Микрожидкостное устройство для селективного захвата биологических объектов

Изобретение относится к микрожидкостным устройствам. Раскрыто микрожидкостное устройство для селективного захвата целевых биологических объектов, содержащее а) массив симметричных столбиков в форме капли (1), в которых линии хорды (5) симметричных столбиков в форме капли параллельны друг другу и при этом геометрические центры симметричных столбиков в форме капли образуют ромбическую решетку (4), характеризующуюся тем, что длина (d) стороны ромба в решетке образована как Евклидово расстояние между геометрическими центрами двух соседних симметричных столбиков в форме капли, b) извилистый микрожидкостный канал (2) и c) объем захвата (3), при этом извилистый микрожидкостный канал (2) содержит последовательность сегментов эллипса (13), каждый из которых характеризуется хордой, параллельной большой или малой оси эллипса, причем указанная хорда разделена на секцию впуска (17) и секцию выпуска (18), через которые целевой биологический объект входит в сегмент эллипса (13) и выходит из него, причем сегменты эллипса соединены друг с другом, причем следующий сегмент эллипса формируется путем поворота предшествующего сегмента эллипса вокруг его хорды и параллельного переноса на расстояние, равное секции впуска (17), вдоль хорды, причем объем захвата (3) определяется логическим вычитанием массива симметричных столбиков в форме капли из извилистого микрожидкостного канала. Изобретение обеспечивает повышение вероятности взаимодействия объект/поверхность для захвата целевых биологических объектов среди различных других объектов в суспензии, что приводит к повышению эффективности захвата. 5 з.п. ф-лы, 9 ил.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к микрожидкостным устройствам для селективного захвата биологических объектов, взвешенных в среде, и к медицинской диагностике.

Уровень техники

Рак является второй по частоте причиной смерти во всем мире (8,8 миллиона смертей в 2015 году) и ассоциирован с серьезным экономическим бременем (до 4% мирового ВВП).

Первоначальная диагностика рака требует инвазивной биопсии ткани опухоли - дорогостоящего, длительного и болезненного процесса, сопряженного со значительным риском инфицирования. Его самым большим ограничением является то, что взятие образца одной опухоли может не охватить все присутствующие мутации, поскольку рак со временем эволюционирует генетически, что требует постоянного мониторинга для персонализированной терапии. Многообещающим решением является жидкостная биопсия, которая включает забор образцов жидкостей организма, в основном крови, для анализа биомаркеров рака.

Системы обогащения/выделения циркулирующих опухолевых клеток (CTC) являются одними из основных столпов на рынке жидкой биопсии и, как ожидается, достигнут 8,7 млрд долларов в 2020 году при CAGR, составляющем 15% (Grand View Research, 2016).

CTC представляют собой клетки, которые распространяются в кровь из первичных или метастатических опухолей и играют ключевую роль в метастатическом каскаде. Прогностическая ценность CTC была доказана и одобрена FDA для рака груди, простаты и колоректального рака, где большее количество CTC (> 5 CTC/7,5 мл крови) коррелирует с более низким общим коэффициентом выживаемости (OSR) по результатам исследования CellSearch®.

Другие потенциальные клинические применения CTC включают мониторинг заболеваний, рекомендации по терапии, стратификацию пациентов для точной медицины и индивидуализированной терапии, скрининг для ранней диагностики, исследования рака и разработку лекарств. Основная проблема при использовании CTC в повседневной клинической практике связана с трудностью их выделения из крови, поскольку они являются чрезвычайно редкими (всего одна CTC на миллиард клеток крови).

Ни одна из современных технологий выделения CTC не может обеспечить необходимую чувствительность, надежность, робастность, простоту применения и экономическую эффективность, которые являются наиболее важными потребностями пользователя с точки зрения клинических и экономических перспектив.

