Обработка с целью удаления эктопаразитов у рыб
Способ включает введение рыбе неоникотиноида и замену воды, содержащей удаленные эктопаразиты, при этом разделяют удаленных эктопаразитов и рыбу. Неоникотиноид не составлен в виде композиции, предназначенной для введения в корм. Предусмотрены применение неоникотиноида и содержащая его композиция. Группа изобретений обеспечивает отделение эктопаразитов с рыбы и их удаление. 3 н. и 36 з.п. ф-лы, 2 ил., 11 табл., 8 пр.
Настоящее изобретение относится к способам удаления эктопаразитов у рыб в воде с использованием неоникотиноидов и к неоникотиноидам для применения при лечении заражения рыб эктопаразитами, к композициям, предназначенным для применения при лечении заражения рыб эктопаразитами, которые содержат один или несколько эктопаразитицидов, при этом одним из эктопаразитицидов или одним из нескольких эктопаразитицидов является неоникотиноид.
Заражение эктопаразитами в аквакультуре является важной коммерческой проблемой. Кроме того, заражение выращенной на фермах рыбы может повлиять и на естественные рыбные запасы. Однако количество промышленно приемлемых методов обработки ограничено, например, из-за опасений, связанных с высвобождением химиотерапевтических агентов в окружающую среду и развитием резистентности у эктопаразитов или другим снижением чувствительности к агентам.
Неоникотиноиды представляют собой класс нейроактивных инсектицидов, химически подобных никотину. Семейство неоникотиноидов включает ацетамиприд, клотианидин, имидаклоприд, нитенпирам, нитиазин, тиаклоприд и тиаметоксам. По сравнению с фосфорорганическими соединениями и карбаматными инсектицидами, неоникотиноиды менее токсичны для птиц и млекопитающих, чем для насекомых.
EP0590425 в очень широком смысле относится к способу борьбы с паразитами рыб путем назначения рыбам агониста или антагониста никотинергических ацетилхолиновых рецепторов. В единственном примере, приведенном в EP0590425, проверяется in vitro активность имидаклоприда в количестве 1 м.д. или 100 м.д. против изолированных водяных вшей в ванне с водой. Однако в EP0590425 нет указаний на подходящую дозу для использования в условиях in vivo в отношении изолированных водяных вшей у рыб не в лабораторных условиях, а в коммерческой среде.
Действительно, разработка промышленно приемлемых способов обработки, которая основывается на введении, связанном с погружением в воду, является сложной задачей ввиду экологических проблем и проблем безопасности. В частности, считается важным свести к минимуму высвобождение неоникотиноидов в окружающую среду в целом, вследствие их предполагаемого негативного воздействия, в частности, на наземных насекомых.
В WO2009/010755 предложены комбинированные обработки, включающие карбамат или фосфорорганическое соединение, пиретроид или пиретрин и необязательно другой биоцид, выбранный из следующих классов молекул: хлороникотинил; фенилпиразол; оксадиазин; пиразол; или хлорорганическое соединение. Однако демонстрационные примеры обработки рыб не раскрываются.
В WO2010/109187 предложены комбинированные обработки, включающие пиретроид, фосфорорганическое соединение и необязательно другой биоцид, выбранный из следующих классов молекул: хлороникотинил; фенилпиразол; оксадиазин; пиразол; или хлорорганическое соединение. Однако демонстрационные примеры обработки рыб не раскрываются.
Поэтому сохраняется потребность в промышленно приемлемой связанной с погружением обработке, с целью удаления эктопаразитов у рыб, которая учитывает вопросы безопасности, проблемы окружающей среды и проблемы устойчивости к обработке.
Таким образом, одним из аспектов настоящего изобретения является неоникотиноид для применения при лечении инвазии эктопаразитами у рыб. Предпочтительно, неоникотиноид назначают рыбам в течение 120 мин или меньше, 60 мин или меньше, меньше чем 30 мин, меньше чем 20 мин, 15 мин или меньше, меньше чем 10 мин или 5 мин или меньше.
Предпочтительно, неоникотиноид приготовлен или составлен в виде композиции для введения путем погружения.
Предпочтительно, неоникотиноид не приготовлен или не составлен в виде композиции, предназначенной для введения в корм.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что неоникотиноид более эффективен против эктопаразитов в подвижной стадии их жизненного цикла. Поэтому в вариантах осуществления настоящего изобретения эктопаразит находится в подвижной стадии жизненного цикла. В других вариантах осуществления настоящего изобретения эктопаразит находится в неподвижной стадии жизненного цикла. В популяции эктопаразитов эктопаразиты могут находиться как в подвижной, так и в неподвижной стадиях жизненного цикла. Таким образом, в вариантах осуществления настоящего изобретения обработка может быть эффективной в течение как подвижных, так и неподвижных стадий жизненного цикла эктопаразитов.
В вариантах осуществления настоящего изобретения неоникотиноид вводят рыбе в концентрации 1-500 м.д., 1-200 м.д., 20-200 м.д., 1-64 м.д., 10-64 м.д., 10-50 м.д., 50 м.д. или больше, 100 м.д. или больше или 200 м.д. масс./об. или больше.
В примерных вариантах осуществления настоящего изобретения неоникотиноид вводят рыбе в концентрации 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 64, 100, 200 или 500 м.д. масс./об.
Как правило, неоникотиноид вводят рыбе в концентрации 15 м.д. масс./об. или 20 м.д. масс./об.
В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения неоникотиноид вводят рыбе в концентрации 100 м.д. масс./об. или больше в течение 5-15 мин, предпочтительно в концентрации 200 м.д. масс./об. или больше в течение 5-15 мин.
Таким образом, неоникотиноид представляет собой безопасное и эффективное средство для удаления эктопаразитов у рыб в природных условиях, которыми может быть, например, судно с живорыбными садками.
Условия судна с живорыбными садками вызывает уникальные трудности, связанные с тем, что пространство и время обработки ограничены, и возникают дополнительные риски, связанные с гарантией того, что подвергнутые обработке водяные вши не попадают в окружающую среду. Несмотря на указанные сложности, настоящее изобретение позволяет с большим успехом избавляться от водяных вшей в природных условиях и, например, позволяет избежать необходимости судну с живорыбными садками возвращаться на берег, или необходимости перекачивать собственную воду на другое судно для проведения обработки или транспортировки на берег, с целью удаления водяных вшей из используемой для обработки воды.
Настоящее изобретение может быть пригодно для использования или осуществления в любой изолированной зоне, что позволяет избежать выброса эктопаразитицидов или удаленных водяных вшей в окружающую среду. Варианты осуществления настоящего изобретения осуществляются на судне с живорыбными садками.
Неожиданно авторы настоящего изобретения обнаружили, что применение неоникотиноида более эффективно при удалении эктопаразитов, чем применение азаметифоса или дельтаметрина.
Полагают, что неоникотиноид эффективен против всех эктопаразитов. Однако в варианте осуществления настоящего изобретения эктопаразит представляет собой водяную вошь. В частности, водяной вошью является Lepeophtheirus salmonis. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения водяной вошью являются водяные вши вида Caligus, такие как C. elongatus или С. rogercresseyi.
Полагают, что неоникотиноид эффективен против заражения эктопаразитами всех рыб. В варианте осуществления настоящего изобретения рыбой является лосось, форель, озерная форель или рыба-чистильщик.
Во всех аспектах и вариантах осуществления настоящего изобретения, описанных в настоящем документе, термин ”рыба-чистильщик” относится к видам рыб, которые обслуживают другие виды рыб, удаляя нежелательные вещества, такие как омертвевшая кожа и/или эктопаразиты. В любом варианте осуществления настоящего изобретения, рыба-чистильщик может представлять собой одну рыбу-чистильщика или несколько рыб-чистильщиков, выбранных из группы, состоящей из: рыба-воробей/пинагор (Cyclopterus lumpus); губан семейства губановых; таутоголябрус (Tautogolabrus adspersus); и патагония (Eleginops maclovinus). Губаном семейства губановых может быть один губан или несколько губанов, выбранных из группы, состоящей из: радужный губан (Labrus bergylta); темнополосая зеленушка (Symphodus melops); малоротый центролабрус (Centrolabrus exoletus); гребенчатый губан (Ctenolabrus rupestris); пятнистый губан (Labrus mixtus). В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения рыба-чистильщик представляет собой рыбу-воробья или губана.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения неоникотиноид представляет собой имидаклоприд или его фармацевтически эффективные соли или сложные эфиры. В других вариантах осуществления настоящего изобретения неоникотиноидом может быть ацетамиприд, клотианидин, нитенпирам, нитиазин, тиаклоприд или тиаметоксам или их фармацевтически эффективные соли или сложные эфиры.
