Способ получения композиционного препарата папаина и альгината натрия в виде густого раствора

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения композиционного препарата папаина и альгината натрия в виде густого раствора, включающий иммобилизацию ферментного препарата папаина в буферном растворе с носителем, инкубирование при комнатной температуре в течение 2 часов и промывку. Иммобилизацию папаина проводят путем комплексообразования в густой раствор альгината натрия в соотношении 10 мл раствора папаина в концентрации 20 мг/мл, полученного растворением в буфере, на 1 г сухого альгината натрия, предварительно растворенного в 10 мл буфера, при постоянном перемешивании со скоростью 250 об/мин. В качестве буферного раствора используют 0,05 М фосфатный буфер с рН 6,5, содержащий цистеин в концентрации 0,04 М. Образовавшийся препарат промывают с помощью диализа в течение 8 часов, после чего буфер меняют на порцию свежего в объеме 400 мл и продолжают диализ еще в течение 16 часов до отсутствия в промывном растворе свободного папаина. Предложенный способ прост в исполнении, не требует предварительной активации носителя и обеспечивает получение композиционного препарата иммобилизованного папаина и альгината натрия в виде густого раствора, включающего только иммобилизованный папаин и полностью отмытого от его нестабилизированной формы. 3 ил.

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в химико-фармацевтической промышленности, медицинской практике, косметологии и исследовательских целях. Изобретение может применяться при создании гибридных лекарственных препаратов в виде густых растворов ранозаживляющего и противоожогового назначения.

Папаин (КФ 3.4.22.2) - протеолитический фермент растительного происхождения класса гидролаз, выделенный из плодов дынного дерева Carica papaya. Его молекулярная масса составляет 23 кДа. Папаин имеет высокую активность в кислых, нейтральных и щелочных средах, в широком диапазоне температур. Изоэлектрическая точка фермента равна 8,75. Папаин применяется во многих отраслях народного хозяйства, таких как пищевая, фармацевтическая промышленности и др. Он используется при лечении воспалений, отеков, аллергий, а также для улучшения пищеварения [Holyavka М., Pankova S., Koroleva V. et al. Influence of UV radiation on molecular structure and catalytic activity of free and immobilized bromelain, ficin and papain // Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. - 2019. V. 201. - P. 111681]. Папаин обладает ранозаживляющими свойствами, антибактериальной активностью и проявляет ингибирующее действие на активацию тромбоцитов и образование моноцитарно-тромбоцитарных агрегатов, снижает степень проявления атеросклероза и перитонеального энтерита [Y.M. Kang, Н.А. Kang, D.C. Cominguez et al. Papain Ameliorates Lipid Accumulation and inflammation in High-Fat Diet-Induced Obesity Mice and 3T3-L1 Adipocytes via AMPK Activation // International Journal of Molecular Sciences. - 2021. V. 22. - P. 16].

Ферменты - это биологические катализаторы, которые ускоряют химические реакции за счет снижения энергии активации. Применение растворов ферментов в ряде отраслей промышленности является дорогостоящим, возможны трудности для повторного использования. Кроме того, энзимы могут иметь нестабильную молекулярную структуру, чувствительную к нефизиологическим температурам и значениям рН среды [Попова Т.Н., Рахманова Т.И., Попов С.С. Медицинская энзимология // Учебное пособие, Воронеж: Издательство ВГУ. - 2008. - С. 64]. Наиболее успешным и эффективным способом преодоления этих проблем является комплексообразование ферментов с различными полимерными носителями. Комплексообразование повышает устойчивость фермента к изменениям окружающей среды, сводит к минимуму или предотвращает загрязнение продукта катализатором и снижает эффекты ингибирования. Кроме того, становится возможным отделять ферменты от реакционных сред для повторного использования, поэтому возможно более экономичное их применение [Z. Ashkan, R. Hemmati, A. Homaei Immobilization of enzymes on nanoinorganic support materials: An update// International Journal of Biological Macromolecules. - 2021. V. 168. - P. 708-721].

Альгинат натрия представляет собой водорастворимый нейтральный линейный полисахарид. Молекулярная масса колеблется от 12 до 18 кДа. Он нетоксичен, биосовместим, биоразлагаем и неиммуногенен, обладает свойствами стабилизирующего характера, высокой вязкостью в воде и способностью к гелеобразованию. Альгикат натрия используется для различных биомедицинских целей, среди которых наиболее перспективными являются доставка лекарств, доставка генов, перевязка ран и их заживление [A. Ahmad, N.M. Mubarak, F.T. Jannat et al. A Critical Review on the Synthesis of Natural Sodium Alginate Based Composite Materials: An Innovative Biological Polymer for Biomedical Delivery Applications // Processes. - 2021. V. 9. - Р.27].