В настоящее время на рынке СТС конкурируют около 40 компаний. Среди них на рынке имеется только одна одобренная FDA система обнаружения CTC от компании Janssen Diagnostic (CellSearch®), недавно приобретенной Menarini Silicon Biosystems. Система считается широко признанным золотым стандартом для подсчета CTC рака груди, простаты и колоректального рака. Один тест стоит от 450 до 600 долларов в США и Европе. Хотя CellSearch® одобрен FDA, он не применяется в повседневной клинической практике в основном из-за высокой стоимости инфраструктуры и централизации в определенных клиниках, что вызывает проблемы с перемещением образцов.

Кроме того, технологии, разработанные впоследствии, показали гораздо более высокие числа CTC для тех же клинических образцов, что снизило надежность системы.

Платформами для выделения CTC, которые используют микрожидкостные технологии для выделения CTC на основе иммуноаффинности, являются IsoFlux (Fluxion Biosciences), LiquidBiopsy (Cynvenio), Biocept и Biofluidica.

Платформы IsoFlux (Harb W., et al., 2013) и LiquidBiopsy (Winer-Jones JP et al., 2014) используют центрифугирование с фиколл-плотностью для предварительного обогащения и иммуномагнитного мечения CTC вне чипа в образце перед загрузкой образца в микрожидкостный чип для магнитного разделения в микрожидкостном потоке. Основными недостатками этих технологий являются длительное время предварительной обработки образцов для обогащения CTC перед загрузкой образца. С другой стороны, в последних двух системах используются микрожидкостные каналы, покрытые антителами, для выделения CTC из биологических жидкостей, аналогично способу и устройству, предложенным в рамках настоящего изобретения.

Технология, представленная в US 9250242B2, основана на покрытых антителом параллельных, узких (25 мкм) и глубоких синусоидальных микрожидкостных каналах, что способствует качательному движению клеток на поверхностях. Напротив, предлагаемое изобретение предлагает более широкий канал, включающий столбики, для изменения траектории потока биологических объектов.

Конструкция канала, представленная в US 2006/0160243A1, основана на покрытых антителом цилиндрических столбиках, расположенных случайным образом в микрожидкостном канале. Цилиндрические столбики имеют разный диаметр. Устройство увеличивает траекторию потока биологических объектов, так что прямолинейный поток прерывается набором поперечных столбиков. Аналогичным образом, US 2014/0154703A1 охватывает способы и микрожидкостное устройство для диагностики рака, содержащее вход, выход и множество препятствий, расположенных между ними и дополнительно содержащих опорные столбики, покрытые антителом. Диаметр каждого из опорных столбиков и расстояние между столбиками могут изменяться в зависимости от различных участков канала. US 2007/0026417A1 раскрывает способ обнаружения, обогащения и анализа циркулирующих опухолевых клеток и других частиц. Форма препятствий является цилиндрической. Благодаря взаимодействию антитело-антиген на столбике клетки могут быть захвачены. В отличие от цилиндрических препятствий, предложенных в упомянутых предшествующих изобретениях, предлагаемое в настоящем описании изобретение обеспечивает хаотическую траекторию для биологических объектов с помощью симметричных столбиков в форме капли, расположенных регулярно внутри микрожидкостного канала, образованного сегментами эллипса. Все столбики имеют одинаковые размеры, и изобретение увеличивает число столкновений между биологическими объектами и столбиками за счет увеличения площади поверхности и сканирования всех углов атаки.

Краткое описание изобретения

В настоящем изобретении предлагается микрожидкостное устройство, которое обеспечивает избирательный захват биологических объектов, взвешенных в среде.

Устройство позволяет непрерывно изменять угол атаки, таким образом, сохраняя хаотические траектории биологических объектов по всему каналу.

Устройство включает в себя симметричные столбики в форме капли (т.е. столбики в форме подводного крыла, что приводит к повышению вероятности взаимодействия объект/поверхность для захвата целевых биологических объектов среди различных других объектов в суспензии, что приводит к повышению эффективности захвата (чувствительности), которая определяется как процентное отношение количества захваченных целевых биологических объектов в объеме захвата и общего количества целевых биологических объектов, входящих в объем захвата.

