Варианты trem2, устойчивые к действию шеддазы

Изобретение относится к биотехнологии. Представлена нуклеиновая кислота, содержащая последовательность, кодирующую TREM2 человека, отличающаяся тем, что TREM2 человека содержит мутантный стеблевой участок, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 33-40, который придает устойчивость к расщеплению шеддазой. Изобретение касается также способа лечения связанного с TREM2 заболевания или нарушения у субъекта, нуждающегося в этом. При этом способ включает введение субъекту, нуждающемуся в лечении, представленной нуклеиновой кислоты. Изобретение позволяет повысить эффективность лечения связанного с TREM2 заболевания или нарушения у субъекта. 8 н. и 26 з.п. ф-лы, 8 ил., 4 табл., 8 пр.

 

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, который был подан в электронном виде в формате ASCII и, таким образом, включен в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте. Указанная копия в формате ASCII, созданная 20 июля 2018 г., называется PAT057836-WO-PCT_SL.txt и имеет размер 60538 байт.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

В настоящем изобретении предусмотрены способы и композиции, касающиеся мутантных вариантов TREM2, устойчивых к расщеплению шеддазой, например мутантных вариантов TREM2 человека, устойчивых к расщеплению шеддазой, и нуклеиновые кислоты, кодирующие такие мутантные варианты TREM2, устойчивые к расщеплению шеддазой.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Триггерные рецепторы, экспрессируемые на миелоидных клетках, или "TREM", представляют собой группу трансмембранных гликопротеинов, которые экспрессируются на поверхности различных типов миелоидных клеток, таких как тучные клетки, моноциты, макрофаги, дендритные клетки и нейтрофилы. TREM имеют характерную для иммуноглобулинов (Ig) складку в своем внеклеточном домене и, таким образом, принадлежат к суперсемейству иммуноглобулинов (IgSF). Рецепторы TREM содержат короткий внутриклеточный домен, но у них отсутствуют стыковочные мотивы для посредников передачи сигнала, и им необходимы адаптерные белки, такие как DAP12 (DNAX-активирующий белок весом 12 кДа), для клеточной активации. Сообщалось о двух представителях TREM: TREM1 и TREM2, оба из которых играют важную роль в иммунных и воспалительных ответах.

TREM2 экспрессируется на поверхности макрофагов, дендритных клеток, остеокластов, клеток микроглии, клеток эпителия легких и клеток гепатокарциномы, но отсутствует в миелоидных клетках крови. TREM2 физически связывается с DAP12, который выполняет функцию сигнального адаптерного белка для TREM2 и ряда других рецепторов клеточной поверхности. Цитоплазматический домен DAP12 содержит иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив (ITAM) (Wunderlich, J. Biol. Chem. 288, 33027-33036, 2013). После активации взаимодействующего рецептора, DAP12 подвергается фосфорилированию по двум консервативным тирозиновым остаткам ITAM с помощью Src-киназ. Последующее рекрутирование и активация протеинкиназы Syk запускает нижележащие сигнальные пути, в том числе активацию митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK) и фосфолипазы Cγ (PLCγ).

TREM2 может быть активирован липополисахаридами (LPS), белком 60 теплового шока, нейритным дебрисом, бактериями и широким спектром анионных и цвиттер-ионных липидов, например фосфатидной кислотой (PA), фосфатидилглицеролом (PG), фосфатидилсерином (PS), фосфатидилинозитолом (PI), фосфатидилхолином (PC) и сфингомиелином. Активация TREM2 повышает фагоцитарную способность микроглии и макрофагов, снижает высвобождение провоспалительных цитокинов и ограничивает передачу сигнала с помощью TLR. TREM2 обеспечивает выживаемость микроглии путем синергизма с передачей сигнала с помощью рецептора CSF-1. Кроме того, TREM2 взаимодействует с плексином A1, регулируя клеточную адгезию и подвижность. Передача сигнала с помощью TREM2 облегчает деградацию поглощенного объекта и имеет решающее значение для метаболизма липидов, поглощения миелина и внутриклеточного распада.

TREM2 подвергается последовательной протеолитической обработке посредством выведения эктодомена и внутримембранного протеолиза (Wunderlich, J. Biol. Chem. 288, 33027-33036, 2013). Во время выведения эктодомена эктодомен TREM2 высвобождается с помощью протеаз, таких как представители семейств ADAM (белок, содержащий домены дизинтегрина и металлопротеиназы) или BACE (фермент, расщепляющий b-сайт APP) (Kleinberger, Sci Transl Med. 2014; 6(243):243ra86). После удаления эктодомена оставшийся удерживаемый мембраной фрагмент дополнительно подвергается внутримембранному протеолизу, опосредованному γ-секретазой. Растворимые фрагменты TREM2 (sTREM2), полученные посредством выведения эктодомена, были обнаружены в супернатантах культур дендритных клеток, а также в образцах плазмы крови и CSF пациентов с невоспалительными неврологическими заболеваниями и рассеянным склерозом (Kleinberger, 2014). Выведенный эктодомен TREM2 (sTREM2) в CSF человека был оценен как потенциальный биомаркер болезни Альцгеймера (AD) и было показано, что его уровень повышается во время старения в целом (Suarez-Calvet, EMBO Molecular Medicine 8, 466-476, 2016). Подробный анализ при AD выявил, что уровень sTREM2 повышается в начале AD до появления клинических симптомов, достигает пика в MCI-AD и остается повышенным, но с более низкими уровнями по сравнению со стадией MCI-AD при деменции, обусловленной AD (Suarez-Calvet, 2016).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном документе предусмотрены мутантные варианты TREM2 человека, устойчивые к расщеплению шеддазой (например, мутантные варианты TREM2 человека, устойчивые к расщеплению с помощью ADAM17 или ADAM10), нуклеиновые кислоты, кодирующие мутантные варианты TREM2 человека, устойчивые к расщеплению шеддазой, и векторы и клетки, содержащие такие нуклеиновые кислоты. Также в данном документе предусмотрены способы повышения экспрессии TREM2 у субъекта и способы лечения связанного с TREM2 заболевания или нарушения у субъекта посредством применения нуклеиновых кислот, кодирующих мутантные варианты TREM2 человека, устойчивые к расщеплению шеддазой, или векторов и клеток, содержащих такие нуклеиновые кислоты.

В одном аспекте в данном документе предусмотрены нуклеиновые кислоты, содержащие последовательность, кодирующую мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению шеддазой (например, мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению DAM17 или ADAM10).

В некоторых вариантах осуществления мутантный вариант TREM2 человека содержит "стеблевой" участок, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 33-40. В некоторых вариантах осуществления мутантный вариант TREM2 человека содержит "стеблевой" участок, состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из любой из SEQ ID NO: 33-40. В некоторых вариантах осуществления мутантный вариант TREM2 человека содержит "стеблевой" участок, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 33-35. В некоторых вариантах осуществления мутантный вариант TREM2 человека содержит "стеблевой" участок, состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из любой из SEQ ID NO: 33-35. В некоторых вариантах осуществления мутантный вариант TREM2 человека содержит аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 41-48. В некоторых вариантах осуществления мутантный вариант TREM2 человека содержит аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 41-48.

В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрены нуклеиновые кислоты содержащие любую из SEQ ID NO: 67-74. В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрены нуклеиновые кислоты содержащие любую из SEQ ID NO: 67-69. В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрены нуклеиновые кислоты содержащие любую из SEQ ID NO: 67, 70 или 74. В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрены нуклеиновые кислоты, содержащие SEQ ID NO: 67.

В некоторых вариантах осуществления такие нуклеиновые кислоты могут содержать промотор, например конститутивный промотор, индуцибельный промотор, синтетический промотор или промотор, специфический в отношении типа клеток. В некоторых вариантах осуществления промотор представляет собой промотор, специфический в отношении типа клеток. Например, промотор может управлять экспрессией нуклеиновых кислот специфически в клетках микроглии, макрофагах или дендритных клетках. В некоторых вариантах осуществления такие нуклеиновые кислоты содержат промотор, выбранный из промотора гена TREM2, промотора гена TMEM119, промотора гена Hexb, промотора гена IBA1, промотора гена CD45, промотора гена CD11b, промотора гена Cst7, промотора гена Lpl, промотора гена Csf1, промотора гена Cs1R, промотора гена Itgax, промотора гена Clec7a, промотора гена Lilrb4, промотора гена Tyrobp, промотора гена Ctsb, промотора гена Ctsd, промотора гена B2m, промотора гена Lyz2, промотора гена Cx3cr1, промотора гена Cst3, промотора гена Ctss, промотора гена P2ry12, промотора гена C1qa или промотора гена C1qb. В некоторых вариантах осуществления такие нуклеиновые кислоты содержат промотор TREM2. В некоторых вариантах осуществления такие нуклеиновые кислоты могут содержать сигнал полиаденилирования.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты, содержащие последовательность, кодирующую мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению шеддазой, могут дополнительно содержать вторую последовательность, кодирующую белок DAP12. В некоторых вариантах осуществления такие нуклеиновые кислоты содержат внутренний сайт посадки рибосомы, вышележащий по отношению ко второй последовательности. В некоторых вариантах осуществления такие нуклеиновые кислоты содержат последовательность 2A, вышележащую по отношению ко второй последовательности, например последовательность 2A, выбранную из любой из SEQ ID NO: 52-66. Белок DAP12 может содержать SEQ ID NO: 49. В некоторых вариантах осуществления белок DAP12 состоит из SEQ ID NO: 49.

В другом аспекте в данном документе предусмотрены векторы (например, векторы экспрессии), которые содержат нуклеиновые кислоты, содержащие последовательность, кодирующую мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению шеддазой. Такие векторы могут быть ДНК-векторами, РНК-векторами, плазмидами, космидами или вирусными векторами. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой вирусный вектор, выбранный из вектора на основе любого из следующих вирусов: лентивируса, аденовируса, аденоассоциированного вируса (AAV), вируса простого герпеса (HSV), парвовируса, ретровируса, вируса осповакцины, вируса Синбис, вируса гриппа, реовируса, вируса ньюкаслской болезни (NDV), вируса кори, вируса везикулярного стоматита (VSV), полиовируса, поксвируса, вируса долины Сенека, вируса Коксаки, энтеровируса, вируса миксомы или вируса Мараба. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой лентивирусный вектор. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой вектор на основе AAV. В некоторых вариантах осуществления вектор дополнительно содержит селектируемый маркер.

В другом аспекте в данном документе предусмотрены клетки, содержащие нуклеиновую кислоту или вектор, которые содержат последовательность, кодирующую мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению шеддазой. Такими клетками могут быть макрофаги, дендритные клетки или клетки микроглии. В некоторых вариантах осуществления клетка может экспрессировать выявляемый маркер.

В дополнительном аспекте в данном документе предусмотрены полипептиды, которые содержат аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 33-40. Также предусмотрены полипептиды, которые содержат аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 41-48.

В дополнительном аспекте в данном документе предусмотрены способы повышения экспрессии TREM2 у субъекта (например, человека) посредством введения субъекту любого из нуклеиновых кислот, векторов или клеток, описанных в данном документе. Субъект может иметь связанное с TREM2 заболевание или нарушение. Такие нуклеиновые кислоты, векторы или клетки можно вводить субъекту внутривенным, внутричерепным, интратекальным, подкожным или интраназальным путем. Способы могут дополнительно предусматривать введение второго средства субъекту.

В дополнительном аспекте в данном документе предусмотрены способы лечения связанного с TREM2 заболевания или нарушения у субъекта (например, человека), нуждающегося в этом, при этом способ предусматривает введение субъекту любого из нуклеиновых кислот, векторов или клеток, описанных в данном документе. Такие нуклеиновые кислоты, векторы или клетки можно вводить субъекту внутривенным, внутричерепным, интратекальным, подкожным или интраназальным путем. Способы могут дополнительно предусматривать введение второго средства субъекту.

В некоторых вариантах осуществления связанное с TREM2 заболевание или нарушение представляет собой нейровоспалительное или нейродегенеративное заболевание, выбранное из болезни Альцгеймера, лобно-височной деменции, болезни Паркинсона, бокового амиотрофического склероза, болезни Насу-Хакола, рассеянного склероза, бокового амиотрофического склероза (ALS), энцефалита с антителами к NMDA-рецепторам, аутизма, волчанки головного мозга (NP-SLE), химиоиндуцированной периферической нейропатии (CIPN), посттерапевтической невралгии, хронической воспалительной демиелинизирующей полинейропатии (CIDP), эпилепсии, синдрома Гийена-Барре (GBS), миозита с тельцами включения, заболеваний лизосомального накопления, сфингомиелинлипидоза (Ниманна-Пика C), мукополисахаридоза II/IIIB, метахроматической лейкодистрофии, мультифокальной моторной нейропатии, тяжелой миастении, болезни Бехчета с вовлечением нервных структур, оптиконейромиелита (NMO), неврита зрительного нерва, полимиозита, дерматомиозита, энцефалита Расмуссена, синдрома Ретта, инсульта, поперечного миелита, травматического повреждения головного мозга, повреждения спинного мозга, вирусного энцефалита или бактериального менингита. В некоторых вариантах осуществления связанное с TREM2 заболевание или нарушение представляет собой болезнь Альцгеймера. В некоторых вариантах осуществления связанное с TREM2 заболевание или нарушение представляет собой лобно-височную деменцию.

В некоторых вариантах осуществления способы, описанные в данном документе, могут дополнительно предусматривать анализ уровня TREM2 человека на клеточной поверхности в образце (например, образце спинномозговой жидкости), полученном от субъекта. Уровень TREM2 человека на клеточной поверхности в образце можно определить с помощью анализа, выбранного из проточной цитометрии, иммуногистохимического исследования, вестерн-блоттинга, иммунофлуоресцентного анализа, радиоиммуноанализа (RIA), твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), гомогенной флуоресценции с временным разрешением (HTRF) или позитронно-эмиссионной томографии (PET).

Также включены пути применения нуклеиновых кислот, векторов, клеток или полипептидов, описанных в данном документе, для лечения связанного с TREM2 заболевания или нарушения у субъекта. Также предусматриваются пути применения нуклеиновых кислот, векторов, клеток или полипептидов, описанных в данном документе, при изготовлении лекарственного препарата для лечения связанного с TREM2 заболевания или нарушения у субъекта.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На фиг. 1A показано иллюстративное выравнивание аминокислотных последовательностей изоформы 1 TREM2 человека (SEQ ID NO: 1), изоформы 1 TREM2 яванского макака (SEQ ID NO: 5) и изоформы 1 TREM2 мыши (SEQ ID NO: 6). "Стеблевой" участок TREM2 включает остатки, заштрихованные светло-серым цветом. Трансмембранный домен TREM2 включает подчеркнутые остатки. На фиг. 1B показано иллюстративное выравнивание аминокислотных последовательностей изоформы 1 TREM2 человека (SEQ ID NO: 1), изоформы 2 (SEQ ID NO: 3) и изоформы 3 (SEQ ID NO: 4). На фиг. 1C показано иллюстративное выравнивание аминокислотных последовательностей "стеблевых" участков изоформы 1 TREM2 человека (SEQ ID NO: 89), изоформы 2 (SEQ ID NO: 8) и изоформы 3 (SEQ ID NO: 9). На фиг. 1D показано иллюстративное выравнивание аминокислотных последовательностей "стеблевых" участков изоформы 1 TREM2 человека (SEQ ID NO: 7), изоформы 1 TREM2 яванского макака (SEQ ID NO: 10) и изоформы 1 TREM2 мыши (SEQ ID NO: 11). На фиг. 1E проиллюстрированы структура TREM2 и его взаимодействие с сигнальным адаптерным белком DAP12. Зрелый TREM2 включает один домен иммуноглобулина (IgSF), "стеблевой" участок, трансмембранный (TM) домен и цитоплазматический домен.

На фиг. 2A-2E показано, что ADAM17 представляет собой ключевую шеддазу для расщепления эктодомена TREM2 в клетках CHO-hDAP12-hTREM2 и макрофагах M2A человека. На фиг. 2A-2B показана экспрессия TREM2 на клеточной поверхности CHO-hDAP12-hTREM2 после обработки ингибиторами ADAM DPC333 (черный круг) или GI254023 (направленный вверх треугольник); результаты дополнительной обработки форболмиристиновой кислотой (PMA) показаны на фиг. 2B. На фиг. 2C-2D показана экспрессия TREM2 на клеточной поверхности макрофагов M2A человека после обработки ингибиторами ADAM DPC333 (черный круг) или GI254023 (направленный вверх треугольник); результаты дополнительной обработки при помощи PMA показаны на фиг. 2D. Окрашивание TREM2 на клеточной поверхности нанесено на график в виде средних значений интенсивности, скорректированных для окрашивания ядер в виде среднего значения ±S.E. (n=3). Показан иллюстративный эксперимент из двух экспериментов. Фиг. 2E представляет собой линейный график, на котором показано ингибирование рекомбинантных ADAM10 и ADAM17 посредством DPC333 и GI254023 in vitro в буфере Hepes при pH 7,5.

Фиг. 3A-3D представляют собой столбчатые гистограммы, на которых показано, что клетки THP1, нокаутные по TREM2 ADAM10, но не ADAM17, имеют повышенный уровень экспрессии TREM2 и сниженный уровень выведенного фрагмента TREM2 (sTREM2). На фиг. 3A показана экспрессия TREM2 на клеточной поверхности в клонах клеток THP1 CRISPR. На фиг. 3B показан уровень sTREM2 супернатантов из клонов клеток THP1 C CRISPR. Данные нанесены на график в виде среднего значения ± S.E. (n=2). * p<0,01, статистическая разница с необработанной группой клона Ctrl gRNA. * p<0,01, статистическая разница с обработанной при помощи PMA группой клона Ctrl gRNA. CtrlgRNA представляет собой клон, трансфицированный контрольной gRNA; AD10 H4 представляет собой нокаутный клон ADAM10 CRISPR; AD17 G12 представляет собой нокаутный клон ADAM17 CRISPR. На фиг. 3C показано отсутствие экспрессии ADAM10 у клона THP1 ADAM10 H4 CRISPR. На панели, расположенной слева, показан контрольный клон CtrlgRNA; на панели, расположенной справа, показан клон AD10 H4. Фиг. 3D представляет собой иллюстративный вестерн-блот-анализ THP1 контрольного клона CtrlgRNA (дорожка 1) и клеток ADAM17 AD17 G12 CRISPR (дорожка 2), показывающий отсутствие экспрессии ADAM17 у клона THP1 ADAM17 G12 CISPR.

На фиг. 4A-4D показан аминокислотный фрагмент в проксимальной части мембраны "стеблевого" участка TREM2, который важен для выведения. На фиг. 4A показана аминокислотная последовательность проксимальной части мембраны "стеблевого" участка TREM2 человека дикого типа или мутантного TREM2 человека. Нумерация аминокислот в соответствии с iProt Q9NZC2. TM: трансмембранный участок. Гэпы указывают на удаленные аминокислоты в соответствующем мутантном варианте. Замененные аминокислоты выделены жирным шрифтом. Подчеркнутые аминокислоты указывают на основной сайт расщепления шеддазой для образования C-конца эктодомена TREM2. Как показано в таблице 4, WT: SEQ ID NO: 12; TRUNC3 (делеция 159-174): SEQ ID NO: 13; TRUNC1: SEQ ID NO: 14; T2del 3-8: SEQ ID NO: 15; T2del 6-11: SEQ ID NO: 16; T2del 11-16: SEQ ID NO: 17; T2-YGG: SEQ ID NO: 18; T2-WFR: SEQ ID NO: 19; двойная мутация T2: SEQ ID NO: 20; T2-IPD: SEQ ID NO: 21; T2-IPP: SEQ ID NO: 22, T2-IDP: SEQ ID NO: 23. Фиг. 4B представляет собой столбчатую гистограмму, на которой показаны результаты анализа с помощью FACS TREM2 WT и мутантных вариантов TREM2, временно экспрессирующихся в клетках HEK293-FT. Клетки обрабатывали через 48 часов после трансфекции при помощи 50 нг/мл PMA или 0,05% DMSO. Клетки отделяли, метили при помощи антисыворотки AF1828 и анализировали посредством проточной цитометрии. Данные нанесены в виде соотношения необработанных клеток и клеток после обработки при помощи PMA для каждого мутантного варианта в виде среднего значения ± S.E. (n=3). Значения статистической разницы с WT рассчитывали посредством ANOVA с критерием множественного сравнения Даннетта. *P<0,01. Фиг. 4C представляет собой столбчатую гистограмму, на которой показана активация гена с помощью двойного мутантного варианта TREM2, показанного на фиг. 4A. Двойной мутантный вариант TREM2 стабильно экспрессировался в клетках BWZ-lacZ-mDAP12. Клетки высевали на активирующие моноклональные антитела или изотипический контроль и активность репортерного гена оценивали через 16 ч. Данные нанесены в виде соотношения RGA для активирующих/контрольных Ab в виде среднего значения ± S.E. (n=3). Фиг. 4D представляет собой столбчатую гистограмму, на которой показано, что замена трех аминокислот в сайте расщепления шеддазой сильно повышает экспрессию TREM2 на клеточной поверхности. Результаты анализа с помощью FACS TREM2 WT и мутантных вариантов TREM2, временно экспрессирующихся в клетках HEK293-FT. Клетки обрабатывали через 48 ч. после трансфекции при помощи 50 нг/мл PMA или 0,05% DMSO. Клетки отделяли, метили при помощи антисыворотки AF1828 и анализировали посредством проточной цитометрии. Данные нанесены в виде соотношения необработанных клеток и клеток после обработки при помощи PMA для каждого мутантного варианта в виде среднего значения ± S.E. (n=3). Значения статистической разницы рассчитывали посредством ANOVA с критерием множественного сравнения Даннетта. *P < 0,01.

На фиг. 5A-5E показано, что ADAM17 расщепляет пептиды "стеблевого" участка TREM2 in vitro в H157-S158. На фиг. 5A показаны аминокислотные последовательности синтетических пептидов, полученных из "стеблевого" участка TREM2 для анализов расщепления in vitro. Все пептиды получали с N-концевой флуоресцентной меткой 7-метоксикумарина (Mca) на C-конце. Подчеркнутые аминокислоты указывают на основной сайт расщепления шеддазой. AA112-171: SEQ ID NO: 24; пептид 1: SEQ ID NO: 25; пептид 2: SEQ ID NO: 26; пептид 3: SEQ ID NO: 27; пептид 1a: SEQ ID NO: 28; пептид 2a: SEQ ID NO: 29; пептид 4: SEQ ID NO: 30; пептид 5: SEQ ID NO: 31; пептид 6: SEQ ID NO: 32. На фиг. 5B показаны результаты анализа с помощью HPLC расщепления пептида 3 (10 мкМ) посредством ADAM17 (31 нМ) в течение 1, 5 или 24 часов. На фиг. 5C показаны результаты анализа с помощью HPLC расщепления пептида 3 (10 мкМ) посредством ADAM17 (31 нМ) в течение 48 часов с идентификацией основного продукта и 2 второстепенных продуктов. На фиг. 5C раскрыты соответственно SEQ ID NO: 83, 51 и 84 в порядке появления. На фиг. 5D показана динамика расщепления пептида 1, пептида 2 или пептида 3 посредством ADAM17 (среднее значение 2 экспериментов). На фиг. 5E показана динамика расщепления пептида 4, пептида 5 или пептида 6 посредством ADAM17 (среднее значение 2 экспериментов).

На фиг. 6A показана идентификация C-конца выведенного эктодомена TREM2 из клеток HEK-FT, временно трансфицированных с помощью TREM2 WT или TREM2 R47H человека (SEQ ID NO: 85) и DAP12. Массив ионов 3-кратно заряженного [D137-H157] иона пептида, масса/заряд 791,94-792,06. Ион пептида, представляющий интерес, явно присутствует во всех четырех продуктах расщепления трипсином выведенного фрагмента TREM2 (массив ионов, выделенный прямоугольником). * иллюстрирует неизвестный пептид, присутствующий в виде 5-кратно заряженного иона, и ** представляет собой дезаминированную форму того же пептида. На фиг. 6B показан MS^E-спектр после деконволюции пептида D₁₃₇-H₁₅₇ (SEQ ID NO: 85). Панель, расположенная сверху, указывает какие ионы фрагментов b и y идентифицированы. Данный масс-спектр из продукта расщепления трипсином TREM2 R47H PMA.

На фиг. 7 показана идентификация выведенного эктодомена TREM2 из клеток HEK-FT, временно трансфицированных с помощью hTREM2 WT или мутантного варианта hTREM2 R47H и hDAP12. Масс-спектры 4 масс-спектров после деконволюции: выведенный hTREM2 [19-157] явно присутствует во всех четырех экстрактах клеточных супернатантов. Клеточные супернатанты были обработаны PNGазой F и сиалидазой A после аффинной очистки, но не были восстановлены.

На фиг. 8A-8C показано определение сайта (сайтов) O-гликозилирования в пределах "стеблевого" участка TREM2. TREM2-His сначала обрабатывали сиалидазой A, затем восстанавливали, алкилировали, далее обрабатывали PNGазой F. Полученный образец затем расщепляли либо трипсином, либо ферментом Asp- и Glu-C. Продукты расщепления анализировали посредством LC-MS^E. Фиг. 8A: масс-спектр после деконволюции, объединенные сканы: 1926:2097 (SEQ ID NO: 86). Фиг. 8B: масс-спектр после деконволюции, объединенные сканы: 1566:1584 (SEQ ID NO: 87). Фиг. 8C: масс-спектр после деконволюции, объединенные сканы: 1373:1477 (SEQ ID NO: 88).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

В данном документе предусмотрены мутантные варианты TREM2 человека, устойчивые к расщеплению шеддазой (например, мутантные варианты TREM2 человека, устойчивые к расщеплению с помощью ADAM17 или ADAM10), нуклеиновые кислоты, кодирующие мутантные варианты TREM2 человека, устойчивые к расщеплению шеддазой, и векторы и клетки, содержащие такие нуклеиновые кислоты. Также в данном документе предусмотрены способы повышения экспрессии TREM2 у субъекта и способы лечения связанного с TREM2 заболевания или нарушения у субъекта посредством применения нуклеиновых кислот, кодирующих мутантные варианты TREM2 человека, устойчивые к расщеплению шеддазой, или векторов и клеток, содержащих такие нуклеиновые кислоты.

