Способ количественного мультиплексного анализа альфа-2-макроглобулина, фетуина а и сывороточного амилоида а1 как факторов воспаления в сыворотке крови с использованием maldi-tof масс-спектрометрии

Изобретение относится к области молекулярной диагностики, а именно к разработке метода молекулярной диагностики синдрома системной воспалительной реакции (ССВР, systemic inflammatory response syndrome, SIRS), включая сепсис, с помощью количественного определения альфа-2-макроглобулина, фетуина А и сывороточного амилоида А1 в сыворотке крови человека с применением технологии MALDI-TOF масс-спектрометрии. По настоящему изобретению для альфа-2-макроглобулина в качестве изотопно-меченого стандарта используют пептид VGFYESDVMGR, для фетуина А - HTFMGVVSLGSPSGEVSHPR, а для сывороточного амилоида А1 - FFGHGAEDSLADQAANEWGR, в качестве изотопной метки используется стабильный изотоп кислорода ¹⁸О. Технический результат состоит в обеспечении возможности эффективного количественного мультиплексного анализа альфа-2-макроглобулина, фетуина А и сывороточного амилоида А1 как факторов воспаления в сыворотке крови с использованием MALDI-TOF масс-спектрометрии. 4 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл., 5 пр.

 

Область применения

Изобретение относится к области молекулярной диагностики, а именно к разработке метода молекулярной диагностики синдрома системной воспалительной реакции (ССВР, systemic inflammatory response syndrome, SIRS), включая сепсис, с помощью количественного определения альфа-2-макроглобулина, фетуина А и сывороточного амилоида А1 в сыворотке крови человека с применением технологии MALDI-TOF масс-спектрометрии.

Предшествующий уровень техники

Наиболее удобным объектом для изучения профиля белковых биомаркеров при возникновении каких-либо патологических состояний в организме человека является сыворотка крови человека. Среди известных маркеров воспаления для мультиплексного определения перспективными являются альфа-2-макроглобулин, сывороточный амилоид А и фетуин А [1].

Альфа-2-макроглобулин (α2-МГ) представляет собой белок сыворотки крови, выполняющий широкий спектр регуляторных процессов в организме человека, основным из которых является ингибирование активностей целого ряда протеаз. Сывороточная концентрация α2-МГ обладает прогностическим потенциалом при оценке тяжести течения различных заболеваний [2-6].

Белки сывороточного амилоида А (serum amyloid A, SAA) отвечают за множество разнообразных функций в организме. Их деятельность направлена на активацию защитной системы организма в ответ на развитие патологии, при этом, когда организм длительное время не способен справиться с заболеванием, присутствие SAA в избыточных количествах может приводить к новым нежелательным процессам и явлениям в организме. Основными циркулирующими формами SAA являются SAA1 и SAA2 (acute-phase serum amyloid A, A-SAA), представляющие собой белки острой фазы, уровень которых значительно возрастает в ответ на воспаления различного генеза подобно C-реактивному белку (C-reactive protein, CRP). При этом A-SAA считаются более удобным маркером системного воспаления, так как их уровни гораздо оперативнее и интенсивнее реагируют на патологические изменения в организме по сравнению с CRP. A-SAA являются неспецифическими маркерами воспаления, увеличение их концентрации в сыворотке крови напрямую связано с возрастанием тяжести течения заболевания, что делает их удобным диагностическим инструментом, позволяющим подбирать адекватные стратегии лечения [7].

Многообразие функций в организме, которыми обладает фетуин А, позволяет использовать его в качестве биомаркера большого круга заболеваний. Повышенные концентрации фетуина А способны провоцировать атеросклероз, резистентность к инсулину, дислипидемию и ожирение. Нормальный уровень фетуина А способствует укреплению костной ткани, а также препятствует избыточной кальцификации сосудов и появлению различных сердечно-сосудистых патологий. В свою очередь, снижение уровня фетуина А может также быть ассоциировано с развитием системного воспаления, сепсиса или хронической болезни почек.