В вариантах осуществления настоящего изобретения не требуется, чтобы эктопаразиты изначально были убиты неоникотиноидом. Вместо этого, эктопаразитов заставляют освободиться или оторваться от рыбы, и каждый удаленный эктопаразит будет находиться в одном из следующих состояний: живой; умирающий; и убитый. При обработке рыб, зараженных смешанной популяцией водяных вшей, которые могут, например, иметь различную чувствительность к используемым эктопаразитицидам, популяция удаленных водяных вшей, скорее всего, будет находиться в смеси двух или нескольких состояний. Таким образом, хотя в указанных вариантах осуществления настоящего изобретения не требуется, чтобы эктопаразиты были первоначально убиты, некоторые эктопаразиты или все эктопаразиты будут убиты в процессе обработки. В вариантах осуществления настоящего изобретения, требующих высвобождение, но не уничтожение эктопаразитов, неоникотиноид может применяться в сублетальной дозе и/или в течение сублетального времени. Указанный вариант осуществления настоящего изобретения наиболее пригоден для удаления популяций эктопаразитов, которые обладают определенной устойчивостью к действию эктопаразитицида, что может привести к увеличению дозы, необходимой для уничтожения эктопаразита, до уровней, которые непрактичны или слишком дороги для их достижения. В этом смысле настоящее изобретение позволяет решить проблему устойчивости к обработке.
В других вариантах неоникотиноид применяют в летальной дозе и/или в течение летального времени.
При сублетальных обработках регуляторные факторы и надлежащая практика могут потребовать принятия мер, препятствующих высвобождению удаленных эктопаразитов в окружающую среду. Таким образом, варианты осуществления настоящего изобретения включают заключительный этап предотвращения высвобождения удаленных эктопаразитов в окружающую среду.
В вариантах осуществления настоящего изобретения неоникотиноид применяют при температуре 4-18°C, 4-16°C, 5-15°C, 10-14°C или 12-14°C.
Другим аспектом настоящего изобретения является композиция для применения с целью устранения заражения рыб эктопаразитами, содержащая один или несколько эктопаразитицидов, где один из эктопаразитицидов или из нескольких эктопаразитицидов представляют собой неоникотиноид для применения согласно настоящему изобретению.
В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения композиция содержит один эктопаразитицид. Таким образом, композиция содержит только неоникотиноид, и исключаются другие формы эктопаразитицидов.
Так, например, в вариантах осуществления настоящего изобретения предлагается композиция, содержащая неоникотиноид, но исключают один или несколько агентов, выбранных из: карбамата; фосфорорганического соединения; пиретроида; пиретрина; хлороникотинила; фенилпиразола; оксадиазина; пиразола; или хлорорганического соединения.
Другим аспектом настоящего изобретения является способ удаления эктопаразитов у рыб в воде, включающий: (i) введение рыбе неоникотиноида для удаления эктопаразитов из рыбы; и (ii) замена воды, содержащей неоникотиноид и удаленные эктопаразиты, замещающей водой, при этом отделяют удаленных эктопаразитов от рыбы.
Предпочтительно обработка представляет собой обработку путем погружения.
Предпочтительно, обработка не является обработкой путем добавления в корм.
Таким образом, недостаточно того, чтобы неоникотиноид убивал или иным образом обездвиживал водяных вшей на рыбе. На самом деле водяные вши должны быть отделены от рыбы с тем, чтобы обеспечить сбор водяных вшей, как живых, так и мертвых, необязательно для отдельного их уничтожения. Таким образом, указанный способ позволяет устранять заражение эктопаразитами без необходимости убивать эктопаразитов путем химической обработки, и позволяет разделять эктопаразиты и рыбу таким образом, что эктопаразиты могут быть захвачены. Каждый из эктопаразитов, удаленный указанным способом, будет находиться в одном из следующих состояний: живой; умирающий; и убитый. Это весьма удобно, поскольку обработки, которые убивают эктопаразитов до того, как они будут отделены от рыбы, требуют проведения дальнейшей обработки рыб, с целью удаления убитых эктопаразитов и часто прочно прикрепившихся эктопаразитов из рыб. С точки зрения аквакультуры указанный способ также позволяет получить рыбный продукт, который относительно свободен, практически свободен или полностью свободен от загрязнения водяными вшами.
Таким образом, способ по настоящему изобретению с успехом пригоден для удаления популяций эктопаразитов, которые в определенной степени устойчивы к эктопаразитициду, что может привести к увеличению дозы, необходимой для уничтожения эктопаразита, до уровней, которые непрактичны или слишком дороги в осуществлении. В этом отношении настоящее изобретение позволяет решить проблему стойкости к обработке.
В вариантах осуществления настоящего изобретения эктопаразит находится в подвижной стадии жизненного цикла. В других вариантах осуществления настоящего изобретения эктопаразит находится в неподвижной стадии жизненного цикла. В популяции эктопаразитов эктопаразиты могут находиться как в подвижной, так и в неподвижной стадиях жизненного цикла. Таким образом, в вариантах осуществления настоящего изобретения лечение может быть эффективным по отношению как подвижных, так и неподвижных стадий жизненного цикла.
В вариантах осуществления настоящего изобретения, неоникотиноид назначают рыбе в концентрации 1-500 м.д., 1-200 м.д., 20-200 м.д., 1-64 м.д., 10-64 м.д., 10-50 м.д., 50 м.д. или больше, 100 м.д. или больше, 200 м.д. масс./об или больше.
В примерных вариантах осуществления настоящего изобретения неоникотиноид назначают рыбе в концентрации 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 64, 100, 200 или 500 м.д. масс./об.
Как правило, неоникотиноид назначают рыбе в концентрации 15 м.д. масс./об. или 20 м.д. масс./об.
В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения неоникотиноид назначают рыбе в концентрации 100 м.д. масс./об. или больше в течение 5-15 мин, предпочтительно в концентрации 200 м.д. асс./об. или больше в течение 5-15 мин.
В вариантах осуществления настоящего изобретения неоникотиноид применяют в течение периода времени, достаточного для того, чтобы удалить 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% или всех эктопаразитов у рыбы.
Соответственно, данный способ может включать стадии, которые позволяют установить походящее эффективное время. Таким образом, данный способ может включать мониторинг водяных вшей после введения неоникотиноида, с целью оценки приемлемого уровня удаления (например, процента удаления) и, таким образом, определение дозы и периода времени, необходимых для достижения приемлемого уровня удаления. Указанные параметры могут затем использоваться при применении способа в природных условиях без осуществления контроля над уровнем удаления, с учетом полученных данных о том, что приемлемый уровень удаления с большой вероятностью будет достигнут.
Как правило, неоникотиноид применяют в течение 180 мин или меньше, 120 мин или меньше, 60 мин или меньше, меньше чем 30 мин, меньше чем 20 мин, 15 мин или меньше, меньше чем 10 мин или 5 мин или меньше.
В вариантах осуществления настоящего изобретения рыба представляет собой лосось, форель или рыбу-чистильщика.
Неоникотиноид может применяться в сублетальной дозе и/или в течение сублетального времени.
Термин “сублетальный” может относиться к дозе и/или времени обработки. Он может быть применен в отношении сведений о дозе и/или времени, необходимых для уничтожения эктопаразита. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения “сублетальный” относится к дозе и/или времени, необходимым, чтобы убить эктопаразит, у которого развилась определенная степень устойчивости к эктопаразитициду. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения сублетальность представляет собой обработку, которая не убивает всех эктопаразитов в популяции, необязательно при температурах в диапазоне 4-18°C.
Таким образом, варианты осуществления настоящего изобретения не требуют, чтобы эктопаразиты были изначально убиты неоникотиноидом, скорее они заставляют эктопаразиты освободиться или отделиться от рыбы. Сказанное сводит к минимуму применение потенциально опасного агента в природных условиях. Минимизация времени применения целесообразна в природных условиях, где подвергаемая обработке огороженная часть водоема может быть не полностью изолирована от окружающей среды, и поэтому может произойти утечка активного вещества. Концентрацию в подобных условиях следует поддерживать в течение всего времени обработки, и поэтому сокращение времени обработки может свести к минимуму потерю агента в окружающую среду.
Неоникотиноид может применяться в летальной дозе и/или в течение летального времени.
В вариантах осуществления настоящего изобретения неоникотиноид применяют при температуре 4-18°C, 4-16°C, 5-15°C, 10-14°C или 12-14°C.
В вариантах осуществления настоящего изобретения неоникотиноид является единственным эктопаразитицидом, который назначают на время проведения обработки. Сказанное предоставляет преимущества, по сравнению с комбинированными методами обработки, поскольку ожидается, что комбинированная обработка окажет большее негативное воздействие на окружающую среду вследствие большего числа эффектов, которые не являются заданными показателям, и увеличения вероятности развития резистентности.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения неоникотиноид представляет собой имидаклоприд или его фармацевтически эффективные соли или сложные эфиры. В других вариантах осуществления настоящего изобретения неоникотиноидом может быть ацетамиприд, клотианидин, нитенпирам, нитиазин, тиаклоприд или тиаметоксам или их фармацевтически эффективные соли или сложные эфиры.
