды могут кодировать антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат сегмент вариабельного домена легкой цепи, который включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 545, или идентичную ей, например, SEQ ID NO: 544; и сегмент вариабельного домена тяжелой цепи, который включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 402, или идентичную ей, например, SEQ ID NO: 401. Выделенные полинуклеотиды, способные кодировать представленные в настоящем документе сегменты вариабельного домена, могут быть включены в один и тот же, или в разные векторы для получения антител или антигенсвязывающих фрагментов.

[0110] Описанные в настоящем документе полинуклеотиды могут кодировать антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат сегмент вариабельного домена легкой цепи, который включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 572, или идентичную ей, например, SEQ ID NO: 571. Согласно некоторым вариантам осуществления описанные выделенные полинуклеотиды могут кодировать антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат сегмент вариабельного домена тяжелой цепи, который включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 384, или идентичную ей, например, SEQ ID NO: 383. Согласно некоторым вариантам осуществления описанные выделенные полинуклеотиды могут кодировать антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат сегмент вариабельного домена легкой цепи, который включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 572, или идентичную ей, например, SEQ ID NO: 571; и сегмент вариабельного домена тяжелой цепи, который включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 384, или идентичную ей, например, SEQ ID NO: 383. Выделенные полинуклеотиды, способные кодировать представленные в настоящем документе сегменты вариабельного домена, могут быть включены в один и тот же, или в разные векторы для получения антител или антигенсвязывающих фрагментов.

[0111] Описанные в настоящем документе полинуклеотиды могут кодировать антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат сегмент вариабельного домена легкой цепи, который включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 572, или идентичную ей, например, SEQ ID NO: 571. Согласно некоторым вариантам осуществления описанные выделенные полинуклеотиды могут кодировать антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат сегмент вариабельного домена тяжелой цепи, который включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 393, или идентичную ей, например, SEQ ID NO: 392. Согласно некоторым вариантам осуществления описанные выделенные полинуклеотиды могут кодировать антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат сегмент вариабельного домена легкой цепи, который включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 572, или идентичную ей, например, SEQ ID NO: 571; и сегмент вариабельного домена тяжелой цепи, который включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 393, или идентичную ей, например, SEQ ID NO: 392. Выделенные полинуклеотиды, способные кодировать представленные в настоящем документе сегменты вариабельного домена, могут быть включены в один и тот же, или в разные векторы для получения антител или антигенсвязывающих фрагментов.

[0112] Описанные в настоящем документе полинуклеотиды могут кодировать антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат сегмент вариабельного домена легкой цепи, который включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 572, или идентичную ей, например, SEQ ID NO: 571. Согласно некоторым вариантам осуществления описанные выделенные полинуклеотиды могут кодировать антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат сегмент вариабельного домена тяжелой цепи, который включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 402, или идентичную ей, например, SEQ ID NO: 401. Согласно некоторым вариантам осуществления описанные выделенные полинуклеотиды могут кодировать антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат сегмент вариабельного домена легкой цепи, который включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 572, или идентичную ей, например, SEQ ID NO: 571; и сегмент вариабельного домена тяжелой цепи, который включает аминокислотную последовательность, практически такую же, как SEQ ID NO: 402, или идентичную ей, например, SEQ ID NO: 401. Выделенные полинуклеотиды, способные кодировать представленные в настоящем документе сегменты вариабельного домена, могут быть включены в один и тот же, или в разные векторы для получения антител или антигенсвязывающих фрагментов.

[0113] Полинуклеотиды, способные кодировать представленные в настоящем документе сегменты вариабельного домена, могут быть включены в один и тот же, или в разные векторы для получения антител или антигенсвязывающих фрагментов. Полинуклеотиды, кодирующие сконструированные антигенсвязывающие белки, также включены в объем настоящего раскрытия. Согласно некоторым вариантам осуществления описанные полинуклеотиды (и пептиды, которые они кодируют) включают лидерную последовательность. Можно использовать любую известную в данной области лидерную последовательность. Лидерная последовательность может включать без ограничения сайт рестрикции или сайт начала трансляции.

[0114] Также представлены векторы, содержащие описанные в настоящем документе полинуклеотиды. Векторы могут представлять собой векторы экспрессии. Рекомбинантные векторы экспрессии, содержащие последовательность, кодирующую представляющий интерес полипептид, следовательно, входят в объем настоящего раскрытия. Вектор экспрессии может содержать одну или несколько дополнительных последовательностей, таких как без ограничения регуляторные последовательности (например, промотор, энхансер), селективный маркер и сигнал полиаденилирования. Векторы для трансформации широкого спектра клеток-хозяев хорошо известны, и они включают без ограничения плазмиды, фагмиды, космиды, бакуловирусы, бакмиды, искусственные бактериальные хромосомы (ВАС), искусственные дрожжевые хромосомы (YAC), а также другие бактериальные, дрожжевые и вирусные векторы.

[0115] Рекомбинантные векторы экспрессии в пределах объема настоящего описания включают синтетические, геномные или происходящие из кДНК фрагменты нуклеиновых кислот, которые кодируют по меньшей мере один рекомбинантный белок, которые могут быть функционально связаны с подходящими регуляторными элементами. Такие регуляторные элементы могут включать промотор транскрипции, последовательности, кодирующие подходящие сайты связывания рибосом в мРНК, и последовательности, которые осуществляют контроль терминации транскрипции и трансляции. Векторы экспрессии, в особенности векторы экспрессии для экспрессии в клетках млекопитающих, могут также включать один или несколько нетранскрибируемых элементов, таких как точка начала репликации, подходящий промотор и энхансер, связанные с геном, который нужно экспрессировать, другие 5'- или 3'-фланкирующие нетранскрибируемые последовательности, 5'- или 3'-нетранслируемые последовательности (такие как необходимые сайты связывания рибосом), сайт полиаденилирования, донорные и акцепторные сайты сплайсинга или последовательности терминации транскрипции. Также может быть включена точка начала репликации, которая обеспечивает способность к репликации в хозяине.

[0116] Последовательности контроля транскрипции и трансляции в векторах экспрессии, применяемых для трансформации клеток позвоночных, могут быть получены из вирусов в качестве источников. Иллюстративные векторы могут быть сконструированы, как описано Okayama and Berg, 3 Mol. Cell. Biol. 280 (1983).

[0117] Согласно некоторым вариантам осуществления кодирующую антитело или антигенсвязывающий фрагмент последовательность помещают под контроль сильного конститутивного промотора, как, например, промоторов следующих генов: гипоксантинфосфорибозилтрансферазы (HPRT), аденозиндезаминазы, пируваткиназы, бета-актина, миозина человека, гемоглобина человека, мышечного креатина человека и других. Кроме того, многие вирусные промоторы функционируют конститутивно в эукариотических клетках, и являются подходящими для применения с описанными вариантами осуществления. Такие вирусные промоторы включают без ограничения промотор предранних генов цитомегаловирусa (CMV), промоторы ранних и поздних генов SV40, промотор вируса опухоли молочной железы мышей (MMTV), промотор из длинных концевых повторов (LTR) вируса лейкоза Молони, промотор вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), вируса Эпштейна-Барр (EBV), вируса саркомы Рауса (RSV) и других ретровирусов, и промотор тимидинкиназы вируса простого герпеса. Согласно одному варианту осуществления кодирующую антитело или его антигенсвязывающий фрагмент последовательность помещают под контроль индуцируемого промотора, такого как промотор гена металлотионеина, тетрациклин-индуцируемый промотор, доксициклин-индуцируемый промотор, промоторы, которые содержат один или несколько интерферон стимулируемых элементов ответа (ISRE), как, например, промоторы гена протеинкиназы R, 2',5'-олиго-аденилат-синтетаз, генов Мх, ADAR1 и т.д.

[0118] Описанные в настоящем документе векторы могут содержать один или несколько сайтов внутренней посадки рибосомы (IRES). Включение IRES-последовательности в слитые векторы может быть полезным для усиления экспрессии некоторых белков. Согласно некоторым вариантам осуществления векторная система будет включать один или несколько сайтов полиаденилирования (например, SV40), которые могут находиться выше или ниже любой из вышеупомянутых последовательностей нуклеиновых кислот. Компоненты вектора могут быть непрерывно соединены или расположены таким образом, чтобы обеспечивалось оптимальное расстояние для экспрессии генных продуктов (т.е. путем введения «спейсерных» нуклеотидов между ORF), или располагаться иным образом. Регуляторные элементы, такие как IRES-мотив, также могут быть расположены для обеспечения оптимального расстояния для экспрессии.

[0119] Векторы могут содержать селективные маркеры, которые хорошо известны в данной области. Селективные маркеры включают положительные и отрицательные селективные маркеры, например, гены устойчивости к антибиотикам (например, ген устойчивости к неомицину, ген устойчивости к гигромицину, ген устойчивости к канамицину, ген устойчивости к тетрациклину, ген устойчивости к пенициллину), гены глутамат-синтазы, HSV-TK, производные HSV-TK для селекции по ганцикловиру или ген бактериальной пурин-нуклеозидфосфорилазы для селекции по 6-метилпурину (Gadi et al., 7 Gene Ther. 1738-1743 (2000)). Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая селективный маркер или сайт клонирования, может находиться выше или ниже последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей представляющий интерес полипептид или сайт клонирования.

[0120] Описанные в настоящем документе векторы можно применять для трансформации различных клеток генами, кодирующими описанные антитела или антигенсвязывающие фрагменты. Например, векторы можно применять для получения клеток, продуцирующих антитело или антигенсвязывающий фрагмент. Таким образом, согласно другому аспекту представлены клетки-хозяева, трансформированные векторами, содержащими последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связывают тау, как, например, антитела или антигенсвязывающие фрагменты, описанные и приведенные в качестве примеров в настоящем документе.

[0121] В данной области известны многочисленные методики введения чужеродных генов в клетки, и их можно применять для конструирования рекомбинантных клеток для целей осуществления описанных способов, в соответствии с различными вариантами осуществления, описанными и приведенными в качестве примеров в настоящем документе. Применяемая методика должна обеспечивать стабильный перенос последовательности гетерологичного гена в клетку-хозяина так, чтобы последовательность гетерологичного гена могла унаследоваться и экспрессироваться потомством клеток, и чтобы необходимые связанные с развитием функции и физиологические функции реципиентных клеток не нарушались. Методики, которые можно применять, включают без ограничения перенос хромосом (например, слияние клеток, опосредованный хромосомами перенос генов, опосредованный микроклеткой перенос генов), физические способы (например, трансфекция, слияние сферопластов, микроинъекция, электропорация, перенос с помощью липосом), перенос с использованием вирусного вектора (например, рекомбинантные ДНК-вирусы, рекомбинантные РНК-вирусы) и т.д. (описано в Cline, 29 Pharmac. Ther. 69-92 (1985)). Осаждение фосфатом кальция и индуцированное полиэтиленгликолем (PEG) слияние бактериальных протопластов с клетками млекопитающих также можно применять для трансформации клеток.

[0122] Клетки, подходящие для применения при экспрессии описанных в настоящем документе антител или антигенсвязывающих фрагментов, предпочтительно представляют собой эукариотические клетки, более предпочтительно клетки растений, грызуна или человека, например, среди прочего, и без ограничения, клетки NS0, СНО, СНОK1, perC.6, Tk-ts13, ВНК, HEK293, COS-7, T98G, CV-1/EBNA, L-клетки, С127, 3Т3, HeLa, NS1 и линии клеток миеломы Sp2/0. Кроме того, экспрессия антител может осуществляться с помощью клеток гибридомы. Способы получения гибридом хорошо известны в данной области.

[0123] Клетки, трансформированные описанными в настоящем документе векторами экспрессии, могут быть подвергнуты селекции или скринингу в отношении рекомбинантной экспрессии описанных в настоящем документе антител или антигенсвязывающих фрагментов. Положительные по рекомбинантной конструкции клетки размножают и подвергают скринингу в отношении субклонов, характеризующихся требуемым фенотипом, например, высоким уровнем экспрессии, улучшенными свойствами роста или способностью производить белки с требуемыми биохимическими характеристиками, например, вследствие модификации белка или измененных посттрансляционных модификаций. Такие фенотипы могут быть обусловлены унаследованными свойствами данного субклона или мутацией. Мутации могут быть вызваны посредством применения химических веществ, УФ-света, излучения, вирусов, инсерционных мутагенов, ингибирования репарации ошибочно спаренных нуклеотидов или комбинации таких способов.

[0124] Согласно определенным вариантам осуществления представлена выделенная клеточная линия, экспрессирующая любые из описанных в настоящем документе антител к тау. Согласно одному варианту осуществления выделенная клеточная линия является гибридомой. Согласно одному варианту осуществления выделенная клеточная линия представляет собой гибридому, продуцирующую моноклональное антитело 7G6. Согласно одному варианту осуществления выделенная клеточная линия представляет собой клетки 293-F Freestyle®, на основе которых была получена 7G6-HCzu8-LCzu6-HEK, и при этом клеточная линия была депонирована в Американской коллекции типовых культур, Манассас, Вирджиния, США, 11 октября 2017 года, с патентным номером депозита в АТСС РТА-124523. Согласно одному варианту осуществления выделенная клеточная линия представляет собой клетки 293-F Freestyle®, на основе которых была получена 7G6-HCzu25-LCzu18-HEK, и при этом клеточная линия была депонирована в Американской коллекции типовых культур, Манассас, Вирджиния, США, 11 октября 2017 года, с патентным номером депозита в АТСС РТА-124524.

[0125] Клетки, которые экспрессируют представленные в настоящем документе антитела к тау или антигенсвязывающие фрагменты, можно использовать в способах получения антител к тау или антигенсвязывающих фрагментов путем культивирования клеток в условиях, подходящих для экспрессии соответствующего антитела или антигенсвязывающего фрагмента. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело к тау или антигенсвязывающий фрагмент извлекают из культуральной среды.

[0126] Согласно определенным вариантам осуществления любое из представленных в настоящем документе антител или антигенсвязывающих фрагментов, которые специфически связывают тау, является пригодным для обнаружения присутствия тау в биологическом образце. Термин «обнаружение» в контексте настоящего документа охватывает количественное или качественное обнаружение. Согласно определенным вариантам осуществления биологический образец может происходить из клетки или ткани, например, цереброспинальной жидкости, клетки или ткани головного мозга (например, коры или гиппокампа) или крови, гистологического препарата и т.д. Согласно некоторым вариантам осуществления описанные способы предусматривают обнаружение тау в образце путем приведения биологического образца в контакт с:

(а) любым из антитела ms7G6, антитела 7G6-HCzu8-LCzu6, антитела 7G6-HCzu8-LCzu21, антитела 7G6-HCzu23-LCzu15, антитела 7G6-HCzu24-LCzu15, антитела 7G6-HCzu25-LCzu15, антитела 7G6-HCzu23-LCzu18, антитела 7G6-HCzu24-LCzu18, антитела 7G6-HCzu25-LCzu18 или его антигенсвязывающего фрагмента;

(b) антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, которые содержат аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи антитела ms7G6, антитела 7G6-HCzu8-LCzu6 или антитела 7G6-HCzu25-LCzu18, как описано в таблице 1;

(c) антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, которые содержат сегмент вариабельного домена тяжелой цепи и сегмент вариабельного домена легкой цепи любого из антитела ms7G6, антитела 7G6-HCzu8/LCzu6, антитела 7G6-HCzu8/LCzu21, антитела 7G6-HCzu23/LCzu15, антитела 7G6-HCzu24/LCzu15, антитела 7G6-HCzu25/LCzu15, антитела 7G6-HCzu23/LCzu18, антитела 7G6-HCzu24/LCzu18 или антитела 7G6-HCzu25/LCzu18, как описано в таблице 1; или

(d) антителом с аминокислотной последовательностью антитела, продуцируемого любой из клеточных линий, депонированных в АТСС с номером доступа РТА-124523 или РТА-124524, или его антигенсвязывающего фрагмента.

[0127] Согласно определенным вариантам осуществления способ предусматривает приведение биологического образца в контакт с представленным в настоящем документе антителом к тау в условиях, допустимых для связывания антитела к тау с тау, и обнаружение того, образуется ли комплекс между антителом к тау и тау. Согласно некоторым вариантам осуществления таких способов антитело к тау является меченым для возможности обнаружения. Способ может представлять собой in vitro или in vivo способ. Комплекс, образуемый между антителом к тау и тау в тестируемом биологическом образце, можно сравнивать с комплексом, образуемым в контрольном биологическом образце (например, биологическом образце от здорового субъекта). Количество комплекса, образующегося между антителом к тау и тау в тестируемом биологическом образце, также можно количественно оценивать и сравнивать с количеством комплекса, образующегося в контрольном биологическом образце или со средним количеством комплекса, о котором известно, что он образуется у здоровых субъектов.

[0128] Согласно дополнительному аспекту настоящее изобретение относится к фармацевтическим составам, содержащим любое из антител или антигенсвязывающих фрагментов, которые специфически связывают описанный в настоящем документе тау, например, для применения в любом из терапевтических способов, представленных в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтический состав содержит любое из антител или антигенсвязывающих фрагментов, которые специфически связывают представленный в настоящем документе тау, и фармацевтически приемлемый носитель.

[0129] Фармацевтические составы описанных в настоящем документе антитела к тау или антигенсвязывающего фрагмента получают путем смешивания таких антитела или антигенсвязывающего фрагмента с требуемой степенью чистоты с одним или несколькими необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями и/или вспомогательными веществами (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)) в форме лиофилизированных составов или водных растворов. Фармацевтически приемлемые носители, разбавители и вспомогательные вещества обычно нетоксичны для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях, и включают без ограничения: стерильную воду, буферы, такие как фосфатный, цитратный и на основе других органических кислот; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония; хлорид бензетония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол и м-крезол); низкомолекулярные (менее чем приблизительно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие средства, такие как EDTA; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; металл-комплексы (например, комплексы Zn-белок); и/или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как полиэтиленгликоль (PEG). Иллюстративные фармацевтически приемлемые носители в настоящем документе дополнительно включают средства диспергирования лекарственных средств в межклеточном пространстве, такие как растворимые активные в нейтральной среде гликопротеины гиалуронидазы (sHASEGP), например, растворимые гликопротеины гиалуронидазы РН-20 человека, такие какгНиРН20 (HYLENEX™, Baxter International, Inc.). Определенные иллюстративные sHASEGP и способы применения, включая rHuPH20, описаны в заявке на выдачу патента США №7871607 и публикации США №2006/0104968. Согласно одному аспекту sHASEGP объединяют с одним или несколькими дополнительными гликозаминогликаназами, такими как хондроитиназы.

[0130] Иллюстративные лиофилизированные составы на основе антитела описаны в заявке на выдачу патента США №6267958. Водные составы на основе антитела включают таковые, описанные в заявке на выдачу патента США №6171586 и WO 2006/044908, причем последние составы включают гистидин-ацетатный буфер.

[0131] Антитело к тау или антигенсвязывающий фрагмент в качестве активного ингредиента в фармацевтическом составе могут быть заключены в микрокапсулы, полученные, например, с помощью методик коацервации или с помощью полимеризации на границе раздела фаз, например, микрокапсулы из гидроксиметилцеллюлозы или желатина и микрокапсулы из поли-(метилметакрилата) соответственно, в коллоидные системы доставки лекарственного средства (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такие методики раскрыты в Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).

[0132] Можно получать препараты с замедленным высвобождением. Подходящие примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые матрицы из гидрофобных полимеров, содержащие антитело, при этом матрицы находятся в виде изделий определенной формы, например, пленок или микрокапсул.

[0133] Составы, предназначенные для in vivo введения, обычно являются стерильными. Стерильность может быть легко достигнута, например, путем фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны.

[0134] Любые из представленных в настоящем документе антител или антигенсвязывающих фрагментов, которые специфически связывают тау (или составы на их основе), можно применять в терапевтических способах.

[0135] Согласно одному аспекту представлены антитело к тау или антигенсвязывающий фрагмент для применения в качестве лекарственного препарата. Согласно некоторым вариантам осуществления представлены антитело к тау или антигенсвязывающий фрагмент для применения в снижении уровня нерастворимого тау. Согласно некоторым вариантам осуществления представлены антитело к тау или антигенсвязывающий фрагмент для применения в ингибировании агрегации тау. Согласно дополнительным аспектам представлены антитело к тау или антигенсвязывающий фрагмент для применения в лечении таупатий. Иллюстративные таупатий, которые можно лечить с помощью раскрытых антител к тау или антигенсвязывающих фрагментов, включают болезнь Альцгеймера (AD), прогрессирующий надъядерный паралич (PSP) и лобно-височную деменцию (FTD). Иллюстративная FTD, которую можно лечить, представляет собой болезнь Пика (PiD).

[0136] Согласно определенным вариантам осуществления представлены антитело к тау или антигенсвязывающий фрагмент для применения в способе лечения. Согласно некоторым вариантам осуществления представлены антитело к тау или антигенсвязывающий фрагмент для применения в способе снижения уровня нерастворимого тау у субъекта. Согласно некоторым вариантам осуществления представлены антитело к тау или антигенсвязывающий фрагмент для применения в способе ингибирования агрегации тау у субъекта. Согласно определенным вариантам осуществления представлены антитело к тау или антигенсвязывающий фрагмент для применения в способе лечения субъекта с таупатией. Способ лечения таупатии предусматривает введение субъекту антитела к тау или антигенсвязывающего фрагмента в количестве, эффективном для лечения таупатии. Согласно определенным вариантам осуществления таупатия представляет собой любую из вышеописанных таупатий. Согласно предпочтительным вариантам осуществления субъект представляет собой млекопитающее, предпочтительно человека.

[0137] Согласно дополнительному аспекту также в настоящем документе представлено применение описанных в настоящем документе антитела к тау или антигенсвязывающего фрагмента в изготовлении или получении лекарственного препарата. Согласно некоторым вариантам осуществления лекарственный препарат предназначен для снижения уровня нерастворимого тау. Согласно некоторым вариантам осуществления лекарственный препарат предназначен для ингибирования агрегации тау. Согласно некоторым вариантам осуществления лекарственный препарат предназначен для лечения таупатии. Согласно определенным вариантам осуществления таупатия представляет собой любую из вышеописанных таупатий.

[0138] Описанные в настоящем документе антитело к тау или антигенсвязывающий фрагмент можно вводить любым подходящим способом, включая парентеральное, внутрилегочное и интраназальное, и, если необходимо для местного лечения, внутриочаговое введение. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. Введение можно осуществлять любым подходящим путем, например, с помощью инъекций, таких как внутривенные или подкожные инъекции, в зависимости от того, является ли введение кратковременным или длительным. В настоящем документе предусмотрены различные схемы введения дозы, включая без ограничения однократные или многократные введения с различными интервалами времени, болюсное введение и дробную инфузию.

[0139] Представленные в настоящем документе антитела к тау или антигенсвязывающие фрагменты должны составляться, дозироваться и вводиться способом, соответствующим надлежащей медицинской практике. Рассматриваемые в этом контексте факторы включают конкретное подлежащее лечению нарушение, конкретное подлежащее лечению млекопитающее, клиническое состояние отдельного пациента, причину нарушения, сайт доставки средства, способ введения, схему введения и другие известные практикующим врачам факторы.