TREM-2 опосредует нефлогистический фагоцитоз бактерий и погибающих клеток и ослабляет воспалительные ответы. Гомозиготная потеря функции TREM-2 человека вызывает болезнь Насу-Хакола (поликистозную липомембранную остеодисплазию со склерозирующей лейкоэнцефалопатией, "PLOSL"), или синдром, подобный лобно-височной деменции (FTD), заболевания, характеризующиеся костными кистами, нейровоспалением, прогрессирующей нейродегенерацией и пресенильной деменцией. Гетерозиготная потеря функциональной мутации R47H TREM-2 представляет собой также важный фактор риска в отношении болезни Альцгеймера (AD) с поздним началом, с величиной эффекта, которая подобна величине эффекта аллеля аполипопротеина E ε4. TREM-2 экспрессируется в клетках микроглии, обнаруженной в белом веществе, гиппокампе и неокортексе, что частично согласуется с патологическими признаками, об обнаружении которых в головном мозге сообщалось при AD, подтверждая возможное участие TREM-2 в патогенезе AD. При помощи генетических скринингов в настоящий момент также идентифицированы гетерозиготные миссенс-мутации в TREM2 как факторы риска в отношении болезни Паркинсона (PD), бокового амиотрофического склероза (ALS) и лобно-височной деменции (FTD), в дополнение к AD (Kleinberger, Sci Transl Med. 2014 Jul 2;6(243):243ra86). Таким образом, функциональный TREM-2 необходим для защиты против связанных со старением нейровоспалительных и нейродегенеративных заболеваний, которые вызывают тяжелое когнитивное нарушение и деменцию.

Из-за альтернативного сплайсинга существует три изоформы TREM2 человека, причем изоформа 1 является самой длинной изоформой. Аминокислотные последовательности изоформы 1 TREM2 человека (SEQ ID NO: 1), изоформы 2 TREM2 человека (SEQ ID NO: 3) и изоформы 3 TREM2 человека (SEQ ID NO: 4) выровнены на фиг.1B. При помощи выравнивания аминокислотных последовательностей "стеблевых" участков изоформы 1 TREM2 человека (SEQ ID NO: 89), изоформы 2 (SEQ ID NO: 8) и изоформы 3 (SEQ ID NO: 9) выявлено, что последовательность "стеблевого" участка изоформы 1 TREM2 человека приблизительно на 79% идентична последовательностям "стеблевого" участка изоформы 2 или 3 TREM2 человека (фиг.1C).

Аминокислотные последовательности изоформы 1 TREM2 человека (SEQ ID NO: 1), изоформы 1 TREM2 яванского макака (SEQ ID NO: 5) и изоформы 1 TREM2 мыши (SEQ ID NO: 6) выровнены на фиг.1A. При помощи выравнивания аминокислотных последовательностей "стеблевых" участков изоформы 1 TREM2 человека (SEQ ID NO: 7), изоформы 1 TREM2 яванского макака (SEQ ID NO: 10) и изоформы 1 TREM2 мыши (SEQ ID NO: 11) выявлено, что последовательность "стеблевого" участка изоформы 1 TREM2 человека на 98% идентична последовательности "стеблевого" участка изоформы 1 TREM2 яванского макака и на 69% идентична последовательности "стеблевого" участка изоформы 1 TREM2 мыши (фиг.1D). На фиг.1E проиллюстрированы структура TREM2 и его взаимодействие с сигнальным адаптерным белком DAP12.

Определения

Используемая в описании и формуле изобретения форма единственного числа включает ссылки на форму множественного числа, если исходя из контекста явно не подразумевается иное. Например, термин "клетка" включает множество клеток, в том числе их смеси.

Все числовые обозначения, например pH, температура, время, концентрация и молекулярный вес, в том числе диапазоны, представляют собой приближения, которые изменяются (+) или (-) с шагом 0,1. Следует понимать, хотя это не всегда указано в явной форме, что всем числовым обозначениям предшествует термин "приблизительно". Также следует понимать, хотя это не всегда указано в явной форме, что реагенты, описанные в данном документе, представляют собой только примеры и что соответствующие им эквиваленты известны из уровня техники.

Используемый в данном документе термин "TREM2" (также известный как "триггерный рецептор 2, экспрессируемый на миелоидных клетках", TREM-2, TREM2a, TREM2b или TREM2c) означает гликопротеин, кодируемый геном TREM2. TREM2 человека принадлежит к суперсемейству иммуноглобулинов (IgSF) и включает сигнальный пептид, один домен иммуноглобулина V-типа (IgV), "стеблевой" участок, трансмембранный домен и цитоплазматический хвост. Ген TREM2 человека картирован на хромосоме в местоположении 6p21,1 и геномную последовательность гена TREM2 человека можно найти в GenBank под номером NC_000006.12. Из-за альтернативного сплайсинга существует по меньшей мере три изоформы TREM2 человека. Термин "TREM2 человека" используют для обозначения любой изоформы TREM2 человека. Последовательности белка и mRNA для самой длинной изоформы TREM2 человека (изоформа 1) представляют собой приведенное ниже.

Предшественник изоформы 1 предшественника триггерного рецептора 2, экспрессируемого на миелоидных клетках [Homo sapiens] (NP_061838.1)

MEPLRLLILLFVTELSGAHNTTVFQGVAGQSLQVSCPYDSMKHWGRRKAWCRQLGEKGPCQRVVSTHNLWLLSFLRRWNGSTAITDDTLGGTLTITLRNLQPHDAGLYQCQSLHGSEADTLRKVLVEVLADPLDHRDAGDLWFPGESESFEDAHVEHSISRSLLEGEIPFPPTSILLLLACIFLIKILAASALWAAAWHGQKPGTHPPSELDCGHDPGYQLQTLPGLRDT (SEQ ID NO: 1)

Триггерный рецептор 2 Homo sapiens, экспрессируемый на миелоидных клетках (TREM2), вариант транскрипта 1, mRNA (NM_018965.3)

gggcagcgcc tgacatgcct gatcctctct tttctgcagt tcaagggaaa gacgagatct tgcacaaggc actctgcttc tgcccttggc tggggaaggg tggcatggag cctctccggc tgctcatctt actctttgtc acagagctgt ccggagccca caacaccaca gtgttccagg gcgtggcggg ccagtccctg caggtgtctt gcccctatga ctccatgaag cactggggga ggcgcaaggc ctggtgccgc cagctgggag agaagggccc atgccagcgt gtggtcagca cgcacaactt gtggctgctg tccttcctga ggaggtggaa tgggagcaca gccatcacag acgataccct gggtggcact ctcaccatta cgctgcggaa tctacaaccc catgatgcgg gtctctacca gtgccagagc ctccatggca gtgaggctga caccctcagg aaggtcctgg tggaggtgct ggcagacccc ctggatcacc gggatgctgg agatctctgg ttccccgggg agtctgagag cttcgaggat gcccatgtgg agcacagcat ctccaggagc ctcttggaag gagaaatccc cttcccaccc acttccatcc ttctcctcct ggcctgcatc tttctcatca agattctagc agccagcgcc ctctgggctg cagcctggca tggacagaag ccagggacac atccacccag tgaactggac tgtggccatg acccagggta tcagctccaa actctgccag ggctgagaga cacgtgaagg aagatgatgg gaggaaaagc ccaggagaag tcccaccagg gaccagccca gcctgcatac ttgccacttg gccaccagga ctccttgttc tgctctggca agagactact ctgcctgaac actgcttctc ctggaccctg gaagcaggga ctggttgagg gagtggggag gtggtaagaa cacctgacaa cttctgaata ttggacattt taaacactta caaataaatc caagactgtc atatttagct ggataaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa (SEQ ID NO: 2)

Аминокислотные последовательности изоформы 2 TREM2 человека (SEQ ID NO: 3) и изоформы 3 (SEQ ID NO: 4) показаны на фиг. 1B. В некоторых вариантах осуществления термин "белок TREM2" также охватывает белки, которые по всей длине последовательности по меньшей мере приблизительно на 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичны любой из SEQ ID NO: 1, 3 или 4, где такие белки все еще имеют способность к связыванию лиганда, внутриклеточной сигнализации, облегчению фагоцитоза и деградации фагоцитированного материала, и другим регуляторным функциям TREM2. Последовательности белков TREM2 мыши, яванского макака и других животных известны из уровня техники (например, NP_112544.1 и NP_001259007.1 для мышиного белка TREM2).

Термин "внеклеточный домен" означает часть трансмембранного белка, которая экспонирована на внеклеточной стороне липидного бислоя клетки. Способы определения эктодомена белка известны из уровня техники (Singer (1990); High et al. (1993), и программное обеспечение McVector, Oxford Molecular). Например, внеклеточный домен белка TREM2 человека может включать аминокислотные остатки от 14 до 174 из SEQ ID NO: 1 (изоформа 1), аминокислотные остатки от 14 до 168 из SEQ ID NO: 3 (изоформа 2) или аминокислотные остатки от 14 до 171 из SEQ ID NO: 4 (изоформа 3).

Термин "эктодомен" TREM2 означает часть внеклеточного домена TREM2, которая высвобождается после расщепления шеддазой.

Термин "стеблевой" участок TREM2 означает часть внеклеточного домена TREM2, которая соединяет домен иммуноглобулина V-типа (IgV) и трансмембранный домен.

Термин "трансмембранный домен" означает часть трансмембранного белка, которая пронизывает липидный бислой клетки. Способы определения трансмембранного домена белка известны из уровня техники (Elofsson et al. (2007) Annu. Rev. Biochem. 76:125-140; Bernsel et al. (2005) Protein Science 14:1723-1728).

Термины "цитоплазматический домен" и "цитоплазматический хвост" используют взаимозаменяемо, и они означают часть трансмембранного белка, которая находится на цитоплазматической стороне липидного бислоя клетки. Способы определения цитоплазматического хвоста белка известны из уровня техники (Elofsson et al. (2007) and Bernsel et al. (2005)).

Термины "расщепление устойчивого мутантного варианта TREM2" и "мутантный вариант TREM2, устойчивый к расщеплению шеддазой" используют взаимозаменяемо в данном документе, и они означают мутантный вариант TREM2, который содержит одну или несколько мутаций рядом с сайтом расщепления шеддазой, которая расщепляет TREM2 дикого типа (например, ADAM17 или ADAM10), и таким образом с меньшей степенью подвержен расщеплению шеддазой, например с приблизительно на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% меньшей степенью подвержен расщеплению шеддазой по сравнению с белком TREM2 дикого типа в тех же условиях. "Мутантный вариант TREM2, устойчивый к расщеплению" может иметь меньшую вероятность выведения эктодомена, например приблизительно на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% меньшую вероятность выведения, чем белок TREM2 дикого типа в тех же условиях. Такие устойчивые к расщеплению мутантные варианты TREM2 могут иметь меньшую вероятность выведения, в то время как сохраняют ключевые функции TREM2, например все еще могут иметь способность к связыванию лиганда, внутриклеточной передаче сигнала, облегчению фагоцитоза и деградации фагоцитированного материала и другим регуляторным функциям TREM2.

Используемый в данном документе термин "DAP12" (также известный как TYROBP; KARAP; PLOSL) означает трансмембранный сигнальный полипептид, который содержит иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив (ITAM) в своем цитоплазматическом домене. Последовательности белка и mRNA для самой длинной изоформы DAP12 человека (изоформа 1) представляют собой приведенное ниже.

Предшественник изоформы 1 белка TYRO, связывающего тирозиновую протеинкиназу [Homo sapiens] (NP_003323.1)

MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSGLRPVQAQAQSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYK (SEQ ID NO: 49)

Белок TYRO Homo sapiens, связывающий тирозиновую протеинкиназу (TYROBP), вариант транскрипта 1, mRNA (NM_003332.3)

agacttcctc cttcacttgc ctggacgctg cgccacatcc caccggccct tacactgtgg tgtccagcag catccggctt catgggggga cttgaaccct gcagcaggct cctgctcctg cctctcctgc tggctgtaag tggtctccgt cctgtccagg cccaggccca gagcgattgc agttgctcta cggtgagccc gggcgtgctg gcagggatcg tgatgggaga cctggtgctg acagtgctca ttgccctggc cgtgtacttc ctgggccggc tggtccctcg ggggcgaggg gctgcggagg cagcgacccg gaaacagcgt atcactgaga ccgagtcgcc ttatcaggag ctccagggtc agaggtcgga tgtctacagc gacctcaaca cacagaggcc gtattacaaa tgagcccgaa tcatgacagt cagcaacatg atacctggat ccagccattc ctgaagccca ccctgcacct cattccaact cctaccgcga tacagaccca cagagtgcca tccctgagag accagaccgc tccccaatac tctcctaaaa taaacatgaa gcacaaaaac aaaaaaaaaa aaaaaaaa (SEQ ID NO: 50)

Термин "лечить" или "лечение" означает как терапевтическое лечение, так и профилактические или превентивные меры, где целью является предупреждение или замедление нежелательного физиологического изменения или нарушения. Для целей настоящего изобретения благоприятные или требуемые клинические результаты включают без ограничения выявляемое или невыявляемое ослабление симптомов, уменьшение степени выраженности заболевания, стабилизацию (т. е. отсутствие ухудшения) состояния заболевания, задержку или замедление прогрессирования заболевания, облегчение или смягчение болезненного состояния и ремиссию (либо частичную, либо полную). "Лечение" может также означать увеличение выживаемости по сравнению с ожидаемой выживаемостью при отсутствии получения лечения.

Термин "субъект" означает животное, человека или отличное от человека животное, в отношении которого обеспечивают лечение в соответствии со способами по настоящему изобретению. Предусматриваются ветеринарные и отличные от ветеринарных пути применения. Данный термин включает без ограничения млекопитающих, например человека, других приматов, свиней, грызунов, таких как мыши и крысы, кроликов, морских свинок, хомяков, коров, лошадей, кошек, собак, овец и коз. К типичным субъектам относятся люди, сельскохозяйственные животные и домашние животные, такие как кошки и собаки.

"Эффективное количество" означает количество, достаточное для достижения благоприятных или требуемых результатов. Например, терапевтическое количество представляет собой такое количество, при котором достигается необходимый терапевтический эффект. Данное количество может быть тем же или отличным от профилактически эффективного количества, которое представляет собой количество, необходимое для предупреждения начала заболевания или симптомов заболевания. Эффективное количество можно вводить посредством одного или нескольких введений, применений или доз. "Терапевтически эффективное количество" терапевтического соединения (т. е. эффективная доза) зависит от выбранных терапевтических соединений. Композиции можно вводить от одного или нескольких раз в день до одного или нескольких раз в неделю; в том числе один раз в два дня. Специалист в данной области поймет, что некоторые факторы могут влиять на дозу и время, необходимые для эффективного лечения субъекта, в том числе без ограничения тяжесть заболевания или нарушения, предыдущие виды лечения, общее состояние здоровья и/или возраст субъекта и наличие других заболеваний. Более того, лечение субъекта терапевтически эффективным количеством терапевтических соединений, описанных в данном документе, может включать один сеанс лечения или ряд сеансов лечения.

Термин "нуклеиновая кислота" или "полинуклеотид" означает дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК) или рибонуклеиновые кислоты (РНК) и их полимеры в однонитевой или двухнитевой форме. Если специально не ограничено, термин охватывает нуклеиновые кислоты, содержащие известные аналоги природных нуклеотидов, которые имеют свойства связывания, подобные свойствам эталонной нуклеиновой кислоты, и метаболизируются способом, подобным способу для встречающихся в природе нуклеотидов. Если не указано иное, конкретная последовательность нуклеиновой кислоты также косвенно охватывает ее варианты с консервативными модификациями (например, с заменами вырожденными кодонами), аллели, ортологи, SNP и комплементарные последовательности, а также явно указанную последовательность. В частности, замены вырожденными кодонами можно осуществлять путем получения последовательностей, в которых в третьем положении одного или нескольких выбранных (или всех) кодонов произведена замена любым из канонических оснований и/или остатками дезоксиинозина (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985) и Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).

Термины "пептид", "полипептид" и "белок" используют взаимозаменяемо, и они означают соединение, состоящее из аминокислотных остатков, ковалентно связанных пептидными связями. Белок или пептид должен содержать по меньшей мере две аминокислоты, и не установлено ограничение в отношении максимального количества аминокислот, которые может содержать последовательность белка или пептида. Полипептиды включают любой пептид или белок, содержащий две или более аминокислоты, соединенные друг с другом пептидными связями. Используемый в данном документе термин означает как короткие цепи, которые также обычно называются в уровне техники, например, как пептиды, олигопептиды и олигомеры, так и более длинные цепи, которые обычно называются в уровне техники как белки, которых существует множество типов. "Полипептиды" включают, например, среди прочих, биологически активные фрагменты, в значительной степени гомологичные полипептиды, олигопептиды, гомодимеры, гетеродимеры, варианты полипептидов, модифицированные полипептиды, производные, аналоги, слитые белки. Полипептид предусматривает природный пептид, рекомбинантный пептид или их комбинацию.

Термин "консервативные модификации последовательности" означает модификации аминокислот, которые не оказывают значительного влияния на характеристики связывания антитела или фрагмента антитела, содержащего аминокислотную последовательность, или значительно не изменяют их. Такие консервативные модификации включают аминокислотные замены, добавления и делеции. Модификации можно вводить в антитело или фрагмент антитела посредством стандартных методик, известных из уровня техники, таких как сайт-направленный мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез. Консервативные аминокислотные замены представляют собой замены, при которых аминокислотный остаток заменяют аминокислотным остатком, имеющим подобную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих подобные боковые цепи, были определены в уровне техники. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин).

Термин "гомологичный" или "идентичность" означает идентичность последовательностей субъединиц между двумя полимерными молекулами, например между двумя молекулами нуклеиновой кислоты, такими как две молекулы ДНК или две молекулы РНК, или между двумя молекулами полипептидов. Если положение субъединицы в обеих из двух молекул занимает одна и та же мономерная субъединица, например, если положение в каждой из двух молекул ДНК занято аденином, то они являются гомологичными или идентичными по данному положению. Гомология между двумя последовательностями находится в прямой зависимости от количества совпадающих или гомологичных положений; например, если половина (например, пять положений в полимере длиной десять субъединиц) положений в двух последовательностях являются гомологичными, то эти две последовательности являются гомологичными на 50%; если 90% положений (например, 9 из 10) являются совпадающими или гомологичными, то две последовательности являются гомологичными на 90%. Процент "идентичности последовательности" можно определить посредством сравнения двух оптимально выровненных последовательностей в пределах окна сравнения, при этом для оптимального выравнивания этих двух последовательностей фрагмент аминокислотной последовательности в окне сравнения может содержать добавления или делеции (например, гэпы или выступы) по сравнению с эталонной последовательностью (которая не содержит добавлений или делеций). Процент можно рассчитать посредством определения количества положений, в которых в обеих последовательностях встречается идентичный аминокислотный остаток, с получением количества совпадающих положений, деления количества совпадающих положений на общее количество положений в окне сравнения и умножения результата на 100 с получением процента идентичности последовательностей. Результатом является процент идентичности рассматриваемой последовательности относительно запрашиваемой последовательности.

Термин "выделенный" означает измененный относительно природного состояния или извлеченный из него. Например, нуклеиновая кислота или пептид, в природных условиях присутствующие в живом животном, не являются "выделенными", но те же нуклеиновая кислота или пептид, частично или полностью отделенные от сопутствующих материалов в своем природном состоянии, являются "выделенными". Выделенные нуклеиновая кислота или белок могут существовать в значительной степени очищенной форме или могут существовать в ненативной среде, такой как, например, клетка-хозяин. Выделенное антитело в значительной степени не содержит других антител, имеющих отличающиеся типы антигенной специфичности (например, выделенное антитело, которое специфически связывает TREM2, в значительной степени не содержит других антител, которые специфически связывают другие антигены, отличные от TREM2). Выделенное антитело, которое специфически связывает целевую молекулу, может, однако, иметь перекрестную реактивность к одним и тем же антигенам других видов, например, выделенное антитело, которое специфически связывает TREM2, может связывать молекулы TREM2 других видов. Более того, выделенное антитело может в значительной степени не содержать других клеточного материала и/или химических веществ.

Если не определено иное, все применяемые в данном документе технические и научные термины имеют то же значение, которое обычно понимают рядовые специалисты в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Хотя при осуществлении на практике настоящего изобретения можно применять способы и материалы, подобные или эквивалентные тем, которые описаны в данном документе, ниже описаны подходящие способы и материалы. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие ссылки, упомянутые в данном документе, включены посредством ссылки во всей своей полноте. В случае расхождений настоящее описание, в том числе определения, будет иметь преимущественную силу. Кроме того, материалы, способы и примеры являются исключительно иллюстративными и не предполагаются как ограничивающие.

Мутантные варианты TREM2, устойчивые к расщеплению шеддазой

TREM2 подвергается последовательной протеолитической обработке посредством выведения эктодомена и внутримембранного протеолиза (Wunderlich, J. Biol. Chem. 288, 33027-33036, 2013). Во время выведения эктодомена эктодомен TREM2 высвобождается с помощью протеаз, таких как представители семейств ADAM (белок, содержащий домены дизинтегрина и металлопротеиназы) или BACE (фермент, расщепляющий b-сайт APP) (Kleinberger, Sci Transl Med. 2014 Jul 2;6(243):243ra86). Растворимые фрагменты TREM2 (sTREM2), полученные посредством выведения эктодомена, были обнаружены в супернатантах культур дендритных клеток, а также в образцах плазмы крови и CSF пациентов с невоспалительными неврологическими заболеваниями и рассеянным склерозом (Kleinberger, 2014). Подробный анализ при болезни Альцгеймера (AD) выявил, что уровень sTREM2 повышается в начале AD до появления клинических симптомов, достигает пика в MCI-AD и остается повышенным, но с более низкими уровнями по сравнению со стадией MCI-AD при деменции, обусловленной AD (Suarez-Calvet, EMBO molecular medicine 8, 466-476, 2016).

С учетом данных, представленных в настоящем документе, идентифицировали ADAM17 как основную шеддазу, ответственную за конститутивное выведение (пример 2). Отсечение с помощью ADAM17 уменьшает вероятность конститутивного выведения TREM2 и повышает уровень TREM2 на клеточной поверхности (пример 3). После обработки форболмиристиновой кислотой (PMA) начинают действовать дополнительные механизмы выведения, один из которых может включать ADAM10 (пример 3). Было идентифицировано две области, которые важны для индуцированного PMA выведения TREM2: проксимальная область мембраны с аминокислотами 169-172 и дистальная область мембраны в участке аминокислот 156-164 (пример 4). При помощи анализа с помощью HPLC показано, что связь H157-S158 в TREM2 представляет собой основной сайт расщепления для ADAM17 (пример 5). Выведенный эктодомен TREM2 из клеток характеризовали и подтверждали, что основной сайт расщепления находится между H157 и S158 (пример 6). Отсутствие O-гликозилирования идентифицировали в положениях, расположенных близко к сайту расщепления: S160 или S168 (пример 7). Показано, что мутантные варианты TREM2 с мутациями в сайте расщепления шеддазой имеют повышенный уровень экспрессии на клеточной поверхности и повышенную устойчивость к расщеплению шеддазой (пример 8).

В данном документе предусмотрены мутантные варианты TREM2, устойчивые к расщеплению шеддазой (или "устойчивые к расщеплению мутантные варианты TREM2"), например мутантные варианты TREM2 человека, устойчивые к расщеплению шеддазой (или "устойчивые к расщеплению мутантные варианты TREM2 человека"). В некоторых вариантах осуществления устойчивые к расщеплению мутантные варианты TREM2 устойчивы к расщеплению с помощью ADAM17 или ADAM10. В некоторых вариантах осуществления устойчивые к расщеплению мутантные варианты TREM2 содержат мутантный "стеблевой" участок. Например, устойчивые к расщеплению мутантные варианты TREM2 могут содержать одну или несколько мутаций рядом с сайтом расщепления шеддазой. В некоторых вариантах осуществления устойчивые к расщеплению мутантные варианты TREM2 содержат одну или несколько мутаций рядом с сайтом расщепления с помощью ADAM17 между H157 и S158.

В некоторых вариантах осуществления мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению шеддазой, содержит "стеблевой" участок, содержащий любую из аминокислотных последовательностей, предусмотренных в таблице 1. В некоторых вариантах осуществления мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению шеддазой, содержит "стеблевой" участок, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 33-40. В некоторых вариантах осуществления мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению шеддазой, содержит "стеблевой" участок, состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из любой из SEQ ID NO: 33-40. В некоторых вариантах осуществления мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению шеддазой, содержит "стеблевой" участок, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 33-35. В некоторых вариантах осуществления мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению шеддазой, содержит "стеблевой" участок, состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из любой из SEQ ID NO: 33-35. В некоторых вариантах осуществления мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению шеддазой, содержит "стеблевой" участок, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 33, 36, 40. В некоторых вариантах осуществления мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению шеддазой, содержит "стеблевой" участок, состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из любой из SEQ ID NO: 33, 36, 40. В некоторых вариантах осуществления мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению шеддазой, содержит "стеблевой" участок, содержащий SEQ ID NO: 33. В некоторых вариантах осуществления мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению шеддазой, содержит "стеблевой" участок, состоящий из SEQ ID NO: 33.