В вариантах осуществления настоящего изобретения данный способ дополнительно включает стадию: (iii) предотвращения высвобождения удаленных эктопаразитов в окружающую среду. Она может принимать форму сбора эктопаразитов из образца воды, содержащей удаленные эктопаразиты.
Предпочтительно, образцом воды является вся вода, используемая в данном способе.
В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения эктопаразиты, живые, мертвые и/или умирающие, включая их яйцеводы, где они присутствуют, собирают, пропуская образец воды через сетчатый фильтр. Квалифицированный специалист сможет найти и использовать соответствующий сетчатый фильтр для применения. Сетчатый фильтр может иметь размер ячеек, по крайней мере, 30 мкм, по крайней мере, 60 мкм или, по крайней мере, 150 мкм, например, приблизительно 150, 60 или 30 мкм. В качестве примера, подходящий сетчатый фильтр для водяных вшей будет иметь размер ячеек приблизительно 150 мкм.
В вариантах осуществления настоящего изобретения данный способ дополнительно включает сбор удаленных эктопаразитов, необязательно концентрирование эктопаразитов, и уничтожение любых оставшихся в живых паразитов. Это целесообразно как гарантия того, что эктопаразиты были умерщвлены в тех случаях, когда предполагается, что неоникотиноид убьет эктопаразиты, или когда известно, что режим дозирования неоникотиноида не убивает, а просто удаляет эктопаразиты. Указанное помогает избежать проблем, связанных с десенсибилизацией эктопаразита или популяции эктопаразита по отношению к неоникотиноиду. Уничтожение любых оставшихся в живых паразитов может быть достигнуто любыми подходящими средствами, такими как механические или химические средства, обычно путем применения эктопаразитицида.
В вариантах осуществления настоящего изобретения рыбу, которую подвергали обработке в замкнутом пространстве, таком как судно с живорыбными садками, выпускаются обратно в окружающую среду, такую как огороженный участок моря.
Настоящее изобретение далее будет описано с помощью примеров со ссылкой на прилагаемые чертежи, на которых:
На фигуре 1 показана доля вшей, удаленных из лосося путем обработки погружением с использованием имидаклоприда в пяти концентрациях (0, 10, 15, 20 и 25 мг/л);
На фигуре 2 приведен график Каплана-Мейера доли зараженных рыб в зависимости от продолжительности обработки в минутах (n=10; t ≤ 56 мин) при обработке с использованием 10 мг/л и 20 мг/л имидаклоприда.
Примеры
Пример 1 - Обработка с помощью 10, 30 и 50 м.д. имидаклоприда
1.1 Введение провокационной пробы водяных вшей
Для проведения обработки подготовили восемь проточных резервуаров, каждый из которых содержал 15 рыб. Рыбой служил лосось (Salmo salar) со средней массой приблизительно 270 г, смешанного пола. Яйцеводы, извлеченные из яйцепроизводящих самок Lepeophtheirus salmonis, собирали и культивировали до получения инфекционных копеподитов. Восемь флаконов, содержащих приблизительно 330-350 копеподитов, случайным образом разместили в резервуаре для обработки (получали в среднем 22 вши на рыбу).
В процессе подготовки к проверочному заражению потоки воды в резервуарах остановили, а уровень освещенности снизили. Затем в каждый резервуар добавили вшей и поддерживали резервуары в полной темноте в течение 6 час, после чего уровень освещенности повысили, а ток воды возобновили.
Рыбам вводили провокационную пробу водяных вшей в течение либо одной недели, либо в течение шести недель.
1.2 Обработка
1.2.1 Обработка после проведения проверочного заражения в течение одной недели
Через неделю после введения провокационной пробы водяных вшей рыбу в трех резервуарах обрабатывали любой из доз 10 м.д. масс./об., 30 м.д. масс./об. или 50 м.д. масс./об. имидаклоприда. В качестве контроля один резервуар обрабатывали с помощью 0,03% ДМСО, а другой имитационный резервуар обрабатывали морской водой.
Для каждого подготовленного для обработки резервуара соответствующее количество имидаклоприда (см. таблицу 1) растворяли в 100 мл ДМСО и смешивали приблизительно с 900 мл морской воды из экспериментального резервуара, получая раствор для обработки. Поток воды в экспериментальных резервуарах отключали, а затем добавляли раствор для обработки.
Рыбу подвергали воздействию в течение 60 мин в статической воде с полной аэрацией и наблюдали в течение времени экспозиции. По окончании времени экспозиции воду быстро сливали приблизительно до 1/3 объема, а затем потоки в резервуарах возобновляли.
| Таблица 1 | ||||
| Группа | Тип обработки | Объем резервуара (литры) | Масса имидаклоприда, используемого при обработке (г) | Точка обработки, количество недель после введения провокационной пробы вшей |
| Группа 1 | Контроль - морская вода | Не определен | - | 1 неделя |
| Группа 2 | Контроль - морская вода/ДМСО | N/A | - | 1 неделя |
| Группа 3 | 10 м.д. имидаклоприда | 273,2 | 2,73 | 1 неделя |
| Группа 4 | 30 м.д. имидаклоприда | 271,6 | 8,15 | 1 неделя |
| Группа 5 | 50 м.д. имидаклоприда | 288,2 | 14,41 | 1 неделя |
| Группа 6 | 10 м.д. имидаклоприда | 293,3 | 2,9 | 6 недель |
| Группа 7 | 30 м.д. имидаклоприда | 278,4 | 8,4 | 6 недель |
| Группа 8 | 50 м.д. имидаклоприда | 292,0 | 14,6 | 6 недель |
1.2.2 Обработка после шести недель воздействия
Через шесть недель после введения рыбам провокационной пробы водяных вшей, рыбу в оставшихся трех резервуарах обрабатывали любой из доз 10 м.д. масс./об., 30 м.д. масс./об. или 50 м.д. масс./об. имидаклоприда. Обработку проводили таким же образом, что и для резервуаров для обработки рыб, которым провокационную пробу вводили в течение одной неделю (см. 1.2.1). Количество имидаклоприда, добавленного в каждый резервуар для обработки, приведено в Таблице 1.
- Наблюдения при 50 м.д. масс./об.
Во время наблюдений, проведенных в интервале от 2 до 6 мин после добавления имидаклоприда, в группе обработки 50 м.д. масс./об. вши в толще воды не обнаружены.
После 12-минутной обработки было обнаружено, что приблизительно 10 вшей отделились от хозяина и находились в свободном состоянии в толще воды. После 18-минутной обработки в толще воды наблюдалось около 20 вшей. Активных движений у этих вшей не зафиксировано. Через 44 мин после добавления имидаклоприда было отмечено, что вши в неактивном состоянии оставались на дне резервуара. Кроме того, было отмечено, что лишь пять рыб оставались зараженными, и у каждой из них обнаружена хотя бы одна вошь. Через 53 мин после добавления имидаклоприда лишь 2-3 рыбы оставались заражены вшами. Через 58 мин после добавления имидаклоприда лишь на одной рыбе была обнаружена только одна вошь. Через 81 мин после добавления имидаклоприда вшей на рыбе не было обнаружено.
Через два дня после обработки было отмечено, что поражения, ранее связанные с кормлением и прикреплением вшей, почти полностью рассосались.
- Наблюдения при 30 м.д. масс./об.
Приблизительно 1-2 вши наблюдали в толще воды резервуара, содержащего рыбу, которую обрабатывали с помощью 30 м.д. масс./об. имидаклоприда, через 10 мин после его добавления. Через 18 мин после добавления в толще воды присутствовали приблизительно 10 вшей. Через 25 мин после добавления приблизительно 20 вшей были обнаружены в воде, а меньше 6 рыб оказались зараженными и имели приблизительно 1-2 вши на рыбу. Через 33 мин после добавления имидаклоприда большинство рыб были признаны не имеющими какой-либо инвазии вшей. Все вши, отделившиеся от хозяина, были неподвижны. Через 47 мин после добавления только 3 рыбы оказались зараженными и у каждой обнаружена одна вошь. Через 59 мин после добавления имидаклоприда ни на одной рыбе не было замечено заражение вшами. Отдельные вши, по-видимому, повторно прикрепились к 4 рыбам, поскольку по 1 вши наблюдали на четырех рыбах через 78 мин после добавления имидаклоприда. По прошествии еще 6 мин вши на этих рыбах не наблюдалось, и все вши в резервуаре были неподвижны.
Через два дня после обработки было отмечено, что поражения, ранее связанные с кормлением и прикреплением вшей, почти полностью рассосались.
- Наблюдения при 10 м.д. масс./об.