[0140] Для предупреждения или лечения заболевания, соответствующая доза антитела к тау или антигенсвязывающего фрагмента будет зависеть от типа подлежащего лечению заболевания, типа антитела, тяжести и течения заболевания, от того, вводят антитело или антигенсвязывающий фрагмент в профилактических или терапевтических целях, предшествующей терапии, истории болезни пациента и ответа на антитело, и на усмотрение лечащего врача. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент подходящим образом вводят пациенту однократно или в течение курса лечения. В зависимости от типа и тяжести заболевания начальная предположительная доза для введения пациенту может составлять от приблизительно 1 мкг/кг до 15 мг/кг антитела или антигенсвязывающего фрагмента, например, для одного или нескольких отдельных введений или непрерывной инфузии. Типичная суточная доза может варьироваться от приблизительно 1 мкг/кг до 100 мг/кг или больше, в зависимости от вышеупомянутых факторов. Для повторных введений на протяжении нескольких дней или дольше, в зависимости от состояния, лечение обычно будет продолжаться до тех пор, пока не произойдет требуемое подавление симптомов заболевания. Иллюстративная доза антитела или антигенсвязывающего фрагмента будет варьироваться от приблизительно 0,05 мг/кг до приблизительно 100 мг/кг. Таким образом, пациенту можно вводить одну или несколько доз, составляющих приблизительно 0,5 мг/кг, 2,0 мг/кг, 10 мг/кг, 30 мг/кг или 100 мг/кг (или любую их комбинацию). Такие дозы можно вводить прерывисто, например, каждую неделю или раз в три недели (например так, чтобы пациент получил от приблизительно двух до приблизительно двадцати, или, например, приблизительно шесть доз антитела). Можно вводить начальную более высокую нагрузочную дозу, за которой следует одна или несколько более низких доз. Однако пригодными могут быть и другие схемы приема. Прогресс такой терапии можно отслеживать с помощью традиционных методик и анализов.

[0141] Также в настоящем документе представлено изделие, содержащее материал(-ы), пригодный(-е) для лечения, предупреждения и/или диагностики описанных выше нарушений. Изделие предусматривает контейнер и информацию о препарате или листок-вкладыш на контейнере, или ассоциированный с контейнером. Подходящие контейнеры включают, например, бутылки, флаконы, шприцы, пакеты для IV растворов и т.д. Контейнеры могут быть выполнены из различных материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер содержит композицию, которая сама по себе или в комбинации с другой композицией является эффективной для лечения, предупреждения и/или диагностики состояния, и может содержать стерильное отверстие для доступа (например, контейнер может представлять собой пакет для внутривенного раствора или флакон с пробкой для прокалывания иглой для подкожных инъекций). Активное средство в композиции представляет собой описанное в настоящем документе антитело к тау или антигенсвязывающий фрагмент. В информации о препарате или листке-вкладыше указывается, что композиция применяется для лечения выбранного состояния. В качестве альтернативы, или в дополнение, изделие может дополнительно предусматривать второй контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как бактериостатическая вода для инъекции (BWFI), забуференный фосфатом солевой раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Кроме того, он может включать другие материалы, желательные с коммерческой и пользовательской точки зрения, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.

[0142] Иллюстративные варианты осуществления

[0143] В настоящем документе представлены иллюстративные варианты осуществления раскрытой технологии. Эти варианты осуществления являются лишь иллюстративными и не ограничивают объем настоящего раскрытия или прилагаемой к нему формулы изобретения.

[0144] Вариант осуществления 1. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связывают тау человека, причем антитело содержит:

определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (HCDR1), определяющую комплементарность область 2 тяжелой цепи (HCDR2) и определяющую комплементарность область 3 тяжелой цепи (HCDR3), изложенные в SEQ ID NO: 196, и определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (LCDR1), определяющую комплементарность область 2 легкой цепи (LCDR2) и определяющую комплементарность область 3 легкой цепи (LCDR3), изложенные в SEQ ID NO: 411;

HCDR1, HCDR2 и HCDR3, изложенные в SEQ ID NO: 268, и LCDR1, LCDR2 и LCDR3, изложенные в SEQ ID NO: 465; или

HCDR1, HCDR2 и HCDR3, изложенные в SEQ ID NO: 402, и LCDR1, LCDR2 и LCDR3, изложенные в SEQ ID NO: 572.

[0145] Вариант осуществления 2. Моноклональное антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с вариантом осуществления 1, где:

HCDR1 содержит SEQ ID NO: 594, HCDR2 содержит SEQ ID NO: 596, HCDR3 содержит SEQ ID NO: 598, LCDR1 содержит SEQ ID NO: 738, LCDR2 содержит SEQ ID NO: 740 и LCDR3 содержит SEQ ID NO: 742, как определено в соответствии со способом по Kabat;

HCDR1 содержит SEQ ID NO: 864, HCDR2 содержит SEQ ID NO: 866, HCDR3 содержит SEQ ID NO: 868, LCDR1 содержит SEQ ID NO: 1008, LCDR2 содержит SEQ ID NO: 1010 и LCDR3 содержит SEQ ID NO: 1012, как определено согласно IMGT;

HCDR1 содержит SEQ ID NO: 642, HCDR2 содержит SEQ ID NO: 644, HCDR3 содержит SEQ ID NO: 646, LCDR1 содержит SEQ ID NO: 774, LCDR2 содержит SEQ ID NO: 776 и LCDR3 содержит SEQ ID NO: 778, как определено в соответствии со способом по Kabat;

HCDR1 содержит SEQ ID NO: 912, HCDR2 содержит SEQ ID NO: 914, HCDR3 содержит SEQ ID NO: 916, LCDR1 содержит SEQ ID NO: 1044, LCDR2 содержит SEQ ID NO: 1046 и LCDR3 содержит SEQ ID NO: 1048, как определено согласно IMGT;

HCDR1 содержит SEQ ID NO: 732, HCDR2 содержит SEQ ID NO: 734, HCDR3 содержит SEQ ID NO: 736, LCDR1 содержит SEQ ID NO: 846, LCDR2 содержит SEQ ID NO: 848 и LCDR3 содержит SEQ ID NO: 850, как определено в соответствии со способом по Kabat; или

HCDR1 содержит SEQ ID NO: 1002, HCDR2 содержит SEQ ID NO: 1004, HCDR3 содержит SEQ ID NO: 1006, LCDR1 содержит SEQ ID NO: 1116, LCDR2 содержит SEQ ID NO: 1118 и LCDR3 содержит SEQ ID NO: 1120, как определено согласно IMGT.

[0146] Вариант осуществления 3. Моноклональное антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с вариантом осуществления 1 или 2, где остаток в положении 49 легкой цепи в соответствии со способом по Kabat не является цистеином.

[0147] Вариант осуществления 4. Моноклональное антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с вариантом осуществления 3, где остаток в положении 49 легкой цепи в соответствии со способом по Kabat представляет собой серии.

[0148] Вариант осуществления 5. Моноклональное антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с любым из предыдущих вариантов осуществления, где остаток в положении 57 тяжелой цепи в соответствии со способом по Kabat не является цистеином.

[0149] Вариант осуществления 6. Моноклональное антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с вариантом осуществления 5, где остаток в положении 57 тяжелой цепи в соответствии со способом по Kabat представляет собой серии.

[0150] Вариант осуществления 7. Моноклональное антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с любым из предыдущих вариантов осуществления, где остаток в положении 34 легкой цепи в соответствии со способом по Kabat представляет собой глутамат.

[0151] Вариант осуществления 8. Моноклональное антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с любым из предыдущих вариантов осуществления, где остаток в положении 36 легкой цепи в соответствии со способом по Kabat не является фенилаланином.

[0152] Вариант осуществления 9. Моноклональное антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с вариантом осуществления 8, где остаток в положении 36 легкой цепи в соответствии со способом по Kabat представляет собой тирозин.

[0153] Вариант осуществления 10. Моноклональное антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с любым из предыдущих вариантов осуществления, где остаток в положении 46 легкой цепи в соответствии со способом по Kabat не является аргинином.

[0154] Вариант осуществления 11. Моноклональное антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с вариантом осуществления 10, где остаток в положении 46 легкой цепи в соответствии со способом по Kabat представляет собой лейцин.

[0155] Вариант осуществления 12. Моноклональное антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с любым из предыдущих вариантов осуществления, где остаток в положении 94 тяжелой цепи в соответствии со способом по Kabat не является лизином.

[0156] Вариант осуществления 13. Моноклональное антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с любым из предыдущих вариантов осуществления, где остаток в положении 71 тяжелой цепи в соответствии со способом по Kabat не является аргинином.

[0157] Вариант осуществления 14. Моноклональное антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии со способом варианта осуществления 13, где остаток в положение 71 тяжелой цепи в соответствии со способом по Kabat представляет собой валин.

[0158] Вариант осуществления 15. Моноклональное антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с вариантом осуществления 1 или вариантом осуществления 2, причем антитело содержит:

вариабельный домен тяжелой цепи (HCVD), содержащий SEQ ID NO: 268, и вариабельный домен легкой цепи (LCVD), содержащий SEQ ID NO: 465;

HCVD, содержащий SEQ ID NO: 268, и LCVD, содержащий SEQ ID NO: 581;

HCVD, содержащий SEQ ID NO: 384, и LCVD, содержащий SEQ ID NO: 545;

HCVD, содержащий SEQ ID NO: 393, и LCVD, содержащий SEQ ID NO: 545;

HCVD, содержащий SEQ ID NO: 402, и LCVD, содержащий SEQ ID NO: 545;

HCVD, содержащий SEQ ID NO: 384, и LCVD, содержащий SEQ ID NO: 572;

HCVD, содержащий SEQ ID NO: 393, и LCVD, содержащий SEQ ID NO: 572; или

HCVD, содержащий SEQ ID NO: 402, и LCVD, содержащий SEQ ID NO: 572.

[0159] Вариант осуществления 16. Моноклональное антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с любым из предыдущих вариантов осуществления, где антитело продуцируется клеточной линией с номером депозита в АТСС РТА-124523.

[0160] Вариант осуществления 17. Моноклональное антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-15, где антитело продуцируется клеточной линией с номером депозита в АТСС РТА-124524.

[0161] Вариант осуществления 18. Моноклональное антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с любым из предыдущих вариантов осуществления, где антитело представляет собой антитело мыши, химерное антитело или гуманизированное антитело.

[0162] Вариант осуществления 19. Моноклональное антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с любым из предыдущих вариантов осуществления, где антитело представляет собой IgG1.

[0163] Вариант осуществления 20. Моноклональное антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с любым из предыдущих вариантов осуществления, где антитело связывает мономерный тау 2N4R дикого типа человека с K_D менее чем приблизительно 0,5 нМ, как измерено с помощью метода поверхностного плазмонного резонанса.

[0164] Вариант осуществления 21. Моноклональное антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с любым из предыдущих вариантов осуществления, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент связываются с тау человека на эпитопе, содержащем аминокислотную последовательность HVPG (SEQ ID NO: 1133).

[0165] Вариант осуществления 22. Моноклональное антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с вариантом осуществления 21, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент являются биэпитопными и связываются с тау человека на эпитопе, содержащем аминокислотную последовательность HVPG (SEQ ID NO: 1133) в пределах повторяющейся области 2 или повторяющейся области 4.

[0166] Вариант осуществления 23. Моноклональное антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-20, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент связываются с тау человека на эпитопе, содержащем аминокислотную последовательность HVPGG (SEQ ID NO: 79).

[0167] Вариант осуществления 24. Моноклональное антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с вариантом осуществления 23, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент являются биэпитопными и связываются с тау человека на эпитопе, содержащем аминокислотную последовательность HVPGG (SEQ ID NO: 79) в пределах повторяющейся области 2 или повторяющейся области 4.

[0168] Вариант осуществления 25. Моноклональное антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с любым из предыдущих вариантов осуществления,

где антитело или антигенсвязывающий фрагмент связывают тау человека на эпитопе, содержащем аминокислотную последовательность HVPGG (SEQ ID NO: 79) в пределах повторяющейся области 2, с предпочтением в отношении связывания, которое по меньшей мере приблизительно 10-кратно превышает таковое в отношении связывания на эпитопе, содержащем аминокислотную последовательность HKPGG (SEQ ID NO: 182) в пределах повторяющейся области 3, или связывания на эпитопе, содержащем аминокислотную последовательность HQPGG (SEQ ID NO: 183) в пределах повторяющейся области 1, или

где антитело или антигенсвязывающий фрагмент связывают тау человека на эпитопе, содержащем аминокислотную последовательность HVPGG (SEQ ID NO: 79) в пределах повторяющейся области 4, с предпочтением в отношении связывания, которое по меньшей мере приблизительно 10-кратно превышает таковое в отношении связывания на эпитопе, содержащем аминокислотную последовательность HKPGG (SEQ ID NO: 182) в пределах повторяющейся области 3, или связывания на эпитопе, содержащем аминокислотную последовательность HQPGG (SEQ ID NO: 183) в пределах повторяющейся области 1,

как определено с помощью анализа связывания пептидов.

[0169] Вариант осуществления 26. Моноклональное антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с любым из предыдущих вариантов осуществления, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент не связывают тау на эпитопе, содержащем аминокислотную последовательность HVSGG (SEQ ID NO: 184) в пределах повторяющейся области 2, или на эпитопе, содержащем аминокислотную последовательность HVLGG (SEQ ID NO: 185) в пределах повторяющейся области 2.

[0170] Вариант осуществления 27. Меченые антитело или антигенсвязывающий фрагмент, предусматривающие антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с любым из предыдущих вариантов осуществления.

[0171] Вариант осуществления 28. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая моноклональное антитело или антигенсвязывающий фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-26.

[0172] Вариант осуществления 29. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты согласно варианту осуществления 28.

[0173] Вариант осуществления 30. Клетка, которая экспрессирует молекулу нуклеиновой кислоты согласно варианту осуществления 28.

[0174] Вариант осуществления 31. Способ получения антитела к тау или антигенсвязывающего фрагмента, предусматривающий культивирование клетки в соответствии с вариантом осуществления 30 в условиях, подходящих для получения антитела или антигенсвязывающего фрагмента.

[0175] Вариант осуществления 32. Способ в соответствии с вариантом осуществления 31, дополнительно предусматривающий извлечение антитела или антигенсвязывающего фрагмента.

[0176] Вариант осуществления 33. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или антигенсвязывающий фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-26 и фармацевтически приемлемый носитель.

[0177] Вариант осуществления 34. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-26 для применения в качестве лекарственного препарата.

[0178] Вариант осуществления 35. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-26 для применения в лечении таупатии.

[0179] Вариант осуществления 36. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-26 для применения в получении лекарственного препарата для лечения таупатии.

[0180] Вариант осуществления 37. Антитело для применения в соответствии с вариантом осуществления 35 или 36, где таупатия представляет собой болезнь Альцгеймера, лобно-височную деменцию или прогрессирующий надъядерный паралич.

[0181] Вариант осуществления 38. Антитело для применения в соответствии с вариантом осуществления 37, где лобно-височная деменция представляет собой болезнь Пика.

[0182] Вариант осуществления 39. Способ снижения уровней саркозил-нерастворимого тау, причем способ предусматривает введение субъекту моноклонального антитела или антигенсвязывающего фрагмента согласно любому из вариантов осуществления 1-26.

[0183] Вариант осуществления 40. Способ ингибирования агрегации тау, причем способ предусматривает введение субъекту моноклонального антитела или антигенсвязывающего фрагмента согласно любому из вариантов осуществления 1-26.

[0184] Вариант осуществления 41. Способ в соответствии с вариантом осуществления 39 или 40, где способ осуществляют in vitro или in vivo.

[0185] Вариант осуществления 42. Способ лечения таупатий у субъекта, причем способ предусматривает введение субъекту моноклонального антитела или антигенсвязывающего фрагмента согласно любому из вариантов осуществления 1-26 в условиях, эффективных для лечения таупатий у субъекта.

[0186] Вариант осуществления 43. Способ в соответствии с вариантом осуществления 42, где таупатия представляет собой болезнь Альцгеймера, лобно-височную деменцию или прогрессирующий надъядерный паралич.

[0187] Вариант осуществления 44. Способ в соответствии с вариантом осуществления 43, где лобно-височная деменция представляет собой болезнь Пика.

[0188] Нижеследующие примеры представлены для дополнения предшествующего раскрытия и для обеспечения лучшего понимания описанного в настоящем документе заявляемого объекта. Эти примеры не должны толковаться как ограничивающие описанный заявляемый объект. Следует понимать, что описанные в настоящем документе примеры и варианты осуществления представлены исключительно в иллюстративных целях, и что различные модификации или изменения в их свете будут очевидны для специалистов в данной области, и они должны быть включены в объем настоящего изобретения и могут быть выполнены без отступления от истинного объема настоящего изобретения.

Пример 1. Получение моноклональных антител

[0189] Для получения антител к тау, распознающих связывающую микротрубочки область (MTBR) тау, синтезировали пептидную последовательность CNIKHVPGGGSVQIVYKPVD (SEQ ID NO: 186) (пептидный антиген). Остатки 2-20 SEQ ID NO: 186 соответствуют аминокислотной последовательности, которая охватывает участок соединения второй (т.е. отсутствующей в 3R-изоформе) и третьей повторяющейся областями тау (фиг. 2). Последовательность также включает гексапептидный мотив, известный как PHF6 (VQIVYK) (SEQ ID NO: 187) (von Bergen et al., PNAS, 2000, 97(10): 5129-5134), который является одним сайтов, инициирующих агрегацию тау. Пептидный антиген соединяли с гемоцианином фиссурелловых (KLH) в качестве белка-носителя через N-концевой цистеиновый остаток, который в природе не встречается в полноразмерной белковой последовательности тау-441 человека. Конечный иммуноген получали путем смешивания конъюгированного с пептидным антигеном KLH с полным адъювантом Фрейнда (1:2 (объем/объем)). Нокаутных по тау мышей (Jackson #007251) иммунизировали 0,08 мл на мышь 2,5 мг/мл раствора иммуногена. Спустя примерно 3 недели после начальной инъекции мыши получали вторичную иммунизацию конъюгированным с пептидным антигеном KLH без адъюванта при 0,05 мл на мышь в той же концентрации белка, что и ранее.

[0190] Через один месяц после вторичной иммунизации у мышей собирали антисыворотку и оценивали титры антитела с помощью ELISA для измерения иммунореактивности в отношении исходного тау-пептида для иммунизации, а также рекомбинантных тау-белков 2N4R и 1N3R. Вкратце, либо 150 нг конъюгированного с BSA пептидного антигена, либо 50 нг рекомбинантного тау-белка 2N4R или 1N3R (Enzo Life Sciences, номера по каталогу BML-SE321 и BML-SE323 соответственно) применяли для покрытия каждой лунки 96-луночного планшета (Costar, номер по каталогу 2797) в 10 мМ фосфатном буфере, рН 7,0, при 37°С в течение 1 часа. Содержимое планшетов блокировали в конечной концентрации 1% BSA, разбавленном в PBS, при комнатной температуре в течение 30 минут. Блокирующий раствор удаляли, и в планшет добавляли различные разведения антисыворотки в том же блокирующем буфере на 1 час при комнатной температуре. Планшет несколько раз промывали PBS перед добавлением HRP-меченного антитела к IgG мыши на 30 минут при комнатной температуре. После дополнительных стадий промывки обнаруживали связывание антител путем добавления 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМВ) в качестве субстрата. Ферментативную реакцию останавливали с использованием равного объема 2М H₂SO₄, и определяли оптическую плотность в лунке с применением планшет-ридер при длине волны 450 нм.

[0191] После определения мышей с высоким титром антитела, из медиальных подвздошных лимфатических узлов выделяли клетки, и сливали их с применением полиэтиленгликоля с клетками миеломы SP2 мыши с получением гибридом. Слитые клетки высевали в 96-луночные планшеты и культивировали в среде для селекции, содержащей гипоксантин-аминоптерин-тимидин (HAT). Супернатанты культур сперва подвергали скринингу в отношении связывания тау с применением ELISA-анализов связывания стандартного пептида и рекомбинантного тау, как подробно описано в предыдущем абзаце. Для получения аппроксимации относительного связывания супернатант культуры, который был положительным в ELISA пептидов, и один из рекомбинантных белков, 2N4R или 1N3R, либо оба, затем оценивали в конкурентной ELISA-системе. 96-луночный планшет покрывали рекомбинантным тау 2N4R, блокировали и промывали, как было описано ранее. На стадии первичного антитела супернатант культуры разводили 1 к 10 и инкубировали с разными разведениями свободного антигена (тау 2N4R) в течение 1 часа при комнатной температуре перед добавлением в планшет. После добавления комплексов антитело/антиген в планшет протокол остальной части анализа был идентичен стандартной процедуре ELISA. Отдельные клоны клеток подтверждали с использованием серийного разведения и микроскопии. Полученные в результате конечные гибридомы замораживали в бессывороточной среде.

Очистка антител из гибридом

[0192] Гибридомы выращивали в среде Hybridoma-SFM (Life Technologies), содержащей 1% FBS, 1 нг/мл IL-6 человека (R&D Systems) и пенициллин/стрептомицин. Культуры масштабировали до 100 мл, и когда достигалась высокая плотность клеток и доля жизнеспособных клеток составляла примерно 30%, собирали супернатант. Антитело очищали с применением колонок с белком G, элюировали глицином/HCl, рН 2,5, и незамедлительно нейтрализовали. Очищенное антитело затем подвергали диализу в 25 мМ фосфате натрия (рН 6,5) и 150 мМ NaCl, разделяли на аликвоты и хранили при -80°С.

[0193] Получали клоны гибридомы, вырабатывающие антитела, которые распознавали исходный пептид для иммунизации и полноразмерный рекомбинантный тау-белок 2N4R (таблица 2).

Пример 2. Аффинность антител мыши к рекомбинантному мономерному тау-белку, экспрессированному в E.coli.

[0194] Кинетический анализ взаимодействия полученных в примере 1 моноклональных антител мыши к тау с тау (2N4R) дикого типа человека и эквивалентным мутантным тау-белком P301S проводили с применением прибора BIAcore™ Т100. Рекомбинантные полноразмерные тау-белки человека были экспрессированы в E.coli, а затем их очищали с помощью аффинной хроматографии с использованием среды Cellufine™ Phosphate с последующим осаждением сульфатом аммония и обращенно-фазной HPLC-хроматографией.

[0195] Очищенные из гибридом антитела захватывали с помощью белка A/G, иммобилизованного на сенсорном чипе СМ5 (GE Healthcare). Тау-белки дикого типа и P301S затем наносили на сенсорный чип в пяти разных концентрациях и рассчитывали аффинность (равновесную константу диссоциации, K_D) в соответствии с инструкцией производителя.

Результаты показаны в таблице 2.

Пример 3. Высокоточное картирование эпитопов антитела ms7G6.

[0196] Последовательность распознавания антитела 7G6 мыши («ms7G6» или «7G6») для полноразмерной последовательности тау-белка 2N4R дикого типа человека (Tau441) подвергали высокоточному картированию эпитопов с применением пептидных микроматриц виде чипа.

[0197] Все процедуры осуществляли с помощью PEPperPrint GmbH, Германия. Полноразмерную последовательность тау 2N4R дикого типа человека удлиняли нейтральной линкерной последовательностью GSGSGSG (SEQ ID NO: 188) на С-конце, и она транслировалась в перекрывающиеся 15-мерные пептиды. Полученную в результате пептидную микроматрицу, содержащую 441 разный пептид, печатали в двух повторах на стеклянном чипе вместе с 82 пятнами дополнительного контрольного пептида с НА-меткой (YPYDVPDYAG) (SEQ ID NO: 189).