Увеличение взаимодействия объекта с поверхностью позволяет увеличить расстояния между столбиками до значения, по меньшей мере, в три-десять раз превышающего характеристический размер целевого объекта вместо типичного значения, в два-три раза превышающего характеристический размер целевого объекта, без ущерба для эффективности захвата. Более широкое расстояние между столбиками снижает вероятность засорения канала при прохождении образца через канал. Это особенно важно при работе с суспензиями в высокой концентрации.

В конкретном варианте осуществления для захвата CTC из жидкостей организма, таких как кровь, увеличение взаимодействия объект/поверхность обеспечивает использование расстояний между столбиками, составляющих 75-150 мкм, вместо 50-70 мкм, без снижения эффективности захвата клеток.

Столбики имеют одинаковую форму и схему распределения по всему каналу, что значительно сокращает входные параметры конструкции и упрощает процедуру проектирования.

Кроме того, более широкие расстояния между столбиками обеспечивают универсальность производственных процессов, включая различные варианты формования полимеров.

Устройство поддерживает хаотические траектории биологических объектов по всему каналу без изменения формы и расположения столбиков. Это достигается за счет использования извилистого микрожидкостного канала и симметричных столбиков в форме капли, распределенных в виде массива, при этом геометрические центры столбиков в массиве образуют ромбическую решетку.

Объект изобретения состоит в том, чтобы определить линии потока жидкости по равномерно распределенной структуре столбиков путем включения структуры канала, как описано выше, что приводит к непрерывному изменению угла атаки по всему каналу. Это дает следующие преимущества:

Более высокая чувствительность: высокая эффективность захвата биологических объектов за счет более высокой частоты взаимодействия объект/поверхность.

Работа канала без засорения: увеличение взаимодействия объекта с поверхностью обеспечивает увеличение расстояний между столбиками до значений, по меньшей мере, в три-десять раз превышающих характеристический размер целевого объекта вместо типичного значения, в два-три раза превышающего характеристический размер целевого объекта, без ущерба для эффективности захвата. Более широкое расстояние между столбиками снижает вероятность засорения канала при прохождении образца через канал. Это особенно важно при работе с суспензиями в высокой концентрации.

Простота проектирования: упрощенная процедура проектирования со значительно сокращенными входными параметрами конструкции за счет равномерно распределенной структуры столбиков.

Универсальное и экономичное производство устройств: более широкие расстояния между столбиками обеспечивают универсальность производственных процессов, включая различные варианты формования полимеров.

Изобретение будет применяться в биомедицинских микросистемах для диагностики in vitro (IVD) или только для исследовательских целей (RUO). Одним из примеров применения является обнаружение биологических объектов, таких как CTC, в образцах крови больных раком. CTC в образце крови могут быть избирательно захвачены среди других клеток периферической крови благодаря их отличительным поверхностным белкам, которые селективно взаимодействуют с нанесенным на поверхности канала антителом.

Описание чертежей

Фиг. 1. Схематически изображен извилистый микрожидкостный канал с массивом столбиков в форме капли в типовом расположении.

Фиг. 2. Схематически изображен симметричный столбик, имеющий форму капли , и линия его хорды.

Фиг. 3. Изображена схема взаимодействия между целевым биологическим объектом и антителами, нанесенными на один симметричный столбик в форме капли.

Фиг. 4. (A, B, C, D, E) Изображено микрожидкостное устройство с различными областями захвата, показывающее пространственную локализацию целевых биологических объектов, захваченных специфичными антителами в прямом микрожидкостном канале.

Фиг. 5. Изображена схема сегмента эллипса, содержащего массив симметричных столбиков в форме капли в типовом расположении.