Среди различных методов одновременного выявления вышеперечисленных маркеров наибольшим потенциалом обладает метод масс-спектрометрии, позволяющий, во-первых, достоверно идентифицировать изучаемый белок, во-вторых, при применении некоторых подходов определять концентрацию отдельных компонентов в сложной белковой смеси. Вместе с тем, для идентификации и количественного анализа с помощью масс-спектрометрии, как правило, возникает необходимость выделить интересующий нас белковый объект, что практически исключает использование подобного подхода для серийных методов контроля. В связи с этим в данной работе предложен альтернативный вышеописанному подходу количественный мультиплексный анализ ряда белковых биомаркеров непосредственно в сыворотке крови человека при помощи современных масс-спектрометрических методик с применением изотопно-меченых внутренних стандартов. В основе предлагаемого подхода лежат имеющиеся в литературе данные о функциональных особенностях интересующих нас белков, а также способности α2-МГ и фетуина А участвовать в реакциях ограниченного протеолиза. Именно ограниченный протеолиз лежит в основе образования множества активных форм белков, которые поступают в биологическую среду в виде предшественников [8,9]. Особенностью разрабатываемого метода является применение способности трипсина образовывать комплекс с α2-МГ, в результате чего последний переходит в активное состояние за счет процесса ограниченного протеолиза, что приводит к потере трипсином способности к гидролизу высокомолекулярных белков в сыворотке крови. Сформированный комплекс сохраняет активный центр фермента, ограничивая протеолитическую активность в отношении отдельных субстратов, зарегистрировать которую можно с помощью предлагаемого масс-спектрометрического подхода.

Применение MALDI масс-спектрометрии для осуществления количественных расчетов как новое направление в количественной протеомике возникло сравнительно недавно. В 2004 году была предложена методика количественного определения пептидов с использованием синтетических аналогов аминокислот, содержащих изотопы (метод внутренних стандартов). Отличительной особенностью этого подхода являлась возможность применять его при MALDI-TOF масс-спектрометрии, что существенно расширяло возможности этого метода [10].

При этом метод получения стабильных изотопомеров пептидов и белков в дальнейшем был усовершенствован. Метод основан на обмене кислорода ¹⁶О на ¹⁸О в карбоксильных группах этих соединений в воде H₂¹⁸O в присутствии трифторуксусной кислоты (ТФУ) [11]. При этом показано, что изотопную метку можно вводить на любой стадии пробоподготовки - как до триптического гидролиза, так и после. Данный способ получения изотопомеров является универсальным решением для любых пептидов и белков. Аминокислотные остатки, которые подвергаются обмену (Asp и Glu), присутствуют практически во всех белках, к тому же в любых пептидах есть как минимум одна С-концевая карбоксильная группа. Чем больше атомов ¹⁸О вводится в молекулу, тем существеннее расходятся в спектре пики внутреннего стандарта и анализируемого образца. При этом число атомов ¹⁸О, вошедших в молекулу, не влияет на результат количественного определения, которое можно проводить как по спектрам MALDI исследуемых белков, так и по спектрам их триптических пептидов [12,13].

В настоящее время существует необходимость разработки подходов дифференциальной диагностики генерализованного воспаления инфекционного и неинфекционного происхождения. Применяемая в настоящее время стандартная микробиологическая диагностика SIRS требует не менее 48 часов для выявления этиологического агента, причем во многих случаях время проведения анализа может оказаться значительно больше [14]. Кроме того, на ее результаты может влиять предшествующая антибактериальная терапия и несоблюдение надлежащих требований при заборе биологического материала. Тем не менее, молекулярная диагностика SIRS, сепсиса и их возможных осложнений - трудновыполнимая задача вследствие высокой вариабельности и отсутствия специфических маркеров, характеризующих патогенез заболевания. В современной литературе описано свыше 178 различных биомаркеров SIRS, однако ни один из них не обладает необходимой надежностью, чтобы использовать его в качестве единственного диагностического критерия.

Очевидно, что для диагностики воспалительных процессов, а также характеристики патогенеза заболевания, наиболее целесообразным является одновременное измерение нескольких маркеров в одном эксперименте. Однако в настоящее время нет однозначного ответа на то, какой набор маркеров может быть использован для прогноза развития SIRS разной инфекционной этиологии и какими методами он может быть определен. В связи с этим разработанная методика для одновременной количественной оценки в сыворотке крови сразу нескольких маркеров воспаления с использованием метода масс-спектрометрии представляется крайне актуальной.

На сегодняшний день не известны способы количественного измерения сывороточных альфа-2-макроглобулина, фетуина А и сывороточного амилоида А1 человека с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии с применением изотопно-меченых аналогов пептидов, содержащих атомы стабильного изотопа кислорода ¹⁸О, входящих в состав измеряемых соединений. Таким образом, ни один из известных способов не может рассматриваться в качестве прототипа заявляемого изобретения.

Технической проблемой является необходимость разработки эффективного способа количественного мультиплексного анализа альфа-2-макроглобулина, фетуина А и сывороточного амилоида А1 как факторов воспаления в сыворотке крови с использованием MALDI-TOF масс-спектрометрии.