[0198] Антитело к тау ms7G6 разводили до концентрации 1 мкг/мл в PBS (рН 7,4), содержащем 0,05% Tween 20 и 10% блокирующий буфер Rockland (МВ-070). Разведенное антитело инкубировали на чипе в течение 16 часов при 4°С со встряхиванием при 140 об/мин. Первичное антитело удаляли и чип промывали в PBS (рН 7,4)/0,05% Tween 20. Промывочный буфер удаляли, а затем в том же буфере, что и для первичного антитела, на чипе в течение 45 минут при комнатной температуре инкубировали меченное DyLight™ 680 антитело козы к IgG (H+L) мыши (1:5000) и меченное DyLight™ 800 антитело к НА-метке (1:2000). Детектирующее антитело удаляли, и чип снова один раз промывали, как было описано ранее. Флуоресцентные изображения были получены с помощью системы визуализации LI-COR Odyssey™, и данные с микроматрицы в конечном счете анализировали с применением программного обеспечения PepSlide™ Analyser.

[0199] На флуоресцентном изображении чипа (фиг. 3А) и полученном в результате графике интенсивности (фиг. 3В) показано, что ms7G6 связывается с двумя основными сайтами на полноразмерном тау-белке. Также обнаружено, что минимальной требуемой последовательностью для связывания ms7G6 по обоим сайтам является HVPGG (SEQ ID NO: 79), которая охватывает положения аминокислот 299-303 (во втором повторе) и 362-366 (в четвертом повторе). Незначительное связывание наблюдали в двух дополнительных сайтах: HQPGG (SEQ ID NO: 183) в положениях аминокислот 268-272 и HKPGG (SEQ ID NO: 182) в положениях 330-334. Из расчета средних показателей интенсивности сигнала видно, что в случае антитела 7G6 мыши наблюдалось 41-кратное или 38-кратное предпочтение в отношении связывания с сайтом HVPGG (SEQ ID NO: 79), обычно содержащимся в пределах второй повторяющейся области полноразмерного тау 4R, в сравнении с последовательностями HQPGG (SEQ ID NO: 183) (повторяющаяся область 1) или HKPGG (SEQ ID NO: 182) (повторяющаяся область 3) соответственно. Подобным образом, наблюдали 35-кратное или 33-кратное предпочтение в отношении связывания с сайтом HVPGG (SEQ ID NO: 79), обычно содержащимся в пределах четвертой повторяющейся области полноразмерного тау 4R, в сравнении с последовательностями HQPGG (SEQ ID NO: 183) (повторяющаяся область 1) или HKPGG (SEQ ID NO: 182) (повторяющаяся область 3) соответственно.

Пример 4. Сканирование замен в эпитопе для 7G6.

[0200] Для определения консервативности аминокислот эпитопа, распознаваемого антителом ms7G6, осуществляли сканирование замен встречающейся в природе последовательности тау-пептида ¹KDNIKHVPGGGSVQI¹⁵ (SEQ ID NO: 26). Все процедуры выполняли с помощью PEPperPrint GmbH, Германия, и они основывались на замене по всем положениям в исходном пептиде на каждую из 20 встречающихся в природе аминокислот.

[0201] Синтезировали все возможные 15-мерные пептиды, и печатали в трех повторах на стеклянном чипе с получением микроматрицы, содержащей 900 пятен пептидов. Также на чип в качестве контролен наносили дополнительные копии пептида дикого типа, а также контрольный пептид с НА-меткой. Чип с пептидами затем зондировали с использованием ms7G6 в тех же условиях, которые описаны в примере 3 (Высокоточное картирование эпитопов антитела ms7G6) и полученные в результате данные анализировали с применением программного обеспечения PepSlide™ Analyser (на фиг. 4 проиллюстрированы результаты для SEQ ID NO: 38-78). С помощью сканирования замен было показано, что в пределах пептидного эпитопа ¹HVPGG⁵ (SEQ ID NO: 79) антитело ms7G6 характеризуется некоторой гибкостью во втором положении в отношении ряда возможных остатков. Имело место также некоторое связывание в случае, когда 5-ая аминокислота (глицин) заменялась либо на аланин, либо на серии. Средний пролиновый остаток необходим для связывания антител и не может быть заменен какой-либо другой встречающейся в природе аминокислотой. Эта аминокислота может соответствовать остатку Р301 (в пределах аминокислот 299-303 Tau441, номер доступа в Uniprot P10636-8), который обычно подвергают мутации с заменой на сериновый или лейциновый остаток с целью имитации таупатий человека в ряде доклинических in vitro и in vivo моделей. Данные сканирования замен указывают на то, что антитело ms7G6 предпочтительно распознает сайт связывания с аминокислотной последовательностью HVPGG (SEQ ID NO: 79) по аминокислотам 362-366 в мутантном белке P301S.

Пример 5. Агрегация тау in vitro.

[0202] Для определения того, может ли антитело ms7G6 функционально ингибировать агрегацию тау in vitro, осуществляли анализы агрегации с использованием рекомбинантного тау-белка.

[0203] Тау-белок дикого типа или мутантный тау-белок P301S разводили до концентрации 60 мкМ в буфере, содержащем 25 мМ HEPES (рН 7,4), 100 мМ NaCl и 0,5 мМ ТСЕР, в конечном объеме 20 мкл. Смесь нагревали в термоциклере при 98°С в течение 30 минут, а затем давали остыть до комнатной температуры. Контрольный IgG2b мыши или антитела ms7G6 разводили до конечной концентрации 8,3 мкМ в смеси 25 мМ HEPES (рН 7,4), 100 мМ NaCl и ингибиторов протеаз и фосфатаз HALT. Разведенные антитела или буфер в качестве контроля смешивали с тау-белками и инкубировали при 37°С в течение 30 минут. Для индукции агрегации тау к каждой реакционной смеси добавляли гепарин до достижения конечной концентрации 12 мкМ в конечном объеме 100 мкл. Конечные условия реакции были следующими: 12 мкМ тау, 8,3 мкМ антитела, 0,1 мМ ТСЕР и 12 мкМ гепарина в буфере, содержащем 25 мМ HEPES, рН 7,4/100 мМ NaCl. Конечные реакционные смеси инкубировали при 37°С в течение по меньшей мере 6 дней, с отбором образцов на протяжении всего времени для измерения агрегации тау.

[0204] Агрегацию тау измеряли в дни 0, 1, 2, 5 и 6 путем отбора 10 мкл реакционной смеси и помещения в 384-луночный планшет с черным дном (Greiner). В каждую лунку добавляли краситель тиофлавин S в конечной концентрации 15 мкМ, и содержимое планшета инкубировали при комнатной температуре в темноте в течение 30 минут. Флуоресценцию измеряли на планшет-ридере Pherastar™ при длине волны возбуждения и испускания 485 нм и 520 нм соответственно.

[0205] Как показано на фигурах 5А и 5В, степень и скорость гепарин-индуцированной агрегации были выше для тау-белка P301S, в сравнении с тау-белком дикого типа. Антитело ms7G6 в значительной степени снижало агрегацию как тау P301S, так и тау дикого типа in vitro, в сравнении с IgG, о чем свидетельствует более низкий уровень генерируемой флуоресценции. Это говорит о том, что даже в случае белка P301S, связывание ms7G6 с остатками 362-366 в отдельности может обеспечивать ингибирование агрегации в этих условиях.

Пример 6. In vitro модель диссеминации на клетках.

[0206] Для определения того, оказывает ли ms7G6 или гуманизированная версия, известная как 7G6-zuHC25-zuLC18 (см. пример 10), влияние на клетки, каждое антитело тестировали в in vitro клеточной модели диссеминации и агрегации тау.

[0207] 2И4К-изоформа тау дикого типа человека была экспрессирована в Е. coli, а затем очищена, как было описано ранее (Soeda et al., Nat Commun. 2015, 6: 10216). Рекомбинантный тау (40 мкМ) смешивали с гепарином (240 мкг/мл) и инкубировали при 37°С в течение 48-96 часов в 100 мМ ацетате натрия, рН 7,0, содержащем 2 мМ DTT. Агрегированный тау-белок собирали путем ультрацентрифугирования и ресуспендировали в 100 мМ ацетате натрия, рН 7,0, или PBS. Затем раствор подвергали обработке ультразвуком с получением «затравок» рекомбинантного тау.

[0208] Клетки Neuro-2a (АТСС) трансфицировали в суспензии экспрессионными плазмидами на основе кДНК, кодирующими тау 0N4R P301S, с применением Lipofectamine LTX (Thermo Fisher Scientific), и высевали при плотности 1,5×10⁴ клеток на лунку в 96-луночный планшет в среде DMEM, содержащей 10% фетальную телячью сыворотку. Клетки оставляли прикрепляться на ночь при 37°С перед добавлением «затравок» тау. Параллельно с этим, антитела к тау в различных концентрациях смешивали с 1 мкг/мл «затравки» тау, и также инкубировали в течение ночи при 37°С. На следующий день культуральную среды удаляли, и добавляли среду, содержащую смесь антител к тау и «затравку». Содержимое планшетов снова культивировали в течение ночи при 37°С.

[0209] Клетки фиксировали параформальдегидом в конечной концентрации 4% и подвергали иммуноокрашиванию с использованием Н-150 (Santa Cruz Technology, sc-5587), тиофлавина S (Sigma-Aldrich, T-1892) и DAPI (Wako, 340-07971). Получали изображения и анализировали их с применением InCell Analyzer 2200 и Toolbox.

[0210] Как показано на фигурах 6А, 6В, 6С и 6D, наблюдали значимое снижение интенсивности окрашивания по тиофлавину S (агрегированный тау) в ответ на обработку как ms7G6, так и 7G6-HCzu25-LCzu18. Это указывает на то, что оба антитела были способны блокировать эффект диссеминации тау в этой клеточной модели в данных условиях анализа.

Пример 7. Эффективность в доклинической in vivo модели таупатий при предварительном инкубировании «затравок» рекомбинантного тау P301S с антителами.

[0211] Эффекты трех новых антител, включая ms7G6, тестировали на краткосрочной in vivo модели отложения тау путем предварительного инкубирования соответствующих антител с «затравками» рекомбинантного тау P301S. «Затравки» с антителом или без него затем путем инъекции вводили в головной мозг трансгенных по P301S мышей.

Интрацеребровентрикулярная (ICV) инъекция «затравок» may

[0212] Предварительно образованный фибриллярный (PFF) тау получали путем смешивания рекомбинантного тау 2N4R P301S (40 мкМ) и гепарина (240 мкг/мл), с последующей стадией инкубации при 37°С в течение 48-96 часов в 100 мМ ацетате натрия, рН 7,0, содержащем 2 мМ DTT. Агрегированный тау собирали путем ультрацентрифугирования и ресуспендировали в 100 мМ ацетате натрия, рН 7,0. Полученные в результате фибриллы подвергали обработке ультразвуком и применяли в качестве «затравок» для инъекции. «Затравки» тау в концентрации 0,83 мг/мл инкубировали с 1 мг/мл IgG₁ или 2 мг/мл антитела к тау в течение 1 часа при 37°С. Смеси «затравки» тау/антитело, контроли (т.е. только тау) или среду-носитель путем инъекции вводили в интрацеребровентрикулярную (ICV) зону трансгенных по P301S мышей возрастом 2-3,5 месяца (MRC Technology, Великобритания). У этих мышей сверхэкспрессируется тау 0N4R P301S человека под контролем нейрон-специфического промотора гена Thy-1 при генетическом фоне СВАхС57/b16.

[0213] Ранее сообщалось, что у этих животных, при отсутствии обработки, развивается распространенная связанная с тау патология в головном мозге и спинном мозге со значительным двигательным дефектом в возрасте 5-6 месяцев (Allen et al., J Neurosci. 2002, 22(21):9340-51). В текущем эксперименте с применением более молодых мышей с мутацией P301S, животных умерщвляли спустя две недели после ICV-инъекции, извлекали головной мозг и собирали представляющую интерес область ткани. Образцы ткани затем подвергали разделению на фракции саркозил-растворимого и нерастворимого тау (Sahara et al., J Neurochem. 2002 Dec; 83(6): 1498-508), как описано ниже.

Экстракция саркозил-нерастворимого may из головного мозга мышей с мутацией P301S, которым путем инъекции вводили «затравку»

[0214] Ткань гомогенизировали в 19 объемах (вес ткани/объем) буфера для экстракции, содержащего 50 мМ Tris-HCl (рН 7,5) (Invitrogen), 5 мМ EDTA (Nippon Gene), 1 мМ EGTA (Nacalai Tesque), 1% NP-40 (Fluka), 0,25% натриевой соли дезоксихолевой кислоты (Sigma Aldrich), ОД MNaCl, 0,5 мМ PMSF (Sigma Aldrich), 1×PhosSTOP™ (Roche, Базель, Швейцария) и 1×Complete™ EDTA(-) (Roche). Гомогенаты центрифугировали на 163000 g при 4°C в течение 20 минут, и полученные в результате супернатанты собирали и сохраняли в виде растворимой в Tris-буфере фракции. Перед обработкой ультразвуком осадок ресуспендировали в приблизительно 10 объемах (вес ткани/объем) буфера, содержащего 10 мМ Tris-HCl (рН 7,5), 0,5 М NaCl, 1 мМ EGTA, 10% сахарозу (Wako Pure Chemical) и 1% саркозил. Обработанные саркозилом образцы инкубировали при 37°С в течение 60 минут, а затем центрифугировали на 163000 g при 4°С в течение еще 20 минут. Супернатанты собирали как саркозил-растворимую фракцию. Наконец, к осадку, который затем подвергали обработке ультразвуком, добавляли приблизительно 10 объемов PBS (Gibco). Эта смесь образовывала саркозил-нерастворимую фракцию.

Обнаружение саркозил-нерастворимого may с помощью вестерн-блоттинга

[0215] Саркозил-нерастворимые фракции солюбилизировали в буфере для образцов NuPAGE™ LDS и средстве для восстановления образцов NuPAGE™ (Invitrogen), нагревали при 70°С в течение 10 минут и разделяли с применением 12,5% полиакриламидных гелей (DRC). Белки переносили на PVDF-мембраны толщиной 0,2 мкм (Bio-Rad, Геркулес, Калифорния, США) и мембраны для блоттинга блокировали в 2,5% обезжиренном молоке (Yukikirushi) в TBS (Takara), содержащем 0,05% Tween (Nacalai tesque), в течение 1 часа при комнатной температуре. После блокирования мембраны для блоттинга инкубировали с моноклональным антителом к тау человека НТ7 (1:1000 или 1:2000, Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) в блокирующем буфере в течение 1 часа при комнатной температуре. Мембраны для блоттинга промывали в TBS-T в течение 30 минут, а затем инкубировали с HRP-конъюгированным антителом к IgG мыши (1:2000, GE healthcare) в течение еще 1 часа при комнатной температуре. Вторичное антитело удаляли, и мембраны для блоттинга промывали, как описано выше. Тау-белки детектировали с помощью хемилюминесцентного субстрата пероксидазы хрена (HRP) (Merck Millipore) и подвергали их количественному определению с применением анализатора Fusion FX (Vilber-Lourmat, Франция). Для определения количества тау в каждый гель загружали серийные разведения стандартов тау, полученных из исходной саркозил-нерастворимой фракции из спинного мозга с мутацией P301S.

[0216] Как показано на фиг. 7, в случае предварительной инкубации «затравок» с мутацией P301S с ms7G6, но не с контрольным IgG, 8Е5 или 1F1, было показано значимое снижение уровней саркозил-нерастворимого тау в сравнении со средой-носителем. Это говорит о том, что ms7G6 было лучшим антителом в этом примере, в сравнении с другими полученными антителами к тау.

Пример 8. Проверка модели диссеминации и распространения тау с P301S in vivo.

[0217] Для определения того, возможно ли какое-либо распространение патологического тау из одной области головного мозга в другую в доклинической модели на грызунах, осуществляли такой же эксперимент по диссеминации на трансгенных по P301S мышах, как описано в примере 7, но с некоторыми модификациями. В этом случае 20 мкл «затравок» рекомбинантного тау P301S в концентрации 0,9 мг/мл путем ICV-инъекции вводили в головной мозг мышей возрастом 2,5-3 месяца. Мышей умерщвляли к 2, 4 или 6 неделе после первичной инъекции «затравок», извлекали головной мозг, и сохраняли как гиппокамп, так и кору. Саркозил-нерастворимый тау получали и детектировали, как описано выше.

[0218] Как показано на фиг. 8, резкое повышение уровней нерастворимого тау наблюдалось в гиппокампе в промежутке между 2 и 4 неделей после инъекции «затравок», при этом в этот же момент времени в коре наблюдались лишь незначительные уровни нерастворимого тау. Однако в промежутке между 4 и 6 неделей после инъекции «затравок» в коре наблюдалось более значительное повышение уровней нерастворимого тау в сравнении с контрольной группой без «затравок». Это демонстрирует, что в данной модели нерастворимый тау может образовываться в гиппокампе, до образования его в коре, что свидетельствует о событии вторичного распространения.

Пример 9. Эффект периферического введения дозы 7G6 один раз в неделю в модели с инъекцией «затравок» с мутацией P301S in vivo.

а) Эксперимент 1

[0219] Инъекцию «затравок» тау P301S трансгенным по P301S мышам осуществляли, как описано в примере 8, с незначительными модификациями. За промежуток времени от приблизительно семи до приблизительно четырех часов до инъекции «затравок» тау, мыши получали дозу либо 40 мг/кг контрольного IgG2b-антитела (BioXCell), либо антитела ms7G6 внутрибрюшинно. Каждое антитело готовили в 25 мМ фосфатном буфере (рН 6,5) с 150 мМ NaCl. Также была включена контрольная группа обработки средой-носителем, которая получала только буфер. После инъекции «затравок» тау в головной мозг, мыши получали дополнительные дозы антитела или буфер один раз в неделю в течение периода времени 6 недель. Затем животных умерщвляли, выделяли ткани головного мозга, и нерастворимый тау получали и измеряли, как описано в примере 7.

b) Эксперимент 2

Осуществляли точный повтор эксперимента 1 (пример 9а).

c) Эксперимент 3

[0220] Снова осуществляли повтор эксперимента 1 (пример 9а), за исключением того, что вводили два уровня доз ms7G6, 20 и 40 мг/кг, и животных умерщвляли спустя 8 недель после инъекции «затравки», а не спустя 6 недель, как в предыдущих двух экспериментах.

[0221] Как показано на фигурах 9 и 10, в этих трех экспериментах было продемонстрировано, что ms7G6 может обуславливать снижение уровней нерастворимого тау в этой модели с инъекцией «затравок» с использованием «затравок» рекомбинантного тау P301S у трансгенной по P301S мыши. Наблюдаемое в коре снижение говорит о том, что антитело может обеспечивать замедление распространения патологического тау. В примере 4 было установлено, что антитело ms7G6 не способно связываться с последовательностью HVSGG (SEQ ID NO: 184) (аа299-303), которая присутствует в сайте с P301S мутантного белка. В совокупности это означает, что in vivo эффекты ms7G6 в этой in vivo модели обусловлены связыванием с тау на остающемся эпитопе HVPGG (SEQ ID NO: 79) в пределах четвертой повторяющейся области (аа362-366).

Пример 10. Гуманизация антител

10А. Материалы и способы

10А.а. Моделирование in silico

[0222] Для получения молекулярной модели Fv-области ms7G6 применяли Discovery Studio 4.5. Наиболее подходящие первые 1-3 кристаллические структуры с белковыми последовательностями, наиболее гомологичными с вариабельными доменами тяжелой цепи (VH) и легкой каппа-цепи (VK) ms7G6 применяли в качестве матрицы для получения двадцати пяти гомологических моделей с применением функции «Создать гомологические модели» («Create Homology Models»). Была выбрана модель с наименьшим энергетическим показателем, и энергия сначала была минимизирована только для водорода, а затем для всех атомов. Каркасные остатки, отличающиеся между последовательностями мыши (HCzu1 и LCzu1), были выделены, а таковые, которые находятся ближе всего к CDR или на границе VH/VK, были идентифицированы как остатки, которые могут быть важными для поддержания связывания тау CDR или для обеспечения стабильности антитела соответственно. Остатки CDR, отличающиеся между последовательностями мыши (HCzu1 и LCzu1), были выделены, и были идентифицированы остатки, которые могут быть не важны для поддержания связывания тау CDR.

10А.b. Синтез и клонирование генов

10А.b.1. Клонирование InFusion™

[0223] Гуманизированные вариабельные домены тяжелой и легкой цепей были кодон-оптимизированы для экспрессии в клетках СНО и синтезированы с помощью GeneArt. Вариабельные домены синтезировали с последовательностью инициации трансляция Козак и последовательностью сигнала секреции Ig, и они включали 15 пар оснований на 5'- и 3'-концах, гомологичных сайту клонирования в субклонирующем векторе. ПЦР-фрагменты, синтезированные с помощью GeneArt, субклонировали в экспрессионную плазмиду, содержащую последовательность константной области гамма- или каппа-цепи человека, с применением набора для клонирования InFusion™ HD (Clontech). Все клоны подвергали секвенированию для подтверждения наличия и точности вставок.

10A.b.2. QuikChange™

[0224] Точечные мутации вносили с применением QuikChange™ XL от Stratagene в соответствии с протоколом от производителя. Все клоны подвергали секвенированию для подтверждения наличия мутации.

10А.с. Клеточная культура

10А.с.1. Транзиентная продукция mAb в HEK

[0225] Для каждого миллилитра 3×10⁶ клеток, подлежащих трансфекции с использованием ExpiFectamine™ (Thermo), 333,3 нг НС-плазмиды и 333,3 нг LC-плазмиды инкубировали в течение 5-10 мин в 50 мкл Opti-MEM (Thermo). Аналогичным образом, в 50 мкл Opti-MEM инкубировали 2,67 мкл ExpiFectamine™. К смеси ДНК добавляли раствор ExpiFectamine™ и инкубировали в течение 20-30 мин при комнатной температуре. К клеткам добавляли смесь ДНК : ExpiFectamine™, с одновременным перемешиванием путем вращения сосуда, и инкубировали при 37°С, 8% CO₂, со встряхиванием при 125 об/мин. На следующий день к трансфекционной смеси добавляли 5 мкл усилителя трансфекции 1 и 50 мкл усилителя трансфекции 2 на мл клеток, с последующей инкубацией в течение еще 7-10 дней. Спустя 48-72 ч клетки питали в конечной концентрации 10 г/л дрожжевого экстракта (BD Biosciences), 5 мМ валериановой кислоты (Sigma-Aldrich) и 1:100 CD концентрата липидов (Thermo).

10А.с.2. Транзиентная продукция mAb в СНО

[0226] Для каждого миллилитра 6×10⁶ клеток, подлежащих трансфекции с использованием ExpiFectamine™ для СНО (Thermo), 500 нг НС-плазмиды и 500 нг LC-плазмиды смешивали в Opti-PRO™ (Thermo) в общем объеме 40 мкл. Аналогичным образом, в 36,8 мкл Opti-PRO смешивали 3,2 мкл ExpiFectamine™ для СНО. К смеси ДНК добавляли раствор ExpiFectamine™ для СНО и инкубировали в течение 1-5 мин при комнатной температуре. К клеткам добавляли смесь ДНК: ExpiFectamine™ для СНО, с одновременным перемешиванием путем вращения сосуда, и инкубировали при 37°С, 8% CO₂, со встряхиванием при 125 об/мин. На следующий день к трансфекционной смеси добавляли 6 мкл усилителя трансфекции и 160 мкл подпитки на мл клеток, и клетки переносили в условия с 32°С, 5% CO₂. В день 5 добавляли еще 160 мкл подпитки на мл клеток. В день 12-14 собирали супернатанты.