Вши не наблюдались в толще воды в течение первых 19 мин после добавления имидаклоприда. Через 21 мин после добавления наблюдалось несколько вшей, активно плавающих в толще воды. Четыре минуты спустя большинство указанных вшей были неподвижны. Через 54 мины после добавления были отмечены как зараженные 2 рыбы, на каждой из которых паразитировала одна яйцепроизводящая самка. Через 86 мин после добавления наблюдали, что одиночная самка вши отделилась от хозяина. Хотя непосредственно не наблюдали, остальные яйцепроизводящие самки были обнаружены отдельно от своего хозяина. Через 91 мин после добавления агента наблюдали одиночного самца вши на голове хозяина. Эту вошь наблюдали на ее хозяине в течение, по крайней мере, пяти дней после обработки.
1.2.3 Прекращение исследований
Через восемь недель после того, как рыба была проверочно заражена водяными вшами, исследование было прекращено. Рыб анастезировали в MS222 (метансульфонат трикаина) и убивали прокалыванием спинного мозга, используя инструмент Iki Jime. Регистрировали длину и массу каждой рыбы, а также внешние симптомы. Удаляли всех вшей у каждой рыбы и отмечали пол и стадии развития. Вшей хранили в этаноле, а пол и стадию развития подтверждали с помощью стереомикроскопа.
Окончательные подсчеты вшей проводились вслепую, и результаты приведены в таблице 2. Представленные данные выражены в виде показателя распространения и плотности популяции. Показатель распространения определяли как число хозяев, зараженных одной или несколькими особями паразита, деленное на число обследованных хозяев (включая зараженных и незараженных хозяев), и выражали в процентах.
| Таблица 2 | |||||
| Обработка | Показатель распространения | Плотность популяции (и диапазон) взрослых вшей-самцов | Плотность популяции (и диапазон) взрослых вшей-самок | Плотность популяции (и диапазон) яйцепроизводящих самок | Плотность популяции (и диапазон) или все стадии развития вшей |
| Контроль ДМСО | 100 | 1,2 (0-4) | 0 (0-0) | 1,47 (0-4) | 2,67 (1-6) |
| Контроль морская вода | 93,33 | 2 (0-7) | 0,067 (0-1) | 1,8 (0-6) | 3,87 (0-11) |
| 1 неделя провокационной пробы+10 м.д. имидаклоприда | 100 | 0,87 (0-2) | 0,067 (0-1) | 1,47 (0-3) | 2,4 (1-5) |
| 1 неделя провокационной пробы+30 м.д. имидаклоприда | 93,33 | 0,8 (0-1) | 0 (0-0) | 1,4 (0-3) | 2,2 (0-4) |
| 1 неделя провокационной пробы+50 м.д. имидаклоприда* | 100 | 1,23 (0-3) | 0 (0-0) | 1,69 (0-5) | 2,92 (0-7) |
| 1 неделя провокационной пробы+10 м.д. имидаклоприда | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 1 неделя провокационной пробы+30 м.д. имидаклоприда | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 1 неделя провокационной пробы+50 м.д. имидаклоприда | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
* Две рыбы были удалены из этой группы обработки. Рыба 1: Длина тела рыбы по Смитту 316 мм, общая масса 452 г. Извлечены 3 взрослых самца и 6 взрослых самок. Рыба 2: Длина тела рыбы по Смитту 290мм, общая масса 379г. Извлечены 1 взрослый самец и 1 взрослая самка.
Показатель распространения инвазии вшей на всех стадий развития на рыбах, обследованных на 8-й неделе, не отличался между двумя контрольными группами и рыбами, получавших 10, 30 или 50 м.д. масс./об. имидаклоприда, через неделю после заражения. Однако, как указано выше, никаких вшей не было извлечено у рыб, которых подвергали обработке с помощью 10, 30 или 50 м.д. масс./об. имидаклоприда через 6 недель после введения провокационной пробы водяных вшей. Обработку считали на 100% эффективной во всех дозах обработки против вшей на подвижных стадиях развития паразита.
Не наблюдалось существенных различий в общей плотности популяции вшей у подвергнутых обработке рыб через неделю после проверочного заражения, по сравнению с контролем ДМСО; незначительная разница в плотности популяции вшей была отмечена при сравнении с контролем морской воды - ее не посчитали существенной. Аналогичным образом, наблюдались незначительные различия между плотностью популяции самцов вшей, извлеченных из подвергнутых обработке рыб через неделю после проверочного заражения, и контрольными группами. Существенных отличий не отмечено в плотности популяции яйцепроизводящих самок из подвергнутых обработке рыб через неделю после проверочного заражения, и контрольными группами.
Пример 2 - Оптимизация концентрации при обработке
2.1 Провокационная проба водяных вшей
120 лососевых рыб (Salmo salar) распределили в пяти проточных резервуарах для обработки и их акклиматизировали в течение 24 час до введения провокационной пробы паразитов.
Яйцеводы, извлеченные из яйцепроизводящих самок Lepeophtheirus salmonis, собирали и культивировали до получения инфекционных копеподитов. Копеподиты затем равномерно распределили в пяти бутылях, содержащих морскую воду, и оставили при ~10°C на ночь.
В процессе подготовки к проверочному заражению потоки воды в резервуарах для обработки остановили, а уровень освещенности снизили. 650 ± 20 копеподитов (~27 на хозяина) добавляли в статическую воду и содержали резервуары в полной темноте в течение 7 часов, после чего уровень освещенности повысили, а ток воды возобновили.
2.2 Исследование относительной эффективности
Рыб были случайным образом разделили на десять групп по десять рыб в каждой и содержали в статических "чаны для обработки", заполненных 30 л воды и имевших высокий уровень аэрации, как показано в таблице 3.
| Таблица 3 | ||||
| Группа | Концентрация имидаклоприда (мг/л) | Продолжительность обработки (мин) | Количество повторных экспериментов | Общее количество рыб в повторных экспериментах |
| 1 и 2 | 0 | 60 | 2 | 10 |
| 3 и 4 | 10 | 60 | 2 | 10 |
| 5 и 6 | 15 | 60 | 2 | 10 |
| 7 и 8 | 20 | 60 | 2 | 10 |
| 9 и 10 | 25 | 60 | 2 | 10 |
Восемь групп (3-10) подвергали обработке требуемыми концентрациями имидаклоприда в течение 60 мин: имидаклоприд растворяли в ДМСО и добавляли к ~1 л воды из резервуара перед добавлением в чаны для обработки. Оставшаяся группа и параллельный эксперимент (1 и 2) были контрольными группами ДМСО с концентрацией 0,03%.
Участвовавших в проведении эксперимента животные тщательно контролировались на наличие побочных реакций и состояния заражения паразитами. Там, где это было возможно, регистрировалось время, в течение которого, как считали, все паразиты отделились. Поскольку обработки проводились в статических системах, температуру и растворенный кислород регулярно контролировали в течение процедуры, а аэрацию регулировали по мере необходимости.
По окончании периода обработки подопытных животных извлекали из раствора для обработки и подвергали гуманной эвтаназии. Каждую рыбу взвесили, измерили и индивидуально оценили количество паразитов на ней. Количество паразитов в растворе для обработки также подсчитывали и качественно оценивали по следующим показателям: пол и зрелость, явные признаки отравления неоникотиноидом и/или потенциального выздоровления.
- Результаты
Общая доля вшей, удаленных при четырех концентрациях обработки 10, 15, 20 и 25 мг/л имидаклоприда в сочетании с ДМСО с концентрацией 0,03%, показана в таблице 4 и на фигуре 1 (n=2, t=60 мин, “усы” обозначают ± средняя квадратическая ошибка).
| Таблица 4 | |||||
| Группа | Концентрация имидаклоприд (мг/л) | Параллельный эксперимент | Первая выловленная рыба (минуты после добавления имидаклоприда) | Последняя выловленная рыба (минуты после добавления имидаклоприда) | Расчетное общее удаление паразитов (минуты после добавления имидаклоприда) |
| 1 | 0 | 1 | 60 | 65 | Не определено |
| 2 | 0 | 2 | 60 | 65 | Не определено |
| 3 | 10 | 1 | 60 | 65 | Не определено |
| 4 | 10 | 2 | 60 | 65 | 46 |
| 5 | 15 | 1 | 58 | 64 | 33 |
| 6 | 15 | 2 | 60 | 66 | 43 |
| 7 | 20 | 1 | 59 | 64 | 32 |
| 8 | 20 | 2 | 60 | 65 | 38 |
| 9 | 25 | 1 | 60 | 66 | 31 |
| 10 | 25 | 2 | 60 | 66 | 22 |
Все 4 дозировки обработки удалили 80-100% заражения паразитами при 60-минутной обработки.
Для сравнения удаления паразитов после обработки с помощью каждой концентрации использовали логистическую регрессию. Анализ логистической регрессии проводили с использованием функции обобщенной линейной модели в языке в R v. 2.13.0 и принимали биномиальное или квази-биномиальное распределение ошибок (определяемое путем сравнения нулевого отклонения со степенями свободы).