Таблица 1. Иллюстративные аминокислотные последовательности "стеблевого" участка мутантного варианта TREM2 человека, устойчивого к расщеплению шеддазой

Название	SEQ ID NO	Последовательность
T2-IPD	33	SLHGSEADTLRKVLVEVLADPLDHRDAGDLWFPGESESFEDAHVEIPDSRSLLEGEIPFPPTS
T2-IPP	34	SLHGSEADTLRKVLVEVLADPLDHRDAGDLWFPGESESFEDAHVEIPPSRSLLEGEIPFPPTS
T2-IDP	35	SLHGSEADTLRKVLVEVLADPLDHRDAGDLWFPGESESFEDAHVEIDPSRSLLEGEIPFPPTS
TRUNC3 (делеция 159-174)	36	SLHGSEADTLRKVLVEVLADPLDHRDAGDLWFPGESESFEDAHVEHS
T2del 11-16	37	SLHGSEADTLRKVLVEVLADPLDHRDAGDLWFPGESESFEDAHVEHSEGEIPFPPTS
T2-YGG	38	SLHGSEADTLRKVLVEVLADPLDHRDAGDLWFPGESESFEDAHVYGGWGGWGPEGEIPFPPTS
T2-WFR	39	SLHGSEADTLRKVLVEVLADPLDHRDAGDLWFPGESESFEDAHVEHSISRSLLEGEIWFRWTS
Двойная мутация T2	40	SLHGSEADTLRKVLVEVLADPLDHRDAGDLWFPGESESFEDAHVYGGWGGWGPEGEIWFRWTS

В некоторых вариантах осуществления мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению шеддазой, содержит аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей, предусмотренных в таблице 2. В некоторых вариантах осуществления мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению шеддазой, содержит аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 41-48. В некоторых вариантах осуществления мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению шеддазой, состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из любой из SEQ ID NO: 41-48. В некоторых вариантах осуществления мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению шеддазой, содержит аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 41-43. В некоторых вариантах осуществления мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению шеддазой, состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из любой из SEQ ID NO: 41-43. В некоторых вариантах осуществления мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению шеддазой, содержит аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 41, 44, 48. В некоторых вариантах осуществления мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению шеддазой, состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из любой из SEQ ID NO: 41, 44, 48. В некоторых вариантах осуществления мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению шеддазой, содержит SEQ ID NO: 41. В некоторых вариантах осуществления мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению шеддазой, состоит из SEQ ID NO: 41.

Также в данном документе предусмотрены полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 33-40. В некоторых вариантах осуществления полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 33-40. В некоторых вариантах осуществления полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 41-48. В некоторых вариантах осуществления полипептид состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из любой из SEQ ID NO: 41-48. В некоторых вариантах осуществления полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 41-43. В некоторых вариантах осуществления полипептид состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из любой из SEQ ID NO: 41-43.

Таблица 2. Иллюстративные аминокислотные последовательности мутантного варианта TREM2 человека, устойчивого к расщеплению шеддазой

Название	SEQ ID NO	Последовательность
T2-IPD	41	MEPLRLLILLFVTELSGAHNTTVFQGVAGQSLQVSCPYDSMKHWGRRKAWCRQLGEKGPCQRVVSTHNLWLLSFLRRWNGSTAITDDTLGGTLTITLRNLQPHDAGLYQCQSLHGSEADTLRKVLVEVLADPLDHRDAGDLWFPGESESFEDAHVEIPDSRSLLEGEIPFPPTSILLLLACIFLIKILAASALWAAAWHGQKPGTHPPSELDCGHDPGYQLQTLPGLRDT
T2-IPP	42	MEPLRLLILLFVTELSGAHNTTVFQGVAGQSLQVSCPYDSMKHWGRRKAWCRQLGEKGPCQRVVSTHNLWLLSFLRRWNGSTAITDDTLGGTLTITLRNLQPHDAGLYQCQSLHGSEADTLRKVLVEVLADPLDHRDAGDLWFPGESESFEDAHVEIPPSRSLLEGEIPFPPTSILLLLACIFLIKILAASALWAAAWHGQKPGTHPPSELDCGHDPGYQLQTLPGLRDT
T2-IDP	43	MEPLRLLILLFVTELSGAHNTTVFQGVAGQSLQVSCPYDSMKHWGRRKAWCRQLGEKGPCQRVVSTHNLWLLSFLRRWNGSTAITDDTLGGTLTITLRNLQPHDAGLYQCQSLHGSEADTLRKVLVEVLADPLDHRDAGDLWFPGESESFEDAHVEIDPSRSLLEGEIPFPPTSILLLLACIFLIKILAASALWAAAWHGQKPGTHPPSELDCGHDPGYQLQTLPGLRDT
TRUNC3 (делеция 159-174)	44	MEPLRLLILLFVTELSGAHNTTVFQGVAGQSLQVSCPYDSMKHWGRRKAWCRQLGEKGPCQRVVSTHNLWLLSFLRRWNGSTAITDDTLGGTLTITLRNLQPHDAGLYQCQSLHGSEADTLRKVLVEVLADPLDHRDAGDLWFPGESESFEDAHVEHSILLLLACIFLIKILAASALWAAAWHGQKPGTHPPSELDCGHDPGYQLQTLPGLRDT
T2del 11-16	45	MEPLRLLILLFVTELSGAHNTTVFQGVAGQSLQVSCPYDSMKHWGRRKAWCRQLGEKGPCQRVVSTHNLWLLSFLRRWNGSTAITDDTLGGTLTITLRNLQPHDAGLYQCQSLHGSEADTLRKVLVEVLADPLDHRDAGDLWFPGESESFEDAHVEHSEGEIPFPPTSILLLLACIFLIKILAASALWAAAWHGQKPGTHPPSELDCGHDPGYQLQTLPGLRDT
T2-YGG	46	MEPLRLLILLFVTELSGAHNTTVFQGVAGQSLQVSCPYDSMKHWGRRKAWCRQLGEKGPCQRVVSTHNLWLLSFLRRWNGSTAITDDTLGGTLTITLRNLQPHDAGLYQCQSLHGSEADTLRKVLVEVLADPLDHRDAGDLWFPGESESFEDAHVYGGWGGWGPEGEIPFPPTSILLLLACIFLIKILAASALWAAAWHGQKPGTHPPSELDCGHDPGYQLQTLPGLRDT
T2-WFR	47	MEPLRLLILLFVTELSGAHNTTVFQGVAGQSLQVSCPYDSMKHWGRRKAWCRQLGEKGPCQRVVSTHNLWLLSFLRRWNGSTAITDDTLGGTLTITLRNLQPHDAGLYQCQSLHGSEADTLRKVLVEVLADPLDHRDAGDLWFPGESESFEDAHVEHSISRSLLEGEIWFRWTSILLLLACIFLIKILAASALWAAAWHGQKPGTHPPSELDCGHDPGYQLQTLPGLRDT
Двойная мутация T2	48	MEPLRLLILLFVTELSGAHNTTVFQGVAGQSLQVSCPYDSMKHWGRRKAWCRQLGEKGPCQRVVSTHNLWLLSFLRRWNGSTAITDDTLGGTLTITLRNLQPHDAGLYQCQSLHGSEADTLRKVLVEVLADPLDHRDAGDLWFPGESESFEDAHVYGGWGGWGPEGEIWFRWTSILLLLACIFLIKILAASALWAAAWHGQKPGTHPPSELDCGHDPGYQLQTLPGLRDT

Нуклеиновые кислоты, кодирующие мутантные варианты TREM2 человека, векторы и клетки

В настоящем изобретении также предусмотрены нуклеиновые кислоты, кодирующие мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению шеддазой, векторы для экспрессии мутантного варианта TREM2 человека, устойчивого к расщеплению шеддазой, и клетки, содержащие такие векторы экспрессии. В других аспектах в настоящем изобретении предусмотрена последовательность, кодирующая мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению шеддазой, и векторы экспрессии и клетки-хозяева, содержащие такой полинуклеотид.

В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрены нуклеиновые кислоты, содержащие последовательность, кодирующую мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению шеддазой, который содержит "стеблевой" участок, содержащий любую из аминокислотных последовательностей, предусмотренных в таблице 1. В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрены нуклеиновые кислоты, содержащие последовательность, кодирующую мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению шеддазой, который содержит "стеблевой" участок, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 33-40. В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрены нуклеиновые кислоты, содержащие последовательность, кодирующую мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению шеддазой, который содержит "стеблевой" участок, состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из любой из SEQ ID NO: 33-40. В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрены нуклеиновые кислоты, содержащие последовательность, кодирующую мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению шеддазой, который содержит "стеблевой" участок, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 33-35. В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрены нуклеиновые кислоты, содержащие последовательность, кодирующую мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению шеддазой, который содержит "стеблевой" участок, состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из любой из SEQ ID NO: 33-35. В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрены нуклеиновые кислоты, содержащие последовательность, кодирующую мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению шеддазой, который содержит "стеблевой" участок, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 33, 36, 40. В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрены нуклеиновые кислоты, содержащие последовательность, кодирующую мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению шеддазой, который содержит "стеблевой" участок, состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из любой из SEQ ID NO: 33, 36, 40. В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрены нуклеиновые кислоты, содержащие последовательность, кодирующую мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению шеддазой, который содержит "стеблевой" участок, содержащий SEQ ID NO: 33. В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрены нуклеиновые кислоты, содержащие последовательность, кодирующую мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению шеддазой, который содержит "стеблевой" участок, состоящий из SEQ ID NO: 33.

В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрены нуклеиновые кислоты, содержащие последовательность, кодирующую мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению шеддазой, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей, предусмотренных в таблице 2. В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрены нуклеиновые кислоты, содержащие последовательность, кодирующую мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению шеддазой, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 41-48. В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрены нуклеиновые кислоты, содержащие последовательность, кодирующую мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению шеддазой, который состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из любой из SEQ ID NO: 41-48. В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрены нуклеиновые кислоты, содержащие последовательность, кодирующую мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению шеддазой, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 41-43. В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрены нуклеиновые кислоты, содержащие последовательность, кодирующую мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению шеддазой, который состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из любой из SEQ ID NO: 41-43. В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрены нуклеиновые кислоты, содержащие последовательность, кодирующую мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению шеддазой, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 41, 44, 48. В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрены нуклеиновые кислоты, содержащие последовательность, кодирующую мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению шеддазой, который состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из любой из SEQ ID NO: 41, 44, 48. В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрены нуклеиновые кислоты, содержащие последовательность, кодирующую мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению шеддазой, который содержит SEQ ID NO: 41. В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрены нуклеиновые кислоты, содержащие последовательность, кодирующую мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению шеддазой, который состоит из SEQ ID NO: 41.

В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрены нуклеиновые кислоты, содержащие последовательность, кодирующую мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению шеддазой, где последовательность содержит любую из последовательностей, предусмотренных в таблице 3. В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрены нуклеиновые кислоты, содержащие последовательность, кодирующую мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению шеддазой, где последовательность содержит любую из SEQ ID NO: 67-74. В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрены нуклеиновые кислоты, содержащие последовательность, кодирующую мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению шеддазой, где последовательность содержит любую из SEQ ID NO: 67-69. В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрены нуклеиновые кислоты, содержащие последовательность, кодирующую мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению шеддазой, где последовательность содержит любую из SEQ ID NO: 67, 70 или 74. В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрены нуклеиновые кислоты, содержащие последовательность, кодирующую мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению шеддазой, где последовательность содержит SEQ ID NO: 67.

В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрены нуклеиновые кислоты содержащие любую из SEQ ID NO: 67-74. В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрены нуклеиновые кислоты содержащие любую из SEQ ID NO: 67-69. В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрены нуклеиновые кислоты содержащие любую из SEQ ID NO: 67, 70 или 74. В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрены нуклеиновые кислоты, содержащие SEQ ID NO: 67.

Таблица 3. Иллюстративные последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей "стеблевой" участок мутантного варианта TREM2 человека, устойчивого к расщеплению шеддазой

Название	SEQ ID NO	Последовательности
T2-IPD Последовательность ДНК	67	AGCCTGCATGGCAGCGAAGCGGATACCCTGCGCAAAGTGCTGGTGGAAGTGCTGGCGGATCCGCTGGATCATCGCGATGCGGGCGATCTGTGGTTTCCGGGCGAAAGCGAAAGCTTTGAAGATGCGCATGTGGAAATTCCGGATAGCCGCAGCCTGCTGGAAGGCGAAATTCCGTTTCCGCCGACCAGC
T2-IPP Последовательность ДНК	68	AGCCTGCATGGCAGCGAAGCGGATACCCTGCGCAAAGTGCTGGTGGAAGTGCTGGCGGATCCGCTGGATCATCGCGATGCGGGCGATCTGTGGTTTCCGGGCGAAAGCGAAAGCTTTGAAGATGCGCATGTGGAAATTCCGCCGAGCCGCAGCCTGCTGGAAGGCGAAATTCCGTTTCCGCCGACCAGC
T2-IDP Последовательность ДНК	69	AGCCTGCATGGCAGCGAAGCGGATACCCTGCGCAAAGTGCTGGTGGAAGTGCTGGCGGATCCGCTGGATCATCGCGATGCGGGCGATCTGTGGTTTCCGGGCGAAAGCGAAAGCTTTGAAGATGCGCATGTGGAAATTGATCCGAGCCGCAGCCTGCTGGAAGGCGAAATTCCGTTTCCGCCGACCAGC
TRUNC3 (делеция 159-174) Последовательность ДНК	70	AGCCTGCATGGCAGCGAAGCGGATACCCTGCGCAAAGTGCTGGTGGAAGTGCTGGCGGATCCGCTGGATCATCGCGATGCGGGCGATCTGTGGTTTCCGGGCGAAAGCGAAAGCTTTGAAGATGCGCATGTGGAACATAGC
T2del 11-16 Последовательность ДНК	71	AGCCTGCATGGCAGCGAAGCGGATACCCTGCGCAAAGTGCTGGTGGAAGTGCTGGCGGATCCGCTGGATCATCGCGATGCGGGCGATCTGTGGTTTCCGGGCGAAAGCGAAAGCTTTGAAGATGCGCATGTGGAACATAGCGAAGGCGAAATTCCGTTTCCGCCGACCAGC
T2-YGG Последовательность ДНК	72	AGCCTGCATGGCAGCGAAGCGGATACCCTGCGCAAAGTGCTGGTGGAAGTGCTGGCGGATCCGCTGGATCATCGCGATGCGGGCGATCTGTGGTTTCCGGGCGAAAGCGAAAGCTTTGAAGATGCGCATGTGTATGGCGGCTGGGGCGGCTGGGGCCCGGAAGGCGAAATTCCGTTTCCGCCGACCAGC
T2-WFR Последовательность ДНК	73	AGCCTGCATGGCAGCGAAGCGGATACCCTGCGCAAAGTGCTGGTGGAAGTGCTGGCGGATCCGCTGGATCATCGCGATGCGGGCGATCTGTGGTTTCCGGGCGAAAGCGAAAGCTTTGAAGATGCGCATGTGGAACATAGCATTAGCCGCAGCCTGCTGGAAGGCGAAATTTGGTTTCGCTGGACCAGC
Двойная мутация T2 Последовательность ДНК	74	AGCCTGCATGGCAGCGAAGCGGATACCCTGCGCAAAGTGCTGGTGGAAGTGCTGGCGGATCCGCTGGATCATCGCGATGCGGGCGATCTGTGGTTTCCGGGCGAAAGCGAAAGCTTTGAAGATGCGCATGTGTATGGCGGCTGGGGCGGCTGGGGCCCGGAAGGCGAAATTTGGTTTCGCTGGACCAGC

В данном документе предусмотрены векторы (например, векторы экспрессии), которые можно применять для экспрессии мутантного варианта TREM2 человека, устойчивого к расщеплению шеддазой. Термин "вектор экспрессии" означает молекулу нуклеиновой кислоты-носитель, в которую может быть вставлена необходимая кодирующая последовательность для введения в клетку, где она может быть экспрессирована. Вектор экспрессии может представлять собой ДНК-вектор, РНК-вектор, плазмиду, космиду, или вирусный вектор, или искусственные хромосомы (см., например, Harrington et al., Nat Genet 15:345, 1997). Например, невирусные векторы, применимые для экспрессии полипептида в клетках млекопитающих (например, человека), включают pThioHis A, B и C, pcDNA3. Векторы 1/His, pEBVHis A, B & C (Invitrogen, Сан-Диего, штат Калифорния), MPSV и многие другие векторы, известные из уровня техники для экспрессии других белков. В некоторых вариантах осуществления вектор экспрессии может быть способен к автономной репликации или он может встраиваться в ДНК хозяина. В некоторых вариантах осуществления вектор экспрессии дополнительно содержит селектируемый маркер.

Применимые вирусные векторы включают без ограничения векторы на основе любого из следующих вирусов: аденовируса, аденоассоциированного вируса, вируса простого герпеса (HSV), парвовируса, ретровируса, лентивируса, вируса осповакцины, вируса Синбис, вируса гриппа, реовируса, вируса ньюкаслской болезни (NDV), вируса кори, вируса везикулярного стоматита (VSV), полиовируса, поксвируса, вируса долины Сенека, вируса Коксаки, энтеровируса, вируса миксомы или вируса Мараба.

В некоторых вариантах осуществления вектор экспрессии представляет собой лентивирусный вектор. Векторы, полученные из ретровирусов, таких как лентивирус, являются подходящими инструментами для достижения долгосрочного переноса генов, поскольку они обеспечивают долгосрочную стабильную интеграцию трансгена и его репродукцию в дочерних клетках. Лентивирусные векторы имеют дополнительное преимущество по сравнению с векторами, полученными из онкоретровирусов, таких как вирусы лейкоза мышей, в том, что ими можно трансдуцировать непролиферирующие клетки, такие как гепатоциты. Они также имеют дополнительное преимущество, заключающееся в низкой иммуногенности. Ретровирусный вектор также может представлять собой, например, гамма-ретровирусный вектор. Гамма-ретровирусный вектор может содержать, например, промотор, сигнал упаковки (ψ), сайт связывания праймера (PBS), один или несколько (например, два) длинных концевых повторов (LTR) и трансген, представляющий интерес, например ген, кодирующий CAR. В гамма-ретровирусном векторе могут отсутствовать структурные гены вирусов, такие как gag, pol и env. Иллюстративные гамма-ретровирусные векторы включают вирус лейкоза мышей (MLV), вирус некроза селезенки (SFFV) и вирус миелопролиферативной саркомы (MPSV) и векторы, полученные из них. Другие гамма-ретровирусные векторы описаны, например, в Tobias Maetzig et al., "Gammaretroviral Vectors: Biology, Technology and Application" Viruses. 2011 Jun; 3(6): 677-713.

В некоторых вариантах осуществления вектор экспрессии представляет собой вектор на основе аденоассоциированного вируса (AAV), например вектор на основе рекомбинантного AAV (rAAV). "AAV" представляет собой аббревиатуру для аденоассоциированного вируса и может применяться для обозначения самого вируса или его производных. Термин охватывает все подтипы как встречающихся в природе, так и рекомбинантных форм, за исключением случаев, когда необходимо иное. Аббревиатура "rAAV" означает рекомбинантный аденоассоциированный вирус, также называемый вектором на основе рекомбинантного AAV (или "вектором на основе rAAV"). Термин "AAV" включает, например, AAV 1 типа (AAV1), AAV 2 типа (AAV2), AAV 3 типа (AAV3), AAV 4 типа (AAV4), AAV 5 типа (AAV5), AAV 6 типа (AAV6), AAV 7 типа (AAV7), AAV 8 типа (AAV8), AAV 9 типа (AAV9), AAV 10 типа (AAV10, включающий AAVrh10), AAV 12 типа (AAV12), AAV птиц, AAV крупного рогатого скота, AAV собак, AAV лошадей, AAV приматов, AAV млекопитающих, отличных от приматов, и AAV овец. "AAV приматов" означает AAV, который инфицирует приматов, "AAV млекопитающих, отличных от приматов", означает AAV, который инфицирует млекопитающих, отличных от приматов, "AAV крупного рогатого скота" означает AAV, который инфицирует млекопитающих, относящихся к крупному рогатому скоту, и т. д.

Геномные последовательности различных серотипов AAV, а также последовательности нативных инвертированных концевых повторов (ITR), белков Rep и субъединиц капсида известны из уровня техники. Такие последовательности можно найти в литературе или в общедоступных базах данных, таких как GenBank. См., например, номера доступа в GenBank NC-002077 (AAV1), AF063497 (AAV1), NC-001401 (AAV2), AF043303 (AAV2), NC-001729 (AAV3), NC-001829 (AAV4), U89790 (AAV4), NC-006152 (AAV5), AF513851 (AAV7), AF513852 (AAV8), и NC-006261 (AAV8); или в публикациях, таких как WO2005033321 (AAV1-9), раскрытия которой включены в данный документ посредством ссылки. См. также, например, Srivistava et al. (1983) J. Virology 45:555; Chiorini et al. (1998) J. Virology 71:6823; Chiorini et al. (1999) J. Virology 73: 1309; Bantel-Schaal et al. (1999) J. Virology 73:939; Xiao et al. (1999) J. Virology 73:3994; Muramatsu et al. (1996) Virology 221:208; Shade et al.,(1986) J. Virol. 58:921; Gao et al. (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99: 11854; Moris et al. (2004) Virology 33:375-383; публикации международных патентных заявок WO 00/28061, WO 99/61601, WO 98/11244 и патент США № 6156303.

Используемый в данном документе термин "вектор на основе rAAV" означает вектор на основе AAV, содержащий полинуклеотидную последовательность, не происходящую от AAV (т.е. полинуклеотид, гетерологичный AAV), как правило, последовательность, представляющую интерес для генетической трансформации клетки. В некоторых вариантах осуществления гетерологичный полинуклеотид может быть фланкирован по меньшей мере одним и иногда двумя последовательностями инвертированного концевого повтора (ITR) AAV. Термин "вектор на основе rAAV" охватывает как вектор на основе частицы rAAV, так и векторные плазмиды на основе rAAV. Вектор на основе rAAV может быть либо одноцепочечным (ssAAV), либо самокомплементарным (scAAV). "Вирус AAV", или "вирусная частица AAV", или "вектор на основе частицы rAAV" означает вирусную частицу, состоящую из по меньшей мере одного капсидного белка AAV (как правило из всех капсидных белков AAV дикого типа) и заключенного в капсид полинуклеотидного вектора на основе rAAV. Если частица содержит гетерологичный полинуклеотид (т. е. полинуклеотид, отличный от генома AAV дикого типа, такой как трансген, который должен быть доставлен в клетку млекопитающего), она, как правило, означает "вектор на основе частицы rAAV" или просто "вектор на основе rAAV." Таким образом, получение частицы rAAV обязательно включает получение вектора на основе rAAV, такого как вектор, содержащийся в пределах частицы rAAV.

В некоторых вариантах осуществления вектор экспрессии может представлять собой рекомбинантную молекулу ДНК, содержащую нуклеиновую кислоту, кодирующую мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению шеддазой. Используемый в данном документе термин "рекомбинантный" означает что вектор, полинуклеотид, полипептид или клетка представляют собой продукт различных комбинаций стадий клонирования, рестрикции или лигирования (например, по отношению к полинуклеотиду или полипептиду, содержащемуся в них), и/или других процедур, которые приводят к получению конструкции, которая отличается от продукта, обнаруженного в природе. Рекомбинантный вирус или вектор представляет собой вирусную частицу, содержащую рекомбинантный полинуклеотид. Данные термины соответственно включают продукты репликации исходной полинуклеотидной конструкции и дочерние вирусные конструкции по отношению к исходным вирусным конструкциям.

Рекомбинантный вектор экспрессии как правило включает одну или несколько регуляторных последовательностей, функционально связанных с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая должна быть экспрессирована. Термин "регуляторная последовательность" включает промоторы, энхансеры и другие элементы, контролирующие экспрессию (например, сигналы полиаденилирования). Регуляторные последовательности включают последовательности, которые направляют конститутивную экспрессию нуклеотидной последовательности, а также регуляторные и/или индуцируемые последовательности, специфические в отношении типа ткани. Векторы экспрессии могут также включать элементы, предназначенные для оптимизации стабильности матричной РНК и ее способности к трансляции в клетках-хозяевах, и/или селектируемые маркеры для отбора с помощью лекарственного средства для создания долгосрочных стабильных клеточных клонов, экспрессирующих мутантный вариант TREM2 человека. Конструирование вектора экспрессии может зависеть от таких факторов как выбор клетки-хозяина, которая должна быть трансформирована, необходимый уровень экспрессии белка и т. п. Общие способы для создания таких рекомбинантных векторов экспрессии можно найти в Sambrook and Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition; сериях Ausubel et al. eds. (2007 г., обновлена в 2010 г.) Current Protocols in Molecular Biology, среди других известных из уровня техники.