10A.d. Очистка MAb

10A.d.1. Очистка в объеме сорбента

[0227] Содержащую белок А смолу с высокой емкостью связывания Prosep™-vA (Millipore) или LC-каппа-специфическую смолу CaptureSelect™ KappaSelect (Thermo) уравновешивали DPBS, и 50 мкл добавляли к 2 мл образца. После инкубации при комнатной температуре в течение 1 часа среду и смолу добавляли в фильтр-планшет и дважды промывали 1 мл DPBS. Образец элюировали из смолы путем добавления 400 мкл ОД М глицина, рН 2,9, с последующим центрифугированием при 15000 × g в течение 30 с. Образец нейтрализовали 20 мкл 1 М Tris, рН 8,0. Образцы концентрировали до ~100 мкл путем центрифугирования при 15000 × g в течение 5 минут с применением 10k отсекающих мембранных фильтров на 0,5 мл Amicon™ Ultra (Millipore) и подвергали обмену буфера на DPBS с применением колонки для обессоливания на 0,5 мл Zeba™, 7K MWCO, в соответствии с протоколом от производителя.

10A.d.2. Очистка на колонке

[0228] Очистку осуществляли с применением платформы для очистки АКТА Xpress (GE Healthcare). Вплоть до 1 л кондиционированную среду пропускали через колонку MabSelect™ SURE на 5 мл (GE Healthcare), уравновешенную в 20 мМ фосфате натрия, 150 мМ NaCl, рН 7,0. После загрузки колонку тщательно промывали буфером для уравновешивания до тех пор, пока не наблюдалось стабильное исходное состояние. Связанный материал элюировали с применением 100 мМ глицина, рН 2,9. Элюированный материал сразу вводили в колонку для обессоливания 26/10 HiPrep (GE Healthcare), уравновешенную в 1× забуференном фосфатом солевом растворе (PBS), и элюировали тем же буфером. Пиковые фракции собирали. Материал анализировали на предмет содержания белка с помощью ВСА-анализа (Thermo) и степени чистоты с помощью SDS-PAGE в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях.

10А.е. ELISA связывания тау 2N4R

[0229] Черный 96-луночный планшет Nunc MaxiSorp покрывали 2 мкг/мл (если не указано иное) рекомбинантного тау 2N4R дикого типа в DPBS на ночь при 4°С. На следующий день содержимое планшета отсасывали и промывали его три раза промывочным буфером (PBS + 0,05% Tween-20). Содержимое лунок инкубировали с буфером для анализа (1% масса/объем BSA [выделенный методом теплового шока, Sigma], 0,05% Tween-20 [BioRad], DPBS) в течение 1 ч при комнатной температуре. Буфер для анализа отсасывали, и лунки три раза промывали, как описано выше. В каждую лунку добавляли различные концентрации mAb в DPBS на 1 час при комнатной температуре, со встряхиванием на шейкере для микротитрационных планшетов. Образцы отсасывали, и лунки три раза промывали, как описано выше. HRP-конъюгированное антитело козы к IgG (H + L) мыши (JIRL 115-035-146), антитело козы к IgG (H + L) человека (JIRL 109-035-127) или стрептавидин-HRP (JIRL 016-030-084) разводили 1:5000 в буфере для анализа и добавляли в лунки. После инкубации и встряхивания при комнатной температуре в течение 1 часа образцы отсасывали, и лунки три раза промывали, как описано выше. В каждую лунку добавляли QuantaBlu (Thermo) и инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре. Относительные единицы флуоресценции (RFU) измеряли при длине волны возбуждения и испускания, установленных на 320 и 460 нм соответственно, с применением планшет-ридера Spectramax™ M5 (Molecular Devices).

10A.f. Анализы связывания на основе явления поверхностного плазменного резонанса (SPR)

10A.f.1. Анализ связывания мономерного тау с применением захваченных антител к IgG человека/мыши

10A.f.1.i. Получение чипа

[0230] Все эксперименты осуществляли с применением прибора BIAcore™ Т-100 (GE Healthcare). Антитела к IgG человека (моноклональное антитело мыши к Fc человека) из набора для захвата антител человека (GE Healthcare) в объеме 10 мкл разводили до 25 мкл/мл в 200 мкл конечного буфера для иммобилизации (10 мМ ацетат натрия, рН 5,0). Скорость потока была установлена на 5 мкл/мин, тракт потока 1. Смешивали пятьдесят мкл N-гидроксисукцинимида (NHS) и 50 мкл 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC), и вводили в течение 420 сек для активации поверхности чипа СМ5. Разведенное антитело вводили в течение 360 секунд, затем 1 М этаноламин в течение 420 секунд. Тракт потока затем переключали на тракт потока 2. Получали новую смесь EDC/NHS и повторяли процедуру для проточной ячейки 2. Поверхность кондиционировали с помощью 2 инъекций 3 М MgCl₂ в течение 30 сек с применением тракта потока 1,2 при 30 мкл/мин. Для поверхности с антителами к IgG мыши 10 мкл антитела к IgG мыши (поликлональное антитело кролика к IgG мыши) из набора для захвата антител мыши (GE Healthcare) разводили до 30 мкл/мл в 324 мкл конечного буфера для иммобилизации (10 мМ ацетат натрия, рН 5,0). Скорость потока была установлена на 5 мкл/мин, тракт потока 3. Смешивали пятьдесят мкл NHS и 50 мкл EDC и вводили в течение 420 сек для активации поверхности чипа. Разведенное антитело вводили в течение 420 сек. 1 М этаноламин вводили в течение 420 сек. Тракт потока переключали на тракт потока 4. Получали новую смесь EDC/NHS и повторяли процедуру для проточной ячейки 4. Поверхность кондиционировали с помощью 2 инъекций 10 мМ глицина, рН 1,7, в течение 30 сек с применением тракта потока 3,4 при 30 мкл/мин.

Конечные уровни иммобилизации были следующими:

Проточная ячейка 1 - 10000 ОЕ (антитело к IgG человека)

Проточная ячейка 2 - 10092 ОЕ (антитело к IgG человека)

Проточная ячейка 311824 ОЕ (антитело к IgG мыши)

Проточная ячейка 4 - 11216 ОЕ (антитело к IgG мыши)

10A.f.1.ii. Анализ связывания

[0231] Применяемый для анализа связывания подвижный буфер представлял собой PBS-P+/0,2% BSA. Все антитела разводили до концентрации 1 мкг/мл в PBS-P+/0,2% BSA (приготовление аналогично таковому для подвижного буфера), центрифугировали при 14000g в течение 5 мин при комнатной температуре и супернатант переносили в новую пробирку. Анализируемое вещество (мономерный тау 2N4R wt, 2,15 мг/мл, 47 мкМ) разводили до концентрации 100 нМ в PBS-P+/0,2% BSA, центрифугировали при 14000 g в течение 5 мин при комнатной температуре и супернатант переносили в новую пробирку. Раствор 100 нМ подвергали серийному разведению в 5 раз в PBS-P+/0,2% BSA. Конечные концентрации составляли 100 нМ, 20 нМ, 4 нМ, 0,8 нМ, 0,16 нМ, 0,032 нМ и 0 нМ. Гуманизированные антитела захватывали в проточной ячейке 2 при скорости потока 10 мкл/мин в течение времени контакта 60 сек. Антитела мыши захватывали в проточной ячейке 4 при скорости потока 10 мкл/мин в течение времени контакта 60 сек. Разведения тау-белка вводили во все 4 проточные ячейки при скорости потока 30 мкл/мин в течение времени контакта 240 сек. Диссоциация продолжалась 900 сек. После каждого цикла поверхность регенерировали путем введения в течение 30 сек (тракт потока 1,2) 3 М MgCl₂при 30 мкл/мин, введения в течение 30 сек (тракт потока 3,4) 10 мМ глицина при 30 мкл/мин, рН 1,7, введения в течение 30 сек (тракт потока 1,2) 3 М MgCl₂ при 30 мкл/мин, с последующими двумя введениями в течение 30 сек (тракт потока 3,4) 10 мМ глицина при 30 мкл/мин, рН 1,7. После прогона собранные данные были аппроксимированы к равновесной модели связывания с применением всех концентраций с использованием BIAEvaluations. Аппроксимацию данных по кинетике осуществляли с применением ленгмюровской модели связывания 1:1, с исключением 100 нМ примеси (включение 100 нМ примеси приводило к неприемлемо высоким значениям X²). Набор данных по связыванию антител также анализировали с применением модели с 2 состояниями.

10A.f.2. Анализ связывания мономерного тау с применением захваченных антител к IgG человека

10A.f.2.i. Получение чипа

[0232] Получение чипа осуществляли с применением прибора BIAcore™ Т-100. Получение чипа осуществляли с применением функции «Мастер» для иммобилизации. Подвижный буфер представлял собой HBS-P+. Пятьдесят мкл антитела к IgG человека (моноклональное антитело мыши к Fc человека) из набора для захвата антител человека (GE Healthcare) разводили до 25 мкл/мл в 300 мкл конечного буфера для иммобилизации (10 мМ ацетат натрия, рН 5,0). Скорость потока была установлена на 5 мкл/мин. Иммобилизацию осуществляли во всех четырех проточных ячейках с временем контакта с лигандом 360 сек. Поверхность кондиционировали с помощью двух инъекций 3 М MgCl₂ в течение 30 сек с применением тракта потока 1, 2, 3, 4 при 30 мкл/мин.

Конечные уровни иммобилизации были следующими:

Проточная ячейка 1 - 7341 ОЕ

Проточная ячейка 2 7683 ОЕ

Проточная ячейка 3 7530 ОЕ

Проточная ячейка 4 - 6303 ОЕ

10A.f.2.ii. Анализ связывания

[0233] Эксперименты по связыванию осуществляли с применением прибора BIOcore™ Т-100 или прибора Т-200. Применяемый для анализа связывания подвижный буфер представлял собой PBS-P+/0,2% BSA. Все антитела разводили до концентрации 2 мкг/мл в PBS-P+/0,2% BSA (приготовление аналогично таковому для подвижного буфера), центрифугировали при 14000 g в течение 5 мин при комнатной температуре и супернатант переносили в новую пробирку. Анализируемое вещество (мономерный тау 2N4R wt, 2,15 мг/мл, 47 мкМ) разводили до концентрации 100 нМ в PBS-P+/0,2% BSA, центрифугировали при 14000 g в течение 5 мин при комнатной температуре и супернатант переносили в новую пробирку. Раствор 100 нМ подвергали серийному разведению в 5 раз в PBS-P+/0,2% BSA. Конечные концентрации составляли 100 нМ, 20 нМ, 4 нМ, 0,8 нМ, 0,16 нМ, 0,032 нМ и 0 нМ. Гуманизированные антитела последовательно захватывали в проточных ячейках 2, 3 и 4 при скорости потока 10 мкл/мин в течение времени контакта 60 сек. Разведения тау-белка вводили во все 4 проточные ячейки при скорости потока 30 мкл/мин в течение времени контакта 240 сек. Диссоциация продолжалась 900 сек. После каждого цикла поверхность регенерировали путем введения в течение 30 сек 3 М MgCl₂ при 30 мкл/мин во все четыре проточные ячейки. После прогона аппроксимацию данных по кинетике осуществляли с применением ленгмюровской модели связывания 1:1, с исключением 100 нМ примеси (включение 100 нМ примеси приводило к неприемлемо высоким значениям Х2).

10A.f.3. Анализ связывания мономерного тау с применением захваченного сгрептавидина

10A.f.3.i. Получение антител

[0234] Каждое антитело в концентрации 400 мкг разводили до 2 мг/мл и подвергали обмену буфера на 0,1 М бикарбонат натрия, рН 8,3, с применением колонок для обессоливания MWCO 40 кДа на 0,5 мл Zeba™ (Thermo). NHS-PEG4-биотин готовили непосредственно перед применением путем растворения в воде до конечной стоковой концентрации 20 мМ, добавляли к антителам при молярном соотношении 5:1 (биотин : MAb) и конъюгировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Избыточный биотин удаляли последовательными заменами буфера на 1 × DPBS с применением колонок для обессоливания MWCO 40 кДа на 0,5 мл Zeba™. Для BIAcore™-анализа все антитела разводили до концентрации 2 мкг/мл в PBS-P+/0,2% BSA (приготовление аналогично таковому для подвижного буфера), центрифугировали при 14000 g в течение 5 мин при комнатной температуре и супернатант переносили в новую пробирку. Затем для каждого антитела определяли время введения для достижения уровня захвата ~ 225 ОЕ.

[0235] Тау-белок 2N4R дикого типа (2,15 мг/мл, 47 мкМ) разводили до концентрации 100 нМ в PBS-P+/0,2% BSA, центрифугировали при 14000 g в течение 5 мин при комнатной температуре и супернатант переносили в новую пробирку. Раствор 20 нМ подвергали серийному разведению в 5 раз в PBS-P+/0,2% BSA. Конечные концентрации составляли 20 нМ, 4 нМ, 0,8 нМ, 0,16 нМ и 0 нМ.

10A.f.3.ii. Анализ связывания

[0236] Применяемый биосенсорный чип представлял собой чип CAP из набора для захвата биотинилированных молекул CAPture™ (GE Healthcare, номер по каталогу 28-9202-34). Все эксперименты осуществляли с применением прибора Т-100. САР-реагент иммобилизовали во всех четырех проточных ячейках (тракт потока 1, 2, 3, 4) при скорости потока 2 мкл/мин в течение 5 мин (конечный уровень стрептавидина составлял ~3500 ОЕ). Биотинилированные гуманизированные антитела, биотинилированное химерное 7G6 или биотинилированное ms7G6 мыши последовательно захватывали в проточных ячейках 2, 3 и 4 при скорости потока 10 мкл/мин в течение времени контакта от 80 сек до 146 сек (время контакта для биотинилированного химерного антитела составляло 240 сек). Разведения тау-белка вводили во все четыре проточные ячейки при скорости потока 30 мкл/мин в течение времени контакта 180 сек последовательно от 0 нМ до 20 нМ. После последнего введения (20 нМ тау) диссоциация продолжалась 900 сек. После каждого цикла поверхность регенерировали путем введения в течение 120 сек при 10 мкл/мин 6М гуанидина-HCl, 0,25 М NaOH во все четыре проточные ячейки. Образцы анализировали в двух повторах, за исключением 7G6 мыши и 7G6-zuHC25-zuLC18, которые анализировали в двух повторах в двух отдельных проточных ячейках (в общей сложности 4 анализа для каждого). После прогона осуществляли аппроксимацию данных по кинетике с применением ленгмюровской модели связывания 1:1 с применением одноцикловой кинетики.

10A.g. Эксклюзионная хроматография в сочетании с высокоэффективной жидкостной хроматографией (SEC-HPLC)

[0237] SEC-HPLC осуществляли с использованием HPLC-системы Agilent 1260 с насосом для четырехкомпонентных смесей, оснащенной предколонкой AdvanceBio™ SEC 300А, 2,7 мкм, 4,6 мм ID x 50 мм и колонкой AdvanceBio™ SEC 300A, 2,7 мкм, 4,6 мм ID x 300 мм (Agilent). Скорость потока состоящей из 0,1М фосфата натрия (рН 6,5) подвижной фазы в изократическом режиме составляла 0,35 мл/мин. Разделение проводили при температуре окружающей среды. Элюат отслеживали при 280 нм. Для каждого прогона вводили пятьдесят мкг образца (10 мкл 5 мг/мл образца); каждый образец анализировали дважды. Интегрирование пика осуществляли с применением программного обеспечения Agilent OpenLAB. Регистрировали время удержания, высоту пика, площадь пика, ширину пика и симметрию пика. Процентную долю агрегатов и мономеров рассчитывали исходя из площади пика.

10A.h. Анализ на основе дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC)

[0238] Дифференциальный сканирующий калориметр с VP-капиллярной ячейкой (VP-CapDSC; MicroCal, VP-CapDSC, s/n 12-07-149 с построением графиков с помощью Origin-7 и программным обеспечением v.2.0 для MicroCal VP-Capillary DSC) применяли для расшифровки и сравнения структуры более высокого порядка и термостабильности различных F(ab')₂-фрагментов и контролей. Образцы были адаптированы к температуре окружающей среды в течение 30 минут, с последующим перемешиванием навортексе. Весь образец (0,4-0,5 мл) добавляли в соответствующие лунки планшета для анализа (Microliter Analytical Supply, 96-луночный, 500 мкл, закругленные лунки с круглым дном, номер по каталогу 07-2100; пленка для закрывания планшетов Sun Suri, номер по каталогу 300-005). В соответствующие лунки планшета для анализа добавляли 0,5 мл 20% раствора Contrad и 0,5 мл воды. Закрытые планшеты помещали в автодозатор на 10°С.

[0239] Прогон программировали, и начинали с применением следующих параметров анализа:

DSC-контроли:

Начальная температура = 25°С

Конечная температура = 100°С

Скорость сканирования = 100°С/час

Число процедур повторного сканирования = 0

Скорость охлаждения при повторном сканировании = ЕХР

Термостат перед сканированием = 10 минут

Термостат после сканирования = 5 минут

Термостат после проведения цикла = 25°С

Время фильтрования = 10 секунд

Автоматическое заполнение ячеек = при 30°С

Режим обратной связи/с усилением = нет

Индивидуальные сканирования

Параметры образца:

Концентрация = мМ

Параметры файла = авто#

Промывочная станция = выбрать Промывка 2 (будет производиться Промывка 2 (1 × PBS), затем промывка 1 (вода))

Установленная величина регулятора термостата = 25°С

Регуляция импульса:

Величина импульса = -3

Продолжительность = 600

Прерывание импульса

Единицы шкалы по оси Y = мкал/минута.

Промывка в технологическом потоке Contrad/Contrad при 25-70°С, 100°С/час с последующими двумя введениями буфер/буфер.

10 В. Результаты

10 В.а. Гуманизация IGHV1/IGKV2

10 В.а.1 моделирование 7G6 in silico

[0240] Белковые последовательности вариабельного домена зародышевой линии человека, наиболее гомологичные mAb ms7G6 мыши, получали с применением BLAST на сайте http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/ и http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi. Последовательности семейств вариабельных доменов IGHV1-46*03 и IGKV2-30*02 были наиболее гомологичными ms7G6 (фиг. 11). Каркасные последовательности мыши замещали наиболее близкими по гомологии последовательностями зародышевой линии человека для получения гуманизированных вариантов с привитыми CDR.

[0241] Последовательности мыши и последовательности с привитыми CDR применяли для получения in silico моделей вариабельных доменов. Теоретическая структура мышиных и гуманизированных моделей была наложена, и остатки в непосредственной близости к CDR анализировали в отношении потенциального структурного влияния на общую структуру CDR-петель. Несмотря на то, что большинство отличающихся остатков не были расположены на границе димеров или были отдалены от CDR, было обнаружено, что несколько остатков находятся в непосредственной близости (в пределах 5 Å) к CDR.

[0242] В Vκ-домене гидроксильная группа в Tyr36 мыши образовывала потенциальную водородную связь с Trp100 в CDRH3. В случае Phe36 человека эта водородная связь утрачивалась, что может оказывать влияние на структурную целостность CDRH3. Arg46 намного крупнее Leu46 мыши, и Arg46 может создавать стерическое препятствие для надлежащего сворачивания CDR. Подобным образом, в Vh-домене, положение 71 находилось напротив CDR. Arg71 человека может создавать стерическое препятствие для надлежащего сворачивания CDR, в отличие от Val71 мыши. Val78 человека располагался подобным образом, и он крупнее Ala78 мыши. Следовательно, Val78 может, однако маловероятно, влиять на целостность CDR.

[0243] Антитело 7G6 мыши содержало два неспаренных цистеиновых остатка, которые могли создать проблемы при разработке mAb из-за присутствия трех тиольных групп, которые могли содействовать агрегации, окислению, цистеинилированию или глутатионилированию продукта. Один Cys находился в положении 57 в CDRH2, а второй находился в положении 49 в FWRL2.

[0244] По определению согласно Kabat CDRH2 на 8 С-концевых аминокислот длиннее, чем по определению согласно IMGT. Последние 8 аминокислот анализировали в отношении их близости к сайту связывания антигена и потенциального вклада в связывание антигена. Asn58 находился в пределах потенциального антигенсвязывающего сайта на потенциальной границе контакта CDR-антиген в верхней части вариабельных доменов. Остатки 60, 61, 64 и 65, отличающиеся между последовательностями мыши и зародышевой линии человека, находились за пределами потенциального антигенсвязывающего сайта и, по всей видимости, напрямую не контактировали с антигеном или не обеспечивали структурную поддержку для надлежащего сворачивания CDR.

10 В.а.2. Гуманизированные Vh1- и Vκ2-варианты и анализ связывания тау с помощью ELISA

[0245] Получали серию гуманизированных мутантов с применением семейств вариабельных доменов Vh1 и Vκ2 зародышевой линии для оценки важности остатков мыши в положениях, предсказанных путем моделирования in silico как таковые, являющиеся важными для взаимодействий CDR-антиген (фиг. 12). Гуманизированные и мышиные остатки 7G6 анализировали в положениях Vh 60, 61, 64, 65, 71 и 78 в различных комбинациях (7G6-HCzu1-4), а также в случае мутации C57S (7G6-HCzu5). Комбинации остатков человека и мыши в положениях 36, 46 и 49 в Vκ ms7G6 также анализировали (7G6-LCzu1-5), а также в случае мутации C49S (7G6-LCzu6). MAb экспрессировались в матричном формате, причем в случае каждой комбинации гуманизированных НС и LC проводили котрансфекцию, за исключением 7G6-HCzu5, которое коэкспрессировалось только с 7G6-LCzu2, и 7G6-LCzu6, которое коэкспрессировалось только с 7G6-HCzu3.

[0246] Для тестирования прямого связывания с тау, тау 2N4R покрывали 96-луночные планшеты, и в лунки добавляли различные концентрации гуманизированных mAb. Связанные с тау MAb детектировали с помощью либо HRP-конъюгированного антитела к IgG мыши ([ms]7G6 мыши), либо антитела к IgG человека (остальные образцы). Образцы инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре в 96-луночных планшетах, покрытых тау 2N4R. После промывки в лунки добавляли детекторные HRP-конъюгированные антитела к IgG мыши или человека. Антитело к IgG мыши применяли для детектирования ms7G6. Уровень активности HRP в каждой лунке измеряли с помощью флуоресцентного субстрата QuantaBlu и RFU детектировали с помощью планшет-ридера SpectraMax M5.

[0247] Данные по образцам, сгруппированным в соответствии с LC-вариантом, за исключением мутантов по цистеину, которые сгруппированы на самом нижнем графике, показаны на фигурах 13A-13F. Среди всех НС- и LC-вариантов 7G6 наблюдали небольшие различия в связывании тау (фигуры 13A-F; таблица 3). Хотя для ms7G6 наблюдали лучшее связывание, по сравнению с гуманизированными вариантами, следует отметить, что этот результат может быть искаженным ввиду применения отличающихся детекторных антител для образцов антител мыши и человека. mAb2 соответствует контрольному IgG-антителу, связывающему отличный от тау антиген.

[0248] Для снижения потенциальной иммуногенности получали еще одну серию мутантов с возрастающим числом остатков человека (7G6-HCzu6, 7G6-HCzu 7 и 7G6-HCzu 8; фиг. 12). Поскольку для Ser57 Vh было показано небольшое различие в связывании с Cys57, большинство мутантов содержало Ser57. Для дальнейшего подтверждения того, что серии был подходящей заменой цистеину в положении 57, получали две пары мутантов, отличающиеся только в положении 57 (7G6-HCzu7 и 7G6-HCzu9, и 7G6-HCzu8 и 7G6-HCzu10; фиг. 12).