Было установлено, что удаление паразитов во всех случаях возможно при концентрациях обработки, значительно превышающих 0 мг/л (р<0,01). Хотя удаление значительно выше при 25 мг/л (97±3%), чем при 10 мг/л (80±11%) (р<0,05), не удалось определить никакой существенной разницы в эффективности между концентрациями, равными или превышающими 15 мг/л (92±4%) (р>0,4). Удаление паразитов, когда животных-хозяев подвергали обработке с помощью 20 мг/л, составило 92±7%. Таким образом, имидаклоприд эффективно удалял L. salmonis у его хозяина при всех испытанных концентрациях.
2.3 Исследование скорости удаления
Было замечено, что водяные вши, подвергнутые воздействию концентрации 10 мг/л имидаклоприда, дольше не покидают своего хозяина, по сравнению с теми, которые подвергались воздействию концентрации 30 мг/л.
Для количественной оценки взаимосвязи между концентрацией и временем, необходимым для проявления воздействия, двадцать животных-хозяев случайным образом распределяли для проведения обработки с концентрацией 10 или 20 мг/л имидаклоприда (10 рыб на каждую концентрацию). Организация и осуществление исследований по определению скорости была практически такой же, как при исследовании относительной эффективности, за исключением того, что рыбу извлекали из раствора для обработки и усыпляли сразу же, как только произошло полное удаление паразитов, тем самым минимизируя время проведения процедуры и связанные с этим проблемы качества жизни.
- Результаты
Обработка с использованием 10 мг/л и 20 мг/л имидаклоприда привела к полному отделению паразита от хозяев. Экспериментальные животные находились под пристальным наблюдением на протяжении всей процедуры, и время до полного очищения регистрировали с точностью до минуты. Наступление этого события представляло конечную точку эксперимента, и животных извлекали и подвергали эвтаназии в данный момент времени. Анализ выживаемости использован для определения того, отличалось ли значительно время очищения от паразита между дозами 10 мг/л и 20 мг/л. На фигуре 2 визуально представлены скорости в виде графика Каплана-Мейера, а критерий Кокса-Мантеля (логранговый критерий) определяет, что между ними нет существенной разницы (p=0,48, n=10, t ≤ 56 мин). Результаты показывают, что концентрация имидаклоприда не влияет на время очищения от паразитов и оценивает летальное время 50% (LT50) для обеих концентраций как равное ~27,5 мин.
Указанное исследование определило 15 мг/л как оптимальную концентрацию в пределах испытанного диапазона; статистически значимого повышения эффективности выше этой концентрации не наблюдалось. Кроме того, не удалось установить никакой зависимости между концентрацией и временем экспозиции, т. е. вероятность полного очищения от паразита для отдельного хозяина в любой момент времени (≤56 мин) существенно не отличалась ни при 10, ни при 20 мг/л имидаклоприда.
2.4 Восстановление водяных вшей
В точке отбора проб для исследования относительной эффективности (см. 2.2) ряд паразитов оставался прикрепленным к своим хозяевам (20% тех, кто подвергался воздействию 10 мг/л, 8% тех, кто подвергался воздействию 15 и 20 мг/л, и 3% тех, кто подвергался воздействию 25 мг/л).
Подвергнутые действию имидаклоприда паразиты, как в исследованиях относительной эффективности, так и в исследованиях по определению скорости (как те, которых отдалили вручную от их хозяина после обработки, так и те, которые отделились сами в процессе обработки), поместили в чистую морскую воду и наблюдали за признаками восстановления.
Во время первого наблюдения было установлено, что подвергшиеся воздействию индивидуальные особи были либо мертвы, либо все еще активны. У тех, которые все еще был активны, мышечное возбуждение было нескоординированным, неконтролируемым и ограниченным. Указанные особи были явно неспособны выполнять свои основные функции (прикрепление к хозяину и целенаправленное движение), что позволяет предположить, что паразиты, которые оставались прикрепленными к хозяину после обработки, могли впоследствии отделиться под действием напорного потока.
В течение времени после экспозиции (вплоть до 6 часов) ни у одного из паразитов, подвергшихся воздействию имидаклоприда в любой концентрации, не было отмечено явных признаков функционального восстановления.
Пример 3 - Устранение заражения водяными вшами в судне с живорыбными садками
Подлежащую обработке лосось помещали в стандартный рыборазводный садок, затем перекачивался в насыщаемый кислородом садок судна с живорыбными садками таким образом, чтобы плотность рыбы в каждом садке была равна 90 или 120 кг на кубический метр воды. Предварительно смешанный имидаклоприд добавляли в садок с дозой 20 м.д. масс./об. Затем рыбу обрабатывали в течение 60 мин. В конце периода обработки рыбу перекачивали из садка и обезвоживали для того, чтобы использованная для обработки вода возвратилась в садок. Для этого рыбу пропускали над сетью или преграждающими барьерами, а также промывали не подвергнутой обработке морской водой для удаления любых остатков используемой для обработки воды с внешней поверхности рыб перед тем, как рыб возвратят в морской загон. Всю использованную для промывки воду сохраняли после использования.
Воду пропускали через сетчатый фильтр с размером ячеек приблизительно 50 мкм или приблизительно 150 мкм для удаления органических веществ, включая отмирающих и мертвых водяных вшей и их яйцеводы.
Пример 4 - Обработка L. salmonis и водяных вшей видов Caligus в природных условиях
Эффективность имидаклоприда против заражения предвзрослыми и взрослыми стадиями L. salmonis и Caligus sp. выращиваемого на фермах атлантического лосося исследовали путем подсчета количества водяных вшей до и после обработки лосося, проходящего лечение с помощью имидаклоприда. Указанное исследование проводили на коммерческой лососевой ферме в Норвегии. Лосось закачивали на судно с живорыбными садками и подвергали воздействию 20 м.д. имидаклоприда в течение 60 мин. Средняя масса лосося составляла 3,5 кг, а среднее количество лосося в загоне - 180000. 30 рыб в загоне оценивали на наличие L. salmonis и Caligus sp. и регистрировали количество каждой из обнаруженных стадий жизни L. salmonis. Сказанное осуществляли за 24 час до обработки и в течение 24 час после обработки.
Указанные испытания проведены в общей сложности в четырех загонах для выращивания лосося. Перед обработкой рыбу загоняли в загон, чтобы ее можно было закачать на судно с живорыбными садками, где проводилась предварительная обработка водяными вшами. Оценку состояния водяных вшей после обработки проводили путем удаления рыбы из сливной трубы судна с живорыбными садками.
Во все контрольные моменты времени 3 рыбы извлекали и помещали в ванну с анестезирующим средством. Указанную процедуру повторяли 10 раз, пока не было проведена оценка 30 рыб.
Количество водяных вшей, наблюдаемых на рыбах в этом испытании для каждого из четырех исследованных загонов в соответствии с состоянием жизненного цикла водяных вшей, до или после назначения активного вещества, приведено в таблице 5. Все рыбы проходили наблюдение в течение периода обработки, и неблагоприятное поведение не обнаружено.
| Таблица 5 - Количество водяных вшей до и после обработки | ||||||||
| Загон A | Загон B | Загон C | Загон D | |||||
| Стадия | До | После | До | После | До | После | До | После |
| Халимус | 1,2 | 0,5 | 0,2 | 0,0 | 0,1 | 0,0 | 0,0 | 0,0 |
| Предвзрослые самцы | 1,8 | 0,0 | 0,4 | 0,0 | 0,0 | 0,0 | 0,0 | 0,0 |
| Предвзрослые самки | 1,9 | 0,0 | 1,1 | 0,0 | 0,4 | 0,0 | 0,6 | 0,0 |
| Взрослые самцы | 0,9 | 0,0 | 1,0 | 0,0 | 1,7 | 0,0 | 0,8 | 0,0 |
| Взрослые самки | 2,0 | 0,0 | 0,8 | 0,0 | 1,0 | 0,0 | 0,8 | 0,0 |
| Яйцепроизводящие самки | 0,5 | 0,0 | 0,4 | 0,0 | 0,4 | 0,0 | 0,3 | 0,0 |
| Всего | 8,3 | 0,0 | 4,0 | 0,0 | 3,6 | 0,0 | 2,5 | 0,0 |
| Caligus | 2,9 | 0,0 | 0,7 | 0,1 | 3,0 | 0,0 | 0,5 | 0,0 |
Таким образом, обработка имидаклопридом эффективна в природных условиях против L. salmonis и водяных вшей Caligus sp.