Фиг. 6. Изображена схема последовательности сегментов эллипса, содержащих массив симметричных столбиков в форме капли в типовом расположении.

Фиг. 7. Изображено компьютерное моделирование различных траекторий потока среды, содержащей целевые биологические объекты, посредством типового расположения последовательности сегментов эллипса, содержащих массив симметричных столбиков в форме капли.

Фиг. 8. Изображена схема двух сегментов эллипса, содержащих массив симметричных столбиков в форме капли, соединенных через прямой микроканал, содержащий массив симметричных столбиков в форме капли в типовом расположении.

Фиг. 9. Изображено микроскопическое изображение типового устройства, сформированного из последовательности сегментов эллипса и прямого канала, содержащего массив симметричных столбиков в форме капли.

Описание компонентов и частей изобретения

Компоненты, показанные на чертежах, подготовленных для лучшего объяснения устройства для улучшения разделения микрожидкостных биологических структур, пронумерованы отдельно, и объяснение каждого номера дается ниже.

1. Симметричные столбики в форме капли

2. Извилистый микрожидкостный канал

3. Объем захвата

4. Ромбическая решетка

5. Линия хорды

6. Ось симметрии

7. Антитело

8. Целевой биологический объект

9. Линия потока, несущего целевой биологический объект

10. Прямой канал, содержащий препятствия

11. Выше по потоку

12. Ниже по потоку

13. Сегмент эллипса

14. Хорда

15. Большая ось

16. Малая ось

17. Секция впуска

18. Секция выпуска

19. Направление потока

20. Последовательность сегментов эллипса

21. Предшествующий сегмент эллипса

22. Следующий сегмент эллипса

23. Прямой микроканал

24. Вход

25. Выход

d. Длина стороны ромба

а. Угол атаки

Подробное описание изобретения

Устройство содержит массив симметричных столбиков (1) в форме капли, извилистый микрожидкостный канал (2), включающий симметричные столбики (1) в форме капли, действующие как препятствия, и объем захвата (3), как показано на фигуре 1. Геометрические центры симметричных столбиков (1) в форме капли в массиве образуют ромбическую решетку (4). Ромбическая решетка (4) характеризуется длиной стороны ромба (d) в решетке, которая представляет собой евклидово расстояние между геометрическими центрами двух соседних симметричных столбиков в форме капли (1). Другой аспект массива симметричных столбиков (1) в форме капли состоит в том, что линии хорды (5) параллельны друг другу. Линия хорды (5) определяется как отрезок прямой, концы которого расположены на границе симметричного столбика (1) в форме капли и совпадают с осью (6) симметрии симметричного столбика (1) в форме капли (фигура 2). Логическое вычитание массива симметричных столбиков (1) в форме капли из извилистого микрожидкостного канала (2) определяет объем захвата (3), показанный на фигуре 1.

Границы объема захвата (3), включая поверхность симметричных столбиков (1) в форме капли, покрыты по меньшей мере одним антителом (7), подходящим для специфичного захвата целевых биологических объектов (8) в соответствии с их отличительными поверхностными белками среди различных других объектов в суспензии (захват на основе иммуноаффинности), протекающих в объеме захвата (3) вдоль линий потока, несущих целевые биологические объекты (9) (фигура 3).