Известно применение альгината натрия в косметологии в виде масок для лица, которые оказывают многочисленные косметические эффекты: обладают лифтинговым, моделирующим, заживляющим эффектом, оказывают дренажное действие, улучшая отток крови и лимфы, способствуют рассасыванию застойных пятен, стабилизируют водно-жировые процессы. Альгинатная маска является сильным сорбентом: поглощая влагу с поверхности кожи, она пластифицируется и удаляется вместе с вредными веществами, обеспечивая мощную «расшлаковку» [Патент RU 2 715 231 С1, МПК A61K 8/14, A61K 9/127, А61Р 17/18, опубл. 26.02.2020, Бюл. №6].

Существует способ получения гетерогенного препарата на основе папаина, обладающего регенерационными свойствами [Патент RU 2677873 С2, МПК A61K 38/48, A61K 47/30, А61Р 17/02, опубл. 22.01.2019, Бюл. №3], включающий обработку матрицы ионообменных волокон ВИОН АН-1 или ВИОН КН-1 раствором папаина, инкубирование, отличающийся тем, что для иммобилизации на ВИОН КН-1 используют 0,2 М ацетатный буфер (рН 4,5-5,5) или 0,05 М боратный буфер с добавлением KCl (рН 9,0-9,5), а для иммобилизации на ВИОН АН-1 - 0,05 М трис-глициновый (рН 9,0) или 0,05 М глициновый (рН 10,0) буфер в расчете 20 мл раствора фермента в концентрации 5 мг/мл на 1 г волокон, инкубирование проводится в течение 24 ч при комнатной температуре, образовавшийся осадок промывают использованным при иммобилизации буфером до отсутствия в промывных водах белка.

Известен способ получения гетерогенного биокатализатора на основе папаина, иммобилизованного на ионообменных смолах [Патент RU 2768742 С1, МПК C12N 11/04, C12N 11/10, опубл. 24.03.2022, Бюл. №9], включающий адсорбционную иммобилизацию папаина в буферном растворе на матрицу ионообменной смолы в соотношении 20 мл раствора папаина в концентрации 5 мг/мл на 1 г носителя, инкубацию при комнатной температуре с периодическим перемешиванием, промывку образовавшегося осадка буфером до отсутствия в промывных водах белка, отличающийся тем, что иммобилизацию проводят на матрицу воздушно-сухой ионообменной смолы АВ-16-ГС, а в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 0,05 М фосфатный буфер, рН 11,0, инкубацию осуществляют в течение 2 часов, промывку образовавшегося осадка проводят 0,05 М трис-HCl буфером, рН 7,5.

В обоих способах иммобилизация папаина проводится путем адсорбции на нерастворимых носителях в соотношении 20 мл раствора папаина в концентрации 5 мг/мл на 1 г носителя при периодическом перемешивании, что не позволяет полностью автоматизировать процесс. Кроме того, получается нерастворимая форма фермента, которая, безусловно, имеет свои преимущества, но не дает возможность проводить реакции на твердых субстратах.

Известен способ получения иммобилизованного ферментного препарата на основе папаина, гиалуроновой кислоты и полисахаридов, модифицированных виниловыми мономерами [Патент RU 2 750 378 С1, МПК A61K 8/66, А61К 31/702, A61K 31/728, A61K 31/717, A61K 31/722, А61Р 31/00, А61Р 17/00, C12N 11/04 опубл. 28.06.2021, Бюл. №19], включающий растворение папаина в водном растворе низкомолекулярной гиалуроновой кислоты (300 кДа) или среднемолекулярной гиалуроновой кислоты (500 кДа) или высокомолекулярной гиалуроновой кислоты (800 кДа) в соотношении 10 мг папаина на 2 мл водного раствора низкомолекулярной гиалуроновой кислоты (300 кДа) или среднемолекулярной гиалуроновой кислоты (500 кДа) или высокомолекулярной гиалуроновой кислоты (800 кДа) в концентрации 1,5%, при этом осуществляют перемешивание до полного растворения при комнатной температуре; затем ведут иммобилизацию папаина путем добавления к полученной смеси графт-сополимера карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) или хитозана (ХТЗ) с N-винилимидазолом (ВИ) или N,N-диметиламиноэтилметакрилатом (ДМАЭМА) при молекулярной массе полисахарида 50-100 кДа в количестве от 100 до 290 мг для получения жидкого препарата или от 300 до 500 мг для получения геля.