Пример 5 - Временные рамки действия имидаклоприда против водяных вшей
С целью определения временных рамок действия имидаклоприда, лососей, зараженный предвзрослыми и взрослыми водяными вшами, извлекали из резервуара-хранилища и убивали резким ударом по голове. Рыб подвешивали в 30 литрах воды в присутствии 0, 20, 50, 100, 200 или 500 м.д. имидаклоприда, и наблюдали за водяными вшами в течение 30-60 мин, чтобы контролировать, покидали ли они хозяина и когда.
Для рыб, подвергнутых воздействию 0 м.д. имидаклоприда (отрицательный контроль), наблюдения проводили в течение 60 мин. За исключением одной рыбы, подвергнутой воздействию 500 м.д. имидаклоприда, которую отслеживали в течение 60 мин, за всеми другими подвергнутыми обработке рыбами наблюдали в течение 30 мин. Исследования проводили на трех рыбах из каждой группы обработки.
Регистрировали наблюдения за временем, когда вши покидали хозяина, а также пол и стадию водяной вши. Любых вшей, которые покидали хозяина, немедленно перемещали в чистую морскую воду. Кроме того, от хозяина отделяли любых вшей, оставшихся на хозяине в конце периода экспозиции и перемещали в чистую морскую воду.
Вшей наблюдали как вскоре после периода экспозиции, так и приблизительно через 2 часа после окончания периода экспозиции.
Соотношение самцов и самок водяных вшей было приблизительно 50:50. Температура воды была приблизительно 12°С.
Вши на мертвой рыбе, содержавшейся в не подвергнутой обработке морской воде, не покидали хозяина в течение шестидесятиминутного наблюдения и демонстрировали нормальное движение после переноса в чашки Петри. Указанное движение включало плавание и типичное, контролируемое движение придатков.
Вскоре после введения имидаклоприда вши претерпевали два заметных изменения: во-первых, боковые края панциря втягивались внутрь, придавая вшам горбатый вид, и при этом нижнюю сторона вшей приподнималась в сторону от рыбы, а во-вторых, брюшко пораженных особей приподнималось под углом приблизительно 45° относительно поверхности рыбы.
Прежде чем покинуть хозяина, вши обычно становились очень активными, перемещаясь по поверхности рыбы, часто по кругу. Как только они покидали рыбу, они двигались по широкой спирали вниз, а затем оставались неподвижными на дне испытательного резервуара.
В группах, подвергавшихся воздействию имидаклоприда в диапазоне от 20 до 200 м.д., приблизительно 50% вшей покинули хозяина в течение первых 15 мин. У рыб, подвергшихся воздействию 500 м.д. имидаклоприда, приблизительно 70% вшей покинули хозяина в течение первых 9 мин. Оставшиеся вши оставались на хозяине до конца периода экспозиции. Вши на хозяине подверглись боковому сжатию панциря во время обработки, что придавало вшам горбатый вид.
Таким образом, большинство водяных вшей оставляли подвергнутого обработке хозяина в течение 15 мин.
Самцы вшей заметно быстрее оставляли хозяина, по сравнению с самками. У вшей, подвергшихся воздействию имидаклоприда, обычно наблюдалась полная потеря подвижности и быстрое подергивание придатков. Самки вшей показали меньше движений придатков, по сравнению с самцами, но продемонстрировали перистальтические движения брюшка по сравнению с самцами.
- Наблюдения за вшами вне хозяина (в чистой морской воде)
Отрицательный контроль - Вши, не подвергшиеся воздействию имидаклоприда, показали поведение, типичное для вшей, удаленных от их хозяина. Оно включало активное плавание и перистальтические движения брюшка. Движения придатков считались методичными и контролируемыми. Вши реагировали на физические раздражители, активно удаляясь прочь.
20 м.д. -Из 49 вшей, подвергнутых воздействию 20 мг/л имидаклоприда, двоих посчитали мертвыми через 30 мин после экспозиции (р.е.). При прикосновении к ним набором пинцетов вши падали со стенок чашки Петри, переворачивались и проплывали небольшое расстояние. Однако плавание было неустойчивым и вероятно было вызвано чрезмерным движением большинства придатков. Оставшиеся вши считались умирающими, поскольку у них наблюдалось быстрое подергивание их придатков, включая лапки, вторую пару максилл и основные щупальца. Перистальтика брюшка отмечена у самок, подвергавшихся воздействию 20 м.д. имидаклоприда в течение 30 мин. Двенадцать из 49 были признаны живыми и быстро реагирующими, они активно плавали без раздражающего воздействия. Ни одна из вшей, подвергнутых воздействию в течение 30 мин, не показала признаков восстановления.
50 м.д. -Из 21 вши, подвергнутых воздействию 50 м.д. имидаклоприда, четверо считались мертвыми по истечении 30 мин. У оставшихся вшей отмечено подергивание крупных придатков, за исключением перистальтики, которая отмечалась у двух взрослых самок, подвергавшихся воздействию в течение 30 мин. 14 вшей, которых обследовали через 2 часа р.е., считались мертвыми без признаков движения. У двух особей подергивались лапки, а у четырех взрослых самок наблюдалось перистальтическое движение брюшка.
100 м.д. -Из 28 вшей, подвергнутых воздействию 100 м.д. имидаклоприда, четверо считались мертвыми в конце времени экспозиции. У вшей обычно подергивались вторые щупальца и вторая пара максилл. Еще у 11 вшей наблюдались перистальтические движения брюшка. У ряда особей отмечено боковое сжатие панциря. Через 2 час p.е. 17 из 28 вшей считались мертвыми. Перистальтическое движение брюшка отмечено у 9 из 28 вшей через 2 час р.е.; все они оказались взрослыми самками. Наконец, щупальце одной вши и лапка 4 другой вши показали ограниченные подергивания через 2 час р.е.
200 м.д. -Из 26 вшей, подвергнутых воздействию 200 м.д. имидаклоприда, четверо считались мертвыми в конце времени экспозиции. Остальные вши, как правило, были неподвижны, если не считать подергивания вторых щупалец, а перистальтическое движение брюшка было отмечено у четырех взрослых самок вшей. Подергивание заднего прохода одной вши отмечалось через 30 мин p.е. Шесть вшей считались мертвыми через 2 час после экспозиции. Кроме того, ограниченное подергивание было зарегистрировано у остальных особей и состояло в основном из подергивания основных и вторых щупалец и перистальтики брюшка у 3 взрослых самок.
500 м.д. -Шесть из 20 вшей считались мертвыми 30 мин р.е. Из них двое зарегистрированы как показывающие перистальтику брюшка или незначительные подергивания по прошествии 2 час. Для остальных вшей, которых обследовали через 30 мин p.е., были характерны быстрые подергивания основных и вторых щупалец, с некоторым подергиванием челюстных ног и перистальтическим движением брюшка у 4 особей. Через 2 час после экспозиции 15 из 20 вшей считались мертвыми. У трех вшей наблюдалось подергивание вторых щупалец, у двух - перистальтика брюшка.
Пример 6 - Сравнение с азаметифосом и дельтаметрином на изолированных водяных вшах
Использовали особей обоих полов как на предвзрослых, так взрослых стадиях (подвижных стадиях) развития, и их равномерно распределили между группами. Водяных вшей подвергали действию имидаклоприд в течение 60 мин, азаметифоса в течение 60 мин и дельтаметрина в течение 30 мин в ванне емкостью один литр в диапазоне концентраций (таблицы 6, 7 и 8). После обработки водяных вшей переносили в чистую аэрированную морскую воду. Температура морской воды во время эксперимента была 12°C, но во время экспозиции температура повысилась приблизительно до 14°C при режимах экспозиции 60 мин. (имидаклоприд и азаметифос) и до 13°C для режима экспозиции 30 мин (дельтаметрин).
Количество живых и иммобилизованных (включая убитых) вшей в каждом режиме регистрировали приблизительно через 20 час после окончания воздействия. Каждую вошь исследовали индивидуально.