[0249] Все Vκ-варианты были сконструированы с Ser49, за исключением 7G6-LCzu10, который был получен для определения того, является ли остаток Tyr49 человека подходящей заменой Cys49. 7G6-LCzu7 был аналогичен 7G6-LCzu1 и 7G6-LCzu1, за исключением Ser49. 7G6-LCzu21 был аналогичен 7G6-LCzu5, a 7G6-LCzu22 был аналогичен 7G6-LCzu4, также с Ser49. 7G6-LCzu8 содержал валин в положении 30 для определения того, сохранял ли остаток человека в этом положении способность к связыванию тау. Положение 34 было несколько утоплено в структуре, и, возможно, оно не способствовало связыванию антигена, поэтому остаток Asn34 человека на конце CDRL1 был введен в 7G6-LCzu9. Все НС-варианты коэкспрессировались с 7G6-LCzu6, а все LC-варианты коэкспрессировались с 7G6-HCzu5.

[0250] Связывание тау анализировали с помощью прямого ELISA, как описано выше. Образцы инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре в 96-луночных планшетах, покрытых тау 2N4R дикого типа. После стадии промывки в лунки добавляли детекторные HRP-конъюгированные антитела к IgG мыши или человека. Антитело к IgG мыши применяли для детектирования ms7G6. Уровень активности HRP в каждой лунке измеряли с помощью флуоресцентного субстрата QuantaBlu и RFU детектировали с помощью планшет-ридера SpectraMax M5. Для большей части mAb было показано небольшое различие в связывании тау в прямом ELISA-анализе (фиг. 14; таблица 4). Примечательным исключением было LCzu9, которое не проявляло способность к связыванию даже при наивысших концентрациях. Следовательно, Glu34 Vκ был критически важным для связывания антигена. Кроме того, для LCzu22 была показана сниженная способность к связыванию; Tyr36 Vκ в комбинации с Arg46 обуславливал нарушение антигенсвязывающего сайта.

[0251] Связывание гуманизированных антител и антител мыши анализировали с помощью метода поверхностного плазменного резонанса (BIAcore™) для определения их относительных показателей скорости ассоциации (k_a), скорости диссоциации (k_d) и равновесных констант связывания (K_D). Антитела к IgG мыши или человека иммобилизировали на чипе СМ5, и mAb в качестве образцов захватывали на чипе. Чип заливали тау 2N4R и наблюдали связывание. Константы связывания k_a, k_d и K_D определяли с применением модели аппроксимации для ленгмюровского связывания 1:1. Для полученного из гибридомы антитела ms7G6 или рекомбинантного материала IgG2a или IgG2b не было показано различия в показателях скорости ассоциации или диссоциации (таблица 5). Среди НС-вариантов 7G6 имели место лишь незначительные различия, и мутации с заменой цистеина на серии не влияли на связывание тау. 7G6-LCzu2, LCzu6, LCzu7, LCzu8 и LCzu21 связывали тау подобным образом, демонстрируя, что отличающиеся между этими mAb аминокислоты оказывали незначительное влияние на связывание. В случае гуманизированных образцов наблюдали лучшее связывание с тау, чем в случае mAb мыши, однако это, скорее всего, было связано с необходимостью использования различных захватывающих антител в этом формате анализа.

[0252] Эти данные, наряду с данными из ELISA-анализа, продемонстрировали необходимость Glu34 Vκ 7G6 и наличие неблагоприятной комбинации Tyr36 и Arg46 Vκ 7G6. Остатки Vκ 7G6 Tyr36 и Leu46 в LCzu6 были несколько предпочтительнее остатков Phe36 и Arg46 человека в 7G6-LCzu7 и 7G6-LCzu8, но целесообразность сохранения остатков человека в этих положениях перевесила незначительное снижение k_d. Tyr57 Vκ человека в 7G6-LCzu10 оказывал значимое влияние на k_d.

10В.а.3. SDS-PAGE-анализ стабильности HC/LC для Vh1- и Vκ2-вариантов

[0253] Два микрограмма каждого mAb смешивали с 4× буфером для образцов NuPAGE™ LDS и разделяли в невосстанавливающих условиях на 4-12% Bis-Tris-геле для SDS-PAGE в буфере MOPS. Гели окрашивали с помощью InstantBlue™ и обесцвечивали в воде. Все mAb с Cys49 в LC (7G6-LCzu2, 7G6-LCzu3, 7G6-LCzu4 и 7G6-LCzu5) не были стабильными, и в невосстанавливающих условиях тримеры HC-HC-LC, димеры НС-НС и свободную LC разделяли с помощью SDS-PAGE (фиг. 15). В случае 7G6-LCzu2 наблюдали меньшее число низкомолекулярных продуктов разделения, вероятно ввиду того, что этот Vκ содержал два дополнительных остатка мыши, Tyr36 и Leu46, стабилизирующие взаимодействие Vh-Vκ. У 7G6-LCzu3, 7G6-LCzu4 и 7G6-LCzu5 один или оба таких остатка были изменены на Phe36 и/или Arg46 человека. Наименее стабильными mAb были LCzu3-варианты с обоими остатками человека. В случае 7G6-LCzu7, 7G6-LCzu8, 7G6-LCzu9 и 7G6-LCzu22 наблюдали небольшое количество свободных легких цепей, что говорит о том, что взаимодействие НС и LC в этих образцах может быть неоптимальным, в результате чего небольшое количество антител не образует межцепочечную дисульфидную связь HC-LC. Как и в случае 7G6-LCzu3, эти LC-варианты содержат остатки человека в одном или обоих положениях 36 и 46. 7G6-LCzu10 и 7G6-LCzu21 также содержат остатки человека в этих положениях, однако свободных LC не наблюдали, возможно, из-за неполного окрашивания с помощью красителя InstantBlue™.

10В.b Гуманизация IGHV3/IGKV1

10B.b.1 Гуманизированные Vh3- и Vκ1-варианты и анализ связывания тау с помощью ELISA

[0254] Для рассматриваемых выше гуманизированных вариантов 7G6 использовали семейства вариабельных доменов IGHV1 и IGKV2 зародышевой линии человека, выбранные исходя из их сходства с ms7G6. Однако эти семейства недостаточно представлены в человеческой популяции, что увеличивает вероятность того, что гуманизированные варианты будут иммуногенными для пациентов (Brezinschek HP, Foster SJ, Т, Brezinschek RI, Lipsky PE. Pairing of variable heavy and variable kappa chains in individual naive and memory В cells. J Immunol. 1998 May 15; 160(10):4762-7; Jayaram N, Bhowmick P, Martin AC. Germline Vh/VK pairing in antibodies. Protein Eng Des Sel. 2012 Oct; 25(10):523-9; Tiller T, Schuster I, Deppe D, Siegers K, Strohner R, Hemnann T, Berenguer M, Poujol D, Stehle J, Stark Y, Heβling M, Daubert D, Felderer K, Kaden S, J, Enzelberger M, Urlinger S. A fully synthetic human Fab antibody library based on fixed Vh/VK framework pairings with favorable biophysical properties. MAbs. 2013 May-Jun;5(3):445-70). Следовательно, CDR ms7G6 прививали на более распространенные семейства IGHV3 и IGKV1 (фиг. 16).

[0255] Вышеупомянутую in silico модель ms7G6 анализировали, как описано выше, в отношении остатков человека, находящихся в непосредственной близости (5 Å) к CDR. Остатки человека в Vh в положениях 49, 71, 76, 78 и 94 и в Vκ в положениях 2 и 57 были идентифицированы как потенциально критически важные каркасные остатки. Получали два гуманизированных Vh- и Vκ-варианта, один со всеми каркасными остатками человека (7G6-HCzu11; 7G6-LCzu11) и один с потенциально критически важными остатками, подвергнутыми обратной мутации (7G6-HCzu12; 7G6-HCzu12) (фиг. 17). Обе НС коэкспрессировались с обеими LC.

[0256] Тау 2N4R покрывали 96-луночные планшеты, и в лунки добавляли различные концентрации гуманизированных mAb, как описано выше. Связанные с тау MAb детектировали с помощью либо HRP-конъюгированного антитела к IgG мыши (ms7G6), либо антитела к IgG человека (остальные образцы). Все гуманизированные mAb связывались с тау подобным образом, но mAb 7G6-HCzu12-LCzu12 характеризовался наиболее низким ЕС50 (фиг. 18 и таблица 6). Оба mAb мыши характеризовались лучшим связыванием, чем гуманизированные варианты, возможно ввиду применения отличающихся детекторных антител для образцов антител мыши и человека. Эти данные свидетельствуют о том, что по меньшей мере некоторые из остатков человека вблизи CDR оказывают негативное воздействие на связывание антигена.

[0257] Для снижения потенциальной иммуногенности получали еще одну серию мутантов с возрастающим числом остатков человека. Остатки на С-концевой половине CDRH2 оказывали небольшое влияние на связывание тау в 7G6-HCzu4-варианте на основе Vh1. Следовательно, эти остатки заменяли на остатки Vh3 зародышевой линии в 7G6-HCzu13, 7G6-HCzu14, 7G6-HCzu19 и 7G6-HCzu20 (фиг. 17). 7G6-HCzu12-варианты получали таким образом, что остатки мыши были замещены остатками человека в порядке предполагаемого возрастания важности в отношении связывания антигена, основываясь на in silico модели ms7G6. К примеру, боковая цепь Ser76 находилась на петле, обращенной в противоположную от CDR сторону, и этот остаток наименее вероятно влиял на взаимодействие CDR-антиген. Следовательно, он представлял собой первый остаток, подлежащий замене на остаток Asn76 человека в 7G6-HCzu15. Следующим мутации подвергали остаток 49 (7G6-HCzu16), затем 78 (7G6-HCzu17), 71 (7G6-HCzu18) и, наконец, 94 (7G6-HCzu20).

[0258] С небольшой разницей между 7G6-LCzu11 и 7G6-LCzu12, ожидалось, что остатки человека в положениях 2 и 57 будут оказывать небольшое влияние на связывание антигена. Следовательно, каждый из них подвергали мутации по одному. В случае положения 57, анализировали замены тирозина и серина. В 7G6-LCzu16 и 7G6-LCzu17 в положении 30 вводили валин. В 7G6-LCzu17 на конце CDRL1 вводили остаток Asn34 человека. Все НС-варианты коэкспрессировались с 7G6-LCzu12, а все LC-варианты коэкспрессировались с 7G6-HCzu12.

[0259] Для большей части mAb было показано небольшое различие в связывании тау в прямом ELISA-анализе (фиг. 19 и таблица 7). Примечательным исключением было LCzu17, которое не проявляло способность к связыванию даже при наивысших концентрациях. Следовательно, Glu34 Vκ был критически важным для связывания антигена.

ЕС50 определяли с помощью аппроксимации кривой нелинейной регрессии в GraphPad Prism 6.05. NB (связывание отсутствует) означает связывание с тау от незначительно до полного его отсутствия.

10В.b.2 Анализ BIAcore™ аффинности тау в отношении Vh3 и Vκ1-вариантов

[0260] Связывание гуманизиро ванных антител и антител мыши анализировали с помощью BIAcore™ для определения их относительных показателей скорости ассоциации (ka), скорости диссоциации (kd) и равновесных констант связывания (K_D). Антитела к IgG мыши или человека иммобилизировали на чипе СМ5, и mAb в качестве образцов захватывали на чипе. Чип заливали тау 2N4R и наблюдали связывание. Константы связывания k_a, k_d и k_d определяли с применением модели аппроксимации для ленгмюровского связывания 1:1. Оба mAb на основе 7G6-HCzu12 характеризовались подобными значениями k_a и k_d (таблица 8). Однако ka 7G6-HCzu11 было сниженным, хотя при этом k_d не было затронуто. Следовательно, остатки человека в каркасной области Vh3 влияют на связывание с тау. Как и в ELISA-анализе, 7G6-LCzu17 не связывало тау. Различие в k_d между 7G6-HCzu12, 7G6-HCzu13 и 7G6-HCzu14 говорит о том, что С-концевые остатки человека в CDRH2 оказывают негативное влияние на связывание антигена. Снижение k_d не наблюдалось в случае 7G6-HCzu19 и 7G6-HCzu20, которые также содержат остатки человека в указанной области; однако эти mAb характеризуются снижением k_a. 7G6-HCzu15 не очень хорошо связывалось с чипом, и данные по этому mAb были ненадежными. Хотя никаких конкретных данных в случае одиночной мутации S76N не было получено, значения k_a и k_d для 7G6-HCzu16, 7G6-HCzu17, 7G6-HCzu18 были подобными таковым у 7G6-HCzu12, что говорит о том, что мутация S76N не должна влиять на связывание тау. Значение ka для 7G6-HCzu20 было меньшим, чем таковое для 7G6-HCzu19, и это может быть результатом мутации K94R. Следовательно, остатки человека в положениях 49, 71, 76 и 78, вероятно, не влияют на связывание тау. В случае гуманизированных образцов наблюдали лучшее связывание с тау, чем в случае mAb мыши, однако это, скорее всего, было связано с необходимостью использования различных захватывающих антител в этом формате анализа.

[0261] Имело место небольшое различие между значениями k_a или k_d для любого из LC-вариантов 7G6, за исключением 7G6-LCzu17, который не связывал тау из-за Asn34. Следовательно, Ile2 человека не оказывал эффект в отношении связывания антигена. Все из цистеина, серина и тирозина, по-видимому, допускались в положении 57. Валин в положении 30 не оказывал влияние на связывание тау.

10В.b.3 SDS-PAGE-анализ стабильности HC/LC для Vh3- и Vκ1-вариантов

[0262] Два микрограмма каждого mAb смешивали с 4× буфером для образцов NuPAGE™ LDS и разделяли в невосстанавливающих условиях на 4-12% Bis-Tris-геле для SDS-PAGE в буфере MOPS. Гели окрашивали с помощью InstantBlue™ и обесцвечивали в воде. 7G6-HCzu11 с большим числом остатков человека, в особенности при спаривании с 7G6-LCzu12 с меньшим числом остатков человека, обуславливал образование димеров НС-LC и свободных НС (фиг. 20А). Кроме того, в случае 7G6-HCzu18 и 7G6-HCzu19 наблюдали присутствие значимых фрагментов (фигуры 20В и 20С). Эти два антитела отличаются от других в положении 71. Следовательно, остаток Arg41 человека, хотя и не влияет на связывание тау, способствовал дестабилизации взаимодействия HC-LC. Ни для одного из LC-вариантов не наблюдали фрагменты антител. В отличие от проанализированных выше Vh1-Vκ2-mAb, Cys49 не обуславливал образование тримеров HC-HC-LC, димеров НС-НС или свободных LC.

10В.с. Скрининг гуманизированных ангигел

[0263] Опираясь на человеческое происхождение последовательностей, данные по аффинности согласно BIAcore™ и данные по стабильности согласно SDS-PAGE в случае гуманизации IGHV1/IGKV2, 7G6-HCzu8 было выбрано в качестве наиболее близкой к человеческой последовательности с наивысшей аффинностью к тау. 7G6-LCzu6 и 7G6-LCzu21 характеризовались сопоставимой стабильностью в SDS-PAGE и аффинностью к тау, но отличались по одной аминокислоте в положении 36. Обе легкие цепи были выбраны для коэкспрессии с 7G6-HCzu8 для определения наилучшего mAb на основе IGHV1/IGKV2.

[0264] Другой раунд мутагенеза осуществляли в отношении IGHV3- и IGKV1-вариантов с наиболее близкой к человеческой последовательностью, наиболее высокой аффинностью и наиболее высокой стабильностью с целью удаления неспаренных цистеиновых остатков в положениях 57 и 49 соответственно. 7G6-HCzu17 и 7G6-HCzu18 были выбраны как таковые, характеризующиеся наибольшим числом каркасных остатков человека, с наиболее высокой аффинностью. 7G6-HCzu18 было подвергнуто супергуманизации путем введения остатков человека в С-концевой участок CDRH2 для получения 7G6-HCzu21, однако аффинность никогда не анализировали. Все из 7G6-HCzu18, 7G6-HCzu21 и 7G6-HCzu17 содержали цистеин в положении 57, и серии в положение 57 вводили во всех трех вариантах для получения 7G6-HCzu24, 7G6-HCzu23 и 7G6-HCzu25 соответственно (фиг.17). 7G6-LCzu14 и 7G6-LCzu15 представляли собой наиболее близкие к человеческим Vκ-последовательности с наиболее высокой аффинностью. В 7G6-LCzu14 сохранялся Cys49, и, следовательно, его подвергали мутации с целью удаления неспаренного цистеина, и назвали 7G6-LCzu18. Каждая НС IGHV3 образовывала пару с каждой LC IGKV1.

10В.с.1 Анализ массы интактных молекул

[0265] Массу каждого mAb анализировали с помощью ESI-MS для подтверждения совпадения теоретической массы с наблюдаемой массой. MAb расщепляли с помощью IdeS для получения F(ab')₂-фрагментов, с последующим восстановлением с помощью 2 мМ DTT и нагревания при 60°С в течение 3 мин. Массу Fd- (Vh-CH1) и LC-фрагментов анализировали с помощью ESI-MS. 7G6-HCzu8 содержало N-концевую пироглутаминовую кислоту, что является типичной посттрансляционной модификацией N-концевых глутаминовых остатков. Все наблюдаемые показатели массы находились в пределах 3 дальтон от предсказанных показателей массы (таблица 9).

10B.c.2 BIAcore™-анализ связывания тау

[0266] Связывание тау для гуманизированных mAb анализировали с помощью BIAcore™ в двух разных форматах. Первый формат осуществляли, как описано выше, т.е. mAb захватывали с помощью иммобилизованного видоспецифического антитела к Fc. Ограничение этого формата показано в таблицах 5 и 8, где показатели аффинности исходных mAb мыши и гуманизированных mAb нельзя сравнивать напрямую ввиду отличающихся захватывающих антител. Во втором формате биотинилированные mAb захватывали на покрытом стрептавидином чипе. Последний формат позволяет сравнивать напрямую аффинность связывания тау между гуманизированным и исходным антителом мыши, поскольку способ захвата был идентичен.

10B.c.2.i Fc-специфический захват

[0267] Конечные гуманизированные mAb анализировали с помощью BIAcore™ для определения k_a, k_d и k_d связывания с тау, как описано выше (таблица 10). Наблюдали значимое изменение в отношении скорости обратной реакции (k_d) между 7G6-HCzu23 и 7G6-HCzu24, тогда как 7G6-HCzu24 было подобным 7G6-HCzu25, что также наблюдалось в отношении общей аффинности k_d. Это подтверждало важность сохранения остатков мыши в CDRH2, как показано выше в таблице 7.

10B.c.2.ii Захват с помощью стрептавидина

[0268] Биотинилированные гуманизированные mAb и mAb мыши захватывали на покрытом стрептавидином чипе и определяли k_a, k_d и k_d связывания с тау (таблица 11). В случае 7G6-HCzu8-LCzu21 было показано небольшое снижение аффинности (<2-кратно) в сравнении с 7G6-HCzu8-LCzu6. Подобным образом, варианты 7G6-HCzu23 характеризовались -2-кратным снижением аффинности в сравнении с mAb 7G6-HCzu24 и 7G6-HCzu25, как показано в таблице 11. Аффинность всех из 7G6-HCzu8-LCzu6, 7G6-HCzu24-LCzu15, 7G6-HCzu24-LCzu18, 7G6-HCzu25-LCzu15 и 7G6-HCzu25-LCzu18 была одинаковой. В целом, для этих антител было показано ~1,4-кратное снижение аффинности в сравнении с ms7G6, что отражалось главным образом в немного более высокой скорости обратной реакции в случае гуманизированных форм.

10В.с.3 Анализ однородности и агрегации с помощью SEC-HPLC

[0269] Каждый mAb анализировали с помощью SEC-HPLC для определения однородности mAb в растворе. Профили mAb 7G6-HCzu8-LCzu6 и 7G6-HCzu8-LCzu21 были идентичными, с главным пиком на 14,5 мин и широким плечом, что указывает на возможную неоднородность продукта по истечении 16 минут (фиг. 21А). Профили mAb 7G6-HCzu23, 7G6-HCzu24 и 7G6-HCzu25 были идентичными, с узким пиком в районе 14,7 мин (фиг. 21В).

10В.с.4 DSC-анализ

[0270] Кривые плавления F(ab')2-фрагментов анализировали с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC). Профили химерных, 7G6-HCzu8 и 7G6-HCzu25 F(ab')2 были подобны таковым в случае контрольных IgG1-антител человека, связывающих отличный от тау антиген, mAb1 и mAb2. Для 7G6-HCzu23 и 7G6-HCzu24, однако, наблюдали второй пик, что указывает на нестабильность F(ab')2-фрагмента, возможно, диссоциацию взаимодействия HC-LC (фигурах 22A-L). Точки перехода для 7G6-HCzu8-LCzu21, 7G6-HCzu25-LCzu15 и 7G6-HCzu25-LCzu18 были подобными, находясь в диапазоне 77,4-77,6°С. Точка перехода для 7G6-HCzu8-LCzu6 была на один градус выше, при 78,6°С (таблица 12).

10B.d Анализ Т-клеточных эпитопов

[0271] Гуманизированные последовательности анализировали in silico при помощи Stealth Biologics в отношении потенциальных иммунореактивных Т-клеточных эпитопов. Анализировали две последовательности для каждого семейства вариабельных областей зародышевой линии, причем каждая содержала отличающиеся количества остатков человека и мыши. mAb1-2a и mAb1-2b соответствовали IGHV1-46a/IGKV2-30a, a mAb3-1a и mAb3-1b соответствовали IGHV3-23b/IGKV1-39b. Хотя для каждого вариабельного домена анализировали только четыре последовательности, были представлены все потенциальные Т-клеточные эпитопы в тестируемых гуманизированных mAb. Пептидные эпитопы, характеризующиеся идентичностью более чем с 5% последовательностей зародышевой линии человека, считались эпитопами низкого риска, поскольку пептиды связывали только один или два аллельных варианта HLA.

[0272] На фигурах 23 и 24 представлены результаты анализа эпитопов, присутствующих в mAb. Пептиды в таблицах идентифицированы как характеризующиеся 5% или меньшей идентичностью с последовательностями зародышевой линии человека. Процент гомологии пептидов с последовательностями вариабельного домена зародышевой линии также учитывался. Пептиды с ~5% или меньшей гомологией с последовательностями вариабельного домена зародышевой линии и/или таковые, для которых было предсказано, что они связывают три или более аллельных вариантов HLA, идентифицированы как пептиды высокого риска (выделено серым цветом).

[0273] Как 7G6-HCzu8, так и 7G6-HCzu25 содержали общий пептид низкого риска в положении 32 без гомологии с последовательностями зародышевой линии, который связывал 3 аллельных варианта (фигуры 23А и 23В). Пептид 2 был предсказан как пептид низкого риска в 7G6-HCzu25, в отличие от пептида 2 7G6-HCzu8. Пептид 64 был связан с риском в обеих НС, согласно предсказанию связывая 3 аллельных варианта. Пептидная последовательность в 7G6-HCzu8 могла быть связана с меньшим риском, поскольку она характеризовалась некоторой гомологией с вариабельными доменами зародышевой линии. Пептид 70 в 7G6-HCzu8, но не 7G6-HCzu25, представлял небольшой риск.

[0274] Имело место одно различие между 7G6-LCzu6 и 7G6-LCzu21, согласно которому пептид 38 в 7G6-LCzu21 в соответствии с предсказанием связывал 1 аллельный вариант HLA, но представлял очень низкий риск (фигуры 24A-24D). Между 7G6-LCzu15 и 7G6-LCzu18 имело место только одно различие по пептиду 2, который представлял более высокий риск в 7G6-LCzu15, чем в 7G6-LCzu18, поскольку гомология с последовательностями вариабельных доменов зародышевой линии была от незначительной до полного ее отсутствия. При сравнении 7G6-LCzu6/7G6-LCzu21 с 7G6-LCzu15/7G6-LCzu18, последовательности 7G6-LCzu6/7G6-LCzu21 содержали 9 потенциально иммуногенных пептидов, тогда как 7G6-LCzu15/7G6-LCzu 18 содержало 6. Пептиды 51 и 52 были одинаковыми для всех LC, а пептиды 88-94 были одинаковыми или подобными, за исключением того, что пептид 90, который присутствовал в 7G6-LCzu6/7G6-LCzu21, отсутствовал в 7G6-LCzu15/7G6-LCzu18. Пептиды 2 и 3 представляли более высокий риск в 7G6-LCzu6/7G6-LCzu21, чем в 7G6-LCzu15/7G6-LCzu18.