"Промотор" представляет собой последовательность для контроля, которая представляет собой участок последовательности нуклеиновой кислоты, с помощью которого контролируются инициация и скорость транскрипции. Он может содержать генетические элементы, в которых могут связываться регуляторные белки и молекулы, такие как РНК-полимераза, и другие факторы транскрипции. Фразы "функционально расположенный", "функционально связанный", "под контролем" и "под транскрипционным контролем" означают, что промотор расположен в корректных функциональных местоположении и/или ориентации по отношению к последовательности нуклеиновой кислоты, для контроля инициации транскрипции и/или экспрессии данной последовательности. Промотор можно применять в сочетании с "энхансером", который означает цис-действующую регуляторную последовательность, участвующую в активации транскрипции последовательности нуклеиновой кислоты, или без него.

Промотор может быть естественным образом связан с геном или последовательностью, а также может быть получен посредством выделения 5'-некодирующих последовательностей, вышележащих по отношению к кодирующему сегменту и/или экзону. Такой промотор может быть назван "эндогенным". Подобным образом, энхансер может быть естественным образом связан с последовательностью нуклеиновой кислоты, нижележащей или вышележащей по отношению к данной последовательности. В качестве альтернативы, некоторые преимущества будут получены посредством расположения сегмента кодирующей нуклеиновой кислоты под контролем рекомбинантного или гетерологичного промотора, который означает промотор, который обычно не связан с последовательностью нуклеиновой кислоты в его естественной среде. Рекомбинантный или гетерологичный энхансер означает также энхансер, обычно не связанный с последовательностью нуклеиновой кислоты в его естественной среде. Такие промоторы или энхансеры могут включать промоторы или энхансеры других генов, и промоторы или энхансеры, выделенные из любой другой прокариотической клетки, вируса или эукариотической клетки, и промоторы или энхансеры, не "встречающиеся в природе", т. е. содержащие различные элементы различных транскрипционных регуляторных участков и/или мутации, которые изменяют экспрессию. В дополнение к получению последовательностей нуклеиновой кислоты промоторов и энхансеров синтетическим путем, последовательности можно получать с применением рекомбинантного клонирования и/или технологии амплификации нуклеиновой кислоты, включая PCR™, в сочетании с композициями, раскрытыми в данном документе (см. патенты США №№ 4683202, 5928906, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки). Кроме того, предусмотрены последовательности для контроля, которые направляют транскрипцию и/или экспрессию последовательностей в пределах неядерных органелл, таких как митохондрии, хлоропласты и т. п., которые также можно использовать.

Используемые промоторы могут быть конститутивными, индуцируемыми, синтетическими, специфическими в отношении типа ткани или клеток и/или применимыми в подходящих условиях для направления высокого уровня экспрессии введенного сегмента ДНК, что является преимуществом при крупномасштабном получении рекомбинантных белков и/или пептидов. Кроме того, другие регуляторные элементы также могут быть введены для улучшения экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей мутантный вариант белка TREM2, например энхансеры, сайт связывания рибосомы, последовательности терминации транскрипции и т. п.

В некоторых вариантах осуществления конститутивный промотор применяют для обеспечения постоянной экспрессии мутантного варианта белка TREM2. Примеры конститутивного промотора включают без ограничения немедленно-ранний промотор цитомегаловируса (CMV), ранний промотор вируса обезьян 40 (SV40), промотор вируса опухоли молочной железы мышей (MMTV), промотор длинного концевого повтора (LTR) вируса иммунодефицита человека (HIV), промотор MoMuLV, промотор вируса лейкоза птиц, немедленно-ранний промотор вируса Эпштейна-Барра, промотор вируса саркомы Рауса, а также промоторы генов человека, такие как без ограничения промотор гена актина, промотор гена миозина, промотор гена фактора-1α элонгации, промотор гена гемоглобина и промотор гена креатинкиназы.

Индуцируемые промоторы также предусматриваются как часть настоящего изобретения. Применение индуцируемого промотора обеспечивает молекулярный переключатель, способный включать экспрессию полинуклеотидной последовательности, с которой он функционально связан, если такая экспрессия необходима, или отключать экспрессию, если экспрессия нежелательна. Примеры индуцируемых промоторов включают без ограничения металлотионеин-индуцируемый промотор, глюкокортикоид-индуцируемый промотор, прогестерон-индуцируемый промотор и тетрациклин-индуцируемый промотор.

В некоторых вариантах осуществления промотор, специфический в отношении типа ткани или клеток, применяют для обеспечения экспрессии мутантного варианта белка TREM2 только в специфических тканях или клетках. Идентичность промоторов или элементов, специфических в отношении типа ткани или клеток, а также анализы для характеристики их активностей широко известны специалистам в данной области. Примеры включают ген LIMK2 человека (Nomoto et al. 1999, Gene, 236(2):259-271), ген рецептора соматостатина 2 (Kraus et al., 1998, FEES Lett., 428(3): 165-170), мышиный эпидидимальный ген, связывающий ретиноевую кислоту (Lareyre et al., 1999, J. Biol. Chem., 274(12):8282-8290), ген CD4 человека (Zhao-Emonet et al., 1998, Biochirn. Biophys. Acta, 1442(2-3): 109-119), ген коллагена альфа2 (XI) мыши (Tsumaki, et al., 1998, J. Biol. Chem., 273(36):22861-22864), ген рецептора дофамина D1A (Lee, et al., 1997, J. Auton. Nerv. Syst., 74(2-3):86-90), ген инсулиноподобного фактора роста II (Wu et al., 1997, Biochem. Biophys. Res. Commun., 233(1):221-226), ген молекулы-1 адгезии тромбоцит-эндотелиальных клеток человека (Almendro et al., 1996, J. Immunol., 157(12):5411-5421), промотор гена мышечной креатинкиназы (MCK) (Wang et al., Gene Ther. 2008 Nov;15(22):1489-99).

В некоторых вариантах осуществления промотор представляет собой промотор, специфический в отношении типа клеток. Например, промотор можно использовать для управления экспрессией TREM2 специфически в макрофагах, дендритных клетках или клетках микроглии. В некоторых вариантах осуществления специфический промотор применяют для обеспечения экспрессии белка TREM2 в клетках микроглии. Промоторы, которые могут направлять экспрессию белка TREM2 в клетках микроглии включают без ограничения промотор гена TREM2, промотор гена TMEM119, промотор гена Hexb, промотор гена IBA1, промотор гена CD45, промотор гена CD11b, промотор гена Cst7, промотор гена Lpl, промотор гена Csf1, промотор гена Cs1R, промотор гена Itgax, промотор гена Clec7a, промотор гена Lilrb4, промотор гена Tyrobp, промотор гена Ctsb, промотор гена Ctsd, промотор гена B2m, промотор гена Lyz2, промотор гена Cx3cr1, промотор гена Cst3, промотор гена Ctss, промотор гена P2ry12, промотор гена C1qa, промотор гена C1qb, промотор гена Axl, промотор гена Timp2, промотор гена Ctsl, промотор гена Gnas, промотор гена Cd9, промотор гена Fth1, промотор гена Tmsb4x. В некоторых вариантах осуществления вектор экспрессии включает промотор, выбранный из промотора гена TREM2, промотора гена TMEM119, промотора гена Hexb, промотора гена IBA1, промотора гена CD45, промотора гена CD11b, промотора гена Cst7, промотора гена Lpl, промотора гена Csf1, промотора гена Cs1R, промотора гена Itgax, промотора гена Clec7a, промотора гена Lilrb4, промотора гена Tyrobp, промотора гена Ctsb, промотора гена Ctsd, промотора гена B2m, промотора гена Lyz2, промотора гена Cx3cr1, промотора гена Cst3, промотора гена Ctss, промотора гена P2ry12, промотора гена C1qa или промотора гена C1qb. В некоторых вариантах осуществления вектор экспрессии включает промотор гена TREM2.

В некоторых вариантах осуществления синтетический промотор применяют для обеспечения экспрессии мутантного варианта белка TREM2. Синтетические промоторы могут значительно превышать интенсивности транскрипции природных промоторов. Например, можно выбрать синтетические промоторы, которые не отключаются или их активность не снижается в результате осуществления эндогенных клеточных механизмов или факторов. Другие элементы, включающие сайты связывания транс-действующих факторов и энхансеры, могут быть вставлены в синтетический промотор для улучшения эффективности транскрипции. Синтетические промоторы можно рационально сконструировать и химически синтезировать с объединением лучших признаков как синтетических, так и биологических промоторов. Синтетические олигонуклеотиды отжигают и лигируют посредством нескольких способов для создания полноразмерного химически синтезированного промотора. Синтетические промоторы могут представлять собой индуцируемые промоторы или промоторы, специфические в отношении типа клеток. Например, синтетический промотор, который может управлять экспрессией TREM2 специфически в макрофаге, дендритной клетке или клетке микроглии можно рационально сконструировать и химически синтезировать.

Сигнал специфической инициации также может быть необходим для эффективной трансляции кодирующих последовательностей. Такие сигналы включают инициирующий кодон ATG или смежные последовательности. Может быть необходимо обеспечить экзогенные сигналы контроля трансляции, включая инициирующий кодон ATG. Рядовой специалист в данной области легко сможет определить это и обеспечить необходимые сигналы. Широко известно, что инициирующий кодон должен быть "в рамке считывания" с рамкой считывания необходимой кодирующей последовательности для обеспечения трансляции всей вставки. Экзогенные сигналы контроля трансляции и инициирующие кодоны могут быть либо природными, либо синтетическими. Эффективность экспрессии может быть усилена посредством включения подходящих элементов, представляющих собой энхансеры транскрипции.

Экспрессия может осуществляться в любых подходящих клетках-хозяевах, известных из уровня техники, например, в клетках-хозяевах млекопитающих, бактериальных клетках-хозяевах, дрожжевых клетках-хозяевах, клетках-хозяевах насекомых и т.д. Как прокариотические, так и эукариотические системы экспрессии являются широкодоступными. В некоторых вариантах осуществления система экспрессии представляет собой экспрессию в клетках млекопитающих, такую как система экспрессии в клетках CHO. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота может быть кодон-оптимизирована для облегчения экспрессии в необходимой клетке-хозяине. Будет важно применять промотор и/или энхансер, который эффективно направляет экспрессию сегмента ДНК в типе клеток, органелле и организме, выбранных для экспрессии. Специалисты в области молекулярной биологии обычно знают о применении промоторов, энхансеров и комбинаций типов клеток для экспрессии белка, например, см. Sambrook et al. (2001), включенный в данный документ посредством ссылки.

Большинство транскрибируемых эукариотических молекул РНК будут подвергаться сплайсингу РНК для удаления интронов из первичных транскриптов. При применении векторов, содержащих геномные эукариотические последовательности, могут быть необходимы донорные и/или акцепторные сайты сплайсинга для обеспечения надлежащей обработки транскрипта для экспрессии белка (см. Chandler et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94(8):3596-601).

Векторы или конструкции по настоящему изобретению обычно будут содержать по меньшей мере один сигнал терминации. "Сигнал терминации" или "терминатор" состоит из последовательностей ДНК, участвующих в специфической терминации РНК-транскрипта РНК-полимеразой. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления предусматривается сигнал терминации, который завершает получение РНК-транскрипта. Терминатор может быть необходим in vivo для достижения требуемых уровней первичного транскрипта. В эукариотических системах участок терминатора может также содержать специфические последовательности ДНК, которые позволяют сайт-специфическое расщепление нового транскрипта таким образом, чтобы вывести вовне сайт полиаденилирования. Данные сигналы необходимы специализированной эндогенной полимеразе для добавления фрагмента из приблизительно 200 остатков A (поли-A) к 3' концу транскрипта. Молекулы РНК, модифицированные с помощью данного поли-A-хвоста, более стабильны и транслируются более эффективно. Таким образом, в других вариантах осуществления, в которых участвуют эукариоты, предпочтительно, если терминатор содержит сигнал для расщепления РНК, и более предпочтительно, если сигнал терминатора стимулирует полиаденилирование первичного транскрипта. Терминатор и/или элементы сайта полиаденилирования могут служить для повышения уровней первичного транскрипта и/или для сведения к минимуму считывания других последовательностей, не входящих в состав кассеты. Терминаторы, предусмотренные для применения в настоящем изобретении, включают любой известный терминатор транскрипции, описанный в данном документе или известный рядовому специалисту в данной области, включая без ограничения, например, терминирующие последовательности генов, такие как, например, терминатор гена бычьего гормона роста или вирусные терминирующие последовательности, такие как, например, терминатор SV40. В некоторых вариантах осуществления у сигнала терминации может отсутствовать транскрибируемая или транслируемая последовательность, например, из-за усечения последовательности.

При экспрессии, в частности при эукариотической экспрессии, таковой, как правило, включает сигнал полиаденилирования для достижения надлежащего полиаденилирования транскрипта. Считается, что природа сигнала полиаденилирования не имеет решающего значения для успешного осуществления настоящего изобретения на практике, и/или можно применять любую такую последовательность. Предпочтительные варианты осуществления включают сигнал полиаденилирования SV40 и/или сигнал полиаденилирования гена бычьего гормона роста, общепринятые и/или известные как хорошо функционирующие в различных целевых клетках. Полиаденилирование может повышать стабильность транскрипта или может способствовать цитоплазматическому транспорту.

Для репродукции вектора в клетке-хозяине он может содержать один или несколько сайтов начала репликации (часто называемых "ori"), которые представляют собой специфическую последовательность нуклеиновой кислоты, в которой инициируется репликация. В качестве альтернативы можно применять автономную реплицирующуюся последовательность (ARS), если клетка-хозяин представляет собой дрожжевую клетку.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, клетки, содержащие конструкцию нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, можно идентифицировать in vitro или in vivo посредством включения маркера в вектор экспрессии. Такие маркеры будут придавать идентифицируемое изменение клетке, позволяющее легкую идентификацию клеток, содержащих вектор экспрессии. Обычно селектируемый маркер представляет собой маркер, который придает свойство, которое обеспечивает отбор. Положительный селектируемый маркер представляет собой такой маркер, при котором наличие маркера обеспечивает его отбор, в то время как отрицательный селектируемый маркер представляет собой такой маркер, при котором его наличие предотвращает его отбор. Пример положительного селектируемого маркера представляет собой маркер устойчивости к лекарственному средству.

Обычно включение селектируемого маркера для отбора с помощью лекарственного средства способствует клонированию и идентификации трансформантов, например гены, которые придают устойчивость к неомицину, пуромицину, гигромицину, DHFR, GPT, зеоцину и гистидинолу являются применяемыми селектируемыми маркерами. В дополнение к маркерам, придающим фенотип, который обеспечивает различение трансформантов на основе реализации условий, также предусматриваются другие типы маркеров, включающие маркеры для скрининга, такие как GFP, применение которых основано на колориметрическом анализе. В качестве альтернативы можно использовать ферменты для скрининга, такие как тимидинкиназа (tk) вируса простого герпеса или хлорамфениколацетилтрансфераза (CAT). Специалист в данной области также будет знать, как использовать иммунологические маркеры, возможно, в сочетании с анализом с помощью FACS. Считается, что применяемый маркер не важен до тех пор, пока он способен экспрессироваться одновременно с нуклеиновой кислотой, кодирующей продукт гена. Дополнительные примеры селектируемых маркеров и маркеров для скрининга широко известны специалисту в данной области.

В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрены векторы экспрессии, содержащие последовательность, кодирующую мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению шеддазой, например расщеплению с помощью ADAM17 или ADAM10. В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрены векторы экспрессии, содержащие последовательность, кодирующую мутантный вариант TREM2 человека, который содержит "стеблевой" участок, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 33-40. В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрены векторы экспрессии, содержащие последовательность, кодирующую мутантный вариант TREM2 человека, который содержит "стеблевой" участок, состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из любой из SEQ ID NO: 33-40. В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрены векторы экспрессии, содержащие последовательность, кодирующую мутантный вариант TREM2 человека, который содержит "стеблевой" участок, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 33-35. В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрены векторы экспрессии, содержащие последовательность, кодирующую мутантный вариант TREM2 человека, который содержит "стеблевой" участок, состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из любой из SEQ ID NO: 33-35. В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрены векторы экспрессии, содержащие последовательность, кодирующую мутантный вариант TREM2 человека, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 41-48. В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрены векторы экспрессии, содержащие последовательность, кодирующую мутантный вариант TREM2 человека, который состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из любой из SEQ ID NO: 41-48.

В некоторых вариантах осуществления вектор экспрессии содержит промотор, который обеспечивает экспрессию белка TREM2 в макрофаге, дендритной клетке или клетке микроглии. В некоторых вариантах осуществления вектор экспрессии содержит промотор, выбранный из промотора гена TREM2, промотора гена TMEM119, промотора гена Hexb, промотора гена IBA1, промотора гена CD45, промотора гена CD11b, промотора гена Cst7, промотора гена Lpl, промотора гена Csf1, промотора гена Cs1R, промотора гена Itgax, промотора гена Clec7a, промотора гена Lilrb4, промотора гена Tyrobp, промотора гена Ctsb, промотора гена Ctsd, промотора гена B2m, промотора гена Lyz2, промотора гена Cx3cr1, промотора гена Cst3, промотора гена Ctss, промотора гена P2ry12, промотора гена C1qa или промотора гена C1qb. В некоторых вариантах осуществления вектор экспрессии содержит промотор гена TREM2.

В некоторых вариантах осуществления вектор экспрессии содержит сигнал полиаденилирования. В некоторых вариантах осуществления вектор экспрессии содержит селектируемый маркер.

В некоторых вариантах осуществления вектор экспрессии дополнительно содержит вторую последовательность, кодирующую белок DAP12. В некоторых вариантах осуществления белок DAP12 содержит SEQ ID NO: 49. В некоторых вариантах осуществления белок DAP12 состоит из SEQ ID NO: 49.

В некоторых вариантах осуществления векторы экспрессии для экспрессии как полипептида TREM2, так и полипептида DAP12 могут содержать внутренний сайт посадки рибосомы (IRES), вышележащий по отношению к последовательности, кодирующей DAP12. Элементы, представляющие собой IRES, способны обходить модель сканирования рибосомы, заключающуюся в том, что трансляция зависит от 5'-метилированного кэпа, и позволяют начинать трансляцию во внутренних сайтах (Pelletier and Sonenberg, 1988, Nature, 334:320-325). Элементы, представляющие собой IRES, из двух представителей семейства пикорнавирусов (полио- и энцефаломиокардита) были описаны (Pelletier and Sonenberg, 1988), также как и IRES из первичного транскрипта млекопитающих (Macejak and Sarnow, 1991, Nature, 353:90-94, 1991). Элементы, представляющие собой IRES, могут быть связаны с гетерологичными открытыми рамками считывания. Несколько открытых рамок считывания могут быть транскрибированы вместе, каждая отдельно посредством IRES, с созданием полицистронных первичных транскриптов. За счет элемента, представляющего собой IRES, каждая открытая рамка считывания доступна рибосомам для эффективной трансляции. Несколько генов можно эффективно экспрессировать с применением одного промотора/энхансера для транскрипции одного первичного транскрипта (см. патенты США № 5925565 и № 5935819, включенные в данный документ посредством ссылки).

В некоторых вариантах осуществления векторы экспрессии для экспрессии как полипептида TREM2, так и полипептида DAP12 содержат последовательность 2A, вышележащую по отношению к последовательности, кодирующей DAP12. Последовательность олигопептида 2A была первой охарактеризована в плюс-цепи РНК пикорнавируса, вызывающего ящур (FMDV); и показано, что 2A или F2A FMDV опосредует котрансляционное ‘расщепление’ между вышележащим (белки капсида) и нижележащим (белки репликации РНК) доменами полипротеина FMDV (Ryan MD, EMBO J 1994;134: 928-933; Ryan MD, J Gen Virol 1991; 72: 2727-2732; Donnelly MLL, J Gen Virol 1997; 78:13-21; Donnelly MLL, J Gen Virol 2001; 82:1013-1025). Активные последовательности 2A были охарактеризованы в геномах вирусов из других родов пикорнавирусов, «2A-подобные» плюс-последовательности обнаружены в пределах геномов ряда различных РНК-содержащих вирусов и ретротранспозонов, лишенных LTR (Donnelly MLL, J Gen Virol 2001; 82:1027-1041; Heras SR, Cell Mol Life Sci 2006; 63:1449-1460; Luke GA, J Gen Virol 2008; 89:1036-1042; Odon V, Mol Biol Evol 2013; 30:1955-1965; Luke GA, Mob Gen Elements 2014; 3:e27525). Было показано, что такие последовательности олигопептидов 2A или "2A-подобных" олигопептидов опосредуют трансляционное явление ‘перекодирования’, называемое ‘пропуском рибосомы’, ‘остановкой переноса’ или ‘остановкой’ трансляции (Atkins JF, RNA 2007; 13:1-8).

Используемый в данном документе термин "последовательность 2A" означает любую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую олигопептид 2A или "2A-подобный" олигопептид, служащий в качестве линкера между двумя белками, обеспечивая автономный межрибосомальный самопроцессинг полипротеинов (см., например, de Felipe. Genetic Vaccines and Ther. 2:13 (2004); deFelipe et al. Traffic 5:616-626 (2004)). Такие олигопептиды обеспечивают совместную экспрессию нескольких белков с одного вектора. Множество элементов, представляющих собой 2A, известно из уровня техники. Например, вирусные последовательности 2A были описаны в патентах США №№ 9175311, 8865881, 7939059, 7947493, все из которых включены в данный документ посредством ссылки. Например, вирусная последовательность 2A может представлять собой пикорнавирусную, тетравирусную последовательность 2A или их комбинацию. Пикорнавирусная последовательность 2A может быть выбрана из любой из энтеровирусных последовательностей 2A, риновирусных последовательностей 2A, кардиовирусных последовательностей 2A, афтовирусных последовательностей 2A, гепатовирусных последовательностей 2A, эрбовирусных последовательностей 2A, кобувирусных последовательностей 2A, тешовирусных последовательностей 2A и пареховирусных последовательностей 2A. Тетравирусные последовательности 2A могут быть выбраны из любой из бетатетравирусных последовательностей 2A или омегатетравирусных последовательностей 2A. Примеры последовательностей 2A, которые можно применять в способах и системе, раскрытых в данном документе, без ограничения включают последовательности 2A из вируса ящура (F2A), вируса ринита A лошадей (E2A), вируса Thosea asigna (T2A) и тешовируса-1 свиней (P2A). В некоторых вариантах осуществления последовательность 2A кодирует вирусный олигопептид 2A, выбранный из T2A (EGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 52) или GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 53)), P2A (ATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 54) или GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 55)), E2A (QCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 56) или GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 57)), или F2A (VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 58) или GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 59)).

Невирусная последовательность 2A была описана в патенте США № 8945876, который включен в данный документ посредством ссылки. Например, невирусная последовательность 2A может представлять собой последовательность 2A морского ежа (Strongylocentrotus purpuratus) (DGFCILYLLLILLMRSGDVETNPGP) (SEQ ID NO: 60); последовательность 2A губки (Amphimedon queenslandica) (LLCFMLLLLLSGDVELNPGP (SEQ ID NO: 61) или HHFMFLLLLLAGDIELNPGP (SEQ ID NO: 62)); последовательность 2A кишечнодышащего (Saccoglossus kowalevskii) (WFLVLLSFILSGDIEVNPGP (SEQ ID NO: 63)) или последовательность 2A ланцетника (Branchiostoma floridae) (KNCAMYMLLLSGDVETNPGP (SEQ ID NO: 64) или MVISQLMLKLAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 65)). В некоторых вариантах осуществления последовательность 2A представляет собой последовательность, встречающуюся в природе, или синтетическую последовательность, которая включает консенсусную последовательность 2A D-X-E-X-NPGP (SEQ ID NO: 66), в которой X представляет собой любой аминокислотный остаток.

В некоторых вариантах осуществления вектор экспрессии содержит последовательность 2A, кодирующую олигопептид 2A, выбранный из любой из SEQ ID NO: 52-66.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая мутантный вариант TREM2 человека, также может включать последовательность, кодирующую последовательность сигнала секреции таким образом, что полипептид секретируется из клетки-хозяина. Такую последовательность можно обеспечить посредством вектора или части нуклеиновой кислоты TREM2, которая присутствует в векторе.

При создании вектора экспрессии можно применять вектор, который включает сайт множественного клонирования (MCS), который представляет собой участок нуклеиновой кислоты, который содержит несколько сайтов для рестрикционных ферментов, любой из которых можно использовать в сочетании со стандартной рекомбинантной технологией для расщепления вектора. См. Carbonelli et al., 1999, Levenson et al., 1998 и Cocea, 1997, включенные в данный документ посредством ссылки. "Расщепление рестрикционным ферментом" означает каталитическое расщепление молекулы нуклеиновой кислоты с помощью фермента, который функционирует только в специфических местоположениях молекулы нуклеиновой кислоты. Множество таких рестрикционных ферментов коммерчески доступно. Применение таких ферментов широко известно специалистам в данной области. Часто вектор является линеаризованным или фрагментированным с применением рестрикционного фермента, который разрезает в пределах MCS для обеспечения лигирования экзогенных последовательностей с вектором. "Лигирование" означает способ образования фосфодиэфирных связей между двумя фрагментами нуклеиновой кислоты, которые могут быть или не быть смежными друг с другом. Методики с участием рестрикционных ферментов и реакций лигирования хорошо известны специалистам в области рекомбинантной технологии.

Способы введения векторов экспрессии, содержащих полинуклеотидные последовательности, представляющие интерес, варьируются в зависимости от типа клетки-хозяина. Например, трансфекцию с применением хлорида кальция обычно применяют для прокариотических клеток, в то время как обработку фосфатом кальция или электропорацию можно применять для других клеток-хозяев (см. в общих чертах Sambrook et al., выше). Другие способы включают, например, электропорацию, обработку фосфатом кальция, трансформацию, опосредованную липосомами, инъекцию и микроинъекцию, баллистические способы, виросомы, иммунолипосомы, конъюгаты поликатион: нуклеиновая кислота, депротеинизированную ДНК, искусственные вирионы, слияние со структурным белком VP22 вируса герпеса, усиленное средством поглощение ДНК и трансдукцию ex vivo. Для долговременного получения рекомбинантных белков с высоким выходом часто будет необходима стабильная экспрессия. Например, линии клеток, которые стабильно экспрессируют полипептиды, можно получать с применением векторов экспрессии, которые содержат вирусные точки начала репликации или эндогенные элементы для экспрессии и ген селектируемого маркера.