Пропорциональный эффект имидаклоприда, азаметифоса и дельтаметрина в данном испытании in vitro приведен в таблицах 6, 7 и 8.
| Таблица 6 - Влияние имидаклоприда на водяных вшей | |||
| Доза (м.д.) | Живые | Неподвижные | % эффект |
| 9 | 0 | 0 | |
| 0 | 11 | 0 | 0 |
| 5 | 7 | 3 | 30 |
| 5 | 7 | 3 | 30 |
| 10 | 5 | 5 | 50 |
| 10 | 6 | 4 | 40 |
| 15 | 0 | 10 | 100 |
| 15 | 0 | 10 | 100 |
| 20 | 0 | 10 | 100 |
| 20 | 0 | 10 | 100 |
| 30 | 0 | 10 | 100 |
| 30 | 0 | 10 | 100 |
| Таблица 7 - Влияние азаметифоса на водяных вшей | |||
| Доза (м.д.) | Живые | Неподвижные | % эффект |
| 0 | 11 | 0 | 0 |
| 0 | 11 | 0 | 0 |
| 5 | 10 | 0 | 0 |
| 5 | 10 | 0 | 0 |
| 10 | 9 | 1 | 10 |
| 10 | 9 | 1 | 10 |
| 15 | 10 | 0 | 0 |
| 15 | 10 | 0 | 0 |
| 20 | 9 | 1 | 10 |
| 20 | 8 | 2 | 20 |
| 30 | 9 | 1 | 10 |
| 30 | 6 | 4 | 40 |
| Таблица 8 - Влияние дельтаметрина на водяных вшей | |||
| Доза (м.д.) | Живые | Неподвижные | % эффект |
| 0 | 10 | 0 | 0 |
| 0 | 11 | 0 | 0 |
| 5 | 10 | 0 | 0 |
| 5 | 10 | 0 | 0 |
| 10 | 10 | 0 | 0 |
| 10 | 9 | 2 | 18,2 |
| 15 | 8 | 2 | 20 |
| 15 | 9 | 1 | 10 |
| 20 | 8 | 2 | 20 |
| 20 | 9 | 1 | 10 |
| 30 | 10 | 1 | 9.1 |
| 30 | 8 | 2 | 20 |
Оценочная величина EC50 для имидаклоприда равна 7,6 м.д., а оценочная величина EC90 для имидаклоприда равна 14,4 м.д. Значения EC50 и EC90 для азаметифоса и дельтаметрина не рассчитывались.
Пример 7 - Зависимость обработки с использованием имидаклоприда in vivo от концентрации и времени
Для определения зависимости обработки с использованием имидаклоприда in vivo от концентрации и времени атлантическому лососю (средняя масса 320,9 г) назначали имидаклоприд, добавляя его в морскую воду (соленость 32,5‰) при температуре 12°С. Во время введения активного вещества уровень воды в резервуаре понижали и применяли аэрацию. Культуру копеподитов лососевых вшей подсчитывали и корректировали, чтобы получить заданный уровень приблизительно 40 копеподитов на рыбу в резервуаре для проведения проверочного заражения в каждый момент времени введения провокационной пробы.
Лососевых вшей на рыбе подсчитывали стандартными методами. Исследовали только вшей на внешней поверхности рыбы, исключая жабры и полости рта/щек.
Регистрировали количество отделившихся вшей в воде резервуара или вшей, прикрепленных к стенкам резервуара. Вшей в резервуаре с водой собирали и оценивали их способность прикрепляться путем присасывания к гладкой пластиковой поверхности сразу после обработки и вновь через 30-60 мин (для оценки возможного оживления). Живых и жизнеспособных вшей также собирали из контрольных групп, подвергнутых обработке имитаторами активного агента, с целью сравнения, и содержали в камерах для оживления в течение того же периода времени, чтобы оценить возможности системы.
Поведение/внешний вид рыб оценивали in vivo во время проведения каждого теста. Регистрировались любые изменения в поведении и/или внешнем виде, включая смертность. В ходе исследования ни одна рыба не погибла, и вскрытие не проводилось.
Тестируемые растворы активного вещества готовили (добавляли и гомогенизировали в морской воде) и вводили в обрабатываемый объем 40 литров.
Три зараженные водяными вшами рыбы из резервуара были случайным образом отобраны и аккуратно помещены в бочку, образующую внутренний отсек (диаметр=34,5-40 см; высота = 54 см), которую погружали в резервуар и в ней основание было заменено пластиковым сетчатым экраном с квадратными отверстиями площадью 9 мм2.
Рыбу перемещали во внутренний отсек в течение 3 мин после начала каждого испытания. Внутренний отсек подвешивали/погружали в резервуар в ожидании обработки. Обработки и имитации обработок осуществлялись путем слива воды из внутреннего отсека с рыбой и переноса его в бочку, содержащую исследуемый раствор. Обработки/имитации обработок проводили в статической воде с аэрацией/насыщением кислородом. Аэрацию регулировали таким образом, чтобы насыщение кислородом было на уровне 70-100%.
Для прекращения обработки внутренний отсек с подвергнутой обработке рыбой поднимали на поверхность и сливали воду, затем рыбу без воды сразу же переносили во второй чан с летальной дозой анестезирующего средства и оставляли до тех пор, пока рыбы не умирали. Были зарегистрированы все вши, оставшиеся на указанных рыбах, и вши, которые упали в ванну с анестезирующим средством.
Оставшихся вшей в ванне для обработки процеживали через планктонную сетку (размер пор 2 мм), которую опускали в ванну с чистой морской водой. Вшей в этом накопителе переносили в пластиковый стакан (емкостью 1 литр), а затем снова в камеру для оживления (диаметр 5 см; длина 10 см). Вши, которые способны прикрепляться к стенкам сосудов для обработки или к стенкам стакана в течение 3 мин после завершения каждого испытания, были оценены как жизнеспособные. Вши, которые не прикреплялись к стенке, исследовались в течение 30-60 мин в камере для оживления. Подсчитывали в отдельных категориях количество вшей, которые оказались жизнеспособными в камерах для оживления после 30-60 мин, и количество вшей, которые оказались не жизнеспособными.
Контрольные эксперименты с имитацией обработок осуществляли аналогичным образом.
На каждой рыбе до обработки было в среднем по 11 вшей. Время экспозиции имидаклоприда было от 3 до 60 мин, а диапазон доз был от 20 м.д. до 200 м.д.
Ни одна рыба не погибла при проведении испытаний.
Таблица 9 показывает процент вшей, удаленных у рыб при обработке имидаклопридом.
| Таблица 9 - Результаты обработки в ванне с использованием имидаклоприда | |||||
| Доза (м.д.) | Продолжительность обработки (минуты) | ||||
| 3 | 5 | 15 | 30 | 60 | |
| 0 (контроль) | 024/016 | - | - | - | 018/7,323 |
| 20 | - | - | - | 63,936 | 74,127 |
| 50 | - | - | - | 91,323 | - |
| 100 | 7,043 | - | 73,738 | - | - |
| 200 | - | 55,934 | 91,547 | - | - |
В таблице 9 показан процент вшей, удаленных из рыбы после обработки, по отношению к общему количеству вшей. Данные отрицательных контрольных групп для 3-й и 60-й минут получены из двух параллельных экспериментов. Надстрочные числа обозначают общее количество вшей на 3 рыбах в каждом тесте.
Таким образом, имидаклоприд был эффективен для удаления вшей в течение испытанных периодов обработки.
Таблица 10 показывает процент водяных вшей, которые отделились от рыбы в результате обработки, и водяных вшей, оставшихся прикрепленными во время обработки, но впоследствии собранных, которые оставались активными через 30-60 мин после обработки.
| Таблица 10 - Показатели оживления водяных вшей | ||||
| Режим испытаний | % вшей, которые были активны через 30-60 мин после обработки | |||
| Отделившиеся вши, которые были собраны из чана с водой | Присоединившиеся вши, собранные у рыб | |||
| Количество вшей | % активных | Количество вшей | % активных | |
| Контроль 3 мин | 0 | Не определено | 0 | Не определено |
| Контроль 3 мин | 0 | Не определено | 26 | 7,7 |
| Контроль 60 мин | 0 | Не определено | 0 | Не определено |
| Контроль 60 мин | 3 | 0,0 | 16 | 50,0 |
| Имидаклоприд 20 м.д. 30 мин |
23 | 4,3 | 9 | 11,1 |
| Имидаклоприд 20 м.д. 60 мин |
20 | 0,0 | 0 | Не определено |
| Имидаклоприд 50 м.д. 30 мин |
31 | 0,0 | 0 | Не определено |
| Имидаклоприд 100 м.д. 3 мин |
3 | 33,3 | 0 | Не определено |
| Имидаклоприд 100 м.д. 15 мин |
28 | 0,0 | 0 | Не определено |
| Имидаклоприд 200 м.д. 5 мин |
13 | 0,0 | 13 | 0,0 |
| Имидаклоприд 200 м.д. 15 мин |
43 | 0,0 | 0 | Не определено |
Таким образом, водяные вши реагировали на имидаклоприд, отделяясь от рыбы. Некоторые из подвергнутых обработке водяных вшей сохраняли жизнеспособность. Потенциально жизнеспособные отделившиеся (и мертвые) водяные вши удаляли путем фильтрации воды, использованной для обработки.Для сравнения, рыбу, зараженную водяными вшами из тех же источников, подвергли обработке с помощью азаметифоса с концентрацией 0,1 мг/л и дельтаметрина с концентрацией 0,2 мкл/л в течение 30 мин в рекомендуемых режимах дозирования. Обработки осуществляли в тех же условиях, что и обработку имидаклопридом. Был также осуществлен контроль путем имитации обработок. Каждое из условий обработки повторяли дважды. Результаты данного сравнительного исследования приведены в таблице 11.
| Таблица 11 - Результаты обработки в ванне с использованием азаметифоса и дельтаметрина | |
| Соединение | % удаления |
| Контроль 1 | 029 |
| Контроль 2 | 042 |
| Дельтаметрин 1 | 037 |
| Дельтаметрин 2 | 037 |
| Азаметифос 1 | 3,852 |
| Азаметифос 2 | 3,033 |
В таблице 11 приведен процент вшей, удаленных из рыбы после обработки, по отношению к общему количеству вшей. Надстрочные числа обозначают общее количество вшей на 3 рыбах в каждом тесте.