Недостатком способа является высокая стоимость гиалуроновой кислоты и полисахаридов, модифицированных виниловыми мономерами. Использование альгината натрия позволит сократить расходы.

Существует способ иммобилизации папаина в губчатый полиэлектролитный комплекс карбоксиметилхитозан/альгинат натрия [CN107254460A]. Недостатком изобретения является использование глутарового альдегида (химическая иммобилизация с использованием сшивающего агента), что ограничивает применение препарата в фармацевтической промышленности и медицине из-за его токсичности. Авторы не отделяли от полученного продукта несвязанный с носителем белок, т.е. получали смесь иммобилизованной и свободной формы папаина, что может отразиться на эксплуатационных свойствах препарата. Кроме того, для достижения губчатой структуры материала авторы предлагают использовать лиофильную сушку, что существенно удорожает производство данного ферментного препарата.

Известен способ стабилизации протеаз для использования в косметологических целях [US 2011/0177052А1]. Авторы стабилизировали 1%-ный раствор папаина 0,1%-ным раствором альгината натрия. Особенностью изобретения является получение препарата протеазы в жидкой фазе. Кроме того, авторы не отделяли от полученного продукта несвязанный с полисахаридом белок, т.е. получали смесь стабилизированной и нестабилизированной формы папаина, что может отразиться на эксплуатационных свойствах препарата.

В качестве прототипа служил способ получения гетерогенного препарата папаина в геле на основе пищевого хитозана или сукцината хитозана [Патент RU 2712690 С1, МПК C12N 11/04, C12N 11/10, опубл. 30.01.2020, Бюл. №4], включающий иммобилизацию папаина в буферном растворе на матрицу хитозана в соотношении 20 мл раствора фермента в концентрации 1 мг/мл на 1 г носителя; инкубацию при комнатной температуре с периодическим перемешиванием; промывку образовавшегося осадка 50 мМ трис-HCl буфером (рН 7,5) до отсутствия в промывных водах белка, отличающийся тем, что иммобилизацию проводят на матрицу пищевого хитозана с молекулярной массой менее 100 кДа или сукцината хитозана; в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 0,05 М глициновый буфер с рН 10,0 или 0,05 М ацетатный буфер с рН 5,8; инкубация проводится в течение 2 часов.

В отличие прототипа наш способ позволяет получить иммобилизованный папаин в другой форме, т.е. не в виде геля, а в форме густого раствора, включающего только иммобилизованный (стабилизированный) папаин и полностью отмытого от его нестабилизированной (неиммобилизованной) формы.

Технический результат заявленного изобретения заключается в разработке простого в исполнении, не требующего предварительной активации носителя способа получения композиционного препарата иммобилизованного папаина и альгината натрия в виде густого раствора с абсолютной вязкостью 400-500 МПа×с, включающею только иммобилизованный (стабилизированный) папаин и полностью отмытого от его нестабилизированной (неиммобилизованной) формы, при этом в ходе иммобилизации активный центр папаина защищен от окисления путем добавления цистеина в концентрации 0,04 М.

Технический результат достигается тем, что в способе получения композиционного препарата папаина и альгината натрия в виде густого раствора, включающем иммобилизацию ферментного препарата папаина в буферном растворе с носителем, инкубирование при комнатной температуре в течение 2 часов и промывку, согласно изобретению, иммобилизацию папаина проводят путем комплексообразования в густой раствор альгината натрия в соотношении 10 мл раствора папаина в концентрации 20 мг/мл, полученного растворением в буфере, на 1 г сухого альгината натрия, предварительно растворенного в 10 мл буфера, при постоянном перемешивании со скоростью 250 об/мин; в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 0,05 М фосфатный буфер с рН 6,5, содержащий цистеин в концентрации 0,04 М; образовавшийся в процессе инкубирования препарат в виде густого раствора промывают с помощью диализа с использованием целлофанового мешочка шириной 34 мм, вместимостью 3,7 мл на 10 мм длины, с диаметром пор 25 кДа против 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7,5, из расчета, что для промывки 21 мл полученного препарата используют 400 мл 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7.5, диализ ведут в течение 8 часов, после чего буфер меняют на порцию свежего в объеме 400 мл и продолжают диализ еще в течение 16 часов до отсутствия в промывном растворе свободного папаина.