10С. Краткий итог

[0275] Вкратце, ms7G6 гуманизировали исходя из двух разных семейств вариабельных доменов зародышевой линии человека с подобной аффинностью к ms7G6.

[0276] Зародышевыми линиями человека, наиболее близкими к последовательности мыши, были IGHV1-46 и IGKV2-30. Несмотря на то, что некоторые каркасные остатки мыши предположительно требовались для сохранения способности к связыванию антигена, связывание тау не было затронуто при введении каркасного остатка человека (7G6-HCzu1/7G6-HCzu8). Кроме того, связывание тау не было затронуто вследствие мутации с заменой неспаренного Cys57 на серии (7G6-HCzu5/7G6-HCzu8) или супергуманизации CDRH2 по остаткам 60, 61, 64 и 65 (7G6-HCzu4/7G6-HCzu8). Прививание CDR Vκ на IGKV2 не приводило к существенному снижению способности к связыванию тау, однако добавление одного или двух каркасных остатков мыши обеспечивало стабилизацию взаимодействия HC-LC. Leu46, вместе с Tyr36 или без него, обеспечивал повышение стабильности взаимодействия Vh-Vκ, как проанализировано с помощью SDS-PAGE, а комбинация Tyr36-Leu46 (7G6-LCzu2/7G6-LCzu6) обеспечивала образование антитела с немного более высокой аффинностью к тау, чем с Leu46 или Tyr36 по отдельности (7G6-LCzu/7G6-LCzu21 и 7G6-LCzu4/7G6-LCzu22 соответственно). Хотя имел место некоторый риск иммуногенности с лейцином в положении 46, этот риск был низким. Неспаренный Cys49 мог быть заменен серином, а замена на тирозин приводила к повышению скорости диссоциации.

[0277] Семейства вариабельных доменов IGHV3-23 и IGKV1-39 зародышевой линии человека были выбраны для потенциального снижения иммуногенности гуманизированного mAb, путем использования более часто экспрессируемых семейств IGHV3 и IGKV1. Для прививания CDR на IGHV3 зародышевой линии требуется один или несколько остатков мыши. Arg94 не мог быть лизиновым остатком человека. Остатки мыши в положениях 60, 61, 62, 63 и 65 требовались для оптимального связывания антигена. Аргинин в положении 71 не влиял на связывание антигена, но требовался для стабильности взаимодействия Vh-Vκ (7G6-HCzu12, 7G6-HCzu13, 7G6-HCzu14, 7G6-HCzu15, 7G6-HCzu16, 7G6-HCzu17, 7G6-HCzu25). Хотя Val71 приводил к образованию потенциально иммуногенного пептида в паре с Phe63 и Ser65, риск был низким. Связывание тау не затрагивалось при мутации с заменой неспаренного Cys57 на серии (7G6-HCzu23, 7G6-HCzu24, 7G6-HCzu25). Остатки человека во всей каркасной области IGKV1 не влияли на связывание антигена или стабильность (7G6-LCzu18).

[0278] Для всех протестированных антител имели место небольшие различия в р1 и термостабильности.

Пример 11. Иммуногистохимическое исследование пораженного заболеванием головного мозга человека с использованием 7G6-HCzu25/LCzu18.

[0279] Залитые в парафин фиксированные срезы головного мозга человека (8 мкм) депарафинировали с помощью нескольких замен ксилола, а затем тщательно промывали в 100% промышленном денатурированном спирте (IMS). Срезы помещали в пероксид водорода (Н₂0₂) и метанол (2 мл пероксида водорода на 100 мл метанола) на 10 минут при комнатной температуре с целью блокирования эндогенной пероксидазы, а затем промывали под проточной водой в течение еще 10 минут. Каждый срез затем обрабатывали 98% муравьиной кислотой в течение 10 минут при комнатной температуре с последующей промывкой под проточной водой в течение еще 10 минут. Затем срезы кипятили в нитратном буфере (рН 6,0) в течение 10 минут под давлением, а затем снова промывали под проточной водой, а потом TBS. После промывки в деионизированной воде каждый микропрепарат осторожно удаляли и высушивали по краю ткани. После высушивания применяли восковой карандаш для обведения вокруг среза перед нанесением раствора протеиназы K на 10 минут при комнатной температуре.

[0280] После приготовления срезов ткани осуществляли окрашивание с использованием антитела 7G6-HCzu25-LCzu18 в разных концентрациях с помощью набора Klear для обнаружения антител человека на основе HRP-полимера и DAB (GBI Labs, Ботелл, Вашингтон; номер по каталогу D103-18) согласно инструкциям производителя. Как показано на фиг. 25, антитело 7G6-HCzu25-LCzu18 выражение и специфически распознает патологический тау в образцах головного мозга, пораженного болезнью Альцгеймера (нейрофибриллярные клубки и нейропильные нити), PSP (клубки, пучковые астроциты и спиральные тельца) и болезнью Пика (тельца Пика), при иммуногистохимическом исследовании. Для антитела также был показан только очень низкий уровень фонового окрашивания во всех протестированных тканях.

Пример 12. Аффинность 7G6-HCzu25-LCzu18 в отношении тау 2N4R дикого типа.

12А. Материалы и способы

12А.С.2. Транзиентная продукция mAb в СНО

[0281] Антитело 7G6-HCzu25-LCzu18 было получено с применением платформы Lonza версии 7 в соответствии с рекомендуемыми производителем процедурами. ДНК-фрагменты, кодирующие 7G6-HCzu25 и 7G6-LCzu18, клонировали в экспрессионную плазмиду, кодирующую глутаминсинтетазу из Lonza. В соответствии с протоколом Lonza для отбора MSX-резистентных клеточных линий, в клетки CHO-K1sv путем электропорации вводили экспрессионную плазмиду 7G6-HCzu25-LCzu18, с последующим высеванием 2500 клеток на лунку в 96-луночные планшеты в среде, не содержащей глутамин, в присутствии 25 или 50 мкм MSX. Лунки, содержащие MSX-резистентную клетку, подвергали нескольким раундам скрининга в отношении экспрессии антитела в различных объемах клеточной культуры. Клеточная линия 96Е7, продуцирующая наиболее высокие титры антитела 7G6-HCzu25-LCzu18, была выбрана для дополнительного изучения и заморожена при -80°С, и ее хранили в парообразной фазе в жидком азоте.

[0282] Флакон с клеточной линией 96Е7 размораживали и культивировали в одноразовых колбах для культивирования при 36,5°С и 5% CO₂ с последующим дополнительным наращиванием каждые 3-4 дня в одноразовых мешках для качающегося биореактора большего размера при 36,5°С и 5% CO₂. Биореактор для выращивания посевного материла из нержавеющей стали на 200 л использовали для конечного наращивания при 36,5°C с контролируемым рН и растворенным кислородом, перед инокуляцией в производственный биореактор периодического культивирования с подпиткой из нержавеющей стали на 1000 л. Спустя 15 дней в режиме периодического культивирования с подпиткой и при 36,5°C с контролируемым рН и растворенным кислородом, посредством глубинной фильтрации собирали супернатант.

12A.d. Очистка MAb

[0283] Очистку осуществляли с применением платформы для очистки AKTAprocess (GE Healthcare). Процесс очистки состоял из следующих стадий: аффинная хроматография с использованием белка А, инактивация вирусов, глубинная фильтрация, анионообменная хроматография, снижающая титр вирусов фильтрация, концентрирование и замена на конечный буфер.

[0284] Первичную стадию с захватом осуществляли с применением содержащей белок А смолы Amsphere A3 (JSR). Колонку на 14,1 л уравновешивали с применением 50 мМ фосфата натрия, 1 М NaCl, рН 7,0, затем загружали белок в количестве до 45 г на литр смолы на цикл. После загрузки колонку промывали буфером для уравновешивания, затем 25 мМ Bis-Tris, рН 7,0, до тех пор, пока УФ-сигнал не возвращался к исходному уровню. Связанный материал элюировали из колонки с применением 100 мМ глицина, рН 3,4. рН элюата доводили до рН 3,6 с применением 2 М уксусной кислоты для инактивации чувствительных к низкому рН вирусов. После минимально 30-минутного статического удержания элюат нейтрализовали до рН 6,8 с применением 2 М трис-основания. Сразу после этого осуществляли глубинную фильтрацию с применением кассетных фильтров Millistak + DOHC и ХОНС (Millipore). Фильтрат дополнительно обрабатывали с применением анионообменной колонки на 6,7 л Capto Q (GE Healthcare), уравновешенной в 25 мМ Bis-Tris, рН 7,0. В колонку загружали до 150 г белка на литр смолы в несвязывающем режиме. Элюированный продукт фильтровали с применением фильтра для снижающей титр вирусов фильтрации Viresolve Pro, затем концентрировали до 25 г/л. Материал подвергали обмену буфера на буфер. Процедуру очистки осуществляли для двух циклов получения разных моноклональных антител, и они были обозначены как серии 17-0190 и 18-0146. Несколько пробирок из серии 17-0190 были обозначены как 17-0190ARS для применения в качестве эталонного образца.

12A.f. Анализы связывания на основе явления поверхностного плазменного резонанса (SPR)

12A.f.2. Анализ связывания мономерного тау с применением захваченных антител к IgG человека

12A.f.2.i. Получение чипа

[0285] Приготовление реагентов. EDC [1-этил-3(3-диметиламинопропил)карбодиимид] и NHS (N-гидроксисукцинимид) растворяли путем добавления в каждый флакон 10,0 мл воды Milli-Q. Флаконы плотно закрывали крышкой и перемешивали на вортексе до полного растворения твердых веществ. Отдельные аликвоты растворов EDC, NHS и этаноламина объемом 0,5 мл вносили в 7 мм пластмассовые флаконы, закрывали крышкой и хранили в замороженном виде при -20°С. Антитело к IgG (Fc) человека из набора центрифугировали на микроцентрифуге в течение непродолжительного времени для сбора антитела на дне пробирки. Антитело к IgG (Fc) человека в объеме 15 мкл переносили в новую микроцентрифужную пробирку на 1,5 мл и разводили до объема 300 мкл с использованием 285 мкл буфера для иммобилизации. Образец перемешивали на вортексе в течение непродолжительного времени с целью перемешивания, затем 70 мкл разделяли на аликвоты в 4 отдельные 7 мм пробирки, и закрывали крышкой. 4 аликвоты каждого из EDC, NHS и этаноламина размораживали, перемешивали на вортексе в течение непродолжительного времени с целью перемешивания и вытеснения любых захваченных на стенках пробирки пузырьков воздуха, и помещали в штатив для реагентов 2.

[0286] В бутылке Pyrex на 1 л путем разведения 50 мл 10× HBS-P + до объема 0,5 л с использованием 450 мл воды Milli-Q® готовили 0,5 л 1× HBS-P + (подвижный буфер для анализа).

[0287] Подготовка прибора для анализа. Бутылку на 1 л с подвижным буфером для анализа присоединяли к линии подачи буфера А на BIAcore® Т-100, пустую бутылку Pyrex на 2 л присоединяли к спускной линии BIAcore® Т-100 и бутылку Pyrex на 1 л, заполненную 1 л свежей воды Milli-Q®, присоединяли к линии подачи воды. Новый чип СМ5 закрепляли на приборе.

[0288] Иммобилизация захватывающего антитела. В программе системы управления BIAcore® Т-100 открывали новый мастер-шаблон (Wizard Template) и выбирали команду «иммобилизация» («Immobilization»). Тип чипа устанавливали как «СМ5». Способ устанавливали как «аминный». Пустые ячейки для лигандов были заполнены как «антитело человека». Время контакта было установлено на 360 сек для каждой проточной ячейки, а скорость потока на 5 мкл/мин. После завершения этих стадий был запущен анализ.

12A.f.2.ii. Анализ связывания

[0289] Эксперименты по связыванию осуществляли с применением прибора BIOcore™ Т-100 или прибора Т-200. Применяемый для анализа связывания подвижный буфер представлял собой HBS-P+/0,2% BSA. Образцы 7G6-HCzu25LCzu18 разводили до 100 мкг/мл, конечный объем 100 мкл в подвижном буфере для анализа, затем центрифугировали при 18000 × g в течение 10 мин в микроцентрифуге при температуре окружающей среды. Разведение до 1 мкг/мл выполняли путем отбора 40 мкл супернатанта и разведения до 4,0 мл подвижным буфером для анализа в подписанных пробирках на 5 мл. Растворы 1 мкг/мл антитела переносили в подписанные пластмассовые флаконы на 1,5 мл без крышек и закрывали крышками 3 типа. Содержимое флаконов перемешивали на вортексе в течение непродолжительного времени с целью удаления любых налипших на стенках пробирки пузырьков воздуха, и помещали в штатив для образцов и реагентов 1. 200 мкл 1 мкг/мл раствора разведенного антитела в качестве эталонного образца переносили в 7 мм пластмассовый флакон, закрывали крышкой, перемешивали на вортексе в течение непродолжительного времени с целью удаления налипших пузырьков воздуха, и помещали в штатив для образцов и реагентов 1 (для циклов кондиционирования чипа). Рекомбинантный тау-белок 2N4R дикого типа человека разводили до 1 мкМ, конечный объем 0,5 мл в подвижном буфере для анализа (стоковый раствор 1 мг/мл равен 21,7 мкМ). Образец центрифугировали при 18000 × g в течение 10 мин в микроцентрифуге при температуре окружающей среды, и разводили до 100 нМ путем отбора 400 мкл супернатанта и разведения до 4,0 мл подвижным буфером для анализа в подписанной пробирке на 5 мл. Раствор 100 нМ подвергали серийному разведению в 3 раза путем отбора 1333 мкл 100 нМ раствора и разведения в 2667 мкл подвижного буфера для анализа с получением конечного объема 4,0 мл (33,3 мкл). Серийное разведение повторяли 6 раз, с получением в общей сложности 8 разведении (100 нМ, 33,3 нМ, 11,1 нМ, 3,70 нМ, 1,23 нМ, 0,41 нМ, 0,14 нМ и 0,046 нМ тау). Путем добавления 3 мл подвижного буфера для анализа в подписанную пробирку на 5 мл получали 0 нМ раствор тау-белка. Разведения анализируемого вещества переносили в подписанные пластмассовые флаконы на 4 мл и закрывали крышками 5 типа, перемешивали на вортексе в течение непродолжительного времени с целью удаления любых налипших на стенках и дне пробирки пузырьков воздуха, и помещали в штатив для образцов и реагентов 1. В случае анализируемого образца, для которого проводили кондиционирование чипа, 5 мкл 1 мкМ супернатанта с раствором тау-белка отбирали и разводили до 500 мкл в буфере для анализа в 7 мм пластмассовом флаконе, закрывали крышкой, перемешивали на вортексе в течение непродолжительного времени с целью удаления налипших пузырьков воздуха, и помещали в штатив для образцов и реагентов 1. Гуманизированные антитела последовательно захватывали в проточных ячейках 2, 3 и 4 при скорости потока 10 мкл/мин в течение времени контакта 36 сек. Разведения тау-белка вводили во все 4 проточные ячейки при скорости потока 30 мкл/мин в течение времени контакта 300 сек. Диссоциация продолжалась 1800 сек. После каждого цикла поверхность регенерировали путем введения в течение 30 сек 3 М MgCl₂ при 30 мкл/мин во все четыре проточные ячейки. После прогона аппроксимацию данных по кинетике осуществляли с применением ленгмюровской модели связывания 1:1

12 В). Результаты

[0290] Аффинность рекомбинантного тау-белка 2N4R дикого типа человека в отношении антитела 7G6-HCzu25LCzu18 определяли с применением формата анализа с захватом антитела. После захвата антитела 7G6-HCzu25LCzu18 тау-белок человека путем инъекции наносили на поверхность с лигандом в течение 300 сек, с последующим отслеживанием и измерением диссоциации в течение 1800 сек. После каждого цикла, предусматривающего захват антитела, связывание тау-белка и диссоциацию, поверхность чипа регенерировали до состояния поверхности для захвата антител человека с применением 3 М MgCl₂, как того требует производитель. Тау-белок анализировали в диапазоне концентраций от 100 нМ до 0,046 нМ (разведенный в 3 раза). Анализ осуществляли в многоцикловом режиме, так что диссоциацию осуществляли для каждого введения тау-белка. Каждый лиганд анализировали в трех проточных ячейках (fc2, fc3 и fc4) в трех повторах с целью устранения любых эффектов связывания с проточной ячейкой.

[0291] Определяли уровни захвата каждого лиганда в каждой проточной ячейке (относительно fc1). Эти результаты приведены в таблице 13:

Данные выражены в ОЕ. Значения представляют собой средние уровни захвата лиганда для всех соответствующих циклов, fc - проточная ячейка

[0292] Все средние уровни захваченного лиганда составляли от 158 ОЕ до 196 ОЕ. Лишь незначительные различия наблюдались между проточными клетками в пределах данного лиганда.

[0293] Данные по связыванию упоминались дважды, а именно данные указаны как для fc1 без связанного лиганда, так и для инъекций буфера для анализируемого вещества (0 нМ тау-белок). Данные по связыванию были аппроксимированы к ленгмюровской модели связывания 1:1. Эта модель подходит для формата анализа, так как бивалентность антитела и обусловленные эффекты авидности не являются релевантными в формате с захватом антитела. Данные по аффинности для каждого лиганда в отдельных проточных ячейках усредняли и определяли стандартное отклонение. Эти результаты приведены в таблице 14:

[0294] Значимых различий в отношении скорости прямой реакции, скорости обратной реакции или аффинности между двумя сериями лекарственных субстанций 7G6-HCzu25LCzu18 и эталонным образцом 7G6-HCzu25LCzu18 не наблюдали.

Пример 13. Высокоточное картирование эпитопов 7G6-HCzu8-LCzu6 и 7G6-HCzu25-LCzu18.

[0295] Высокоточное картирование эпитопов осуществляли для антител 7G6-HCzu8-LCzu6 и 7G6-HCzu25-LCzu18, как описано в примере 3.

[0296] На флуоресцентных изображениях чипов и полученных в результате графиках интенсивности показано, что оба антитела 7G6-HCzu8-LCzu6 (фиг. 26А) и 7G6-HCzu25/LCzu18 (фиг. 26В) связываются с двумя основными сайтами на полноразмерном тау-белке, подобно антителу 7G6 мыши (см. фиг. 3). Более высокая интенсивность флуоресценции на чипе наблюдалась в основном для 7G6-HCzu25-LCzu18, что приводило в результате к некоторым признакам насыщения сигнала и, следовательно, к отсутствию действительного количественного определения для некоторых, но не для всех пептидов. В этом эксперименте с помощью программного обеспечения для анализа данных (PepSlide™ Analyser) минимальная последовательность связывания для 7G6-HCzu8-LCzu6 была идентифицирована как KHVPGGG (SEQ ID NO: 1135) для сайта в пределах второго повтора (положения 298-304) и HVPGG (SEQ ID NO: 79) для сайта в пределах четвертого повтора (положения 362-366) белка 2N4R. В случае 7G6-HCzu25-LCzu18 с помощью программного обеспечения минимальная требуемая последовательность была идентифицирована как HVPG (SEQ ID NO: 1133) для обоих сайтов связывания.

[0297] Подобно случаю с 7G6 мыши, незначительное связывание наблюдали в двух дополнительных сайтах: HQPGG (SEQ ID NO: 183) в положениях аминокислот 268-272 и HKPGG (SEQ ID NO: 182) в положениях 330-334 для обоих антител 7G6-HCzu8-LCzu6 и 7G6-HCzu25-LCzu18. Из расчета средних показателей интенсивности сигнала для пептидов, содержащих последовательность HXPGG (SEQ ID NO: 1136), видно, что в случае антитела 7G6-HCzu8-LCzu6 человека наблюдалось 108-кратное или 104-кратное предпочтение в отношении связывания с сайтом HVPGG (SEQ ID NO: 79), обычно содержащимся в пределах второй повторяющейся области полноразмерного тау 2N4R, в сравнении с последовательностями HQPGG (SEQ ID NO: 183) (повторяющаяся область 1) или HKPGG (SEQ ID NO: 182) (повторяющаяся область 3) соответственно. Подобным образом, наблюдали 99-кратное или 95-кратное предпочтение в отношении связывания 7G6-HCzu8-LCzu6 с сайтом HVPGG (SEQ ID NO: 79), обычно содержащимся в пределах четвертой повторяющейся области полноразмерного тау 2N4R, в сравнении с последовательностями HQPGG (SEQ ID NO: 183) (повторяющаяся область 1) или HKPGG (SEQ ID NO: 182) (повторяющаяся область 3) соответственно. В идентичном анализе данных для 7G6-HCzu25-LCzu18 было продемонстрировано 65-кратное или 100-кратное предпочтение в отношении связывания с сайтом HVPGG (SEQ ID NO: 79), обычно содержащимся в пределах второй повторяющейся области полноразмерного тау 4R, в сравнении с последовательностями HQPGG (SEQ ID NO: 183) (повторяющаяся область 1) или HKPGG (SEQ ID NO: 182) (повторяющаяся область 3) соответственно. Аналогичным образом, наблюдали 77-кратное или 119-кратное предпочтение в отношении связывания 7G6-HCzu25-LCzu18 с сайтом HVPGG (SEQ ID NO: 79), обычно содержащимся в пределах четвертой повторяющейся области полноразмерного тау 4R, в сравнении с последовательностями HQPGG (SEQ ID NO: 183) (повторяющаяся область 1) или HKPGG (SEQ ID NO: 182) (повторяющаяся область 3) соответственно.

Пример 14. Сканирование замен в эпитопе для 7G6-HCzu8-LCzu6 и 7G6-HCzu25-LCzu18.

[0298] Сканирование замен в эпитопе осуществляли для антител 7G6-HCzu8-LCzu6 и 7G6-HCzu25-LCzu18, как описано в примере 4.

[0299] С помощью сканирования замен было показано, что в последовательности iRVPGG⁵ (SEQ ID NO: 79), в случае обоих антител 7G6-HCzu8-LCzu6 и 7G6-HCzu25-LCzu18, для связывания пептида необходимы остатки ¹H, ³P и ⁴G, с допустимостью в некоторой степени замены по ²V. Эти результаты были подобны таковым, наблюдаемым для антитела 7G6 мыши (см. пример 4). В этом случае некоторую допустимость в отношении замены также наблюдали для второго глицинового остатка (⁵G) последовательности ¹HVPGG⁵ (SEQ ID NO: 79). Однако этот остаток все еще мог оказывать значительное влияние на связывание антител 7G6-HCzu25-LCzu18 и 7G6-HCzu8-LCzu6 с более длинной пептидной последовательностью дикого типа. В совокупности с примером 13, эти результаты указывают на то, что последовательность HVPGG (SEQ ID NO: 79) способствует эффективному связыванию антител 7G6, 7G6-HCzu25-LCzu18 и 7G6-HCzu8-LCzu6 с тау 2N4R в положениях 299-303 и 362-366 в пределах второго и четвертого повтора соответственно.

Пример 15. Агрегация тау с 7G6-HCzu25-LCzu18 in vitro.

Эксперимент 1

[0300] Для определения того, способно ли антитело 7G6-HCzu25-LCzu18 ингибировать агрегацию тау in vitro, антитело тестировали в описанном в примере 5 анализе с применением тау-белка дикого типа с незначительными модификациями. Единственное отличие состояло в том, что применяемое в этом случае контрольное IgG представляло собой IgG1-антитело человека (BioXCell, номер по каталогу ВЕ0297).