Таким образом, водяные вши в основном оставались прикрепленными к рыбе в ответ на действие дельтаметрина или азаметифоса, в отличие от эффекта, наблюдаемого при использовании имидаклоприда, под действием которого водяные вши отделялись от рыбы.
Пример 8 - Безопасность имидаклоприда
Проведена оценка безопасности применения имидаклоприда для рыб. Рыбы, находившиеся в проточном резервуаре, содержащем 271,8 л морской воды, подвергались воздействию 65 м.д. масс./об. активного ингредиента имидаклоприда. 17,67 г имидаклоприда растворяли в 100 мл диметилсульфоксида (ДМСО) и полученный раствор добавляли приблизительно к 900 мл морской воды и перемешивали. Поток в резервуаре отключали и добавляли раствор имидаклоприда.
Рыб подвергали воздействию 65 м.д. имидаклоприда в статической воде в течение 1 час и наблюдали за поведенческими изменениями с интервалами 5-10 мин. Затем рыбу выдерживали еще в течение 7 дней, после чего обработку прекращали. За время экспозиции не было отмечено заметных изменений в поведении рыб. За рыбой наблюдали еще в течение 7 дней, и никаких побочных реакций не отмечено. По окончании обработки внешних патологий не обнаружено.
1. Способ удаления эктопаразитов у рыбы в воде, включающий:
i) введение рыбе неоникотиноида для удаления эктопаразитов у рыбы; и
(ii) замена воды, содержащей удаленные эктопаразиты, замещающей водой, при этом разделяют удаленных эктопаразитов и рыбу,
где неоникотиноид не составлен в виде композиции, предназначенной для введения в корм.
2. Способ по п. 1, где эктопаразит находится в подвижной стадии жизненного цикла.
3. Способ по п. 1, где эктопаразит находится в неподвижной стадии жизненного цикла.
4. Способ по любому из предшествующих пунктов, где неоникотиноид вводят рыбе в концентрации 1-500 ч./млн, 1-200 ч./млн, 20-200 ч./млн, 1-64 ч./млн, 10-64 ч./млн, 10-50 ч./млн, 50 ч./млн или больше, 100 ч./млн или больше, или 200 ч./млн масс./об. или больше.
5. Способ по любому из пп. 1-3, где неоникотиноид назначают рыбе в концентрации 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 64, 100, 200, 200 или 500 ч./млн масс./об.
6. Способ по п. 5, где неоникотиноид вводят рыбе в концентрации 15 ч./млн масс./об.
7. Способ по п. 5, где неоникотиноид вводят рыбе в концентрации 20 ч./млн масс./об.
8. Способ по любому из предшествующих пунктов, где неоникотиноид применяют в течение периода времени, достаточного для удаления 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% или всех эктопаразитов у рыбы.
9. Способ по любому из предшествующих пунктов, где неоникотиноид применяют в течение 180 мин или меньше, 120 мин или меньше, 60 мин или меньше, меньше чем 30 мин, меньше чем 20 мин, 15 мин или меньше, меньше чем 10 мин или 5 мин или меньше.
10. Способ по любому из предшествующих пунктов, где рыба представляет собой лосось, форель, озерную форель или рыбу-чистильщика.
11. Способ по любому из предшествующих пунктов, где неоникотиноид применяют в сублетальной дозе и/или в течение сублетального времени.
12. Способ по любому из пп. 1-10, где неоникотиноид применяют в летальной дозе и/или в течение летального времени.
13. Способ по любому из предшествующих пунктов, где неоникотиноид применяют при температуре 4-18°C, 4-16°C, 5-15°C, 10-14°C или 12-14°C.
14. Способ по любому из предшествующих пунктов, где неоникотиноид является единственным вводимым эктопаразитицидом.
15. Способ по любому из предшествующих пунктов, где неоникотиноид представляет собой имидаклоприд, ацетамиприд, клотианидин, нитенпирам, нитиазин, тиаклоприд или тиаметоксам или их фармацевтически эффективные соли или сложные эфиры.
16. Способ по п. 15, где неоникотиноидом является имидаклоприд или его фармацевтически эффективные соли или сложные эфиры.
17. Способ по любому из предшествующих пунктов, где указанный способ дополнительно включает стадию:
iii) предотвращение высвобождения удаленных эктопаразитов в окружающую среду.
18. Способ по п. 17, где предотвращение высвобождения удаленных эктопаразитов включает сбор эктопаразитов из образца воды, содержащей удаленные эктопаразиты.
19. Способ по п. 18, где собирание эктопаразитов из образца воды включает пропускание указанного образца через сетчатый фильтр.
20. Способ по п. 19, где указанный сетчатый фильтр имеет размер ячеек, равный, по крайней мере, 60 мкм или, по крайней мере, 150 мкм.
21. Способ по любому из предшествующих пунктов, где указанный эктопаразит представляет собой водяную вошь.
22. Способ по любому из предшествующих пунктов, дополнительно включающий уничтожение удаленных эктопаразитов, которые остаются живыми, после необязательно концентрирование эктопаразитов.
23. Способ по п. 22, где оставшихся в живых эктопаразитов уничтожают необязательно путем применения эктопаразитицида.
24. Неоникотиноид для применения при лечении заражения эктопаразитами у рыб в воде,
где после удаления эктопаразитов из рыбы, воду, содержащую удаленных эктопаразитов, заменяют замещающей водой, отделяя таким образом удаленных эктопаразитов от рыбы,
где указанный неоникотиноид вводят рыбе в течение 180 мин или меньше, 120 мин или меньше, 60 мин или меньше, меньше чем 30 мин, меньше чем 20 мин, 15 мин или меньше, меньше чем 10 мин или 5 мин или меньше,
где неоникотиноид не составлен в виде композиции, предназначенной для введения в корм.
25. Неоникотиноид для применения по п. 24, где эктопаразит находится в подвижной стадии жизненного цикла.
26. Неоникотиноид для применения по п. 24, где эктопаразит находится в неподвижной стадии жизненного цикла.
27. Неоникотиноид для применения по любому из пп. 24-26, где указанный неоникотиноид вводят рыбе в концентрации 1-500 ч./млн, 1-200 ч./млн, 20-200 ч./млн, 1-64 ч./млн, 10-64 ч./млн, 10-50 ч./млн, 50 ч./млнили больше, 100 ч./млн или больше или 200 ч./млн масс./об. или больше.
28. Неоникотиноид для применения по любому из пп. 24-27, где указанный неоникотиноид назначают рыбе в концентрации 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 64, 100, 200 или 500 ч./млн масс./об.
29. Неоникотиноид для применения по любому из пп. 24-28, где указанный неоникотиноид вводят рыбе в концентрации 15 ч./млн масс./об.
30. Неоникотиноид для применения по любому из пп. 24-28, где указанный неоникотиноид вводят рыбе в концентрации 20 ч./млн масс./об.
31. Неоникотиноид для применения по любому из пп. 24-30, где эктопаразитом является водяная вошь.
32. Неоникотиноид для применения по любому из пп. 24-31, где указанной рыбой является лосось, форель, озерная форель или рыба-чистильщик.
33. Неоникотиноид для применения по любому из пп. 24-32, где указанный неоникотиноид представляет собой имидаклоприд, ацетамиприд, клотианидин, нитенпирам, нитиазин, тиаклоприд или тиаметоксам или их фармацевтически эффективные соли или сложные эфиры.
34. Неоникотиноид для применения по п. 33, где указанным неоникотиноидом является имидаклоприд или его фармацевтически эффективные соли или сложные эфиры.
35. Неоникотиноид для применения по любому из пп. 24-34, где указанный неоникотиноид применяют в сублетальной дозе и/или в течение сублетального времени.
36. Неоникотиноид для применения по любому из пп. 24-34, где указанный неоникотиноид применяют в летальной дозе и/или в течение летального времени.
37. Неоникотиноид для применения по любому из пп. 24-36, где указанный неоникотиноид применяют при температуре 4-18°С, 4-16°С, 5-15°С, 10-14°С или 12-14°С.
38. Композиция для применения при лечении заражения рыб эктопаразитами, содержащая один или несколько эктопаразитицидов, где один из одного или из нескольких эктопаразитицидов представляет собой неоникотиноид для применения по любому из предшествующих пунктов.
39. Композиция для применения по п. 38, где указанная композиция содержит один эктопаразитицид.