Раскрытие сущности изобретения

Технический результат состоит в обеспечении возможности эффективного количественного мультиплексного анализа альфа-2-макроглобулина, фетуина А и сывороточного амилоида А1 как факторов воспаления в сыворотке крови с использованием MALDI-TOF масс-спектрометрии.

Технический результат достигается за счет способа количественного мультиплексного анализа альфа-2-макроглобулина, фетуина А и сывороточного амилоида А1 как факторов воспаления в сыворотке крови с использованием MALDI-TOF масс-спектрометрии, в ходе которого сыворотку крови разбавляют дистиллированной водой в соотношении 1/25, а трипсин разводят до концентрации 50 мкг/мл в 50 мМ NH₄HCO₃, после чего полученные растворы смешивают в равном соотношении и инкубируют при 37°С в течение 15 минут для измерения уровней альфа-2-макроглобулина и в течение 120-180 минут для измерения уровней фетуина А и SAA1, далее реакцию трипсинолиза останавливают внесением равного объема 2% трифторуксусной кислоты до объемной концентрации 1%, затем в образцы вносят соответствующие изотопно-меченые стандарты в известной концентрации, после чего полученные смеси наносят на мишень MALDI-TOF масс-спектрометра с использованием α-циано-4-гидроксикоричной кислоты в качестве матрицы, после чего получают масс-спектры в режиме регистрации положительных ионов при установке мощности лазерного излучения на уровне минимального порогового значения, достаточного для десорбции-ионизации образца, причем масс-спектры получают путем суммирования пяти серий по 1000 импульсов лазера для каждой серии, при этом для альфа-2-макроглобулина в качестве изотопно-меченого стандарта используют пептид VGFYESDVMGR, для фетуина А - HTFMGVVSLGSPSGEVSHPR, а для сывороточного амилоида А1 - FFGHGAEDSLADQAANEWGR, в качестве изотопной метки используется стабильный изотоп кислорода ¹⁸О.

В наиболее предпочтительном варианте реализации изобретения используют масс-спектрометр, оснащенный твердотельным лазером 337 нм. Также в наиболее предпочтительном варианте реализации изобретения для внутренней калибровки масс в спектрах используют ионы, соответствующие продуктам автопротеолиза трипсина. Также в наиболее предпочтительном варианте реализации изобретения измерения масс устанавливают не более 50 ppm. Также в наиболее предпочтительном варианте реализации изобретения в качестве вариабельной модификации указывают окисление остатков метионина.

Описание фигур

Фиг.1. MALDI-TOF масс-спектр сыворотки крови, обработанной трипсином, А - через 15 минут инкубации, Б - через 120 минут инкубации. Пептиды, обозначенные величинами MH⁺на спектре, относятся к различным маркерам воспаления. Значения MH⁺отобранных пептидов-кандидатов обозначены «*».

Фиг.2. Фрагменты MALDI масс-спектров характеристического пептида VGFYESDVMGR (MH⁺=1259,6) (а), стандарта (б) и их смеси.

Осуществление изобретения

Предложен метод мультиплексного определения концентраций альфа-2-макроглобулина, фетуина А и сывороточного амилоида А1, основанного на взаимодействии трипсина с альфа-2-макроглобулином в сыворотке крови человека, а также проведена оценка его применимости для диагностики синдрома системной воспалительной реакции различной инфекционной этиологии. Показано, что в основе метода лежит способность трипсина, добавленного в сыворотку крови, к связыванию с α2-МГ, что приводит к существенному изменению и ограничению протеолитической активности трипсина в пользу белков с более низкой молекулярной массой. В результате этого взаимодействия в сыворотке крови появляются фрагменты (пептиды) некоторых белков, концентрацию которых можно измерить масс-спектрометрически. В результате масс-спектрометрического анализа подвергнутых гидролизу трипсином сывороток крови были идентифицированы пептиды, относящиеся к α2-МГ, фетуину А и SAA1. Определение концентрации указанных белков по их фрагментам проведены при добавлении в сыворотку крови изотопно-меченых синтетических аналогов пептидов известной концентрации (стандартов), причем мечение коммерческих пептидов изотопами кислорода ¹⁸О проводилось непосредственно в лабораторных условиях без необходимости синтеза дорогостоящих изотопно-меченых аналогов.