Фиг. 1. Диаграмма значений содержания белка (в мг на 1 г носителя) в препаратах папаина в густом растворе альгината натрия с использованием следующих буферов: 1 - 0,05 М ацетатный, 2 - 0,05 М фосфатный, 3 - 0,05 М боратный с добавлением (1 М KCl, 4 - 0,05 М трис-глициновый, 5 - 0,05 М глициновый.

Фиг. 2. Диаграмма значений общей активности (в ед на 1 и раствора) папаина в густом растворе альгината натрия с использованием следующих буферов: 1-0,05 М ацетатный, 2 - 0,05

М фосфатный, 3 - 0,05 М боратный с добавлением 0,1 М KCl, 4 - 0,05 М трис-глициновый, 5 - 0,05 М глициновый.

Фиг. 3. Диаграмма значений удельной активности (в ед на 1 мг белка в пробе) папаина в густом растворе альгината натрия с использованием следующих буферов: 1 - 0,05 М ацетатный, 2 - 0,05 М фосфатный, 3 - 0,05 М боратный с добавлением 0,1 М KCl, 4 - 0,05 М трис-глициновый, 5 - 0,05 М глициновый.

Пример реализации способа.

В качестве объекта исследования был выбран папаин фирмы «Sigma-Aldrich», субстратом для гидролиза служил азоказеин фирмы «Sigma-Aldrich». В качестве носителя для комплексообразования применяли альгинат натрия фирмы «100ing», 1%-ный масс. раствор которого в дистиллированный воде при 20°С имеет абсолютную вязкость 400-500 МПа×с.

Комплексообразование папаина и альгината натрия осуществляли следующим образом. К 1 г альгината натрия, предварительно растворенного в 10 мл 0,05 М фосфатного буфера с рН 6,5, содержащего цистеин в концентрации 0,04 М для предотвращения процессов окисления активного центра папаина, добавляли 10 мл раствора папаина в концентрации 20 мг/мл, приготовленного растворением папаина в 0,05 М фосфатном буфере с рН 6,5, инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре при постоянном перемешивании со скоростью 250 об/мин. После окончания инкубации образовавшийся препарат в виде густого раствора промывали с помощью диализа с использованием целлофанового мешочка Spectra/Por 6 Standard RC шириной 34 мм, вместимостью 3,7 мл на 10 мм длины, изготовленного из регенерированной целлюлозы, с диаметром пор 25 кДа против 400 мл 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7,5 в течение 8 часов, после чего буфер меняли на 400 мл свежего и продолжали диализ еще в течение 16 часов до отсутствия в промывном растворе свободного папаина. Для промывки 21 мл полученного препарата использовали 800 мл 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7,5. По истечении этого времени осуществляли контроль наличия белка в промывных водах с помощью спектрофотометра СФ-2000 при λ=280 нм.

Содержание белка в композиционных препаратах папаина определяли методом Лоури [Lowry О.Н., Rosebrough N.J., Faar A.L., Randall R.J. Protein measurement with folin-phenol reagent // J. Biol. Chem. -1951.-V.193.-P. 265-275].

Определение протеазной активности папаина проводили на субстрате азоказеине (Sigma, США) [Sabirova A.R., Rudakova N.L., Balaban N.P., Ilyinskaya O.N., Demidyuk I.V., Kostrov S.V., Rudenskaya G.N., Sharipova M.R. A novel secreted metzincin metalloproteinase from Bacillus intermedius // FEBS Lett. - 2010 - V. 584 (21), P. 4419-4425]. К 50 мг комплексообразованного образца добавляли 200 мкл 0,05 М трис-HCl буфера с рН 7,5, 800 мкл азоказеина (0,5% масс.в 0,05 М трис-HCl буфере, рН 7,5) и инкубировали 2 часа при 37°С. Далее добавляли 800 мкл трихлоруксусной кислоты (ТХУ) (5% масс.), инкубировали 10 минут при 4°С, затем центрифугировали в течение 3 мин при 11700 g для удаления негидролизованного азоказеина. К 1200 мкл супернатанта добавляли 240 мкл 3%-ного масс.раствора NaOH для нейтрализации кислоты, после чего измеряли оптическую плотность опытной пробы при 410 нм в 10 мм кювете. Контрольная проба содержала 800 мкл азоказеина, 800 мкл ТХУ, 50 мг образца и 200 мкл буфера

(фермент в комплексе с носителем в контрольную пробу вносили последним, остальные операции для нее делали аналогично опытным пробам).