Также в данном документе предусмотрены клетки, которые включают любые векторы экспрессии, описанные в данном документе. В некоторых вариантах осуществления такие клетки содержат вектор экспрессии для экспрессии мутантного варианта TREM2 человека, устойчивого к расщеплению шеддазой. В некоторых вариантах осуществления такие клетки содержат вектор экспрессии для экспрессии как мутантного варианта TREM2 человека, так и белка DAP12 человека. В некоторых вариантах осуществления такие клетки содержат вектор экспрессии для экспрессии мутантного варианта TREM2 человека и второй вектор экспрессии для экспрессии белка человека DAP12. Такие клетки могут представлять собой клетку-хозяина или терапевтическую клетку.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, которая включает молекулу нуклеиновой кислоты, описанную в данном документе. Клетку-хозяина можно применять для продуцирования или экспрессии мутантного варианта TREM2 человека, устойчивого к расщеплению шеддазой, описанного в данном документе. Термины "клетка-хозяин" и "рекомбинантная клетка-хозяин" применяются взаимозаменяемо в данном документе и означают не только клетку конкретного субъекта, но и потомство или потенциальное потомство такой клетки. Поскольку некоторые модификации могут происходить в последующих поколениях из-за либо мутации, либо влияний окружающей среды, такое потомство может в действительности не быть идентичным родительской клетке, но при этом оно все еще включено в объем термина, который используется в данном документе. Клетка-хозяин может представлять собой любую прокариотическую или эукариотическую клетку. Например, белок может экспрессироваться в бактериальных клетках (таких как E. coli), клетках насекомых, дрожжевых клетках или клетках млекопитающих (таких как клетки яичника китайского хомячка (CHO) или клетки COS, например клетки COS-7, клетки с SV40, произошедшие от CV-1; Gluzman (1981) Cell23:175-182). Другие подходящие клетки-хозяева известны специалистам в данной области.

Клетку-хозяина можно применять для продуцирования или экспрессии мутантного варианта TREM2 человека, описанного в данном документе. Соответственно, настоящее изобретение также относится к способам получения мутантного варианта TREM2 человека с применением клетки-хозяина. В одном варианте осуществления способ включает культивирование клетки-хозяина (в которую был введен рекомбинантный вектор экспрессии, кодирующий белок) в подходящей среде таким образом, чтобы продуцировался мутантный вариант TREM2 человека. В другом варианте осуществления способ дополнительно включает выделение мутантного варианта TREM2 человека из среды или клетки-хозяина.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к терапевтической клетке, которая включает молекулу нуклеиновой кислоты, описанную в данном документе. Используемый в данном документе, термин "терапевтическая клетка" означает клетку, которая была генетически сконструирована для экспрессии мутантного варианта TREM2 человека, устойчивого к расщеплению шеддазой. Такая терапевтическая клетка может представлять собой клетку человека, например макрофаг, дендритную клетку или клетку микроглии.

В некоторых вариантах осуществления такая терапевтическая клетка экспрессирует выявляемый маркер, например флуоресцентную молекулу (например, флуоресцеин, техасский красный, родамин, зеленый флуоресцентный белок и т.п.), фермент (например, пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу), люминесцентную молекулу (например, люциферазу), радиоактивную молекулу (например, ³H, ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴C или ³²P) или калориметрические метки, такие как коллоидное золото или окрашенные гранулы. Клетки, экспрессирующие выявляемый маркер, можно отслеживать или визуализировать посредством подходящих способов выявления, таких как микроскопия, авторадиография и/или другие способы визуализации, известные из уровня техники.

Способы лечения и терапевтическое применение

В данном документе предусмотрены способы повышения экспрессии TREM2 у субъекта (например, человека) посредством введения субъекту нуклеиновой кислоты, кодирующей мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению шеддазой, раскрытый в данном документе, или вектора или клетки, содержащих такую нуклеиновую кислоту. Субъект может иметь связанное с TREM2 заболевание или нарушение. Поскольку отсутствие TREM2 человека на клеточной поверхности или избыточное выведение TREM2 было связано с нейровоспалительными и нейродегенеративными патологиями человека, повышение экспрессии устойчивого к расщеплению мутантного варианта TREM2 человека с применением способов, описанных в данном документе, может применяться для лечения или предупреждения такого нейровоспалительного или нейродегенеративного заболевания. Нуклеиновые кислоты, кодирующие мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению шеддазой, или векторы или клетки, содержащие такие нуклеиновые кислоты, также подходят для лечения или предупреждения аутоиммунных, воспалительных или злокачественных нарушений, опосредованных избыточным протеолитическим расщеплением TREM2 или связанных с ним.

Нуклеиновые кислоты или векторы, которые могут повышать уровень экспрессии TREM2, можно идентифицировать посредством скрининга кандидатных нуклеиновых кислот или векторов с применением клеточных анализов или бесклеточных анализов in vitro и/или животных моделей in vivo. Например, клетки можно трансфицировать или инфицировать кандидатными нуклеиновой кислотой или вектором. Уровень TREM2, который может представлять собой уровень полипептида TREM2, имеющего аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:1, или ее фрагмент на клеточной поверхности, можно отслеживать для определения того, повышен ли уровень TREM2 по сравнению с уровнем полипептида TREM2 в необработанных клетках или клетках, обработанных контрольными нуклеиновой кислотой или вектором. Уровень TREM2 человека на клеточной поверхности в образце можно определить с помощью анализа, известного из уровня техники, например с помощью проточной цитометрии, иммуногистохимического исследования, вестерн-блоттинга, иммунофлуоресцентного анализа, радиоиммуноанализа (RIA), твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), гомогенной флуоресценции с временным разрешением (HTRF) или позитронно-эмиссионной томографии (PET) или любого другого иммунного выявления с антителом или фрагментом антитела к белку TREM2 человека.

Нуклеиновые кислоты, векторы или клетки, которые могут повышать уровень экспрессии TREM, можно также идентифицировать посредством скрининга кандидатных нуклеиновых кислот, векторов или клеток у отличных от человека млекопитающих (например, отличных от человека млекопитающих, трансгенных по TREM2 или нокаутных по TREM2). Например, уровень экспрессии TREM2 можно оценить в группе отличных от человека млекопитающих, которым введены нуклеиновые кислоты, векторы или клетки, и сравнить с необработанными контрольными млекопитающими для определения того, приводит ли введение нуклеиновых кислот, векторов или клеток к повышению уровня TREM2, или нет. Отличные от человека млекопитающие включают, например, грызунов, таких как крысы, морские свинки и мыши, и сельскохозяйственных животных, таких как свиньи, овцы, козы, лошади и крупный рогатый скот. Отличных от человека млекопитающих также можно сконструировать таким образом, чтобы у них отсутствовала эндогенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид TREM2, или чтобы они содержали усеченную или нарушенную последовательность эндогенной нуклеиновой кислоты TREM2 (например, нокаутные животные).

Также в данном документе предусмотрены способы лечения связанного с TREM2 заболевания или нарушения у субъекта (например, человека) посредством введения субъекту нуклеиновой кислоты, кодирующей мутантные варианты TREM2 человека, устойчивые к расщеплению шеддазой, раскрытые в данном документе, или вектора или клетки, содержащих такую нуклеиновую кислоту.

В некоторых вариантах осуществления связанное с TREM2 заболевание или нарушение представляет собой нейровоспалительное или нейродегенеративное заболевание, такое как болезнь Альцгеймера, лобно-височная деменция, болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз, болезнь Насу-Хакола, рассеянный склероз, боковой амиотрофический склероз (ALS), энцефалит с антителами к NMDA-рецепторам, аутизм, волчанка головного мозга (NP-SLE), химиоиндуцированная периферическая нейропатия (CIPN), посттерапевтическая невралгия, хроническая воспалительная демиелинизирующая полинейропатия (CIDP), эпилепсия, синдром Гийена-Барре (GBS), миозит с тельцами включения, заболевания лизосомального накопления, например сфингомиелинлипидоз (Ниманна-Пика C) и мукополисахаридоз II/ IIIB, метахроматическая лейкодистрофия, мультифокальная моторная нейропатия, тяжелая миастения, болезнь Бехчета с вовлечением нервных структур, оптиконейромиелит (NMO), неврит зрительного нерва, полимиозит, дерматомиозит, энцефалит Расмуссена, синдром Ретта, инсульт, поперечный миелит, травматическое повреждение головного мозга, повреждение спинного мозга, вирусный энцефалит или бактериальный менингит.

В некоторых вариантах осуществления связанное с TREM2 заболевание или нарушение включает заболевания, связанные с CNS, заболевания, связанные с PNS, системное воспаление и другие заболевания, связанные с воспалением, болью и симптомами синдрома отмены, вызванными злоупотреблением химическими веществами, заболевания или нарушения, связанные с CNS, включают генерализованные тревожные расстройства, когнитивные расстройства, дефициты и дисфункции обучения и памяти, болезнь Альцгеймера (легкой, умеренной и тяжелой степени), синдром дефицита внимания и гиперактивности, болезнь Паркинсона, деменцию при болезни Паркинсона, болезнь Хантингтона, ALS, прионные нейродегенеративные нарушения, такие как болезнь Крейтцфельдта-Якоба и болезнь куру, синдром Жиля де ла Туретта, психоз, депрессию и депрессивные расстройства, манию, маниакальную депрессию, шизофрению, когнитивные дефициты при шизофрении, обсессивно-компульсивные расстройства, панические расстройства, расстройства пищевого поведения, нарколепсию, ноцицепцию, ассоциированную со СПИДом деменцию, сенильную деменцию, легкое когнитивное нарушение, связанное с возрастом (MCI), нарушение памяти, связанное с возрастом, аутизм, дислексию, позднюю дискинезию, эпилепсию и судорожные расстройства, посттравматические стрессовые расстройства, временную гипоксию, псевдодеменцию, предменструальный синдром, синдром поздней лютеиновой фазы, синдром хронической усталости и синдром смены часовых поясов.

Связанное с TREM2 заболевание или нарушение также включает: иммунологические нарушения, особенно включающие воспалительные нарушения (например, бактериальная инфекция, грибковая инфекция, вирусная инфекция, инфекция, вызванная простейшими, или другая паразитарная инфекция, псориаз, септицемия, церебральная малярия, воспалительное заболевание кишечника, артрит, такой как ревматоидный артрит, фолликулит, импетиго, гранулемы, липоидные пневмонии, васкулит и остеоартрит), аутоиммунные нарушения (например, ревматоидный артрит, тиреоидит, такой как тиреоидит Хашимото и болезнь Грейвса, инсулинорезистентный диабет, пернициозная анемия, болезнь Аддисона, пузырчатка, витилиго, язвенный колит, системная красная волчанка (SLE), синдром Шегрена, рассеянный склероз, дерматомиозит, смешанное заболевание соединительной ткани, склеродермия, полимиозит, отторжение трансплантата, такое как отторжение аллотрансплантата), T-клеточные нарушения (например, AIDS), аллергические воспалительные нарушения (например, виды кожной аллергии и/или виды аллергии с вовлечением слизистых оболочек, такие как аллергический ринит, астма, псориаз), неврологические нарушения, нарушения со стороны органов зрения, эмбриональные нарушения или любые другие нарушения (например, опухоли, виды рака, лейкоз, миелоидные заболевания и травмы), которые непосредственно или опосредованно связаны с нарушенной активностью и/или экспрессией TREM2.

В некоторых вариантах осуществления связанное с TREM2 заболевание или нарушение представляет собой аутоиммунное, воспалительное или злокачественное нарушение, опосредованное или связанное с избыточным протеолитическим расщеплением TREM2, или с клетками, экспрессирующими нарушенные или мутантные варианты рецептора TREM2. Примеры аутоиммунных заболеваний включают без ограничения артрит (например, ревматоидный артрит, хронический прогрессирующий артрит и деформирующий артрит) и ревматические заболевания, включающие воспалительные состояния, и ревматические заболевания, включающие потерю костной массы, боль при воспалительном процессе, спондилоартропатии, в том числе анкилозирующий спондилоартрит, болезнь Рейтера, реактивный артрит, псориатический артрит и энтеропатический артрит, гиперчувствительность (включающая как гиперчувствительность дыхательных путей, так и кожную гиперчувствительность) и виды аллергии. Аутоиммунные заболевания включают аутоиммунные гематологические нарушения (в том числе, например, гемолитическую анемию, апластическую анемию, эритробластопению и идиопатическую тромбоцитопению), системную красную волчанку, воспалительные мышечные нарушения, полихондрию, склеродермию, гранулематоз Вегенера, дерматомиозит, хронический активный гепатит, тяжелую миастению, псориаз, синдром Стивенса-Джонсона, идиопатический синдром мальабсорбции, эндокринную офтальмопатию, болезнь Грейвса, саркоидоз, рассеянный склероз, первичный билиарный цирроз, ювенильный диабет (сахарный диабет I типа), увеит (передний и задний), синдром сухого глаза и весенний кератоконъюнктивит, интерстициальный фиброз легких, псориатический артрит и гломерулонефрит (с нефротическим синдромом и без него, например, в том числе подагру, гистиоцитоз клеток Лангерганса, идиопатический нефротический синдром или нефропатию минимальных изменений), опухоли, воспалительное заболевание кожи и роговицы, миозит, потерю костных имплантатов, метаболические нарушения, такие как атеросклероз, диабет и дислипидемия.

В некоторых вариантах осуществления связанное с TREM2 заболевание или нарушение выбрано из астмы, бронхита, пневмокониоза, эмфиземы легких, других обструктивных или воспалительных заболеваний дыхательных путей, включая идиопатический фиброз легких или COPD.

В некоторых вариантах осуществления связанное с TREM2 заболевание или нарушение представляет собой злокачественное нарушение, затрагивающее органы кроветворения или печень, такое как острый миелоидный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз, миелопролиферативные нарушения, миелодиспластические синдромы, множественная миелома, пароксизмальная ночная гемоглобинурия, анемия Фанкони, большая талассемия, синдром Вискотта-Олдрича, гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз.

В некоторых вариантах осуществления связанное с TREM2 заболевание или нарушение выбрано из астмы, энцефалита, воспалительного заболевания кишечника, хронического обструктивного заболевания легких (COPD), аллергических нарушений, септического шока, фиброза легких, недифференцированной спондилоартропатии, недифференцированной артропатии, артрита, воспалительного остеолиза или хронического воспаления в результате хронических вирусных или бактериальных инфекций.

В некоторых вариантах осуществления связанное с TREM2 заболевание или нарушение выбрано из деменции, лобно-височной деменции, болезни Альцгеймера, сосудистой деменции, смешанной деменции, болезни Крейтцфельдта-Якоба, нормотензивной гидроцефалии, бокового амиотрофического склероза, болезни Хантингтона, таупатии, болезни Насу-Хакола, инсульта, острой травмы, хронической травмы, волчанки, острого и хронического колита, нарушения заживления ран, болезни Крона, воспалительного заболевания кишечника, язвенного колита, ожирения, малярии, эссенциального тремора, волчанки центральной нервной системы, болезни Бехчета, болезни Паркинсона, деменции с тельцами Леви, множественной системной атрофии, синдрома Шая-Дрейджера, прогрессирующего надъядерного паралича, кортикальной базальной ганглионарной дегенерации, острого рассеянного энцефаломиелита, гранулематозных нарушений, саркоидоза, заболеваний, связанных со старением, пароксизмальных судорог, повреждения спинного мозга, травматического повреждения головного мозга, возрастной макулярной дегенерации, глаукомы, пигментной дистрофии сетчатки, дегенерации сетчатки, инфекции дыхательных путей, сепсиса, глазной инфекции, системной инфекции, волчанки, артрита, рассеянного склероза, низкой плотности костной ткани, остеопороза, нарушения остеогенеза, остеопетроза, костной болезни Педжета и рака.

В некоторых вариантах осуществления связанное с TREM2 заболевание или нарушение выбрано из деменции, лобно-височной деменции, болезни Альцгеймера, болезни Насу-Хакола и рассеянного склероза. В некоторых вариантах осуществления связанное с TREM2 заболевание или нарушение представляет собой деменцию, такую как лобно-височная деменция, болезнь Альцгеймера, сосудистая деменция, семантическая деменция или деменция с тельцами Леви. В некоторых вариантах осуществления связанное с TREM2 заболевание или нарушение представляет собой болезнь Альцгеймера. В некоторых вариантах осуществления связанное с TREM2 заболевание или нарушение представляет собой лобно-височную деменцию.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновую кислоту, вектор или клетку вводят субъекту внутривенным, внутричерепным, интратекальным, подкожным или интраназальным путем.

В некоторых вариантах осуществления такие способы также включают анализ уровня TREM2 человека на клеточной поверхности в образце, полученном от субъекта, например в образце спинномозговой жидкости. Уровень TREM2 человека на клеточной поверхности в образце можно определить с помощью анализа, известного из уровня техники, например с помощью проточной цитометрии, иммуногистохимического исследования, вестерн-блоттинга, иммунофлуоресцентного анализа, радиоиммуноанализа (RIA), твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), гомогенной флуоресценции с временным разрешением (HTRF) или позитронно-эмиссионной томографии (PET) или любого другого иммунного выявления с антителом или фрагментом антитела к белку TREM2 человека.

В данном документе предусмотрены также пути применения нуклеиновой кислоты, кодирующей мутантные варианты TREM2 человека, устойчивые к расщеплению шеддазой, раскрытые в данном документе, или вектора или клетки, содержащих такую нуклеиновую кислоту, для лечения связанного с TREM2 заболевания или нарушения у субъекта. Также включены пути применения нуклеиновой кислоты, кодирующей мутантные варианты TREM2 человека, устойчивые к расщеплению шеддазой, раскрытые в данном документе, или вектора или клетки, содержащих такую нуклеиновую кислоту, при изготовлении лекарственного препарата для лечения связанного с TREM2 заболевания или нарушения.

Виды комбинированной терапии

Различные способы лечения, описанные выше, можно объединять с другими способами лечения, такими как современный стандарт терапии связанного с TREM2 заболевания или нарушения, например современный стандарт терапии болезни Альцгеймера, лобно-височной деменции, болезни Паркинсона, бокового амиотрофического склероза или болезни Насу-Хакола. Например, нуклеиновые кислоты, кодирующие мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению шеддазой, описанный в данном документе, или векторы или клетки, содержащие такие нуклеиновые кислоты, можно объединять с одним или несколькими из ингибиторов BACE, антител к Tau, антител к бета-амилоиду, FTY720, BG12, бета-интерферона или тисабри. Соответственно, способы лечения связанного с TREM2 заболевания или нарушения, описанные в данном документе, могут дополнительно включать введение второго средства субъекту, нуждающемуся в лечении.

Термин "комбинация" означает либо фиксированную комбинацию в виде одной дозированной единицы, либо комбинированное введение, где соединение по настоящему изобретению и партнер по комбинации (например, другое лекарственное средство, которое поясняется ниже, также называемое "терапевтическим средством" или "совместно применяемым средством") можно вводить независимо в одно и то же время или по отдельности в пределах промежутков времени, особенно когда эти промежутки времени обеспечивают партнерам по комбинации возможность проявления кооперативного, например синергетического, эффекта. Отдельные компоненты могут быть упакованы в набор или по отдельности. Один или оба компонента (например, порошки или жидкости) могут быть восстановлены или разбавлены до необходимой дозы перед введением. Термины "совместное введение" или "комбинированное введение" или им подобные, используемые в данном документе, понимаются как охватывающие введение выбранного партнера по комбинации одному субъекту, нуждающемуся в этом (например, пациенту), и предполагают включение режимов лечения, в которых средства необязательно вводят одним и тем же путем введения или в одно и то же время. Термин "фармацевтическая комбинация", используемый в данном документе, означает продукт, который получают в результате смешивания или комбинирования более чем одного терапевтического средства, и который включает как фиксированные, так и нефиксированные комбинации терапевтических средств. Термин "фиксированная комбинация" означает, что терапевтические средства, например соединение по настоящему изобретению и партнер по комбинации, оба вводят пациенту одновременно в виде единого объекта или дозированно. Термин "нефиксированная комбинация" означает, что терапевтические средства, например соединение по настоящему изобретению и партнер по комбинации, оба вводят пациенту как отдельные объекты либо одновременно, параллельно либо последовательно без конкретных сроков, при этом такое введение обеспечивает терапевтически эффективные уровни двух соединений в организме пациента. Последнее также применяется в отношении "смешанной терапии", например при введении трех или более терапевтических средств.

Используемый в данном документе термин "фармацевтическая комбинация" означает либо фиксированную комбинацию в виде одной дозированной единицы, либо нефиксированную комбинацию или набор из частей для комбинированного введения, где два или более терапевтических средств можно вводить независимо в одно и то же время или по отдельности в пределах временных промежутков, особенно когда эти временные промежутки обеспечивают партнерам по комбинации возможность проявления кооперативного, например синергетического, эффекта.

Термин "комбинированная терапия" означает введение двух или более терапевтических средств для лечения терапевтического состояния или нарушения, описанного в настоящем изобретении. Такое введение охватывает совместное введение этих терапевтических средств практически одновременно, как, например, в одной капсуле, имеющей фиксированное соотношение активных ингредиентов. В качестве альтернативы такое введение охватывает совместное введение в нескольких или в отдельных контейнерах (например, таблетки, капсулы, порошки и жидкости) для каждого активного ингредиента. Порошки и/или жидкости можно восстановить или разбавить до необходимой дозы перед введением. Кроме того, такое введение также охватывает применение каждого типа терапевтического средства последовательным образом, либо примерно в одно и то же время, либо в разное время. В любом случае режим лечения будет обеспечивать благоприятные эффекты комбинации лекарственных средств при лечении состояний или нарушений, описанных в данном документе.

Получение образца

Образцы, используемые в способах, описанных в данном документе, можно получать от субъекта с применением любого из способов, известных из уровня техники, например с помощью биопсии или оперативного вмешательства. Например, образец, содержащий спинномозговую жидкость, можно получать с помощью люмбальной пункции, при который тонкую иглу, присоединенную к шприцу, вводят в люмбальную область позвоночного канала и вакуум создается таким образом, чтобы спинномозговую жидкость можно было засосать посредством иглы и собрать в шприц. Для управления данным типом процедуры можно применять визуализацию с помощью CT, ультразвуковое исследование или эндоскоп. Образец можно быстро заморозить и хранить при -80°C для последующего применения. Образец также можно зафиксировать с помощью фиксирующего средства, такого как формальдегид, параформальдегид или уксусная кислота/этанол. РНК или белок можно выделять из свежего, замороженного или зафиксированного образца для анализа.

Фармацевтические композиции, доза и способы введения

Также в данном документе предусмотрены композиции, например фармацевтические композиции, содержащие одну или несколько нуклеиновых кислот, кодирующих мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению шеддазой, описанный в данном документе, или векторы или клетки, содержащие такие нуклеиновые кислоты. Такие композиции могут дополнительно включать другое средство, например современный стандарт терапии заболевания, которое подлежит лечению.

Фармацевтические композиции, как правило, включают фармацевтически приемлемый носитель. Используемый в данном документе термин "фармацевтически приемлемый носитель" включает солевой раствор, растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические средства и средства, замедляющие всасывание, и т.п., совместимые с фармацевтическим введением. Фармацевтические композиции, как правило, составлены таким образом, что они совместимы с предполагаемым путем их введения. Примеры путей введения включают парентеральное (например, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное), пероральное, внутричерепное, интратекальное или интраназальное (например, ингаляция), внутрикожное, подкожное или чреcслизистое введение. В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции составлены для доставки TREM2-связывающих молекул через гематоэнцефалический барьер.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции содержат один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, включающих, например, ионообменные материалы, оксид алюминия, стеарат алюминия, лецитин, сывороточные белки, такие как сывороточный альбумин человека, буферные вещества, такие как фосфаты, глицин, сорбиновая кислота, сорбат калия, смеси неполных глицеридов насыщенных растительных жирных кислот, воду, соли или электролиты, такие как протаминсульфат, двузамещенный фосфорнокислый натрий, гидрофосфат калия, хлорид натрия, соли цинка, коллоидный диоксид кремния, трисиликат магния, поливинилпирролидон, вещества на основе целлюлозы, полиэтиленгликоль, натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы, полиакрилаты, виды воска, блочные полимеры полиэтилена и полиоксипропилена, полиэтиленгликоль и ланолин.

Способы составления подходящих фармацевтических композиций известны из уровня техники, см., например, Remington: Science and Practice of Pharmacy. 21st ed., 2005; и книги серии Drugs and the Pharmaceutical Sciences: a Series of Textbooks and Monographs (Dekker, NY). Например, растворы или суспензии, применяемые для парентерального, внутрикожного или подкожного применения могут включать следующие компоненты: стерильный разбавитель, такой как вода для инъекции, солевой раствор, нелетучие масла, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители; антибактериальные средства, такие как бензиловый спирт или метилпарабены; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; хелатирующие средства, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота; буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты, и средства для регуляции тонуса, такие как хлорид натрия или декстроза. Уровень pH можно регулировать с помощью кислот или оснований, таких как хлористоводородная кислота или гидроксид натрия. Препарат для парентерального введения можно заключить в ампулы, одноразовые шприцы или флаконы многоразового использования, сделанные из стекла или пластика.