Для каждого изучаемого пептида были получены изотопно-меченые стандарты путем прямого введения изотопов ¹⁸O в состав аналогичных синтезированных пептидов. В ходе экспериментов были установлены особенности протекания реакции взаимодействия трипсина с основными ингибиторами протеаз в сыворотке крови и оценена возможность дальнейшей разработки подходов количественного анализа. Для каждого из исследуемых маркеров было установлено оптимальное время гидролиза трипсином. Мультиплексность метода достигается путем измерения всех заявленных маркеров воспаления в одном образце с добавлением смеси стандартов в известной концентрации, однако реакцию гидролиза с помощью ТФУ необходимо останавливать через 15 минут для измерения уровней α2-МГ и через 120-180 минут для измерения уровней фетуина А и SAA1.

Также технический результат достигается за счет того, что разработанная методика масс-спектрометрической количественной оценки уровней концентрации фетуина А и сывороточного амилоида А была сопоставлена со стандартным иммунологическим методом с помощью коммерческих наборов для иммуноферментного анализа (ИФА). С помощью регрессионного анализа были получены соотношения связи между результатами измерений, полученных двумя указанными методами, в результате чего была установлена четкая корреляционная зависимость между разработанным и референсным методом (ИФА).

Разработанная методика может быть представлена и в мультиплексном варианте. При этом в качестве стандарта в таком случае используется не один синтетический аналог пептида, а их смесь. В общем случае количество белков, концентрация которых одномоментно измеряется в одном образце, ограничено уникальностью производимых ими фрагментов (по массе и по аминокислотной последовательности) и возможностью детектировать их масс-спектрометрически. Количество образцов сыворотки крови, анализ которых может осуществляться одновременно, составляет порядка двух десятков, однако, оно может быть увеличено с помощью автоматической раскапывающей станции дозирования и робота для пробоподготовки. Общее время анализа в настоящий момент составляет около 3-4 часов от момента получения образца сыворотки крови пациента до определения концентрации изучаемых биомаркеров.

Заявляемый способ осуществляют следующим образом.

Сыворотку крови разбавляют дистиллированной водой в соотношении 1/25. Затем разводят трипсин до концентрации 50 мкг/мл в 50 мМ NH₄HCO₃. Полученные растворы смешивают в равном соотношении и инкубируют при 37°С в течение 15 минут для измерения уровней α2-МГ и через 120-180 минут для измерения уровней фетуина А и SAA1. Далее реакцию трипсинолиза останавливают внесением равного объема 2% трифторуксусной кислоты до объемной концентрации 1%. Затем полученный образец наносят на мишень масс-спектрометра с использованием α-циано-4-гидроксикоричной кислоты в качестве матрицы. Затем получают масс-спектры путем суммирования шести серий по 1000 импульсов лазера для каждой серии в режиме регистрации положительных ионов при установке мощности лазерного излучения на уровне минимального порогового значения, достаточного для десорбции-ионизации образца. В рамках заявляемого способа для альфа-2-макроглобулина в качестве изотопно-меченого стандарта используют пептид VGFYESDVMGR (SEQ ID NO:1), для фетуина А - HTFMGVVSLGSPSGEVSHPR (SEQ ID NO:2), а для сывороточного амилоида А1 - FFGHGAEDSLADQAANEWGR (SEQ ID NO:3), в состав которых вводят изотопы кислорода ¹⁸О. Метод введения изотопов основан на обмене кислорода ¹⁶О на ¹⁸О в карбоксильных группах этих соединений в воде H₂¹⁸O в присутствии трифторуксусной кислоты (ТФУ) [11]. Предпочтительно для реализации заявляемого способа используют MALDI-TOF масс-спектрометр, оснащенный твердотельным лазером 337 нм. При этом для внутренней калибровки масс в спектрах использовали ионы, соответствующие продуктам автопротеолиза трипсина. Измерения масс устанавливают не более 50 ppm.

Далее способ количественного определения альфа-2-макроглобулина, фетуина А и сывороточного амилоида А1 в сыворотке крови человека с применением технологии MALDI-TOF масс-спектрометрии будет описан в виде примеров, которые предназначены для иллюстрации изобретения и никоим образом не ограничивают его.

Заявляемое изобретение поясняется примерами.

Пример 1

Получение изотопно-меченых пептидов, входящих в состав сывороточных альфа-2-макроглобулина, фетуина А и сывороточного амилоида А1 человека

Для возможности количественного измерения альфа-2-макроглобулина, фетуина А и сывороточного амилоида А1 в сыворотке крови человека необходимо было синтезировать пептидные фрагменты этих белковых соединений, ионы которых были зарегистрированы на MALDI-TOF масс-спектрометре в результате триптического гидролиза через 15 и 120 минут после начала реакции. На Фиг.1А приведен пример MALDI-TOF масс-спектра сыворотки крови пациента с гангреной нижних конечностей, обработанной трипсином, через 15 минут инкубации, на Фиг.1Б - через 120 минут инкубации.