Препятствия обычно используются в устройствах захвата на основе иммуноаффинности для увеличения площади поверхности, что увеличивает вероятность столкновения целевых биологических объектов (8) с поверхностью, покрытой антителом (7). Это увеличивает взаимодействие объекта с поверхностью и, следовательно, эффективность захвата устройством. Однако в случае прямого канала, содержащего препятствия (10), взаимодействие между целевым биологическим объектом и поверхностью обычно происходит на верхнем по потоку участке (11) канала, и если целевой биологический объект не захвачен на верхнем по потоку участке (11) канала, то вероятность его захвата на нижнем по потоку участке (12) канала резко снижается (фигура 4). На фигурах 4A-E показаны целевые биологические объекты, захваченные на верхнем по потоку участке (11) и нижнем по потоку участке (12) прямого микроканала, содержащего препятствия (10). Уменьшение количества захваченных клеток на этой траектории от верхнего по потоку участка к нижнему по потоку участку в основном связано с тем, что поток жидкости становится однородным, и объекты следуют по различным линиям потока, которые при низком числе Рейнольдса (<<1) не совпадают с препятствиями в микроканале. Для того, чтобы поддерживать высокую вероятность взаимодействия объект/поверхность во всем канале, следует поддерживать хаотические траектории целевых биологических объектов (8).

Устройство по настоящему изобретению реализует хаотические траектории целевых биологических объектов (8), которые должны поддерживаться в извилистом микрожидкостном канале (2) путем непрерывного изменения углов атаки (а), которые представляют собой угол между линией хорды (5) симметричных столбиков (1) в форме капли и линиями потока, несущими целевые биологические объекты (9), как показано на фигуре 1.

В конкретном варианте осуществления устройства извилистый микрожидкостный канал (2) содержит сегмент эллипса (13), который характеризуется хордой (14), параллельной либо большой оси (15), либо малой оси (16) эллипса (фигура 5). Хорда разделена на секцию впуска (17) и секцию выпуска (18), через которые целевые биологические объекты (8) входят в сегмент эллипса (13) и выходят из него, соответственно, как показано направлением потока (19).

В другом варианте осуществления устройства извилистый микрожидкостный канал (2) содержит последовательность сегментов эллипса (20), соединенных друг с другом (фигура 6). Последовательность сегментов эллипса (20) формируется путем переворачивания предыдущего сегмента эллипса (21) в последовательности вокруг его хорды (14) и параллельного переноса на расстояние, равное секции впуска (17), вдоль хорды (14) в направлении к секции выпуска (18). На фигуре 7 показаны результаты компьютерного моделирования потока внутри последовательности двух сегментов эллипса, содержащих типовой массив симметричных столбиков в форме капли (1), изображающих траектории линий потока, несущих целевые биологические объекты (9). Целевые биологические объекты (8) входят в секцию впуска (17) предшествующего сегмента эллипса (21) и следуют по линиям потока жидкости, что приводит к ориентации целевых биологических объектов (8) по направлению к границам объема захвата (3). Вследствие изгибания потока внутри последовательности сегментов эллипса целевые биологические объекты (8) сталкиваются со столбиками (1) в форме капли под разными углами атаки (0°-180°) (фигура 7).

В другом варианте осуществления (фигура 8) устройство содержит, по меньшей мере, канальный блок, состоящий из двух сегментов эллипса. Секция выпуска (18) предшествующего сегмента эллипса (21) соединена с секцией впуска (17) следующего сегмента эллипса (22) через прямой микроканал (23). Прямой микроканал также содержит массив симметричных столбиков в форме капли (1). Направление потока (19) показано на фигуре 8.

На фигуре 9 показано изображение под микроскопом конкретного варианта осуществления, включающего вход (24) для введения среды, содержащей целевые биологические объекты, выход (25), последовательность сегментов эллипса (20) в виде полукругов, прямой микроканал (23), и массив симметричных столбиков в форме капли (1).

Сегменты эллипса (13), входящие в состав устройства, могут быть образованы путем рассечения любого эллипса хордой (14), параллельной либо большой оси (15), либо малой оси (16) эллипса, как показано на фигуре 5. Таким образом, конкретный вариант осуществления сегмента эллипса имеет форму полукруга. Кроме того, секция впуска (17) и секция выпуска (18) хорды (14) могут быть, в частности, выбраны равными друг другу.