Фармацевтические композиции, подходящие для введения путем инъекции, могут включать стерильные водные растворы (если лекарственное средство растворимо в воде) или дисперсии и стерильные порошки для получения стерильных инъекционных растворов или дисперсии для немедленного приема. Подходящие носители для внутривенного введения включают физиологический раствор, воду с бактериостатическим средством, Cremophor EL™ (BASF, Парсиппани, штат Нью-Джерси) или забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS). Во всех случаях композиция должна быть стерильной и должна быть текучей до такой степени, чтобы ее можно было легко вводить через шприц. Она должна быть стабильной в условиях изготовления и хранения и должна быть защищена от загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащие, например, воду, этанол, полиол (например, глицерол, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, посредством применения покрытия, такого как лецитин, посредством поддержания необходимого размера частиц в случае дисперсии и посредством применения поверхностно-активных веществ. Предупреждения действия микроорганизмов можно достичь с помощью различных антибактериальных и противогрибковых средств, например парабенов, хлорбутанола, фенола, аскорбиновой кислоты, тимеросала и т.п. Во многих случаях предпочтительным будет включение в композицию изотонических средств, например сахаров, полиспиртов, таких как маннит, сорбит, или хлорида натрия. Длительное всасывание инъекционных композиций можно обеспечить посредством включения в композицию средства, которое замедляет всасывание, например моностеарата алюминия и желатина.

Стерильные инъекционные растворы можно получать посредством введения активного соединения в необходимом количестве в подходящий растворитель с одним ингредиентом или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, при необходимости с последующей стерилизацией посредством фильтрации.

Обычно дисперсии получают посредством включения активного соединения в стерильную среду-носитель, которая содержит основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из тех, которые перечислены выше. В случае стерильных порошков для получения стерильных инъекционных растворов предпочтительными способами получения являются вакуумная сушка и лиофилизация, которые позволяют получить порошок активного ингредиента с любым дополнительным необходимым ингредиентом из их раствора, предварительно стерилизованного посредством фильтрации.

Составы для парентерального введения могут представлять собой одну болюсную дозу, инфузию или нагрузочную болюсную дозу с последующей поддерживающей дозой. Такие композиции можно вводить со специфическими фиксированными или варьирующими промежутками, например один раз в день или "при необходимости".

Подходящие фармацевтические композиции для введения путем инъекции могут содержать буфер (например, ацетатный, фосфатный или цитратный буфер), поверхностно-активное вещество (например, полисорбат), необязательно стабилизирующее средство (например, человеческий альбумин) и т.д. Препараты для периферического введения включают стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Примеры неводных растворителей представляют собой пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и инъекционные органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Водные носители включают, например, воду, спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, включая солевой раствор и забуференные среды. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит 0,01-0,1 M фосфатный буфер или 0,8% солевой раствор. Другие распространенные среды-носители для парентерального введения включают растворы фосфата натрия, декстрозу Рингера, декстрозу и хлорид натрия, лактат Рингера или нелетучие масла. Среды-носители для внутривенного введения включают жидкие и питательные наполнители, электролитные наполнители, такие как наполнители на основе декстрозы Рингера и т.п. Также могут присутствовать консерванты и другие добавки, такие как, например, противомикробные средства, антиоксиданты, хелатирующие средства и инертные газы и т.п.

Композиции для перорального введения обычно включают инертный разбавитель или съедобный носитель. Если целью является пероральное терапевтическое введение, активное соединение можно включать со вспомогательными веществами и применять в виде таблеток, пастилок или капсул, например желатиновых капсул. Композиции для перорального введения также можно получать с применением жидкого носителя для применения в качестве ополаскивателя для полости рта. Фармацевтически совместимые связывающие средства и/или вспомогательные материалы можно включать в качестве части композиции. Таблетки, пилюли, капсулы, пастилки и т. п., могут содержать любое из следующих ингредиентов или соединений подобной природы: связывающее средство, такое как микрокристаллическая целлюлоза, трагакантовая камедь или желатин; вспомогательное вещество, такое как крахмал или лактоза, разрыхляющее средство, такое как альгиновая кислота, Primogel или кукурузный крахмал; смазывающее средство, такое как стеарат магния или Sterotes; способствующее скольжению вещество, такое как коллоидный диоксид кремния; подсластитель, такой как сахароза или сахарин; или ароматизатор, такой как мята перечная, метилсалицилат или апельсиновый ароматизатор.

Для введения посредством ингаляции соединения можно доставлять в виде аэрозоля, распыляемого из контейнера под давлением или устройства-дозатора, который содержит подходящий пропеллент, например газ, такой как диоксид углерода, или небулайзера. Такие способы включают способы, описанные в патенте США № 6468798. Системное введение терапевтического соединения, описанного в данном документе, можно осуществлять чресслизистым или трансдермальным путем. Для чресслизистого или трансдермального введения в составе применяют смачивающие вещества, подходящие для прохождения через барьер, который необходимо преодолеть. Такие смачивающие вещества обычно известны из уровня техники и включают, например, для чресслизистого введения, детергенты, соли желчных кислот и производные фузидиевой кислоты. Чресслизистое введение можно осуществлять посредством применения назальных спреев или суппозиториев. Для трансдермального введения активные соединения составляют в виде мазей, бальзамов, гелей или кремов, которые обычно известны из уровня техники.

В одном варианте осуществления терапевтические соединения получают с носителями, которые будут защищать терапевтические соединения от быстрого разрушения в организме, такими как состав с контролируемым высвобождением, включая имплантаты и микроинкапсулированные системы доставки.

Фармацевтические композиции можно включать в контейнер, упаковку или устройство-дозатор вместе с инструкциями по введению.

В неограничивающих примерах фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере одно фармацевтическое средство, составляют в виде жидкости (например, термоотверждающейся жидкости), в виде компонента твердого препарата (например, порошка или биоразлагаемого биосовместимого полимера (например, катионного биоразлагаемого биосовместимого полимера)) или в виде компонента геля (например, биоразлагаемого биосовместимого полимера). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере композиция, содержащая по меньшей мере одно фармацевтическое средство, составлена в виде геля, выбранного из группы, включающей альгинатный гель (например, альгинат натрия), гель на основе целлюлозы (например, карбоксиметилцеллюлоза или карбоксиэтилцеллюлоза) или гель на основе хитозана (например, глицерофосфат хитозана). Дополнительные неограничивающие примеры полимеров для элюирования лекарственного средства, которые можно применять для составления любой из фармацевтических композиций, описанных в данном документе, включают каррагинан, карбоксиметилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, декстран в комбинации с поливиниловым спиртом, декстран в комбинации с полиакриловой кислотой, полигалактуроновую кислоту, галактуроновый полисахарид, полимолочную кислоту, полигликолевую кислоту, тамариндовую камедь, ксантановую камедь, целлюлозную камедь, гуаровую камедь (карбоксиметилгуар), пектин, полиакриловую кислоту, полиметакриловую кислоту, N-изопропилполиакриламид, полиоксиэтилен, полиоксипропилен, плюроновую кислоту, полимолочную кислоту, циклодекстрин, циклоамилозу, резилин, полибутадиен, сополимер N-(2-гидроксипропил)метакриламида (HP MA), алкилвиниловый эфир малеинового ангидрида, полидепсипептид, полигидроксибутират, поликапролактон, полидиоксанон, полиэтиленгликоль, полиорганофосфазен, сложный полиортоэфир, поливинилпирролидон, сополимер полимолочной и гликолевой кислот (PLGA), полиангидриды, полисиламин, поли-N-винилкапролактам и геллан.

Дозу, токсичность и терапевтическую эффективность терапевтических соединений можно определять с помощью стандартных фармацевтических процедур в культурах клеток или с применением экспериментальных животных, например, для определения LD50 (дозы, смертельной для 50% особей популяции) и ED50 (дозы, терапевтически эффективной для 50% особей популяции). Соотношение дозы между токсичным и терапевтическим эффектами представляет собой терапевтический индекс и может быть выражено как соотношение LD50/ED50. Соединения, которые проявляют высокие терапевтические индексы, являются предпочтительными. В то же время соединения, которые проявляют токсичные побочные эффекты, можно применять, но следует обращать внимание на конструирование системы доставки, которая нацеливает такие соединения к месту пораженной ткани, с целью минимизировать потенциальное повреждение неинфицированных клеток и за счет этого снизить побочные эффекты.

Данные, полученные из анализов с культурами клеток и исследований на животных, можно применять для составления диапазона доз для применения у людей. Доза таких соединений находится, предпочтительно, в пределах диапазона циркулирующих концентраций, которые включают ED₅₀ с небольшой токсичностью или без нее. Доза может варьировать в пределах данного диапазона в зависимости от применяемой лекарственной формы и используемого пути введения. Для любого соединения, применяемого в способе, раскрытом в данном документе, терапевтически эффективную дозу можно первоначально оценить с помощью анализов с культурами клеток. Дозу можно составлять на животных моделях с достижением диапазона циркулирующих в плазме крови концентраций, которые включают IC₅₀ (т.е. концентрацию тестируемого соединения, с помощью которой достигают половину от максимального подавления симптомов), определенную в культуре клеток. Такую информацию можно использовать для более точного определения применяемых доз у людей. Уровни в плазме крови можно измерить, например, с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Наборы

Также в данном документе предусмотрены наборы, включающие одну или несколько нуклеиновых кислот, кодирующих мутантный вариант TREM2 человека, устойчивый к расщеплению шеддазой, описанный в данном документе, или векторы или клетки, содержащие такие нуклеиновые кислоты, и инструкции по применению. Инструкции по применению могут включать инструкции в отношении установления наличия или лечения связанного с TREM2 заболевания или нарушения. Наборы, предусмотренные в данном документе, можно применять в соответствии с любым из способов, описанных в данном документе. Специалистам в данной области будут известны другие подходящие пути применения наборов, предусмотренных в данном документе, и они смогут использовать наборы для таких путей применения. Наборы, предусмотренные в данном документе, также могут включать почтовое отправление (например, конверт с предварительно оплаченным почтовым сбором или почтовую упаковку), которое может применяться для возвращения образца для анализа, например, в лабораторию. Набор может включать один или несколько контейнеров для образца, или образец может находиться в стандартном флаконе для сбора крови. Набор также может включать одну или несколько из формы информированного согласия, формы официального запроса на тест и инструкций по применению набора в способе, описанном в данном документе. Способы применения таких наборов также включены в данный документ. Одна или несколько из форм (например, форма официального запроса на тест) и контейнер, содержащий образец, могут быть закодированы, например, штрихкодом для идентификации субъекта, который предоставил образец.

Специалисту в данной области будут понятны многие способы и материалы, подобные или эквивалентные описанным в данном документе, которые можно применять при осуществлении на практике настоящего изобретения. Следует отметить, что настоящее изобретение никоим образом не ограничено описанными способами и материалами.

ПРИМЕРЫ

Настоящее изобретение дополнительно описано в следующих примерах, которые не ограничивают объем настоящего изобретения, описанного в формуле изобретения.

Пример 1. Материалы и способы

Соединения.

GI254023 ((2R,3S)-3-(формилгидроксиамино)-2-(3-фенил-1-пропил)бутановая кислота[(1S)-2,2-диметил-1-метилкарбамоил-1-пропил]амид) синтезировали, как описано в Hundhausen et al., Blood. 2003;102:1186-1195). DPC333 ((2R)-2-((3R)-3-амино-3{4-[2-метил-4-хинолинил)метокси]фенил}-2-оксопирролидинил)-N-гидрокси-4-метилпентанамид)) синтезировали, как описано в Qian et al., Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals 35, 1916-1925, 2007.

Культура клеток.

Клетки THP1, стабильно совместно экспрессирующие Cas9 и ген устойчивости к бластицидину, доставленный с помощью лентивируса, культивировали в среде RPMI, содержащей 10% FBS, 1% L-глутамина, 1% пен./стреп. и 10 мкг/мл бластицидина (Thermo Fisher Scientific). Клетки культивировали при 37°C в атмосфере с 5% CO₂.

Получение нокаутных по ADAM17 и ADAM10 линий.

Клетки THP1-Cas9 инфицировали с помощью лентивирусов, экспрессирующих ген устойчивости к пуромицину и sgRNA (для схемы вектора см. Hoffman, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 111, 3128-3133, 2014), нацеливающиеся либо на ADAM10 (GTAATGTGAGAGACTTTGGG, SEQ ID NO: 75), либо на ADAM17 (CCGAAGCCCGGGTCATCCGG, SEQ ID NO: 76). Упаковку в лентивирус проводили в клетках HEK293T, как описано ранее. Вкратце, 30 мкл супернатанта с лентивирусной sgRNA добавляли к 1×10⁶ клеток THP1-Cas9 в 2 мл среды, содержащей 5 мкг/мл полибрена (Sigma), и центрифугировали при 300 g в течение 90 минут в 6-луночном планшете. Через 24 часа клетки осаждали и ресуспендировали в свежей культуральной среде, содержащей 1,5 мкг/мл пуромицина. Через 4 недели с заменой среды еженедельно выделяли геномную ДНК с применением набора Quick-gDNA MiniPrep Kit (Zymo Research) для оценки вставок и делеций (вставок/делеций), присутствующих в пуле, путем секвенирования нового поколения (NGS). Для выделения клонов, содержащих только вставки/делеции со сдвигом рамки считывания, клетки высевали при ограниченном разведении в 96-луночные планшеты. После размножения клонов их анализировали с помощью NGS и клоны, содержащие только аллели со сдвигом рамки считывания, выбирали для последующих анализов.

Анализ вставок/делеций с помощью NGS.

Для получения сконструированных клеток для NGS, каждую мишень амплифицировали с применением локусспецифических праймеров. Проводили два раунда ПЦР. В первом раунде использовали локусспецифические праймеры для амплификации отредактированной области. Праймеры для ADAM10 представляли собой ATTAGACAATACTTACTGGGGATCC (SEQ ID NO: 77) и GGAAGCTCTGGAGGAATATGTG (SEQ ID NO: 78), а праймеры для ADAM17 представляли собой CCCCCAAACACCTGATAGAC (SEQ ID NO: 79) и CCAGAGAGGTGGAGTCGGTA (SEQ ID NO: 80). Образованный во время первого раунда продукт затем использовали в качестве матрицы для второго раунда ПЦР для добавления двойных индексов, совместимых с системой Illumina. Последовательности для Illumina Nextera Adapter для обеих областей-мишеней представляли собой TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG (SEQ ID NO: 81) и GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG (SEQ ID NO: 82). Библиотеки подсчитывали с помощью qRT-PCR и затем секвенировали на системе Illumina MiSeq. Для анализа последовательностей исходные риды выравнивали относительно эталонной последовательности, затем маркировали на основе генотипа. В заключение, маркированные генотипы группировали в три категории: дикого типа, с мутациями в рамке считывания и со сдвигом рамки считывания.

Экспрессия на клеточной поверхности мутированного TREM2 в клетках HEK293.

Мутантные варианты человеческого TREM2 получали с применением набора для сайт-направленного мутагенеза QuikChange (Stratagene) и подтверждали с применением анализа последовательностей. Трансфекции конструкций на основе комплементарной ДНК (cDNA) проводили при соотношении hDAP12 и TREM2 1:1 в клетках HEK-FT с применением реагента липофектамина LTX (Thermofischer) в соответствии с рекомендациями изготовителя. Через 48 ч. после трансфекции клетки обрабатывали в течение 30 мин. с помощью 50 нг/мл PMA или 0,05% DMSO и отделяли с помощью раствора для отделения клеток Accutase (Sigma), и окрашивали антителом козы к TREM2 человека, AF1828 (R&D Systems), или изотипическим контролем с последующим инкубированием с вторичным антителом, конъюгированным с Alexa Fluor 488 (Molecular Probes). Получение данных проводили с применением BD FACSCanto II (BD biosciences).

Экспрессия TREM2 в человеческих макрофагах и клетках CHO.

Клетки CHO трансфицировали с обеспечением совместной экспрессии hDAP12 и hTREM2 с применением реагента липофектамина LTX (Thermofischer) в соответствии с рекомендациями изготовителя. Отобрали один положительный клон и обозначили его CHO-hDAP12-hTREM2. Человеческие макрофаги M2A получали из лейкоцитарной пленки с применением набора для отрицательного выделения моноцитов (Stem cell technologies) и подвергали дифференцировке в течение 5 дней в среде RPMI1640 с Glutamax (Gibco), дополненной 10% FBS (Gibco), PenStrep (Gibco), 1% пируватом натрия (Gibco), 0,025 M буфером HEPES (Gibco), 0,05 мM β-меркаптоэтанолом (Gibco), M-CSF (40 нг/мл) и IL-4 (50 нг/мл). TREM2 клеточной поверхности определяли с помощью FACS, как описано выше.

Визуализация живых клеток.

Человеческие макрофаги M2A или CHO-hDAP12-hTREM2 высевали в 384-луночные планшеты (Greiner) и обрабатывали ингибиторами ADAM DPC333 или GI254023 в концентрациях, указанных на фигурах. Через 16 ч клетки обрабатывали в течение 30 минут при помощи PMA (50 нг/мл) или 0,1% DMSO в течение 30 минут. Планшеты помещали на лед и окрашивали антителом козы к TREM2 человека, AF1828 (R&D Systems), или изотипическим контролем и красителем Хехст с последующим инкубированием с вторичным антителом к антителу козы, конъюгированным с Alexa Fluor 488 (Molecular Probes). Изображения получали с применением анализатора InCell2000 (GE Healthcare). Для количественной характеристики изображений применяли открытое программное обеспечение CellProfiler.

Анализ с репортерным геном в клетках BWZ.

Репортерные клетки тимомы BWZ, которые экспрессируют lacZ под контролем промотора ядерного фактора активированных T-клеток (NFAT, Hsieh et al, Journal of Neurochemistry 109, 1144-1156, 2009), трансфицировали с обеспечением совместной экспрессии mDAP12 и hTREM2 WT или TREM2 с двойной мутацией T2. Клетки высевали в RPMI без фенольного красного, дополненную 2% FBS и 1% заменимых аминокислот в микротитровальные планшеты с высокой степенью связывания (Greiner), предварительно покрытые mAb крысы к TREM2 мыши/человека (R&D, MAB17291) или изотипическим контролем. Культивирование клеток продолжали в течение 16 ч. Активность репортерного гена оценивали с помощью системы для анализа Beta-glo (Promega) в соответствии с рекомендациями изготовителя с применением многоканального считывающего устройства Envision 2104 (Perkin Elmer).

Иммуноочистка.

Выведенный TREM2 очищали от клеточного супернатанта посредством иммуноочистки в микромасштабе. Это осуществляли на платформе MEA (PhyNexus), и применяли покрытые стрептавидином наконечники (PTR 92-05-05, Phynexus). Сначала наконечники уравновешивали с помощью PBS, затем загружали 200 мкл биотинилированного антитела к TREM2 (0,55 пмоль/мкл, BAF1828 от R&D System) в стрептавидиновую микроколонку (объем слоя 5 мкл) со скоростью 0,25 мл/мин. и 8 пассажами. После промывки с помощью PBS выведенный TREM2 захватывали из клеточного супернатанта (200 мкл) со скоростью 25 мл/мин. и 12 пассажами. За этим следует промывка с помощью PBS и элюирование с помощью 0,1 M глицина, pH 2,5 (2×4 пассажа) для конечного объема 2×60 мкл. Затем раствор нейтрализовали путем добавления 1 M Трис-HCl, pH 10 (5 мкл), затем его высушивали (Speedvac) и регидратировали с помощью 8 M мочевины (5 мкл, Fluka) и 0,4 M NH₄CO₃ (30 мкл, Fluka). Образец затем восстанавливали (2 мкл 1 M DTT, 30 мин. при 50°C), алкилировали (6 мкл 1 M IAA (Sigma), 30 мин. при к. т. в темноте), а реакцию останавливали добавлением 1 M DTT (2 мкл) и 0,4 M NH₄CO₃ (30 мкл). Полученный образец расщепляли либо трипсином, либо ферментом Asp-/Glu-C (+1 мкл трипсина (Promega) или Asp-/Glu C (Roche), 1 мкг/мкл, pH 8, и инкубировали в течение ночи при 37°C). В заключение расщепленный образец подкисляли с помощью HCOOH (1 мкл, Fluka) и 25 мкл полученного продукта расщепления впрыскивали на платформу для LC-MS.

Масс-спектрометрия.

Идентификация сайта расщепления путем пептидного картирования: анализы с помощью LC-MSE проводили с применением масс-спектрометра SYNAPT G2S QTOF (WATERS), соединенного с UPLC (ACQUITY I класс, WATERS). Применяли колонку BEH C18 UPLC (1,7 мкм, 1×100 мм, WATERS) для разделения пептидов. Градиент элюирования с помощью подвижной фазы A (0,1% HCOOH в воде) и подвижной фазы B (0,1% HCOOH в ацетонитриле) создавали с применением следующей программы: 1) изократический при 2% B в течение 3 мин; 2) линейный градиент от 2 до 30% B с 3 до 90 мин; 3) линейный градиент от 30 до 100% B с 90 до 95 мин; 4) изократический при 100% B с 95 до 105 мин; 5) линейный градиент от 100 до 2% B с 105 до 105,5 мин; и в заключение, 6) изократический при 2% B с 105,5 до 120 мин. Масс-спектрометр работал в режиме положительного разделения с автоматической коррекцией массы посредством системы lockspray (пептид P14R, масса/заряд 767,433, слитый при 250 фмоль при 5 мкл/мин, частота переключения каждые 20 с на 0,5 с на сканирование, 3 сканирования усреднены). Получали 2 кривые MS, одну для MS и одну для MSE. Обе получали в диапазоне массы масса/заряд 50-2000, время сканирования 0,5 с, напряжение на капилляре 3 кВ, напряжение на конусе 40 В. В режиме MSE напряжение захвата прыгало при каждом сканировании от 20 до 40 В. Кроме того, получали кривую УФ при длине волны 214 нм.

Идентификация сайта расщепления путем измерения интактной массы.

Анализы с помощью LC-MS проводили с применением масс-спектрометра SYNAPT G1 QTOF (WATERS), соединенного с UPLC (ACQUITY I класс, WATERS). Применяли колонку BEH C4 UPLC (1,7 мкм, 1×100 мм, WATERS) для разделения белков. Градиент элюирования с помощью подвижной фазы A (0,1% HCOOH в воде) и подвижной фазы B (0,1% HCOOH в ацетонитриле) создавали с применением следующей программы: 1) изократический при 5% B в течение 1,5 мин; 2) линейный градиент от 5 до 25% B с 1,5 до 2 мин; 3) линейный градиент от 25 до 35% B с 2 до 12 мин; 4) линейный градиент от 35 до 95% B с 12 до 13 мин; 5) изократический при 95% B с 13 до 15 мин; 5) линейный градиент от 95 до 5% B с 15 до 15,5 мин.; и в заключение 6) изократический при 5% B с 15,5 до 20 мин. Масс-спектрометр работал в режиме положительного разделения и откалиброван с помощью NaI, 2 мг/мл. Кривую MS получали в диапазоне массы масса/заряд 600-4500, время сканирования 0,5 с, напряжение на капилляре 3 кВ, напряжение на конусе 40 В, температура десольватации 200°C, скорость потока газа на конусе 50 л/ч. Кроме того, кривую УФ получали при длине волны 214 нм.

Определение O-связанного гликозилирования.

Анализы с помощью LC-MSE проводили с применением масс-спектрометра QTOF Premier (WATERS), соединенного с UPLC (ACQUITY H класс, WATERS). Применяли колонку BEH C18 UPLC (1,7 мкм, 1×100 мм, WATERS) для разделения пептидов. Градиент элюирования с помощью подвижной фазы A (0,1% HCOOH в 98% воде и 2% ацетонитриле) и подвижной фазы B (0,1% HCOOH в ацетонитриле) создавали с применением следующей программы: 1) изократический при 2% B в течение 3 мин; 2) линейный градиент от 2 до 30% B с 3 до 90 мин; 3) линейный градиент от 30 до 100% B с 90 до 95 мин; 4) изократический при 100% B с 95 до 105 мин; 5) линейный градиент от 100 до 2% B с 105 до 105,5 мин; и в заключение, 6) изократический при 2% B с 105,5 до 120 мин. Масс-спектрометр работал в положительном нормальном режиме с системой lockspray (пептид P14R, влитый при 1 пмоль при 10 мкл/мин, частота переключения каждые 20 с на 0,5 с на сканирование, 3 сканирования усреднены). Коррекцию массы проводили с применением lockmass (2+, 767,433 Да) во время обработки данных с помощью PLGS (WATERS). Получали 2 кривые MS, одну для MS и одну для MSE. Обе получали в диапазоне массы масса/заряд 50-2000, время сканирования 0,5 с, напряжение на капилляре 3 кВ, напряжение на конусе 40 В. В режиме MSE напряжение захвата прыгало при каждом сканировании от 20 до 40 В. Кроме того, получали кривую УФ при длине волны 214 нм.

Статистический анализ.

Статистический анализ проводили с помощью программного обеспечения Prism (GraphPad, Сан-Диего, штат Калифорния) с применением ANOVA и теста Стьюдента, при необходимости. P-значение <0,05 считали значимым.