Для ионов с MH⁺=1259,6 (альфа-2-макроглобулин) и MH⁺=2081,0 (фетуин А) предполагаемая последовательность была подтверждена масс-спектрометрически по спектрам фрагментации, а также дополнительно установлены их принадлежности к α2-МГ с величиной Score=114 (пороговое значение 24) и к фетуину А с величиной Score=135 (пороговое значение 29), соответственно. Для иона с MH⁺=2178,0 (сывороточный амилоид А1) принадлежность к белку сывороточного амилоида А была установлена в результате обращения к компьютерной библиотеке белкового поиска MASCOT при идентификации всех триптических пептидов, представленных на спектре сывороточных продуктов ферментативного гидролиза, после двух часов гидролиза. Совпадения семи значений MH⁺ионов экспериментального с теоретическим спектром позволили достоверно идентифицировать в исследуемом образце сывороточный амилоид А1 с величиной Score=105 (пороговое значение 56), с величиной покрытия исходной последовательности в 68%. В случае, если Score больше порогового значения, то идентификация соединения является достоверной (P<0,05).

Пептиды VGFYESDVMGR (MH⁺=1259,6), HTFMGVVSLGSPSGEVSHPR (MH⁺=2081,0) и FFGHGAEDSLADQAANEWGR (MH⁺=2178,0) были синтезированы в ООО «НПФ Верта» (г. Санкт-Петербург, Россия).

Опираясь на ранее известные методики прямого введения изотопов ¹⁸О для количественного анализа методом масс-спектрометрии, были подобраны следующие условия получения изотопно-меченых пептидов: стандарты были получены путем инкубации 1 мМ водных растворов пептидов в присутствии двукратного объема H₂¹⁸O (95-98% ¹⁸O, "Cambridge Isotope Laboratories Andover", США), 25% ацетонитрила и 10% трифторуксусной кислоты (ТФУ) в течение 1 часа при 50°С в твердотельном термостате «Гном» («ДНК-технология», Россия). Затем аликвоты полученных стандартов высушивали в вакуумном концентраторе SpeedVac (Concentrator Plus, Eppendorf 5305, Германия) для дальнейшего растворения в необходимом объеме воды (LiChrosolv, Merck, Германия) непосредственно перед использованием.

Концентрацию стандартов и степень включения изотопа кислорода ¹⁸O характеризовали масс-спектрометрически.

Таким образом, для каждого из трех исследуемых маркеров воспаления был получен изотопно-меченый стандарт, концентрация которого была определена по спектрам смеси пептида и стандарта с учетом известного изотопного распределения, полученного из спектров пептида и стандарта по отдельности. Соотношение суммарной площади под пиками пептида и суммарной площади под пиками стандарта в смеси равно отношению концентраций данных соединений. На Фиг.2 приведен пример фрагмента MALDI масс-спектров характеристического пептида VGFYESDVMGR (MH+=1259,6) (Фиг.2а), стандарта (Фиг.2б) и их смеси (Фиг.2в).

Пример 2

Регистрация и обработка масс-спектров

Для анализа как синтетических, так и полученных в результате ферментативного гидролиза трипсином пептидов использовали MALDI масс-спектрометрию с времяпролетным анализатором, реализованную в приборе ultrafleXtreme™ (Bruker, Германия), оснащенным твердотельным лазером 337 нм.

Образцы наносили на мишень (MTP 384 target plate ground steel TF, Bruker, Германия) с использованием матрицы HCCA (α-циано-4-гидроксикоричная кислота, Bruker). Масс-спектры получали в режиме регистрации положительных ионов при помощи программы Bruker Daltonics flex Control (Bruker, Германия). Для накопления масс-спектров мощность лазерного излучения устанавливали на уровне минимального порогового значения, достаточного для десорбции-ионизации образца. Спектры получали в результате суммирования пяти серий по 1000 импульсов лазера для каждой серии. Обработку полученных результатов проводили с помощью программы Bruker Daltonics flex Analysis (Bruker, Германия). Идентификацию соединений осуществляли посредством программы Bruker Daltonics BioTools (Bruker, Германия), взаимодействующей с базами данных NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) и SwissProt (www.uniprot.org) с использованием MASCOT (www.matrixscience.com). Для внутренней калибровки масс в спектрах использовали ионы, соответствующие продуктам автопротеолиза трипсина (842,51 и 2211,01 Да). Точность измерения масс устанавливали не более 50 ppm. В качестве вариабельной модификации указывали окисление остатков метионина.