[0301] В этом анализе антитело 7G6-HCzu25-LCzu18 тестировали в течение нескольких дней. На фиг. 27 показано, что 7G6-HCzu25-LCzu18 могло эффективно ингибировать агрегацию тау in vitro. Эффект был статистически значимым (t-критерий) при сравнении IgG-контроля и 7G6-HCzu25-LCzu18 для дней 1, 2, 5 и 6 после инкубации при 37°С. Никакой значимой разницы не наблюдалось в день 0 сразу после начала реакций после добавления гепарина.

Эксперимент 2.

[0302] Для подтверждения того, что гуманизированное антитело 7G6-HCzu25-LCzu18 было сопоставимым с антителом 7G6 мыши в отношении ингибирования агрегации тау in vitro, оба антитела сравнивали в одинаковом анализе агрегации тау in vitro. Применяемые условия были идентичны таковым в эксперименте 1 этого примера, за исключением того, что применяли то же самое контрольное IgG2b-антитело мыши, которое было описано в примере 5.

[0303] В случае, когда как антитело мыши 7G6, так и гуманизированное антитело 7G6-HCzu25-LCzu18 тестировали в соответствии с приведенными в примере 5 условиями анализа, оба антитела эффективно ингибировали агрегацию тау in vitro. Как показано на фиг. 28, при сравнении между антителами 7G6 мыши и 7G6-HCzu25-LCzu18 наблюдалась аналогичная величина эффекта.

Пример 16. Клеточный анализ диссеминации с применением фибрилл тау K18 после иммуноистощения 7G6-HCzu25-LCzu18.

[0304] Для определения того, может ли иммуноистощение «затравок» тау из среды для культивирования клеток предотвращать дальнейшую агрегацию тау в клетках, применяли такую же систему анализа с использованием HEK293, как описано в примере 6. Однако в этом случае в качестве «затравки» применяли активную усеченную форму фибрилл тау (K18), а не полноразмерный белок, как было описано ранее. K18-фрагмент был тщательно изучен, и, как правило, он экспрессируется рекомбинантно в виде остатков 244-372 полноразмерного тау-белка 2N4R. Этот фрагмент соответствует связывающей микротрубочки области тау, и сообщалось, что он в большей степени склонен к агрегации, чем полноразмерный белок (Shammas et al., Nature Comms., 6, Article number: 7025 (2015)), а также обладает способностью к образованию активных «затравок» в клеточных анализах (Kfoury et al., 2012, J. Biol. Chem., 287: 19440-19451).

Материалы и способы:

[0305] Получение фибрилл K18. Рекомбинантный тау-441 человека (244-372; «K18») (SignalChem) растворяли в воде сверхвысокой чистоты. Фибриллы получали путем смешивания конечных концентраций 40 мкмоль/л белка K18, 100 ммоль/л ацетата натрия (рН 7), 2 ммоль/л DTT и 240 мкг/мл гепарина. Реакционные смеси перемешивали в течение трех дней при 37°С. После инкубации раствор центрифугировали при 135000 g в течение 20 минут при комнатной температуре. Супернатант выбрасывали, а осадок ресуспендировали в 100 ммоль/л ацетате натрия (рН 7). Агрегированный белок в течение непродолжительного времени подвергали обработке ультразвуком, а затем разводили D-PBS (-) до концентрации 50 мкг/мл и хранили при -80°С.

[0306] Получение иммуноистощенных и иммунопреципитированных образцов. Иммунопреципитацию полученных фибрилл К 18 осуществляли с применением набора для иммунопреципитации на основе белка G Dynabeads® (Thermofisher Scientific, номер по каталогу 10007D) согласно инструкциям производителя. Вкратце, для каждой иммунопреципитации применяли 1,5 мг Dynabeads, связанных либо с 3, либо с 0,3 мкг антитела 7G6-HCzu25-LCzu18. Среда-носитель (без антитела) или 3 мкг коммерчески доступных IgG1-антител человека (Bio-Rad Laboratories, Inc.; номер по каталогу НСА192) были включены в качестве контролей. Связанные с антителом (или обработанные средой-носителем) гранулы ресуспендировали в 170 мкл буфера, содержащего 0,2% BSA. Раствор фибрилл K18 затем размораживали, разводили до 10 мкг/мл в PBS и добавляли к связанным с антителом гранулам с получением конечного объема 200 мкл (содержащего в общей сложности 300 нг K18). В результате этого получали конечные концентрации либо 15, либо 1,5 мкг/мл антитела для каждой реакции иммунопреципитации. Гранулы инкубировали с фибриллами K18 в течение 20 минут при комнатной температуре с вращением, и несвязавшийся материал оставляли в качестве иммуноистощенного (ID) образца. Связанный с антителом материал элюировали в 20 мкл буфера, предоставленного в наборе, и также оставляли для обеспечения иммунопреципитированных (IP) образцов.

[0307] Клеточный анализ. Раствор полиэтиленимина (PEI) разводили в очищенной воде до конечной концентрации 0,1%, а затем применяли для покрытия 96-луночного планшета для тканевых культур при 37°С в течение по меньшей мере одной ночи. Затем планшеты дважды промывали водой перед добавлением в каждую лунку 150 мкл среды Игла в модификации Дульбекко (D-MEM), содержащей 10% фетальную телячью сыворотку и 1% пенициллин/стрептомицин («DMEM (+FBS, P/S)»), перед проведением анализа.

[0308] Клетки Lenti-X 293T (Takar Bio Inc.), обычно поддерживаемые в D-MEM (+FBS, P/S) при 37°C с 5% CO₂, перед добавлением «затравки» тау трансфицировали в суспензии в той же среде без антибиотиков. Для трансфекции, 7 мкг вектора для экспрессии в клетках млекопитающих pcDNA3.1(+) (Invitrogen), содержащего кДНК, кодирующую мутантную изоформу тау P301S ON4R, смешивали с реагентом LTX и Plus™ (Life Technologies, номер по каталогу 15228-100) в соответствии с рекомендациями производителя. Полученную в результате смесь инкубировали в течение по меньшей мере 25 минут при комнатной температуре перед добавлением непосредственно в суспензию 6,0×10⁶ клеток Lenti-X 293T при плотности 1,0×10⁵ клеток/мл. Из предварительно покрытого планшета удаляли среду, и обработанную суспензию клеток распределяли в объеме 150 мкл на лунку (1,5×10⁴ клеток/лунка) и инкубировали в течение 19 часов при 37°С в атмосфере 5% CO₂.

[0309] После размораживания на льду 30 мкл каждого ID-образца разводили в 420 мкл среды Opti-MEM® I с пониженным содержанием сыворотки (ThermoFisher Scientific, номер по каталогу 31985-062). В случае IP-образцов, растворы также размораживали на льду, и 2 мкл каждого разводили в 50 мкл среды Opti-MEM® I с пониженным содержанием сыворотки. Затем добавляли 2,5 мкл Р3000 (Thermofisher Scientific, номер по каталогу L3000-008). В отдельной пробирке, 22 мкл Lipofectamine® 3000 (Thermofisher Scientific, номер по каталогу L3000-008) разводили в 550 мкл среды Opti-MEM® I с пониженным содержанием сыворотки. Затем к каждому IP-образцу, содержащему реагент Р3000, добавляли 52 мкл разведенного раствора Lipofectamine 3000.

[0310] Высеянные клетки дважды промывали, и оставляли в 75 мкл среды Opti-MEM® I с пониженным содержанием сыворотки (ThermoFisher Scientific). В каждую лунку добавляли равный объем разведенного описанного выше ID- или IP-образца и инкубировали в течение 44 часов при 37°С в атмосфере 5% СО₂. Эксперимент осуществляли четырех повторах.

[0311] Иммуноцитохимия. Спустя два дня инкубации клетки фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 30 минут при комнатной температуре. Каждую лунку промывали 3 раза 100 мкл очищенной воды, а затем оставляли в 70 мкл буфера для пермеабилизации/блокирования/окрашивания DAPI (раствор Triton Х-100 (конечная концентрация: 0,2%) и в каждую лунку добавляли раствор Cellstain® DAPI (конечная концентрация: 0,1%; Dojindo), разведенный в 5% BSA в TBS). Планшет накрывали и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре с защитой от света. После инкубации буфер для пермеабилизации/блокирования/окрашивания DAPI удаляли, и в каждую лунку добавляли 80 мкл буфера для окрашивания тиофлавином S (ThS) (тиофлавин S растворяли в 50% этаноле до конечной концентрации 0,0003%), и инкубировали в течение 40 минут при комнатной температуре. Затем каждую лунку дважды промывали 50% этанолом, и заменяли на 250 мкл очищенной воды.

[0312] Анализ с визуализацией. Флуоресцентные изображения для каждой лунки получали с помощью InCell® Analyzer 2200 (GE Healthcare) (ThS: возбуждение [Ex]/испускание [Em] = 475/511 нм, DAPI: Ex/Em = 390/435 нм). Затем с применением программного обеспечения InCell Developer (GE Healthcare) анализировали количество ThS- и DAPI-положительных сигналов в каждой лунке.

[0313] Анализ данных. Коэффициент позитивности ThS рассчитывали с применением следующей формулы:

Затем рассчитывали эффект диссеминации для ID- или IP-образцов с применением следующих формул (программное обеспечение: TIBCO Spotfire):

Эффект диссеминации для ID-образца (% от контроля) = T₁/C₁ × 100, где

T₁: Среднее коэффициента позитивности ThS в обработанном антителом ID-образце, и

C₁: Среднее значение коэффициента позитивности ThS в обработанном буфером ID-образце.

Эффект диссеминации для IP-образца (% от контроля) = Т₂/С₂ × 100, где

Т₂: Среднее значение коэффициента позитивности ThS в обработанном антителом IP-образце, и

С₂: Среднее значение коэффициента позитивности ThS в обработанном антителом 7G6-HCzu25-LCzu18 (15 мкг/мл) IP-образце.

[0314] На фиг. 29 показан нормализованный коэффициент позитивности ThS в клеточном анализе диссеминации после обработки ID-образцов. Антитело 7G6-HCzu25-LCzu18 в концентрации 1,5 и 15 мкг/мл обеспечивало устранение эффектов диссеминации фибрилл K18 (>70% снижение в сравнении с контрольным IgG1 человека, каппа). В случае IP-образцов антитело 7G6-HCzu25-LCzu18 эффективно индуцировало эффекты диссеминации в зависимости от концентрации (данные не показаны).

Пример 17. Модель с инъекцией внутрь гиппокампа «затравок» тау P301S с использованием 7G6.

Материалы и способы:

[0315] «Затравку» тау получали путем смешивания рекомбинантного тау 2N4R P301S человека (40 мкмоль/л) и гепарина (240 мкг/мл), с последующей стадией инкубации при 37°С в течение 48-96 часов в ацетате натрия в концентрации 100 ммоль/л, рН 7,0, содержащем дитиотреитол (DTT) в концентрации 2 ммоль/л. Агрегированный тау собирали путем ультрацентрифугирования и ресуспендировали в ацетате натрия в концентрации 100 ммоль/л, рН 7,0. Полученные в результате фибриллы подвергали обработке ультразвуком и применяли в качестве «затравок» для инъекции.

[0316] «Затравку» тау в объеме 3 мкл (1,5 мг/мл) или раствор без «затравки» (ацетат натрия в концентрации 100 ммоль/л, рН 7,0) стереотаксическим методом путем инъекции вводили в левый гиппокамп (А: +2,5, L: 2,0, V: 1,5) (Franklin and Paxinos, The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates Third Edition 2007, Elsevier USA) 3-4-месячных мышей штамма Thy-1hTau.P301S (CBA.C57BL/6) [гомозиготная по мутации P301S тау человека трансгенная мышь (C57BL/6), полученная ранее (Allen et al., J Neurosci. 2002;22:9340-51)] с применением UltraMicroPump III и контроллера Micro4 (World Precision Instruments) при 0,5 мкл/мин в течение 6 минут. Мышей случайным образом разделяли на группы, как показано в таблице 15. Моноклональное IgG2b-антитело мыши к тау человека, клон 7G6, или IgG2b-антитело мыши в качестве изотипического контроля (клон МРС11, BioXCell) в буфере для состава (25 ммоль/л фосфат натрия, 0,15 моль/л NaCl, рН 6,5)) вводили внутрибрюшинно для достижения дозы 40 мг/кг в группах, которые получали «затравку». Тот же буфер для состава вводили группе, не получающей «затравку». Введение дозы осуществляли за 6-16 до и спустя 1 и 2 недели после инъекции «затравок» тау (всего 3 раза). Перед введением исходя из веса тела рассчитывали вводимый объем (10 мл/кг).

[0317] Всех мышей подвергали глубокому наркозу с использованием комбинированного средства для наркоза (М/М/В: 0,3/4/5; полученного с использованием 0,9 мг/кг медетомидина, 12,0 мг/кг мидазолама и 15 мг/кг буторфанола), и собирали плазму крови и цереброспинальную жидкость (CSF). Затем отдельно вырезали кору и гиппокамп с обеих сторон (ипсилатерально и контралатерально), после интракардиальной перфузии солевым раствором. Ткани головного мозга сразу же замораживали в жидком азоте и хранили при -80°С.

[0318] Вырезанные ткани головного мозга гомогенизировали в 19 объемах (вес ткани/объем) буфера для экстракции («буфер RIPA»), содержащий 50 ммоль/л Tris-HCl (рН 7,5) (In vitro gen), 5 ммоль/л EDTA (Nippon Gene), 1 ммоль/л EGTA (Nacalai Tesque), 1% NP-40 Alternative (EMD Millipore), 0,25% дезоксихолат натрия (Bio world), 0,1 моль/л NaCl, 0,5 ммоль/л PMSF (Sigma Aldrich), 1 x PhosSTOP™ (Roche) и 1х Complete™ EDTA(-) (Roche). Перед обработкой ультразвуком гомогенаты центрифугировали на 163000 g при 4°С в течение 20 минут и осадок ресуспендировали в 10 объемах (вес ткани/объем) буфера, содержащего 10 ммоль/л Tris-HCl (рН 7,5), 0,5 моль/л NaCl, 1 ммоль/л EGTA, 10% сахарозу (Wako Pure Chemical) и 1% саркозил. Обработанные саркозилом образцы инкубировали при 37°С в течение 60 минут, а затем центрифугировали на 163000 g при 4°С в течение еще 20 минут. Наконец, к осадку, который затем подвергали обработке ультразвуком, добавляли 10 объемов PBS (Gibco). Эта смесь образовывала саркозил-нерастворимую фракцию.

[0319] Количество тау-белка в саркозил-нерастворимой фракции количественно определяли с помощью вестерн-блот-анализа. Саркозил-нерастворимые фракции солюбилизировали в буфере для образцов NuPAGE™ LDS (Novex) и средстве для восстановления образцов NuPAGE™ (Invitrogen), нагревали при 80°С в течение 10 минут и разделяли с применением 12,5% полиакриламидных гелей (DRC). Белки переносили на PVDF-мембраны толщиной 0,2 мкм (Bio-Rad) и мембраны для блоттинга блокировали в 2,5% обезжиренном молоке (Yukijirushi) в TBS (Takara), содержащем 0,05% Tween (Nacalai tesque), в течение 1 часа при комнатной температуре. После блокирования мембраны для блоттинга инкубировали с моноклональным антителом к тау человека НТ7 (1:1000, Thermo Fisher Scientific) в блокирующем буфере в течение 1 часа при комнатной температуре. Мембраны для блоттинга промывали в TBS-T в течение 30 минут, а затем инкубировали с HRP-конъюгированным антителом к IgG мыши (1:2000, GE healthcare) в течение еще 1 часа при комнатной температуре. Вторичное антитело удаляли, и мембраны для блоттинга промывали, как описано выше. Тау-белки детектировали с помощью хемилюминесцентного субстрата пероксидазы хрена (HRP) (Merck Millipore) и подвергали их количественному определению с применением Fusion FX и FusionCapt версии 16.15 (Vilber-Lourmat, Франция). Для определения количества тау в каждый гель загружали серийные разведения стандартов тау, полученных из исходной саркозил-нерастворимой фракции тау с P301S из спинного мозга (1, 2, 5, 10, 20 относительных единиц [ОЕ], 1 ОЕ эквивалентна интенсивности полоски тау-белка человека, обнаруженного антителом НТ7 в саркозил-нерастворимой фракции из 7 мкг спинного мозга). Данные, подсчитанные как менее 1 ОЕ (предел обнаружения), были выражены как 0,5 ОЕ.

[0320] Данные выражены в виде среднего ± SEM. Различия в количестве саркозил-нерастворимого тау между не получающими «затравку», обработанными контрольным IgG и обработанными 7G6 группами анализировали с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с критерием Фишера. Значение Р<0,05 (двустороннее) считалось статистически значимым. Статистические анализы осуществляли с применением GraphPad Prism версии 7.02 (программное обеспечение GraphPad).

Результаты

[0321] Эффект 7G6 в отношении саркозил-нерастворимого тау, индуцированного инъекцией «затравок» тау внутрь гиппокампа, отдельно изучали как в ипсилатеральных (сторона инъекции), так и контралатеральных коре и гиппокампе. Как показано на фигурах 30A-30D, 7G6 обеспечивало значимое подавление повышения количества саркозил-нерастворимого тау в контралатеральном гиппокампе, в сравнении с контрольным IgG (фиг. 30А), но при этом для него не наблюдались значимые эффекты в других областях (фигуры 30В, 30С и 30D). Это говорит о том, что 7G6 было способно предотвратить распространение тау в этой модели in vivo.

Пример 18. Данные по трансляционным биомаркерам для 7G6-HCzu25-LCzu18.

[0322] Самцов яванских макаков обрабатывали средой-носителем или антителом 7G6-HCzu25-LCzu18 (10, 30 и 100 мг/кг: 3 животных/доза) путем прерывистого внутривенного введения один раз в неделю в течение 4 недель. MTBR-тау (любая изоформа полноразмерного или усеченного тау, содержащая MTBR), связанный с антителом 7G6-HCzu25-LCzu18 («связанный MTBR-тау») и несвязанную форму («свободный MTBR-тау») в цереброспинальной жидкости («CSF»), собранной у каждой обезьяны, разделяли с использованием колонки с белком А, и анализировали с помощью жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (LC/MS). LC/MS-анализ осуществляли с применением LC-системы UltiMate™ 3000 Nano в сочетании с масс-спектрометром Orbitrap Fusion™ Lumos™ Tribrid™ (Thermo Fisher Scientific, Сан-Хосе, Калифорния) с аналитической колонкой (размер частиц 3 мкм С 18, длина 150 мм, внутренний диаметр 100 мкм). Напряжение на распылителе 2000 В подавалось через металлический тройниковый соединитель. Скорость потока составляла 500 нл/мин. Подвижные фазы состояли из (А) 0,5% уксусной кислоты в 4% ацетонитриле и (В) 0,5% уксусной кислоты в 80% ацетонитриле, и для элюирования анализируемого вещества использовали многоступенчатый линейный градиент от 1% до 1% В за 5 мин, от 1% до 37% В за 15 мин, от 37% до 68% В за 5 мин, от 68% до 99% В за 1 мин и от 99% до 99% В за 4 мин, а затем уравновешивали до исходного состояния, 1% В. Специфический пептид, содержащий эпитоп антитела 7G6-HCzu25-LCzu18, был измерен с помощью LC/MS как приблизительный расчет MTBR-тау. Количество MTBR-тау выражали в виде соотношения площади хроматографического пика указанного пептида (легкий) и его внутреннего стандарта (тяжелый), меченного изотопом пептида.

[0323] Как показано на фиг. 31А, количество связанного MTBR-тау в CSF повышалось при обработке антителом 7G6-HCzu25-LCzu18 дозозависимым образом, тогда как количество свободного MTBR-тау в CSF обезьяны снижалось, также в зависимости от дозы (фиг. 31В). Это говорит о наличии захвата мишени антитела 7G6-HCzu25-LCzu18 в CSF обезьяны in vivo.

[0324] Антитело 7G6-HCzu25-LCzu18 также добавляли в CSF человека при 10, 100, 500, 1000 или 2000 нг/мл. Затем MTBR-тау, связанный 7G6-HCzu25-LCzu18, анализировали с помощью жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (LC/MS) так же, как описано выше. Как показано на фиг. 32, количество связанного MTBR-тау в CSF человека повышалось при обработке антителом 7G6-HCzu25-LCzu18 в зависимости от дозы. Эти данные также указывают на наличие захвата мишени антитела 7G6-HCzu25-LCzu18 в случае MTBR-тау в CSF человека.

Пример 19. Измерение поглощения тау в сверхэкспрессирующих CD32A клетках СНО.

[0325] Получение меченых мономеров и фибрилл may. Агрегаты полноразмерного рекомбинантного тау 2N4R дикого типа человека получали на основе мономеров, как описано для P301S-белка в примере 17. Перед мечением агрегаты подвергали обработке ультразвуком для получения фибрилл, применяемых в анализе. Как фибриллы, так и мономеры метили флуоресцентными метками с применением набора, содержащего активированную сложным NHS-эфиром DyLight™ 488 (ThermoFisherScientific, номер по каталогу 46403), в соответствии с инструкциями производителя, с незначительными различиями между двумя формами белка: 150 мкл мономера тау (100 мкМ) смешивали с 100 мкл раствора DyLight-сложный NHS-эфир, при этом 300 мкл фибрилл тау-441 (587 мкг/мл) смешивали с 66 мкл раствора DyLight-сложный NHS-эфир. Мечение осуществляли при комнатной температуре в течение одного часа. Избыток неконъюгированного красителя удаляли с помощью колонок для удаления красителя Pierce™ (ThermoFisherScientific, номер по каталогу 22858, серия SL260099) в соответствии с протоколом от производителя с применением 125 мкл меченого мономера тау или 122 мкл меченых фибрилл. Конечные концентрации меченых мономеров и фибрилл тау измеряли с помощью метода с бицинхониновой кислотой (ВСА), и хранили при -80°С.

[0326] Клеточный анализ. Замороженные клетки СНО, стабильно экспрессирующие CD32a (Fc-гамма RIIA), быстро размораживали на водяной бане при 37°С и помещали в среду для СНО (среда RPMI 1640 с 10% фетальной телячьей сывороткой, L-глутамином, заменимыми аминокислотами, пируватом натрия и пенициллином/стрептомицином). Клетки высевали в 96-луночный планшет для анализа (Costar, номер по каталогу 3603) при плотности 1×10⁴ клеток/лунка (100 мкл/лунка) и инкубировали в течение 24 часов при 37°С в атмосфере 5% CO₂. Меченые мономеры и фибриллы тау размораживали на льду и разводили до концентраций 1,5 мкг/мл или 0,5 мкг/мл соответственно в буфере для анализа (среда RPMI 1640) (GIBCO, номер по каталогу 21875-034). Затем к каждой из форм белка в общем объеме 60 мкл добавляли антитело 7G6-HCzu25-LCzu18 (конечные концентрации: 0,3 или 3 мкг/мл), изотипический контроль в виде IgG1 человека (BioXcell, номер по каталогу ВЕ0297) (конечная концентрация: 3 мкг/мл) или среду-носитель (25 мМ натрий-фосфатный буфер, рН 6,5, содержащий 150 мМ NaCl), и инкубировали при комнатной температуре в течение одного часа с защитой от света. Среду для СНО удаляли из планшетов, и клетки предварительно обрабатывали 90 мкл буфера для анализа или поликлональным антителом к Fc-рецептору в качестве ингибитора связывания (ThermoFisher Scientific, номер по каталогу 16-9161-71), разведенным до 100 мкг/мл, также в буфере для анализа. Затем клетки инкубировали в течение 30 мин при 37°С в атмосфере 5% CO₂. Далее в соответствующие лунки добавляли 10 мкл смесей меченых мономеров или фибрилл тау с антителом или без него, и планшеты инкубировали в течение еще 60 минут, снова при 37°С в атмосфере 5% CO₂. Каждую обработку осуществляли в лунках в четырех повторах. Шесть независимых экспериментов осуществляли для анализов поглощения мономера тау и пять независимых экспериментов выполняли для измерения поглощения фибрилл тау.