Целевые биологические объекты (8), захваченные в устройстве, могут представлять собой циркулирующие опухолевые клетки, редкие клетки, клетки периферической крови или произвольную комбинацию указанного. Для того, чтобы предотвратить засорение и обеспечить взаимодействие целевых биологических объектов (8) с границами объема захвата (3), расстояние между соседними симметричными столбиками (1) в форме капли может быть выбрано составляющим в три-десять раз больше характеристического размера целевого биологического объекта (8).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Harb W., Fan A., Tran T., Danila D.C., Keys D., Schwartz M., Ionescu-Zanetti C., Mutational Analysis of Circulating Tumor Cells Using a Novel Microfluidic Collection Device and qPCR Assay, Translational Oncology Vol. 6, No. 5, 2013.

Winer-Jones J.P., Vahidi B., Arquilevich N., Fang C., Ferguson S., Harkins D., Hill C., Klem E., Pagano P.C., Peasley C., Romero 1, Shartle R., Vasko R.C., Strauss W.M., Dempsey P.W., Circulating Tumor Cells: Clinically Relevant Molecular Access Based on a Novel CTC Flow Cell, PLOS ONE, Vol 9, Issue 1, e86717, 2014.

Martin G., Soper S., Witek M., Yeh J.J., (2016). United States Patent No. US 9250242B2.

Zhongliang T., Bhatt R.S., Tsinberg P., (2006). United States Patent No. US 2006/0160243A1.

Skelley A., Smirnov D., Dong Y., Merdek K.D., Sprott K., Carney W., Jiang C., Huang R., Lupascu I., (2014). United States Patent No. US 2014/0154703A1.

Fuchs M., Toner M., (2007). United States Patent No. US 2007/0026417A1.

1. Микрожидкостное устройство для селективного захвата целевых биологических объектов, содержащее

а) массив симметричных столбиков в форме капли (1), в которых линии хорды (5) симметричных столбиков в форме капли параллельны друг другу и при этом

геометрические центры симметричных столбиков в форме капли образуют ромбическую решетку (4), характеризующуюся тем, что длина (d) стороны ромба в решетке образована как Евклидово расстояние между геометрическими центрами двух соседних симметричных столбиков в форме капли,

b) извилистый микрожидкостный канал (2) и

c) объем захвата (3),

отличающееся тем, что

извилистый микрожидкостный канал (2) содержит последовательность сегментов эллипса (13), каждый из которых характеризуется хордой, параллельной большой или малой оси эллипса, причем указанная хорда разделена на секцию впуска (17) и секцию выпуска (18), через которые целевой биологический объект входит в сегмент эллипса (13) и выходит из него, причем сегменты эллипса соединены друг с другом, причем следующий сегмент эллипса формируется путем поворота предшествующего сегмента эллипса вокруг его хорды и параллельного переноса на расстояние, равное секции впуска (17), вдоль хорды, причем

объем захвата (3) определяется логическим вычитанием массива симметричных столбиков в форме капли из извилистого микрожидкостного канала.

2. Микрожидкостное устройство по п. 1, в котором длина секции впуска (17) равна длине секции выпуска (18).

3. Микрожидкостное устройство по пп. 1, 2, отличающееся тем, что указанное устройство содержит, по меньшей мере, блок каналов, где этот блок состоит из двух сегментов эллипса (13), причем секция выпуска (18) предшествующего сегмента эллипса соединена с секцией впуска (17) следующего сегмента эллипса через прямой микроканал (23), причем прямой микроканал содержит массив симметричных столбиков в форме капли.

4. Микрожидкостное устройство по любому из пп. 1-3, отличающееся тем, что сегменты эллипса (13) имеют форму полукруга.

5. Микрожидкостное устройство по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что расстояние между соседними симметричными столбиками в форме капли в три-десять раз больше характеристического размера целевого биологического объекта.

6. Микрожидкостное устройство по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что целевой биологический объект выбирают из группы, состоящей из циркулирующих опухолевых клеток, редких клеток, клеток периферической крови или произвольной комбинации указанного.