Пример 2. Ингибиторы ADAM17 стабилизируют TREM2 на клеточной поверхности

Триггерный рецептор, экспрессируемый на миелоидных клетках (TREM2), представляет собой трансмембранный гликопротеин I типа и представителя суперсемейства рецепторов иммуноглобулинов (Ig) (Bouchon et al., The Journal of Experimental Medicine 194, 1111-1122, 2001). Экспрессия TREM2 была продемонстрирована в макрофагах, дендритных клетках, клетках микроглии и остеокластах, и, по-видимому, экспрессия регулируется временным и пространственным образом (Lue et al., Neuroscience 302, 138-150, 2015; Schmid et al., Journal of Neurochemistry 83, 1309-1320, 2002; Sessa et al., European Journal of Neuroscience 20, 2617-2628, 2004). В макрофагах экспрессия TREM2 активируется во время протекания воспаления, например экспрессия достигает максимума на 2-3 дни после контрольного применения тиогликолата в мышиной модели перитонита (Turnbull et al., Journal of Immunology 177, 3520-3524, 2006). TREM2 также является обогащенным в тех областях клеточной поверхности клеток микроглии, которые контактируют с Aβ-бляшками или нейронным дебрисом (Yuan et al., Neuron 90, 724-739, 2016). Некоторые из лигандов, которые воспринимаются TREM2 в данной среде, недавно были идентифицированы, например фосфолипиды и липиды миелина (Poliani et al., The Journal of Clinical Investigation 125, 2161-2170, 2015), а также ApoE (Atagi et al., The Journal of Biological Chemistry 290, 26043-26050, 2015; Bailey et al., The Journal of Biological Chemistry 290, 26033-26042, 2015). Другие лиганды могут представлять собой связанный с Aβ и бляшками нейронный дебрис, поскольку TREM2 участвует в поглощении Aβ в клетках микроглии (Xiang et al., EMBO Molecular Medicine 8, 992-1004, 2016).

Это хорошо согласуется с более ранними исследованиями обширной связи генома, которые показали, что вариант R47H, кодирующий TREM2 SNP, rs75932628-T, способствует в значительной степени повышенному риску позднего возникновения болезни Альцгеймера (LOAD) при соотношении рисков 5,05 (Guerreiro et al., The New England Journal of Medicine 368, 117-127, 2013) и 2,92 (Jonsson et al., The New England Journal of Medicine 368, 107-116, 2013). Такие соотношения рисков сравнимы с таковыми гена APOE4, связанного с хорошо установленным риском AD (Neumann & Daly, The New England Journal of Medicine 368, 182-184, 2013). Следует отметить, что мутированный по R47H TREM2 демонстрирует почти такую же экспрессию на клеточной поверхности, как и TREM2 WT (Kleinberger, 2014), но является функционально нарушенным: мутация R47H в TREM2 обеспечивает уменьшение степени связывания с липидными лигандами (Wang et al., Cell 160, 1061-1071, 2015) и ApoE (Atagi, 2015; Bailey, 2015). Мутация также обеспечивает снижение фагоцитарной способности (Kleinberger, 2014) и тормозит рециклизацию TREM2 посредством Vps35 в пределах ретромерного комплекса (Yin et al., Traffic 17, 1286-1296, 2016). Сообщалось о нескольких людях-носителях R47H без AD, и у таких индивидуумов потеря объема головного мозга была быстрее, чем у неносителей (Rajagopalan et al., The New England Journal of Medicine 369, 1565-1567, 2013), они обладали более низкой когнитивной функцией, чем контрольные индивидуумы сравнимого возраста (Jonsson et al., The New England Journal of Medicine 368, 107-116, 2013), и демонстрировали активацию провоспалительных цитокинов (например, RANTES, INFγ) и снижение активации защитных маркеров (например, IL-4, ApoA1; см. Roussos et al., Alzheimer's & Dementia: the Journal of the Alzheimer's Association 11, 1163-1170, 2015).

Для определения вклада ADAM10 или ADAM17 в выведение эктодомена TREM2, идентифицировали селективные ингибиторы: DPC333 (Qian et al., Drug Metabolism and Disposition: the Biological Fate of Chemicals 35, 1916-1925, 2007) и GI254023 (Hundhausen et al., Blood. 2003;102:1186-1195). DPC333 и GI254023 характеризовали в отношении ингибирующей селективности относительно ADAM10 и ADAM17. На фиг. 2E показан DPC333 как более сильный ингибитор в отношении ADAM17 (IC₅₀<0,6 нM), чем в отношении ADAM10 (IC₅₀=5,3 нM), и GI254023 демонстрирует селективность в отношении ADAM10 (IC₅₀ 1,5 нM) по сравнению с ADAM17 (IC₅₀=196 нM). С применением визуализации живых клеток оценивали экспрессию hTREM2 на клеточной поверхности на клетках CHO-hDAP12-hTREM2 после обработки клеток в течение ночи с помощью двух ингибиторов ADAM в условиях обусловленного выведения (фиг. 2A) или после обработки клеток с помощью PMA (фиг. 2B). Селективный ингибитор ADAM17 DPC333 дозозависимым образом повышает уровни TREM2 на клеточной поверхности при обоих условиях. Ограниченный эффект в отношении уровней TREM2 на клеточной поверхности также наблюдается при более высоких концентрациях GI254023, но только в условиях равновесного состояния. Этот эффект может быть отнесен к истинному ингибированию ADAM10, или он может быть обусловлен неспецифическим ингибированием ADAM17 с помощью GI254023 при применении при высоких концентрациях. В обработанных PMA клетках имеет место полное отсутствие эффекта GI254023 в отношении экспрессии TREM2 на клеточной поверхности (фиг. 2B). Чтобы приблизиться к физиологической клеточной системе, сходный эксперимент проводили на человеческих макрофагах M2A, дифференцированных из CD14⁺ человеческих моноцитов (фиг. 2C-2D). Такие результаты очень хорошо воспроизводят исходные данные в клетках CHO-hDAP12-hTREM2; ингибитор ADAM17 DPC333 повышает экспрессию TREM2 на клеточной поверхности дозозависимым образом при обоих условиях (фиг. 2C-2D), а селективный ингибитор ADAM10 демонстрирует небольшой эффект в отношении выведения в равновесном состоянии (фиг. 2C).

Вкратце, такие эксперименты указывают на то, что в человеческих макрофагах ADAM17 играет критическую роль в выведении TREM2, но нельзя исключать небольшой вклад ADAM10 при условии равновесного состояния.

Пример 3. Отсечение с помощью ADAM17 в клетках THP1 уменьшает конститутивное выведение

Для подтверждения результатов в примере 2 применяли генетический подход для дополнительного исследования вклада ADAM10/17 в выведение TREM2. Человеческие клетки-моноциты THP1 выбрали в качестве модельной системы, в которой эндогенно экспрессируется TREM2. С применением технологии CRISPR/CAS9 получали клоны, у которых отсутствует экспрессия ADAM10 (AD10 H4) или ADAM17 (AD17 G12), а также контрольную клеточную линию (Ctrl gRNA). Отсутствие генных продуктов подтверждали с помощью анализа с использованием FACS или вестерн-блоттинга (фиг. 3C-3D).

Экспрессию TREM2 и sTREM2 на клеточной поверхности оценивали в трех клеточных линиях в одном и том же эксперименте с применением трех различных условий: отсутствие обработки, отражающей конститутивное выведение, обработка с помощью PMA, которая максимально активирует выведение, и в заключение, обработка с помощью PMA и DPC333. Потеря ADAM17 повышает экспрессию TREM2 на клеточной поверхности и сильно снижает содержание растворимого TREM2 в условиях обусловленного выведения, при этом отсутствие ADAM10 не имеет значительных эффектов (см. черные столбцы на фиг. 3A-3B), что, таким образом, указывает на то, что ADAM17 представляет собой основную шеддазу, которая вносит вклад в конститутивное выведение. Максимальное активирование шеддаз с помощью PMA приводит к сильному уменьшению TREM2 на клеточной поверхности, как в контрольной клеточной линии, так и в дефицитном по ADAM10 клоне. Это отражено в сильном повышении sTREM2. В дефицитной по ADAM17 клеточной линии обработка с помощью PMA также приводит к уменьшению TREM2 на клеточной поверхности, но в меньшей степени, чем в контрольном клоне CRISPR. Также повышение в отношении sTREM2 менее выражено по сравнению с обработанным PMA контрольным клоном CRISPR и дефицитным по ADAM10 клоном. Однако расщепление TREM2 в клоне AD17 G12 в присутствии PMA должно быть обусловлено шеддазой, отличной от ADAM17. Соответственно, у клона ADAM10 H4 повышение в отношении индуцированного PMA выведения может быть обусловлено дополнительной активацией ADAM17. Совместная обработка с помощью PMA и DPC333 восстанавливала уровни TREM2 на клеточной поверхности в клетках Ctrl gRNA и AD10 H4, но обладала меньшими эффектами в клоне AD17 G12. У клона AD17 G12 уровни TREM2 на клеточной поверхности не достигают степени, которая наблюдается в условиях конститутивного выведения. Однако показатель sTREM2 сильно уменьшен в клоне AD17 G12 при таких условиях по сравнению с обработкой только PMA.

Вкратце, в клетках THP1 ADAM17, по-видимому, является основной шеддазой, ответственной за конститутивное выведение. После обработки с помощью PMA начинают действовать дополнительные механизмы выведения, один из которых может вовлекать ADAM10.

Пример 4. Аминокислотный фрагмент, расположенный близко к трансмембранному домену TREM2, является важным для выведения

В следующих экспериментах применяли сайт-направленный мутагенез для идентификации областей в пределах "стеблевого" участка TREM2, которые содержат сайт расщепления или являются важными для связывания шеддаз. На фиг. 4A показаны различные мутантные варианты TREM2, которые были получены и протестированы. В таблице 4 перечислены аминокислотные последовательности проксимальной части мембраны "стеблевого" участка и трансмембранного домена TREM2 человека дикого типа или мутантного TREM2 человека.

Таблица 4. Аминокислотная последовательность проксимальной части мембраны "стеблевого" участка и трансмембранного домена TREM2 человека дикого типа или мутантного TREM2 человека

Название	SEQ ID NO	Последовательность
WT	12	LWFPGESESFEDAHVEHSISRSLLEGEIPFPPTSILLLLAC
TRUNC3 (делеция 159-174)	13	LWFPGESESFEDAHVEHSILLLLAC
TRUNC1	14	LWFPGESESFEDAHVEHSISRSLLEGEIILLLLAC
T2del 3-8	15	LWFPGESESFEDAHVEHSISRSLLEGTSILLLLAC
T2del 6-11	16	LWFPGESESFEDAHVEHSISRSLFPPTSILLLLAC
T2del 11-16	17	LWFPGESESFEDAHVEHSEGEIPFPPTSILLLLAC
T2-YGG	18	LWFPGESESFEDAHVYGGWGGWGPEGEIPFPPTSILLLLAC
T2-WFR	19	LWFPGESESFEDAHVEHSISRSLLEGEIWFRWTSILLLLAC
Двойная мутация T2	20	LWFPGESESFEDAHVYGGWGGWGPEGEIWFRWTSILLLLAC
T2-IPD	21	LWFPGESESFEDAHVEIPDSRSLLEGEIPFPPTSILLLLAC
T2-IPP	22	LWFPGESESFEDAHVEIPPSRSLLEGEIPFPPTSILLLLAC
T2-IDP	23	LWFPGESESFEDAHVEIDPSRSLLEGEIPFPPTSILLLLAC

TREM2 дикого типа (WT) или мутантные варианты TREM2 вместе трансфицировали hDAP12 в клетки HEK-FT. Через 48 ч клетки обрабатывали в течение 30 мин с помощью PMA для активации ADAM на клеточной поверхности (см. Sommer, Nature Communications 7, 11523, 2016). Экспрессию TREM2 на клеточной поверхности оценивали с применением FACS, и результаты выражены в виде соотношения уровней экспрессии в необработанных клетках и обработанных с помощью PMA (фиг. 4B). Оценка каждой конструкции в присутствии и в отсутствие обработки с помощью PMA преодолевает возможность того, что некоторые конструкции могут демонстрировать различные связывающие свойства в отношении антисыворотки, и обеспечивает непосредственное сравнение изменений в экспрессии TREM2 на клеточной поверхности после активации шеддаз. Соотношение, равное 1, указывает на полное подавление выведения. Делеция первых 16 аминокислот (AA), расположенных проксимально от трансмембранного домена (TM), максимально снижает выведение TREM2 (TRUNCIII-159-174). Это дает основание предполагать, что данный участок может быть связан с расщеплением и/или сайтом связывания в отношении ADAM. Затем получали четыре более коротких мутантных варианта с делециями, охватывающими данную область, длина каждой составляла 6 аминокислот (TRUNC1, T2del3-8, T2del6-11 и T2del11-16). В то время как наблюдалось отсутствие или очень небольшой эффект в отношении выведения у мутантных вариантов TRUNC1, T2del3-8 и T2del6-11, мутантный вариант T2del11-16 продемонстрировал уменьшение индуцированного PMA выведения (фиг. 4B).

Мутантные варианты с аминокислотными заменами сконструированы для того, чтобы преодолеть тот факт, что мутантные варианты с делециями могут предусматривать сдвиг сайта расщепления ближе к трансмембранному участку, обуславливающему уменьшение расщепления вследствие стерического несоответствия. Аминокислоты 156-164 и 169-172 заменяли на гидрофобные остатки большего размера, которые придавали бы "стеблевому" участку устойчивость к расщеплению протеазами (Stromstedt et al., Antimicrobial agents and chemotherapy 53, 593-602, 2009). В то время как мутантный вариант T2-YGG показал тенденцию к снижению степени выведения TREM2, замена 4 проксимальных к мембране аминокислот в мутантном варианте T2-WFR была более эффективной; и комбинация обеих мутаций (мутантный вариант с двойной мутацией T2) обладала эффектом, подобным мутантному варианту с делецией TRUNCIII-159-174 (фиг. 4A и 4B). Таким образом, такие мутантные варианты TREM2 продемонстрировали устойчивость расщеплению шеддазой.

Вкратце, с помощью мутационного подхода было открыто, что для индуцированного PMA выведения TREM2 важны две области, с аминокислотами 169-172, расположенная проксимально к мембране, и участок с аминокислотами 156-164, расположенный дистально к мембране.

Затем исследовали, сохраняет ли конструкция T2-двойная мутация-TREM2 функциональность. С этой целью данный мутантный вариант стабильно трансфицировали в клетки BWZ, которые уже экспрессировали мышиный DAP12 и репортерный ген бета-Gal, управляемый NFAT (Hsieh, Journal of Neurochemistry 109, 1144-1156, 2009). mDAP12, экспрессируемый без TREM2, в данных клеточных линиях представляет фоновую активность репортерного гена (RGA) в данной системе. Сравнение RGA после активации TREM2 в клетках BWZ-T2-двойная мутация и BWZ-TREM2-WT выявило сравнимую активность, что указывает на то, что мутантный вариант с двойной мутацией T2 способен к передаче сигнала посредством DAP12 (фиг. 4C). Таким образом, конструкция T2-двойная мутация-TREM2 сохраняет функции TREM2.

Пример 5. ADAM17 расщепляет пептиды "стеблевого" участка TREM2 в положении H157-S158

С целью идентификации сайта расщепления ADAM10/ADAM17 в пределах "стеблевого" участка TREM2, характеристики in vitro расщепления пептидов, полученных из "стеблевого" участка, исследовали и подтверждали сайт расщепления путем определения C-конца выведенного растворимого TREM2 из супернатантов культуры клеток. Конструировали серию пептидов, охватывающих "стеблевой" участок, для in vitro изучения расщепления ADAM10/ADAM17 (фиг. 5A). Все пептиды получали с N-концевой флуоресцентной меткой 7-метоксикумарина (Mca). Пептиды 1-3, 1a и 2a инкубировали с ADAM17 в нейтральном буфере не более 48 часов, и за реакцией следовал анализ с помощью HPLC аликвот, извлеченных в различные моменты времени. Значительное расщепление наблюдали только в случае пептида 3, в то время как пептиды 1, 2, 1a и 2a продемонстрировали лишь очень незначительное снижение или отсутствие снижения в отношении исходного пептида (фиг. 5D).

Анализ с помощью HPLC-MS реакционной смеси пептид3/ADAM17 идентифицировал один основной продукт, SISRSLLEGEIPFP-NH₂ (SEQ ID NO: 51), вместе с 2 второстепенными продуктами расщепления (фиг. 5B-5C). Это дает основание предполагать, что связь H157-S158 в TREM2 является основным сайтом расщепления для ADAM17. Анализ с помощью HPLC инкубационной смеси в моменты времени > 24 часа показал появление более одного пика продукта, вместе с уменьшенным пиком основного продукта. В данные моменты времени по сути не осталось субстрата. Следовательно, можно сделать вывод, что второстепенные продукты расщепления происходят в результате вторичного расщепления с помощью ADAM17 основного продукта. Тот же анализ проводили с ADAM10 и получали очень сходные характеристики расщепления (данные не показаны).

В свежих литературных данных изложено лучшее понимание предпочтений ADAM10 и ADAM17 в отношении расщепления пептидов и белков (Caescu et al., Biochem J 424, 79-88, 2009; Tucher et al., J Proteome Res 13, 2205-2214, 2014). На удивление, His очень редко обнаруживался в P1, а Ser обнаруживался в положении P1' в субстратах, расщепленных с помощью ADAM10 и 17. После поиска в отношении по меньшей мере предпочтительных аминокислот в субстратах ADAM10 и 17 было определено, что изолейцин никогда не встречается в P1 субстратов ADAM, а в P1' и в P2' наблюдается очень низкая предпочтительность в отношении аспартата или пролина. Чтобы это доказать, получали пептиды 4-6. В таких пептидах сайт расщепления H-SI заменяли на IPP, IPD и IDP соответственно. В то время как все 3 пептида являлись устойчивыми к in vitro расщеплению с помощью ADAM17 (фиг. 5E), пептиды 5 и 6 медленно расщеплялись ADAM10 (данные не показаны). Пептид 4 с заменой в нем IPP на сайт расщепления H-SI, по-видимому, является устойчивым к расщеплению in vitro.

Пример 6. Эктодомен TREM2, выведенный с клеточной поверхности, расщепляется между H157 и S158

Для обоснования данных in vitro анализа пептидов в сайте расщепления шеддазой TREM2 в клеточной системе клетки HEK-FT временно трансфицировали с помощью hTREM2 или hTREM2-R47H в комбинации с hDAP12. Трансфицированные клетки при обоих условиях обрабатывали с помощью PMA или растворителя. sTREM2 подвергали иммунной очистке из клеточного супернатанта и подвергали ферментному расщеплению трипсином или Asp-/Glu-C с последующим анализом пептидов с помощью LC-MS. При всех четырех условиях идентифицировали один и тот же N-концевой пептид (D137-H157), указывающий на основной сайт расщепления между H157 и S158 (фиг. 6A-6B). Такие эксперименты демонстрируют, что ни обработка с помощью PMA, ни мутация R47H не индуцируют сдвиг основного сайта расщепления.

Следующие эксперименты проводили для идентификации целого выведенного эктодомена TREM2 из подвергнутого иммунной очистке клеточного супернатанта, обработанного PNGазой-F и сиалидазой-A, с последующим анализом с помощью LC-MS. Пептидные молекулы размером 15619 дальтон выявляли в супернатанте клеток, трансфицированных TREM2 WT, которые соответствуют дегликозилированному TREM219-157 (фиг. 7). Соответствующий пептид размером 15600 дальтон выявляли в подвергнутом иммунной очистке клеточном супернатанте трансфицированных R47H-TREM2 клеток. Вследствие аминокислотного обмена данный пептид на 19 дальтон меньше, чем пептид WT, и обеспечивает такое же подтверждение сайта расщепления для мутированного R47H-TREM2.

Пример 7. TREM2 не является O-гликозилированным в положениях, расположенных близко к сайту расщепления

Поскольку посттрансляционные модификации могут влиять на активность шеддаз (Goth et al., Proceedings of National Academy of Sciences of United States of America 112, 14623-14628, 2015; Schjoldager et al., Biochimica et Biophysica Acta 1820, 2079-2094, 2012), изучали, каким образом гликозилирование может влиять на выведение TREM2. Существует два предполагаемых сайта O-гликозилирования, расположенных близко к идентифицированному сайту расщепления H157 эктодомена TREM2: S160 и S168. С применением his-меченого на C-конце hTREM2 и картирования сайтов гликозилирования путем масс-спектрометрии, было показано, что hTREM2 отображает O-гликозилирование в T171 и/или S172 (фиг. 8A-8C), однако не может быть выявлено O-гликозилирования в S160 или S168.

Пример 8. Мутантные варианты TREM2 с мутациями в сайте расщепления шеддазой демонстрируют повышенный уровень экспрессии на клеточной поверхности

Целью следующей группы экспериментов было обоснование в клеточной системе, что мутантные варианты TREM2 с мутацией в положении 157-159 могут обеспечивать снижение расщепления "стеблевого" участка TREM2. Аминокислоты в сайте расщепления HSI (положения 157-159) ADAM17 в пределах "стеблевого" участка TREM2 человека заменяли на аминокислоту IPD посредством сайт-направленного мутагенеза. Мутантную конструкцию временно экспрессировали в клетках HEK293-FT вместе с hDAP12 и оценивали экспрессию TREM2 на клеточной поверхности, как описано на фигуре 2. Наиболее интересно отметить, что мутантный вариант TREM2 с тремя аминокислотными заменами в сайте расщепления шеддазой показал сходное повышение уровня экспрессии TREM2 на клеточной поверхности, как и мутантный вариант TREM2 с усечением сайта расщепления (TRUNC3) или мутантный вариант TREM2 с двойными мутациями T2 (фиг. 4D), что указывает на устойчивость к расщеплению шеддазой в клеточном окружении.

Данные, представленные в данном документе, сначала обеспечивают изучение вклада ADAM10 и ADAM17 в выведение TREM2. Примененные фармакологические и генетические подходы однозначно показывают, что ADAM17 представляет собой ключевую протеазу, участвующую в данном процессе. Ферментативную селективность примененных ингибиторов ADAM определяли в in vitro анализе расщепления и оба ингибитора применяли в широком диапазоне концентраций для изучения влияния на экспрессию TREM2 на клеточной поверхности в клетках CHO-hDAP12-hTREM2 и человеческих макрофагах M2A. Чтобы исключить искажение при фармакологическом подходе неспецифическим ингибированием другими ферментами, эти данные подкрепляли с помощью нокаута посредством CRISPR/CAS9 ADAM10 или ADAM17 в клеточной линии человеческих моноцитов THP-1. Эксперименты по нокауту подтвердили, что дефицит по ADAM17 повышал показатели поверхностного TREM2 и снижал количество sTREM2. Данные, представленные в данном документе, дают основание предполагать, что в условиях равновесного состояния TREM2 в основном расщепляется ADAM17, но после активации ADAM с помощью PMA могут вступать в действие дополнительные механизмы выведения. Данные в недавней литературе указывают, что в условиях равновесного состояния ADAM10 опосредует образование sTREM2 (Kleinberger, 2014). Основное различие между этим исследованием и результатами, представленными в данном документе, заключается в применении клеток HEK-Flp-In, в которых отсутствует совместная экспрессия сигнального адаптерного белка DAP12 вместе с TREM2. Возможно, что TREM2 после экспрессии в рекомбинантной системе в отсутствие DAP12 обладает повышенной чувствительностью к расщеплению с помощью ADAM10. Интересно, что DAP12 имеет внеклеточный домен на 14 аминокислот длиннее (см. Lanier & Bakker, Immunol Today 21, 611-614, 2000). Близкое соседство внеклеточного домена DAP12 к сайту расщепления TREM2 могло предполагать взаимодействие между внеклеточными частями TREM2 и DAP12, что может регулировать активацию и выведение.

В дополнение к изучению конститутивного выведения применяли PMA для усиления выведения TREM2 с клеточной поверхности. Выведение, наблюдаемое при таких условиях в дефицитных по ADAM17 клетках THP1, можно отнести к активности ADAM10, но также оно может вовлекать другие механизмы. Например, эктодомен TREM2 может быть отщеплен внутриклеточно во время его транспортировки из ER в плазматическую мембрану, что обеспечивает секрецию TREM2 в среду.

Недавние исследования позволили выяснить, как обработка с помощью PMA и изменения в активности шеддазы связаны: запускаемые PMA сигнальные каскады активируют скрамблазы, которые усиливают перенос фосфатидилсерина (PS) к верхнему слою плазматической мембраны (Kodigepalli et al., Mol Cancer 12: 32, 2013). Здесь PS связывается с катионным мотивом мембранного проксимального домена ADAM17, что позволяет протеазе осуществлять ее выводящую функцию (Sommer, Nature Communications 7, 11523, 2016). Такие эксперименты были направлены на ADAM17, и необходимы дополнительные исследования, чтобы выяснить, распространяются ли какие-либо из этих данных на ADAM10, ближайший гомолог ADAM17 в пределах семейства ADAM.

Следует отметить, что PS также был описан как лиганд TREM2 (Wang et al., Cell 160, 1061-1071, 2015; Cannon et al., Immunogenetics 64, 39-47, 2012; Daws, Journal of Immunology 171, 594-599, 2003; Song et al., Alzheimer's & Dementia 13: 381-387, 2017). Фосфатидилсерин принадлежит к ряду мембранных фосфолипидов, которые обнажаются поврежденными нейронами и глиальными клетками или высвобождаются поврежденным миелином. Далее, было показано, что отрицательно заряженные фосфолипиды, подобные PS, связываются с Aβ в липидных мембранах (Ahyayauch et al., Biophys J 103, 453-463, 2012; Nagarathinam et al., J Neurosci 33, 19284-19294, 2013). Во всех таких процессах PS выполняет функцию лиганда для TREM2 и в то же время может способствовать его выведению.