Для подтверждения аминокислотной последовательности пептидов выбранные ионы были фрагментированы в тандемном режиме регистрации положительных ионов (с помощью метода LIFT). По обработанным спектрам были установлены аминокислотные последовательности пептидов при обращении к базе данных NCBI с использованием MASCOT. Точность определения m/z родительского иона была ограничена 50 ppm, его фрагментов - 0,2 Да.

Пример 3

Расчет концентрации полученного изотопно-меченого стандарта методом MALDI масс-спектрометрии по известной концентрации синтетического пептида

На первом этапе получали масс-спектры немеченого синтетического пептида известной концентрации, его изотопно-меченого стандарта и их смеси в соотношении 1:1 (v/v). Смесь готовили таким образом, чтобы максимальные интенсивности пиков в изотопных распределениях пептида и его стандарта были сопоставимы.

Пример полученных масс-спектров пептида VGFYESDVMGR (MH⁺=1259,6) и соответствующего стандарта представлен на Фиг.2.

В общем случае соотношение сумм площадей изотопных распределений пептида и его стандарта соответствует соотношению их концентраций. Зная соотношение сумм площадей и концентрацию одного из компонентов, можно вычислить другой компонент.Спектр синтетического пептида, а также спектр изотопно-меченого стандарта нужны для уточнения характера распределения и установления вероятного перекрытия пиков от этих соединений в случае их смеси. В случае перекрытия пиков - изотопное распределение стандарта остается неизменным от спектра к спектру, а значит вклад каждого из перекрывающихся пиков можно вычислить. Удобнее всего найти отношение площади каждого из нескольких первых перекрывающихся пиков стандарта к суммарной площади всех пиков стандарта и в дальнейшем использовать его для определения вклада стандарта в суммарный спектр.

В случае с пептидом VGFYESDVMGR (MH⁺=1259,6) по спектру можно судить об однозначном расхождении распределений синтетического пептида и его изотопно-меченого аналога, что позволяет сравнивать суммарные площади этих соединений в смеси без каких-либо поправок.

В Таблице 1 представлены выходные данные для спектра стандарта (Фиг.2б), предоставляемые программным обеспечением масс-спектрометра (программа flexAnalysis, Bruker, Германия).

Таблица 1 -
Результаты измерений площади, соответствующей регистрируемому сигналу изотопного распределения смеси целевых соединений
Отношение массы к заряду, m/z	, значение площади отдельного пика пептида, относительные единицы	Отношение массы к заряду, m/z	, значение площади отдельного пика стандарта, относительные единицы
1259,6	6151,080	1265,6	55,861
1260,6	4287,920	1266,6	70,349
1261,6	1981,599	1267,6	290,087
1262,6	587,148	1268,6	231,806
1263,6	192,488	1269,6	1491,132
		1270,6	1124,902
		1271,6	3154,776
		1272,6	1984,967
		1273,6	781,578
		1274,6	229,300
		1275,6	132,342

Для полученных результатов справедливо соотношение , где - суммарная площадь под пиками стандарта, - суммарная площадь под пиками синтетического пептида, - концентрация стандарта, - концентрация синтетического пептида. Для расчета концентрации стандарта необходимо располагать точной концентрацией синтетического пептида, что позволяет рассчитать концентрацию стандарта по формуле: . То есть отношение "" суммарной площади пиков стандарта к суммарной площади первых пиков синтетического пептида составляет:

Коэффициент является ключевым параметром, получаемым из спектров и зависящим от уровня шума на спектре и общем уровне сигнала от целевых соединений, что накладывает определенные ограничения на точность измерений, соотношение концентрации стандарта и измеряемого пептида, которое необходимо подбирать таким образом, чтобы коэффициент был близок к единице для обеспечения наименьшей погрешности. В дальнейшем для расчета концентрации пептида, входящего в состав измеряемых сывороточных маркеров, используется обратный коэффициент:

В текущем примере

При смешивании стандарта с синтетическим пептидом в соотношении 1:1, с добавлением матрицы в конечную смесь для нанесения полученного образца на мишень, концентрация полученного стандарта составляет:

Пример 4

Обработка трипсином сывороток крови человека

Сыворотки крови разбавляли дистиллированной водой в 25 раз и смешивали в равном соотношении по объему с трипсином (Sequencing Grade Modified Trypsin, Frozen, Promega, США), разведенным до концентрации 50 мкг/мл в 50 мМ NH₄HCO₃. Полученную смесь помещали в твердотельный термостат «Гном» («ДНК-технология», Россия) для дальнейшей инкубации при 37°С в течение требуемого промежутка времени. Реакцию трипсинолиза останавливали внесением равного объема 2% трифторуксусной кислоты (ТФУ) до объемной концентрации 1%.