Единицей протеазной активности служило количество папаина, которое в условиях эксперимента гидролизует 1 мкМ азоказеина за 1 мин. Удельную протеазную активность рассчитывали по формуле:

A=D*1000/120/200/С,

где А - протеазная активность препарата, мкМ/мин на 1 мг белка,

D - оптическая плотность раствора при 410 нм,

С - концентрация белка в пробе, мг/мл, измеренная по методу Лоури,

120 - время инкубации в минутах,

200 - объем пробы, мкл,

1000 - коэффициент для пересчета в мкМ.

Все экспериментальные исследования осуществляли минимум в 8-кратной повторности. Статистическая обработка полученных результатов проводилась при уровне значимости 5% с использованием t-критерия Стьюдента.

Для получения композиционного препарата папаина в виде густого раствора альгината натрия, в качестве среды для комплексообразования мы использовали следующие буферы: 0,05 М боратный с добавлением 0,1 М KCl с рН 8,0-10,0, 0,05 М ацетатный с рН 4,0-5,8, 0,05 М глициновый с рН 8,6-10,5, 0,05 М трис-глициновый с рН 8,5-9,0, 0,05 М фосфатный с рН 5,8-7,5. Результаты отражены на фиг. 1-3.

Анализ содержания белка в композиционных препаратах показал, что наибольшее количество папаина (в мг на г носителя), наблюдается при использовании 0,05 М трис-глицинового буфера с рН 8,5 и 9,0 в качестве среды для комплексообразования (фиг. 1). Общая активность (в ед на мл раствора) папаина оказалась выше при использовании 0,05 М ацетатного буфера с рН 4,5 и 5,0 (фиг. 2). Наибольшую удельную активность показали препараты папаина, полученные при использовании 0,05 М фосфатного буфера с рН 6,5 фиг. 3).

Метод получения композиционного препарата папаина и альгината натрия в виде густого раствора имеет свои преимущества. Благодаря комплексообразованию, фермент защищен от неблагоприятных условий среды, повышается его стабильность, биокатализатору можно придавать различные конфигурации, возможна его адресная доставка в организм.

Мы сравнили полученные результаты по определению аталитической активности и содержания белка для композиционных препаратов папаина и альгината натрия в виде густого раствора. Оптимальное соотношение содержания белка (мг на г носителя), общей активности (в ед на мл раствора) и удельной активности (в ед на мг белка) получено при создании препарата папаина и альгината натрия в виде густого раствора при использовании 0,05 М фосфатного буфера с рН 6,5.

Таким образом, была разработана методика получения композиционного препарата папаина и альгината натрия в виде густого раствора с абсолютной вязкостью 400-500 МПа×с, включающего только иммобилизованный (стабилизированный) папаин и полностью отмытого от его нестабилизированной (неиммобилизованной) формы, т.к. после диализа 21 мл препарата против 800 мл 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7,5 исключается переход фермента из фазы носителя в раствор, что позволяет проводить реакции, получая продукт, не "загрязненный" ферментом. Кроме того, в ходе иммобилизации активный центр папаина защищен от окисления путем добавления цистеина в концентрации 0,04 М.

Способ получения композиционного препарата папаина и альгината натрия в виде густого раствора, включающий иммобилизацию ферментного препарата папаина в буферном растворе с носителем, инкубирование при комнатной температуре в течение 2 часов и промывку, отличающийся тем, что иммобилизацию папаина проводят путем комплексообразования в густой раствор альгината натрия в соотношении 10 мл раствора папаина в концентрации 20 мг/мл, полученного растворением в буфере, на 1 г сухого альгината натрия, предварительно растворенного в 10 мл буфера, при постоянном перемешивании со скоростью 250 об/мин; в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 0,05 М фосфатный буфер с рН 6,5, содержащий цистеин в концентрации 0,04 М; образовавшийся в процессе инкубирования препарат в виде густого раствора промывают с помощью диализа с использованием целлофанового мешочка шириной 34 мм, вместимостью 3,7 мл на 10 мм длины, с диаметром пор 25 кДа против 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7,5, из расчета, что для промывки 21 мл полученного препарата используют 400 мл 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7,5, диализ ведут в течение 8 часов, после чего буфер меняют на порцию свежего в объеме 400 мл и продолжают диализ еще в течение 16 часов до отсутствия в промывном растворе свободного папаина.