[0327] Фиксация и окрашивание клеток. По истечении конечного периода инкубации клетки фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 30 мин при комнатной температуре. Каждую лунку затем промывали 100 мкл воды и замещали 70 мкл буфером для окрашивания Hoechst (раствор Triton Х-100 (конечная концентрация: 0,2%) и раствором Hoechst (конечная концентрация: 0,02%)). Планшет накрывали и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре с защитой от света. Буфер для окрашивания затем удаляли, и каждую лунку дважды промывали еще 100 мкл воды.

[0328] Визуализация клеток. Флуоресцентные изображения для каждой лунки получали с применением многопараметрической системы визуализации Cellomics (ThermoFisherScientific). Общую интенсивность для меченого тау и число Hoechst-положительных клеток в каждой лунке регистрировали и анализировали с применением программного обеспечения Thermo Scientific HCS Studio (ThermoFisherScientific).

[0329] Анализ данных. Измеряли среднее значение общей интенсивности сигнала тау на клетку и эффект поглощения тау рассчитывали с применением следующих формул в программе пакета программного обеспечения TIBCO spotfire:

Эффект поглощения тау (% от контроля) = T₁/C₁ × 100, где

T₁: Общая интенсивность сигнала конъюгированного с DyLight 488-NHS тау в клетках в обработанном антителом образце и

C₁: Общая интенсивность сигнала конъюгированного с DyLight 488-NHS тау в клетках в обработанном 7G6-HCzu25-LCzu18 (30 мкг/мл) образце.

[0330] Статистический анализ. Данные выражены в виде среднего ± SEM. Статистические анализы осуществляли с применением однофакторного дисперсионного анализа в GraphPad Prism версии 7.02 (программное обеспечение GraphPad), **** р < 0,0001, ** р < 0,01, * р < 0,05.

[0331] На фигурах 33А и 33В показана эффективность поглощения мономера или фибрилл тау соответственно в клетках СНО, сверхэкспрессирующих CD32A. Антитело 7G6-HCzu25-LCzu18 (3 мкг/мл) значимо повышало поглощение мономера тау в сравнении с IgG1-контролем человека (3 мкг/мл) (фиг. 33А). Аналогичным образом, антитело 7G6-HCzu25-LCzu18 (0,3 и 3 мкг/мл) также значимо повышало поглощение фибрилл тау в сравнении с IgG1-контролем человека (3 мкг/мл) (фиг. 33В). В обоих случаях обработка ингибитором FcR обеспечивала значимое блокирование эффекта индуцированного антителом 7G6-HCzu25-LCzu18 поглощения тау в этой клеточной системе анализа.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ЭЙСЭЙ Р ЭНД Д МЕНЕДЖМЕНТ КО., ЛТД.

ЮКЛ БИЗНЕС ПЛК

<120> АНТИТЕЛА К ТАУ И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

<130> 104018.001025

<140>

<141>

<150> 62/697034

<151> 2018-07-12

<150> 62/577011

<151> 2017-10-25

<150> 62/572910

<151> 2017-10-16

<160> 1207

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 1

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe

1 5 10 15

<210> 2

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 2

Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly Thr Tyr Gly Leu

1 5 10 15

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 3

Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His

1 5 10 15

<210> 4

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 4

Thr Met His Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys

1 5 10 15

<210> 5

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 5

Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser

1 5 10 15

<210> 6

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 6

Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser Asp Ala Lys Ser

1 5 10 15

<210> 7

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 7

Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val

1 5 10 15

<210> 8

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 8

Pro Leu Val Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln

1 5 10 15

<210> 9

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 9

Ala Ala Gln Pro His Thr Glu Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu

1 5 10 15

<210> 10

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 10

Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro Ser Leu Glu Asp

1 5 10 15

<210> 11

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 11

Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val

1 5 10 15

<210> 12

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 12

Arg Met Val Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys

1 5 10 15

<210> 13

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 13

Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala

1 5 10 15

<210> 14

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 14

Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro Gly Gln Lys Gly

1 5 10 15

<210> 15

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 15

Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro

1 5 10 15

<210> 16

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 16

Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro

1 5 10 15

<210> 17

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 17

Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro

1 5 10 15

<210> 18

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 18

Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr

1 5 10 15

<210> 19

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 19

Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys

1 5 10 15

<210> 20

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 20

Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro

1 5 10 15

<210> 21

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 21

Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val

1 5 10 15

<210> 22

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 22

Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile

1 5 10 15

<210> 23

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 23

Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

<210> 24

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 24

Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu

1 5 10 15

<210> 25

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 25

Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn

1 5 10 15

<210> 26

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 26

Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile

1 5 10 15

<210> 27

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 27

Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser

1 5 10 15

<210> 28

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 28

Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro

1 5 10 15

<210> 29

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 29

His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu

1 5 10 15

<210> 30

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 30

Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser

1 5 10 15

<210> 31

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 31

Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn

1 5 10 15

<210> 32

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 32

Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu

1 5 10 15

<210> 33

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 33

Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile

1 5 10 15

<210> 34

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 34

Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser

1 5 10 15

<210> 35

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 35

Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser

1 5 10 15

<210> 36

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 36

Thr Gly Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu

1 5 10 15

<210> 37

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 37

Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly

1 5 10 15

<210> 38

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 38

Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala

1 5 10 15

<210> 39

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 39

Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Lys

1 5 10 15

<210> 40

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 40

Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ser

1 5 10 15

<210> 41

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 41

Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Asp Ile

1 5 10 15

<210> 42

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 42

Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Leu Ile

1 5 10 15

<210> 43

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 43

Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Val Ile

1 5 10 15

<210> 44

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 44

Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser Phe Gln Ile

1 5 10 15

<210> 45

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 45

Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser Asn Gln Ile

1 5 10 15

<210> 46

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 46

Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser Tyr Gln Ile

1 5 10 15

<210> 47

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 47

Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly His Val Gln Ile

1 5 10 15

<210> 48

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 48

Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly Gln Val Gln Ile

1 5 10 15

<210> 49

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 49

Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Cys Ser Val Gln Ile

1 5 10 15

<210> 50

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 50

Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Leu Ser Val Gln Ile

1 5 10 15

<210> 51

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 51

Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Thr Ser Val Gln Ile

1 5 10 15

<210> 52

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 52

Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Glu Gly Ser Val Gln Ile

1 5 10 15

<210> 53

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 53

Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Asn Gly Ser Val Gln Ile

1 5 10 15

<210> 54

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 54

Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Trp Gly Ser Val Gln Ile

1 5 10 15

<210> 55

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 55

Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro His Gly Gly Ser Val Gln Ile

1 5 10 15

<210> 56

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 56

Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gln Gly Gly Ser Val Gln Ile

1 5 10 15

<210> 57

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 57

Lys Asp Asn Ile Lys His Val Ala Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile

1 5 10 15

<210> 58

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 58

Lys Asp Asn Ile Lys His Val Ile Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile

1 5 10 15

<210> 59

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 59

Lys Asp Asn Ile Lys His Val Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile

1 5 10 15

<210> 60

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 60

Lys Asp Asn Ile Lys His Asp Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile

1 5 10 15

<210> 61

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 61

Lys Asp Asn Ile Lys His Leu Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile

1 5 10 15

<210> 62

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 62

Lys Asp Asn Ile Lys His Thr Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile

1 5 10 15

<210> 63

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 63

Lys Asp Asn Ile Lys Phe Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile

1 5 10 15

<210> 64

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 64

Lys Asp Asn Ile Lys Pro Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile

1 5 10 15

<210> 65

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 65

Lys Asp Asn Ile Lys Tyr Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile

1 5 10 15

<210> 66

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический

пептид»

<400> 66

Lys Asp Asn Ile His His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile

1 5 10 15

<210> 67

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 67

Lys Asp Asn Ile Arg His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile

1 5 10 15

<210> 68

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 68

Lys Asp Asn Cys Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile

1 5 10 15

<210> 69

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 69

Lys Asp Asn Leu Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile

1 5 10 15

<210> 70

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 70

Lys Asp Asn Thr Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile

1 5 10 15

<210> 71

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 71

Lys Asp Glu Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile

1 5 10 15

<210> 72

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 72

Lys Asp Met Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile

1 5 10 15

<210> 73

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 73

Lys Asp Trp Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile

1 5 10 15

<210> 74

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 74

Lys Gly Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile

1 5 10 15

<210> 75

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 75

Lys Pro Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile

1 5 10 15

<210> 76

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 76

Lys Tyr Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile

1 5 10 15

<210> 77

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 77

His Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile

1 5 10 15

<210> 78

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 78

Arg Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile

1 5 10 15

<210> 79

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 79

His Val Pro Gly Gly

1 5

<210> 80

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 80

Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu

1 5

<210> 81

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 81

Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys

1 5

<210> 82

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 82

Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly

1 5

<210> 83

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 83

Tyr Trp Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala

1 5

<210> 84

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 84

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly

1 5

<210> 85

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 85

Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu

1 5

<210> 86

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 86

Trp Met Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Ser

1 5

<210> 87

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 87

Ile Ser Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5

<210> 88

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 88

Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg

1 5

<210> 89

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 89

Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr

1 5

<210> 90

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 90

Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg

1 5

<210> 91

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 91

Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser

1 5

<210> 92

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 92

Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr

1 5

<210> 93

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 93

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asp Gly

1 5

<210> 94

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 94

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

1 5

<210> 95

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 95

Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly

1 5

<210> 96

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 96

Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu

1 5

<210> 97

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 97

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

1 5

<210> 98

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 98

Tyr Trp Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala

1 5

<210> 99

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 99

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly

1 5

<210> 100

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 100

Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

1 5

<210> 101

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 101

Trp Val Ser Asp Ile Tyr Pro Gly Ser

1 5

<210> 102

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 102

Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Ser Arg Phe

1 5

<210> 103

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 103

Phe Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Val

1 5

<210> 104

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 104

Phe Thr Ile Ser Val Asp Asn Ser Lys

1 5

<210> 105

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 105

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg

1 5

<210> 106

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 106

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala

1 5

<210> 107

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 107

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu

1 5

<210> 108

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 108

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr

1 5

<210> 109

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 109

Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

1 5

<210> 110

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 110

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asp Gly

1 5

<210> 111

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 111

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

1 5

<210> 112

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 112

Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser

1 5

<210> 113

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 113

Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu

1 5

<210> 114

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 114

Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly Gln

1 5

<210> 115

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 115

Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile

1 5

<210> 116

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 116

Ile Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr

1 5

<210> 117

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 117

Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu

1 5

<210> 118

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 118

Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

1 5

<210> 119

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 119

Leu Leu Ile Ser Lys Val Ser Asn Arg

1 5

<210> 120

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 120

Leu Ile Ser Lys Val Ser Asn Arg Phe

1 5

<210> 121

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 121

Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu

1 5

<210> 122

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 122

Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu

1 5

<210> 123

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 123

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val

1 5

<210> 124

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 124

Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

1 5

<210> 125

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 125

Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His

1 5

<210> 126

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 126

Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val

1 5

<210> 127

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 127

Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro

1 5

<210> 128

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 128

Phe Gln Gly Ser His Val Pro Phe Thr

1 5

<210> 129

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 129

Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu

1 5

<210> 130

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 130

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

1 5

<210> 131

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 131

Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser

1 5

<210> 132

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 132

Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu

1 5

<210> 133

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 133

Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly Gln

1 5

<210> 134

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 134

Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile

1 5

<210> 135

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 135

Ile Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr

1 5

<210> 136

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 136

Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu

1 5

<210> 137

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 137

Leu Glu Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly

1 5

<210> 138

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 138

Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

1 5

<210> 139

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 139

Leu Leu Ile Ser Lys Val Ser Asn Arg

1 5

<210> 140

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 140

Leu Ile Ser Lys Val Ser Asn Arg Phe

1 5

<210> 141

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 141

Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu

1 5

<210> 142

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 142

Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu

1 5

<210> 143

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 143

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val

1 5

<210> 144

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 144

Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

1 5

<210> 145

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 145

Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His

1 5

<210> 146

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 146

Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val

1 5

<210> 147

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 147

Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro

1 5

<210> 148

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 148

Phe Gln Gly Ser His Val Pro Phe Thr

1 5

<210> 149

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 149

Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu

1 5

<210> 150

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 150

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

1 5

<210> 151

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 151

Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser

1 5

<210> 152

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 152

Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

1 5

<210> 153

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 153

Ile Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr

1 5

<210> 154

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 154

Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu

1 5

<210> 155

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 155

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

1 5

<210> 156

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 156

Leu Leu Ile Ser Lys Val Ser Asn Arg

1 5

<210> 157

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 157

Leu Ile Ser Lys Val Ser Asn Arg Phe

1 5

<210> 158

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 158

Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

1 5

<210> 159

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 159

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

1 5

<210> 160

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 160

Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

1 5

<210> 161

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 161

Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val

1 5

<210> 162

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 162

Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro

1 5

<210> 163

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 163

Phe Gln Gly Ser His Val Pro Phe Thr

1 5

<210> 164

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 164

Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu

1 5

<210> 165

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 165

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

1 5

<210> 166

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 166

Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser

1 5

<210> 167

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 167

Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

1 5

<210> 168

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 168

Ile Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr

1 5

<210> 169

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 169

Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu

1 5

<210> 170

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 170

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

1 5

<210> 171

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 171

Leu Leu Ile Ser Lys Val Ser Asn Arg

1 5

<210> 172

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 172

Leu Ile Ser Lys Val Ser Asn Arg Phe

1 5

<210> 173

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 173

Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

1 5

<210> 174

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 174

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

1 5

<210> 175

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 175

Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

1 5

<210> 176

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 176

Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val

1 5

<210> 177

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 177

Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro

1 5

<210> 178

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 178

Phe Gln Gly Ser His Val Pro Phe Thr

1 5

<210> 179

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 179

Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu

1 5

<210> 180

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 180

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

1 5

<210> 181

<211> 441

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 181

Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly

1 5 10 15

Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His

20 25 30

Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu

35 40 45

Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser

50 55 60

Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val

65 70 75 80

Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu

85 90 95

Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro

100 105 110

Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val

115 120 125

Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly

130 135 140

Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro

145 150 155 160

Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro

165 170 175

Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly

180 185 190

Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser

195 200 205

Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys

210 215 220

Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys

225 230 235 240

Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val

245 250 255

Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly

260 265 270

Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln

275 280 285

Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly

290 295 300

Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser

305 310 315 320

Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln

325 330 335

Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser

340 345 350

Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn

355 360 365

Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala

370 375 380

Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser

385 390 395 400

Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser

405 410 415

Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val

420 425 430

Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu

435 440

<210> 182

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 182

His Lys Pro Gly Gly

1 5

<210> 183

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 183

His Gln Pro Gly Gly

1 5

<210> 184

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 184

His Val Ser Gly Gly

1 5

<210> 185

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 185

His Val Leu Gly Gly

1 5

<210> 186

<211> 20

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 186

Cys Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr

1 5 10 15

Lys Pro Val Asp

<210> 187

<211> 6

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 187

Val Gln Ile Val Tyr Lys

1 5

<210> 188

<211> 7

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический пептид»

<400> 188

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5

<210> 189

<211> 10

<212> PRT

<213> Вирус гриппа A

<400> 189

Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly

1 5 10

<210> 190

<211> 509

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид»

<400> 190

atgggatgga gctgtatcat cctcattttg gtagcagcag ctacaggtgt ccactcccag 60

gtccaactgc tgcagcctgg ggctgagctt gtgaagcctg gggcttcagt aataatgtcc 120

tgcaaggctt ctggctacac cttcaccacc tactggataa cctgggtgaa gcagaggcct 180

ggacaaggcc ttgagtggat tggagatatt tatcctggta gtagtatttg taactacaat 240

gagaagttca agagcaaggc cacactgact gtagacacat cctccagcac agcctacatg 300

cagctcaaca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag ggaggatggt 360

tacgacgcct ggtttgctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc cgcagccaaa 420

acaacacccc catcagtcta tccactggcc cctgggtgtg gagatacaac tggttcctct 480

gtgactctgg gatgcctggt caagggcta 509

<210> 191

<211> 452

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид»

<400> 191

caggtccaac tgctgcagcc tggggctgag cttgtgaagc ctggggcttc agtaataatg 60

tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc acctactgga taacctgggt gaagcagagg 120

cctggacaag gccttgagtg gattggagat atttatcctg gtagtagtat ttgtaactac 180

aatgagaagt tcaagagcaa ggccacactg actgtagaca catcctccag cacagcctac 240

atgcagctca acagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagggaggat 300

ggttacgacg cctggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctccgcagcc 360

aaaacaacac ccccatcagt ctatccactg gcccctgggt gtggagatac aactggttcc 420

tctgtgactc tgggatgcct ggtcaagggc ta 452

<210> 192

<211> 169

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид»

<400> 192

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Ile Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Gln Val Gln Leu Leu Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Ile Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Thr Tyr Trp Ile Thr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Ile Cys Asn Tyr Asn

65 70 75 80

Glu Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asp Gly Tyr Asp Ala Trp Phe Ala Tyr Trp

115 120 125

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro

130 135 140

Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser

145 150 155 160

Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly

165

<210> 193

<211> 150

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид»

<400> 193

Gln Val Gln Leu Leu Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Ile Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Ile Thr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Ile Cys Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Asp Gly Tyr Asp Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Gly Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Gly

145 150

<210> 194

<211> 57

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид»

<400> 194

atgggatgga gctgtatcat cctcattttg gtagcagcag ctacaggtgt ccactcc 57

<210> 195

<211> 357

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид»

<400> 195

caggtccaac tgctgcagcc tggggctgag cttgtgaagc ctggggcttc agtaataatg 60

tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc acctactgga taacctgggt gaagcagagg 120

cctggacaag gccttgagtg gattggagat atttatcctg gtagtagtat ttgtaactac 180

aatgagaagt tcaagagcaa ggccacactg actgtagaca catcctccag cacagcctac 240

atgcagctca acagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagggaggat 300

ggttacgacg cctggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctccgca 357

<210> 196

<211> 119

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид»

<400> 196

Gln Val Gln Leu Leu Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Ile Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Ile Thr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Ile Cys Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Asp Gly Tyr Asp Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 197

<211> 95

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид»

<400> 197

gccaaaacaa cacccccatc agtctatcca ctggcccctg ggtgtggaga tacaactggt 60

tcctctgtga ctctgggatg cctggtcaag ggcta 95

<210> 198

<211> 31

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид»

<400> 198

Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Cys Gly

1 5 10 15

Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly

20 25 30

<210> 199

<211> 1407

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид»

<400> 199

atgggctggt cctgcatcat cctgtttctg gtggccaccg ccaccggcgt gcacagccag 60

gtgcagctgg tgcagtctgg cgccgaagtg aagaaacctg gcgcctccgt gaaggtgtcc 120

tgcaaggctt ccggctacac ctttaccacc tactggatca cctgggtgcg acaggctcct 180

ggacagggcc tggaatggat gggcgacatc taccccggct cctccatctg caactacaac 240

gagaagttca agtcccgcgt gaccatgacc cgggacacct ccaccagcac cgtgtacatg 300

gaactgtcct ccctgcggag cgaggacacc gccgtgtact actgcgctag agaggacggc 360

tacgacgctt ggtttgccta ctggggccag ggcaccctcg tgaccgtgtc atctgcatcc 420

accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 480

gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 540

tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 600

tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 660

tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 720

tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 780

gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 840

acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 900

gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 960

taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 1020

aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1080

aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 1140

aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1200

gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1260

tccgacggct ccttcttctt atattcaaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1320

gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1380

agcctctccc tgtctcccgg gaaatga 1407

<210> 200

<211> 1350

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид»

<400> 200

caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcgcctc cgtgaaggtg 60

tcctgcaagg cttccggcta cacctttacc acctactgga tcacctgggt gcgacaggct 120

cctggacagg gcctggaatg gatgggcgac atctaccccg gctcctccat ctgcaactac 180

aacgagaagt tcaagtcccg cgtgaccatg acccgggaca cctccaccag caccgtgtac 240

atggaactgt cctccctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc tagagaggac 300

ggctacgacg cttggtttgc ctactggggc cagggcaccc tcgtgaccgt gtcatctgca 360

tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 420

acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 480

aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 540

ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 600

atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 660

tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 720

tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 780

gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 840

gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 900

acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 960

tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1020

gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg 1080

accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1140

gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1200

gactccgacg gctccttctt cttatattca aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1260

caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1320

aagagcctct ccctgtctcc cgggaaatga 1350

<210> 201

<211> 468

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид»

<400> 201

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Thr Tyr Trp Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Met Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Ile Cys Asn Tyr Asn

65 70 75 80

Glu Lys Phe Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser

85 90 95

Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asp Gly Tyr Asp Ala Trp Phe Ala Tyr Trp

115 120 125

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

130 135 140

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

145 150 155 160

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

165 170 175

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

180 185 190

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

195 200 205

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

210 215 220

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

225 230 235 240

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

245 250 255

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

260 265 270

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

275 280 285

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

290 295 300

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

305 310 315 320

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

325 330 335

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

340 345 350

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

355 360 365

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

370 375 380

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

385 390 395 400

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

405 410 415

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

420 425 430

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

435 440 445

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

450 455 460

Ser Pro Gly Lys

465

<210> 202

<211> 449

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид»

<400> 202

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Ile Cys Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Asp Gly Tyr Asp Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 203

<211> 57

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический олигонуклеотид»

<400> 203

atgggctggt cctgcatcat cctgtttctg gtggccaccg ccaccggcgt gcacagc 57

<210> 204

<211> 414

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид»

<400> 204

atgggctggt cctgcatcat cctgtttctg gtggccaccg ccaccggcgt gcacagccag 60

gtgcagctgg tgcagtctgg cgccgaagtg aagaaacctg gcgcctccgt gaaggtgtcc 120

tgcaaggctt ccggctacac ctttaccacc tactggatca cctgggtgcg acaggctcct 180

ggacagggcc tggaatggat gggcgacatc taccccggct cctccatctg caactacaac 240

gagaagttca agtcccgcgt gaccatgacc cgggacacct ccaccagcac cgtgtacatg 300

gaactgtcct ccctgcggag cgaggacacc gccgtgtact actgcgctag agaggacggc 360

tacgacgctt ggtttgccta ctggggccag ggcaccctcg tgaccgtgtc atct 414

<210> 205

<211> 119

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид»

<400> 205

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Ile Cys Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Asp Gly Tyr Asp Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 206

<211> 987

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид»

<400> 206

gcatccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840

ctggactccg acggctcctt cttcttatat tcaaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960

cagaagagcc tctccctgtc tcccggg 987

<210> 207

<211> 309

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид»

<400> 207

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser

305

<210> 208

<211> 1407

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> source

<223> /примечание = «описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид»

<400> 208

atgggctggt cctgcatcat cctgtttctg gtggccaccg ccaccggcgt gcacagccag 60

gtgcagctgg tgcagtctgg cgccgaagtg aagaaacctg gcgcctccgt gaaggtgtcc 120

tgcaaggctt ccggctacac ctttaccacc tactggatca cctgggtgcg acaggctcct 180

ggacagggcc tggaatggat gggcgacatc taccccggct cctccatctg caactacaac 240

gagaagttca agtcccgcgt gaccatgacc gtggacacct ccaccagcac cgtgtacatg 300