В ходе экспериментов также были установлены особенности протекания реакции взаимодействия трипсина с основными ингибиторами протеаз в сыворотке крови. Для каждого из исследуемых маркеров было установлено оптимальное время гидролиза трипсином. Мультиплексность метода достигалась путем измерения всех заявленных маркеров воспаления в одном образце с добавлением смеси стандартов в известной концентрации, однако реакцию гидролиза необходимо было останавливать через 15 минут для измерения уровней α2-МГ и через 120-180 минут для измерения уровней фетуина А и SAA1.

Пример 5

Расчет концентрации сывороточных маркеров воспаления методом MALDI масс-спектрометрии по известной концентрации изотопно-меченого стандарта

С учетом всех разведений сыворотки в ходе триптического гидролиза и остановки реакции образец сыворотки разведен в 100 раз, что необходимо учитывать при пересчете концентраций. Полученный образец смешивают с изотопно-меченым стандартом соответствующего пептида, входящего в состав измеряемого сывороточного маркера или со смесью из всех трех стандартов измеряемых маркеров в известной концентрации. В случае, если суммарная площадь под пиками для измеряемого стандарта сопоставима с суммарной площадью под пиками для измеряемого пептида сывороточного маркера, молярная концентрация в результате триптического гидролиза должна в полной мере отражать молярную концентрацию соответствующего сывороточного маркера.

При добавлении стандарта с концентрацией 4⋅10^-8 М в гидролизованный образец сыворотки в соотношении 1:1 (v/v) концентрацию сывороточного маркера (например, альфа-2-макроглобулина) можно получить, рассчитав . Для одного из измерений .

Для α2-МГ, в отличие от сывороточного амилоида А1 и фетуина А, необходимо учитывать дополнительный коэффициент 2, так как от одной молекулы α2-МГ в результате ограниченного протеолиза трипсином через 15 минут отщепляется две молекулы характеристического пептида VGFYESDVMGR (MH⁺=1259,6), то есть количество моль/л измеряемого пептида в 2 раза превышает молярную концентрацию исходного α2-МГ, что с учетом всех разведений дает следующую формулу для расчета молярной концентрации α2-МГ:

или в других единицах, с учетом молярной массы

Список источников

1. Mancini N. Sepsis diagnostic Methods and Protocols: Method & Molecular Microbiology // Springer New York. 2015. 17-31 p.

2. Christensen U., Sottrup-Jensen L. Mechanism of α2-Macroglobulin-Proteinase Interactions. Studies with Trypsin and Plasmin // Biochemistry. American Chemical Society, 1984. Vol.23, №26. P. 6619-6626.

3. Larsson L.J. et al. The conformational changes of α2-macroglobulin induced by methylamine or trypsin. Characterization by extrinsic and intrinsic spectroscopic probes // Biochemical Journal. Biochem J, 1987. Vol.243, №1. P. 47-54.

4. Atkinson H.M. et al. Determination of alpha-2-macroglobulin complexes by a new immuno-activity assay // Thrombosis Research. Thromb Res, 2012. Vol.129, №5. P. 635-640.

5. Justus C.W.E. et al. Quantification of free α2-macroglobulin and α2-macroglobulin-protease complexes by a novel ELISA system based in streptococcal α2-macroglobulin receptors // Journal of Immunological Methods. J Immunol Methods, 1990. Vol.126, №1. P. 103-108.

6. Abbink J.J. et al. Quantification of functional and inactivated α2-macroglobulin in sepsis // Thrombosis and Haemostasis. Thromb Haemost, 1991. Vol.65, №1. P. 32-39.

7. Buck M. et al. Structure and Expression of Different Serum Amyloid A (SAA) Variants and their Concentration-Dependent Functions During Host Insults // Current Medicinal Chemistry. 2016. Vol.23, №17. P. 1725-1755.

8. Christensen U., Sottrup-Jensen L. Mechanism of α2-Macroglobulin-Proteinase Interactions. Studies with Trypsin and Plasmin // Biochemistry. 1984. Vol.23, №26. P. 6619-6626.

9. Nawratil P. et al. Limited Proteolysis of Human α 2 -HS Glycoprotein/Fetuin // Journal of Biological Chemistry. 1996. Vol.271, №49. P. 31735-31741.

10. Mirgorodskaya O.A. et al. Absolute quantitation of proteins by a combination of acid hydrolysis and matrix-assisted laser desorption/ionization mass, spectrometry // Analytical Chemistry. Anal Chem, 2004. Vol.76, №13. P. 3569-3575.

11. RU2399627C2 - СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИЗОТОПНО-МОДИФИЦИРОВАННЫХ ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ - Яндекс.Патенты [Электронный ресурс]. URL: https://yandex.ru/patents/doc/RU2399627C2_20100920 (дата обращения: 26.04.2022).

12. Козьмин Ю.П. et al. Прямое введение изотопов 18 в пептиды и белки для количественного анализа методом масс-спектрометрии // Биоорганическая химия. Федеральное государственное унитарное предприятие Академический научно …, 2011. Vol.37, №6. P. 793-806.

13. Лебедев А.Т., Артеменко К.А., Самгина Т.Ю. Основы масс-спектрометрии белков и пептидов // М., Техносфера. 2012.

14. D’Onofrio V. et al. The Clinical Impact of Rapid Molecular Microbiological Diagnostics for Pathogen and Resistance Gene Identification in Patients With Sepsis: A Systematic Review // Open Forum Infectious Diseases. Oxford Academic, 2020. Vol.7, №10.

Способ количественного мультиплексного анализа альфа-2-макроглобулина, фетуина А и сывороточного амилоида А1 как факторов воспаления в сыворотке крови с использованием MALDI-TOF масс-спектрометрии

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<120>Способ количественного мультиплексного анализа альфа-2-макроглобулина,

фетуина А и сывороточного амилоида А1 как факторов воспаления в сыворотке

крови с использованием MALDI-TOF масс-спектрометрии

<160>3

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>11

<212>PRT

<213>Synthetic

<400>1

Val Gly Phe Tyr Glu Ser Asp Val Met Gly Arg

1 5 10

<210>2

<211>20

<212>PRT

<213>Synthetic

<400>2

His Thr Phe Met Gly Val Val Ser Leu Gly Ser Pro Ser Gly Glu Val

1 5 10 15

Ser His Pro Arg

20

<210>3

<211>20

<212>PRT

<213>Synthetic

<400>3

Phe Phe Gly His Gly Ala Glu Asp Ser Leu Ala Asp Gln Ala Ala Asn

1 5 10 15

Glu Trp Gly Arg

20

<---

1. Способ количественного мультиплексного анализа альфа-2-макроглобулина, фетуина А и сывороточного амилоида А1 как факторов воспаления в сыворотке крови с использованием MALDI-TOF масс-спектрометрии, в ходе которого сыворотку крови разбавляют дистиллированной водой в соотношении 1/25, а трипсин разводят до концентрации 50 мкг/мл в 50 мМ NH₄HCO₃, после чего полученные растворы смешивают в равном соотношении и инкубируют при 37°С в течение 15 минут для измерения уровней альфа-2-макроглобулина; для измерения уровней фетуина А и сывороточного амилоида А1 полученные растворы инкубируют при 37°С в течение 120–180 минут; далее для остановки каждой из реакций трипсинолиза через необходимый интервал времени в образцы вносят равный объем 2% трифторуксусной кислоты до объемной концентрации 1%, затем в образцы вносят соответствующие изотопно-меченые стандарты в известной концентрации, после чего полученные смеси наносят на мишень MALDI-TOF масс-спектрометра с использованием α-циано-4-гидроксикоричной кислоты в качестве матрицы, после чего получают масс-спектры в режиме регистрации положительных ионов при установке мощности лазерного излучения на уровне минимального порогового значения, достаточного для десорбции-ионизации образца, причем масс-спектры получают путем суммирования пяти серий по 1000 импульсов лазера для каждой серии, при этом для альфа-2-макроглобулина в качестве изотопно-меченого стандарта используют пептид VGFYESDVMGR, для фетуина А - HTFMGVVSLGSPSGEVSHPR, а для сывороточного амилоида А1 - FFGHGAEDSLADQAANEWGR, в качестве изотопной метки используют стабильный изотоп кислорода ¹⁸О.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что используют масс-спектрометр, оснащенный твердотельным лазером 337 нм

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для внутренней калибровки масс в спектрах используют ионы, соответствующие продуктам автопротеолиза трипсина.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что измерения масс устанавливают не более 50 ppm.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве вариабельной модификации указывают окисление остатков метионина.