В мутационном анализе идентифицированы два аминокислотных фрагмента в пределах "стеблевого" участка TREM2, которые являются важными для выведения TREM2. Область, дистальная по отношению к мембране, содержит аминокислоты сайта расщепления. Интересно, что замещение 5 аминокислот, расположенных близко к плазматической мембране (мутант T2-WFR), также стабилизирует TREM2 на клеточной поверхности. Хотя это не было изучено в отношении TREM2, была описана совместная кластеризация ADAM17 с его субстратом, L-селектином (Schaff et al., Journal of Leukocyte Biology 83, 99-105, 2008), и эта часть "стеблевого" участка может участвовать в данном процессе, обеспечивая связывание ADAM17 с его субстратом перед инициацией расщепления после активации протеолитической активности ADAM17 (например, с помощью PS).

В дополнительных экспериментах был идентифицирован точный сайт расщепления для эктодомена TREM2. Применяли три комплементарных подхода, и все показали один и тот же сайт расщепления. Во-первых, пептиды из "стеблевого" участка подвергали in vitro расщеплению с помощью рекомбинантно экспрессированных ADAM10 и ADAM17. Во-вторых, C-конец подвергнутых воздействию трипсина пептидов эктодомена TREM2 очищали из супернатанта клеток HEK-FT, рекомбинантно экспрессирующих hTREM2 и hDAP12, и определяли их. В-третьих, проверяли размер полноразмерного эктодомена TREM2, очищенного из клеточного супернатанта. В то время как расстояние от сайта расщепления до плазматической мембраны (17 аминокислот) находится на верхней границе по сравнению с большинством известных субстратов ADAM17 (12-16 аминокислот, см. Horiuchi, The Keio Journal of Medicine 62, 29-36, 2013; Overall & Blobel, Nature Reviews Molecular Cell Biology 8, 245-257, 2007), последовательность (P2:V, P1:H, P1':S, P2':I) является достаточно уникальной по сравнению с известными субстратами ADAM17 или ADAM10 (Caescu et al., Biochem J 424, 79-88; Liu et al., Mol Immunol 62, 122-128, 2014; Tucher, 2014; Vahidi et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 450, 782-787, 2014). ADAM10 и 17 имеют предпочтение в отношении небольших гидрофобных остатков в положениях P2-P2', что управляет субстратной специфичностью. Однако, если сайты расщепления как для ADAM17, так и для ADAM10 собраны (Tucher, 2014), то аргинин в P1 является достаточно распространенным. Гистидин в данном положении в TREM2 также несет основную боковую цепь с положительным зарядом. Замещение по P1, P1' и P2' аминокислотами, которые не являются распространенными для мотива расщепления ADAM17/ADAM10, обеспечивает снижение расщепления. Следует отметить, что отсутствует сдвиг расщепления в другую сторону в пределах пептида. Это поддерживает наблюдение, что выведение, по-видимому, ограничено областью, близкой к плазматической мембране, и не происходит сдвиг расщепления к вторичному сайту. Это согласуется с более ранними данными, что дает основание предполагать, что положение сайта относительно трансмембранной области и первой глобулярной части белка является таким же важным, как и аминокислотная последовательность сайта расщепления (Horiuchi, The Keio Journal of Medicine 62, 29-36, 2013; Hinkle, The Journal of Biological Chemistry 279, 24179-24188, 2004; Wang et al., The Journal of Biological Chemistry 277, 50510-50519, 2002).

Вариант R47H обуславливает значительно повышенный риск развития LOAD (Guerreiro, 2013; Jonsson, 2013). В отличие от некоторых полиморфных форм, которые обуславливают повышенный риск FTD, подобно T66M (Guerreiro, 2013; Kleinberger, 2014; Borroni et al., Neurobiology of Aging 35, 934 e937-910, 2014; Le Ber, Neurobiology of Aging 35, 2419 e2423-2415, 2017) и Y38C (Guerreiro, 2013), которые обеспечивают снижение экспрессии TREM2 на клеточной поверхности, мутация R47H не влияет на уровни экспрессии, а скорее обеспечивает функциональное нарушение TREM2 (Atagi, 2015; Bailey, 2015; Kleinberger, 2014; Wang, Cell 160, 1061-1071, 2015; Yin, 2016). Данные, представленные в данном документе, указывают, что мутация R47H не оказывает эффекта на сайт расщепления, т.е. размер растворимого выведенного эктодомена TREM2. Однако такие эксперименты не позволяют сделать вывод о том, меняется ли степень выведения, т. е. изменяется ли количество sTREM2.

На выведение эктодомена, как было описано, влияет O-гликозилирование по остаткам серина или треонина, которые находятся в пределах ± 4 остатков сайта процессинга (Goth, 2015; Schjoldager, 2012). Изучали наличие O-гликозилирования близко к сайту расщепления. Результаты указывают, что в пределах "стеблевого" участка TREM2 является O-гликозилированным в T171 и/или S172, но не в S168 или S160. Наиболее вероятно, этот сайт O-гликозилирования слишком уделен от сайта процессинга, чтобы влиять на расщепление. Такие результаты ограничены фактом, что белок hTREM2, применяемый для таких исследований, не был выведен с клеточной поверхности, а секретировался посредством секреторного пути в системе экспрессии, применяемой для получения рекомбинантного белка.

В последние годы была идентифицирована состоятельность вариантов TREM2, которая влияет на восприимчивость к некоторым нейродегенеративным заболеваниям (см. Dardiotis, Neurobiol Aging. 2017 May;53:194.e13-194.e22). Наиболее интересно, что одна из таких мутаций, H157Y (rs2234255, Ahyayauch, 2012; Cuyvers et al., Neurobiology of Aging 35, 726 e711-729, 2014; Jiang et al., Curr Neurovasc Res 13, 318-320, 2016; Ghani, Neurobiology of Aging 42, 217 e217-217 e213, 2016), находится точно в идентифицированном сайте расщепления TREM2 и обуславливает повышение склонности к развитию AD. Данные in vitro показывают, что ADAM10/17 обладает повышенной предпочтительностью к тирозину в положении P1' (Tucher, 2014). Следовательно, можно предположить, что данная мутация может приводить к усилению конститутивного выведения TREM2 с клеточной поверхности с помощью ADAM10/17 и обеспечивает механическую связь между выведением TREM2 и развитием AD, но как именно данная мутация влияет на выведение TREM2 в настоящее время неизвестно.

Потрясающий вопрос, который возникает из таких результатов, заключается в том, играет ли sTREM2 физиологическую роль. При первоначальных фазах защиты хозяина или стерильного воспаления, устойчивое воспаление является преимуществом для нейтрализации патогена или удаления поврежденной ткани, после чего следует последующий ответ разрешения (Freire, Periodontology 2000, 63, 149-164). После разрешения воспаления активность ADAM17 снижалось бы (Le Gall et al., Molecular Biology of the Cell 20, 1785-1794, 2009; Le Gall et al., Journal of Cell Science 123, 3913-3922, 2010), и полученное в результате повышение уровня TREM2 способствовало бы и регрессии, и фагоцитозу. В то же время продуцирование других провоспалительных цитокинов, подобно TNFα, будет снижаться.

Если не указано иное, все способы, стадии, методики и манипуляции, которые конкретно не описаны подробно, могут выполняться и выполняются по сути известным способом, как будет ясно специалисту в данной области. Например, отсылку повторно делают на стандартные руководства и общий уровень техники, упоминаемый в данном документе, и на дополнительные источники литературы, цитируемые в данном документе. Если не указано иное, каждый из источников литературы, цитируемых в данном документе, включен в своей полноте посредством ссылки.

Пункты формулы изобретения являются неограничивающими и представлены ниже.

Несмотря на то, что определенные аспекты и пункты формулы изобретения были подробно раскрыты в данном документе, это было выполнено в качестве примера лишь в целях иллюстрации, и не предназначено для ограничения по отношению к объему прилагаемой формулы изобретения или объему объекта формулы изобретения с любым соответствующим дальнейшим применением. В частности, авторами настоящего изобретения предполагается, что различные замены, изменения и модификации могут быть выполнены по отношению к настоящему изобретению без отклонения от сути и объема настоящего изобретения, определенного формулой изобретения. Считается, что выбор исходного материала в виде нуклеиновой кислоты, клона, представляющего интерес, или типа библиотеки, является привычным вопросом для специалиста в данной области со знанием аспектов, описанных в данном документе. Считается, что другие аспекты, преимущества и модификации, находятся в пределах объема изложенной ниже формулы изобретения. Специалистам в данной области будут понятны многие эквиваленты конкретных аспектов настоящего изобретения, описанного в данном документе, или с помощью проведения только лишь обычных экспериментов они будут способны установить такие эквиваленты. Предполагается, что такие эквиваленты охвачены изложенной ниже формулой изобретения. Изменение объема пункта формулы изобретения в позднее поданных соответствующих заявках может быть связано с ограничениями патентных законов различных стран и не должно пониматься как отказ от объекта формулы изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> NOVARTIS AG

<120> МУТАНТНЫЕ ВАРИАНТЫ TREM2, УСТОЙЧИВЫЕ К РАСЩЕПЛЕНИЮ ШЕДДАЗОЙ

<130> PAT057836-WO-PCT

<140>

<141>

<150> 62/537,486

<151> 2017-07-27

<160> 89

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 230

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Glu Pro Leu Arg Leu Leu Ile Leu Leu Phe Val Thr Glu Leu Ser

1. 5 10 15

Gly Ala His Asn Thr Thr Val Phe Gln Gly Val Ala Gly Gln Ser Leu

20 25 30

Gln Val Ser Cys Pro Tyr Asp Ser Met Lys His Trp Gly Arg Arg Lys

35 40 45

Ala Trp Cys Arg Gln Leu Gly Glu Lys Gly Pro Cys Gln Arg Val Val

50 55 60

Ser Thr His Asn Leu Trp Leu Leu Ser Phe Leu Arg Arg Trp Asn Gly

65 70 75 80

Ser Thr Ala Ile Thr Asp Asp Thr Leu Gly Gly Thr Leu Thr Ile Thr

85 90 95

Leu Arg Asn Leu Gln Pro His Asp Ala Gly Leu Tyr Gln Cys Gln Ser

100 105 110

Leu His Gly Ser Glu Ala Asp Thr Leu Arg Lys Val Leu Val Glu Val

115 120 125

Leu Ala Asp Pro Leu Asp His Arg Asp Ala Gly Asp Leu Trp Phe Pro

130 135 140

Gly Glu Ser Glu Ser Phe Glu Asp Ala His Val Glu His Ser Ile Ser

145 150 155 160

Arg Ser Leu Leu Glu Gly Glu Ile Pro Phe Pro Pro Thr Ser Ile Leu

165 170 175

Leu Leu Leu Ala Cys Ile Phe Leu Ile Lys Ile Leu Ala Ala Ser Ala

180 185 190

Leu Trp Ala Ala Ala Trp His Gly Gln Lys Pro Gly Thr His Pro Pro

195 200 205

Ser Glu Leu Asp Cys Gly His Asp Pro Gly Tyr Gln Leu Gln Thr Leu

210 215 220

Pro Gly Leu Arg Asp Thr

225 230

<210> 2

<211> 1076

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 2

gggcagcgcc tgacatgcct gatcctctct tttctgcagt tcaagggaaa gacgagatct 60

tgcacaaggc actctgcttc tgcccttggc tggggaaggg tggcatggag cctctccggc 120

tgctcatctt actctttgtc acagagctgt ccggagccca caacaccaca gtgttccagg 180

gcgtggcggg ccagtccctg caggtgtctt gcccctatga ctccatgaag cactggggga 240

ggcgcaaggc ctggtgccgc cagctgggag agaagggccc atgccagcgt gtggtcagca 300

cgcacaactt gtggctgctg tccttcctga ggaggtggaa tgggagcaca gccatcacag 360

acgataccct gggtggcact ctcaccatta cgctgcggaa tctacaaccc catgatgcgg 420

gtctctacca gtgccagagc ctccatggca gtgaggctga caccctcagg aaggtcctgg 480

tggaggtgct ggcagacccc ctggatcacc gggatgctgg agatctctgg ttccccgggg 540

agtctgagag cttcgaggat gcccatgtgg agcacagcat ctccaggagc ctcttggaag 600

gagaaatccc cttcccaccc acttccatcc ttctcctcct ggcctgcatc tttctcatca 660

agattctagc agccagcgcc ctctgggctg cagcctggca tggacagaag ccagggacac 720

atccacccag tgaactggac tgtggccatg acccagggta tcagctccaa actctgccag 780

ggctgagaga cacgtgaagg aagatgatgg gaggaaaagc ccaggagaag tcccaccagg 840

gaccagccca gcctgcatac ttgccacttg gccaccagga ctccttgttc tgctctggca 900

agagactact ctgcctgaac actgcttctc ctggaccctg gaagcaggga ctggttgagg 960

gagtggggag gtggtaagaa cacctgacaa cttctgaata ttggacattt taaacactta 1020

caaataaatc caagactgtc atatttagct ggataaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1076

<210> 3

<211> 219

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 3

Met Glu Pro Leu Arg Leu Leu Ile Leu Leu Phe Val Thr Glu Leu Ser

1. 5 10 15

Gly Ala His Asn Thr Thr Val Phe Gln Gly Val Ala Gly Gln Ser Leu

20 25 30

Gln Val Ser Cys Pro Tyr Asp Ser Met Lys His Trp Gly Arg Arg Lys

35 40 45

Ala Trp Cys Arg Gln Leu Gly Glu Lys Gly Pro Cys Gln Arg Val Val

50 55 60

Ser Thr His Asn Leu Trp Leu Leu Ser Phe Leu Arg Arg Trp Asn Gly

65 70 75 80

Ser Thr Ala Ile Thr Asp Asp Thr Leu Gly Gly Thr Leu Thr Ile Thr

85 90 95

Leu Arg Asn Leu Gln Pro His Asp Ala Gly Leu Tyr Gln Cys Gln Ser

100 105 110

Leu His Gly Ser Glu Ala Asp Thr Leu Arg Lys Val Leu Val Glu Val

115 120 125

Leu Ala Asp Pro Leu Asp His Arg Asp Ala Gly Asp Leu Trp Phe Pro

130 135 140

Gly Glu Ser Glu Ser Phe Glu Asp Ala His Val Glu His Ser Ile Ser

145 150 155 160

Arg Ala Glu Arg His Val Lys Glu Asp Asp Gly Arg Lys Ser Pro Gly

165 170 175

Glu Val Pro Pro Gly Thr Ser Pro Ala Cys Ile Leu Ala Thr Trp Pro

180 185 190

Pro Gly Leu Leu Val Leu Leu Trp Gln Glu Thr Thr Leu Pro Glu His

195 200 205

Cys Phe Ser Trp Thr Leu Glu Ala Gly Thr Gly

210 215

<210> 4

<211> 222

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 4

Met Glu Pro Leu Arg Leu Leu Ile Leu Leu Phe Val Thr Glu Leu Ser

1. 5 10 15

Gly Ala His Asn Thr Thr Val Phe Gln Gly Val Ala Gly Gln Ser Leu

20 25 30

Gln Val Ser Cys Pro Tyr Asp Ser Met Lys His Trp Gly Arg Arg Lys

35 40 45

Ala Trp Cys Arg Gln Leu Gly Glu Lys Gly Pro Cys Gln Arg Val Val

50 55 60

Ser Thr His Asn Leu Trp Leu Leu Ser Phe Leu Arg Arg Trp Asn Gly

65 70 75 80

Ser Thr Ala Ile Thr Asp Asp Thr Leu Gly Gly Thr Leu Thr Ile Thr

85 90 95

Leu Arg Asn Leu Gln Pro His Asp Ala Gly Leu Tyr Gln Cys Gln Ser

100 105 110

Leu His Gly Ser Glu Ala Asp Thr Leu Arg Lys Val Leu Val Glu Val

115 120 125

Leu Ala Asp Pro Leu Asp His Arg Asp Ala Gly Asp Leu Trp Phe Pro

130 135 140

Gly Glu Ser Glu Ser Phe Glu Asp Ala His Val Glu His Ser Ile Ser

145 150 155 160

Arg Pro Ser Gln Gly Ser His Leu Pro Ser Cys Leu Ser Lys Glu Pro

165 170 175

Leu Gly Arg Arg Asn Pro Leu Pro Thr His Phe His Pro Ser Pro Pro

180 185 190

Gly Leu His Leu Ser His Gln Asp Ser Ser Ser Gln Arg Pro Leu Gly

195 200 205

Cys Ser Leu Ala Trp Thr Glu Ala Arg Asp Thr Ser Thr Gln

210 215 220

<210> 5

<211> 256

<212> БЕЛОК

<213> Macaca fascicularis

<400> 5

Met Pro Asp Pro Leu Phe Ser Ala Val Gln Gly Lys Asp Lys Ile Leu

1. 5 10 15

His Lys Ala Leu Cys Ile Cys Pro Trp Pro Gly Lys Gly Gly Met Glu

20 25 30

Pro Leu Arg Leu Leu Ile Leu Leu Phe Ala Thr Glu Leu Ser Gly Ala

35 40 45

His Asn Thr Thr Val Phe Gln Gly Val Glu Gly Gln Ser Leu Gln Val

50 55 60

Ser Cys Pro Tyr Asp Ser Met Lys His Trp Gly Arg Arg Lys Ala Trp

65 70 75 80

Cys Arg Gln Leu Gly Glu Lys Gly Pro Cys Gln Arg Val Val Ser Thr

85 90 95

His Asn Leu Trp Leu Leu Ser Phe Leu Arg Arg Arg Asn Gly Ser Thr

100 105 110

Ala Ile Thr Asp Asp Thr Leu Gly Gly Thr Leu Thr Ile Thr Leu Arg

115 120 125

Asn Leu Gln Pro His Asp Ala Gly Phe Tyr Gln Cys Gln Ser Leu His

130 135 140

Gly Ser Glu Ala Asp Thr Leu Arg Lys Val Leu Val Glu Val Leu Ala

145 150 155 160

Asp Pro Leu Asp His Arg Asp Ala Gly Asp Leu Trp Val Pro Gly Glu

165 170 175

Ser Glu Ser Phe Glu Asp Ala His Val Glu His Ser Ile Ser Arg Ser

180 185 190

Leu Leu Glu Gly Glu Ile Pro Phe Pro Pro Thr Ser Val Leu Leu Leu

195 200 205

Leu Ala Cys Ile Phe Leu Ile Lys Ile Leu Ala Ala Ser Ala Leu Trp

210 215 220

Ala Ala Ala Trp His Gly Gln Lys Pro Gly Thr His Pro Pro Ser Glu

225 230 235 240

Pro Asp Cys Gly His Asp Pro Gly His Gln Leu Gln Thr Leu Pro Gly

245 250 255

<210> 6

<211> 227

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 6

Met Gly Pro Leu His Gln Phe Leu Leu Leu Leu Ile Thr Ala Leu Ser

1. 5 10 15

Gln Ala Leu Asn Thr Thr Val Leu Gln Gly Met Ala Gly Gln Ser Leu

20 25 30

Arg Val Ser Cys Thr Tyr Asp Ala Leu Lys His Trp Gly Arg Arg Lys

35 40 45

Ala Trp Cys Arg Gln Leu Gly Glu Glu Gly Pro Cys Gln Arg Val Val

50 55 60

Ser Thr His Gly Val Trp Leu Leu Ala Phe Leu Lys Lys Arg Asn Gly

65 70 75 80

Ser Thr Val Ile Ala Asp Asp Thr Leu Ala Gly Thr Val Thr Ile Thr

85 90 95

Leu Lys Asn Leu Gln Ala Gly Asp Ala Gly Leu Tyr Gln Cys Gln Ser

100 105 110

Leu Arg Gly Arg Glu Ala Glu Val Leu Gln Lys Val Leu Val Glu Val

115 120 125

Leu Glu Asp Pro Leu Asp Asp Gln Asp Ala Gly Asp Leu Trp Val Pro

130 135 140

Glu Glu Ser Ser Ser Phe Glu Gly Ala Gln Val Glu His Ser Thr Ser

145 150 155 160

Arg Asn Gln Glu Thr Ser Phe Pro Pro Thr Ser Ile Leu Leu Leu Leu

165 170 175

Ala Cys Val Leu Leu Ser Lys Phe Leu Ala Ala Ser Ile Leu Trp Ala

180 185 190

Val Ala Arg Gly Arg Gln Lys Pro Gly Thr Pro Val Val Arg Gly Leu

195 200 205

Asp Cys Gly Gln Asp Ala Gly His Gln Leu Gln Ile Leu Thr Gly Pro

210 215 220

Gly Gly Thr

225

<210> 7

<211> 62

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 7

Leu His Gly Ser Glu Ala Asp Thr Leu Arg Lys Val Leu Val Glu Val

1. 5 10 15

Leu Ala Asp Pro Leu Asp His Arg Asp Ala Gly Asp Leu Trp Phe Pro

20 25 30

Gly Glu Ser Glu Ser Phe Glu Asp Ala His Val Glu His Ser Ile Ser

35 40 45

Arg Ser Leu Leu Glu Gly Glu Ile Pro Phe Pro Pro Thr Ser

50 55 60

<210> 8

<211> 57

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 8

Ser Leu His Gly Ser Glu Ala Asp Thr Leu Arg Lys Val Leu Val Glu

1. 5 10 15

Val Leu Ala Asp Pro Leu Asp His Arg Asp Ala Gly Asp Leu Trp Phe

20 25 30

Pro Gly Glu Ser Glu Ser Phe Glu Asp Ala His Val Glu His Ser Ile

35 40 45

Ser Arg Ala Glu Arg His Val Lys Glu

50 55

<210> 9

<211> 60

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 9

Ser Leu His Gly Ser Glu Ala Asp Thr Leu Arg Lys Val Leu Val Glu

1. 5 10 15

Val Leu Ala Asp Pro Leu Asp His Arg Asp Ala Gly Asp Leu Trp Phe

20 25 30

Pro Gly Glu Ser Glu Ser Phe Glu Asp Ala His Val Glu His Ser Ile

35 40 45

Ser Arg Pro Ser Gln Gly Ser His Leu Pro Ser Cys

50 55 60

<210> 10

<211> 62

<212> БЕЛОК

<213> Macaca fascicularis

<400> 10

Leu His Gly Ser Glu Ala Asp Thr Leu Arg Lys Val Leu Val Glu Val

1. 5 10 15

Leu Ala Asp Pro Leu Asp His Arg Asp Ala Gly Asp Leu Trp Val Pro

20 25 30

Gly Glu Ser Glu Ser Phe Glu Asp Ala His Val Glu His Ser Ile Ser

35 40 45

Arg Ser Leu Leu Glu Gly Glu Ile Pro Phe Pro Pro Thr Ser

50 55 60

<210> 11

<211> 59

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 11

Leu Arg Gly Arg Glu Ala Glu Val Leu Gln Lys Val Leu Val Glu Val

1. 5 10 15

Leu Glu Asp Pro Leu Asp Asp Gln Asp Ala Gly Asp Leu Trp Val Pro

20 25 30

Glu Glu Ser Ser Ser Phe Glu Gly Ala Gln Val Glu His Ser Thr Ser

35 40 45

Arg Asn Gln Glu Thr Ser Phe Pro Pro Thr Ser

50 55

<210> 12

<211> 41

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 12

Leu Trp Phe Pro Gly Glu Ser Glu Ser Phe Glu Asp Ala His Val Glu

1. 5 10 15

His Ser Ile Ser Arg Ser Leu Leu Glu Gly Glu Ile Pro Phe Pro Pro

20 25 30

Thr Ser Ile Leu Leu Leu Leu Ala Cys

35 40

<210> 13

<211> 25

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 13

Leu Trp Phe Pro Gly Glu Ser Glu Ser Phe Glu Asp Ala His Val Glu

1. 5 10 15

His Ser Ile Leu Leu Leu Leu Ala Cys

20 25

<210> 14

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 14

Leu Trp Phe Pro Gly Glu Ser Glu Ser Phe Glu Asp Ala His Val Glu

1. 5 10 15

His Ser Ile Ser Arg Ser Leu Leu Glu Gly Glu Ile Ile Leu Leu Leu

20 25 30

Leu Ala Cys

35

<210> 15

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 15

Leu Trp Phe Pro Gly Glu Ser Glu Ser Phe Glu Asp Ala His Val Glu

1. 5 10 15

His Ser Ile Ser Arg Ser Leu Leu Glu Gly Thr Ser Ile Leu Leu Leu

20 25 30

Leu Ala Cys

35

<210> 16

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 16

Leu Trp Phe Pro Gly Glu Ser Glu Ser Phe Glu Asp Ala His Val Glu

1. 5 10 15

His Ser Ile Ser Arg Ser Leu Phe Pro Pro Thr Ser Ile Leu Leu Leu

20 25 30

Leu Ala Cys

35

<210> 17

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 17

Leu Trp Phe Pro Gly Glu Ser Glu Ser Phe Glu Asp Ala His Val Glu

1. 5 10 15

His Ser Glu Gly Glu Ile Pro Phe Pro Pro Thr Ser Ile Leu Leu Leu

20 25 30

Leu Ala Cys

35

<210> 18

<211> 41

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 18

Leu Trp Phe Pro Gly Glu Ser Glu Ser Phe Glu Asp Ala His Val Tyr

1. 5 10 15

Gly Gly Trp Gly Gly Trp Gly Pro Glu Gly Glu Ile Pro Phe Pro Pro

20 25 30

Thr Ser Ile Leu Leu Leu Leu Ala Cys

35 40

<210> 19

<211> 41

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 19

Leu Trp Phe Pro Gly Glu Ser Glu Ser Phe Glu Asp Ala His Val Glu

1. 5 10 15

His Ser Ile Ser Arg Ser Leu Leu Glu Gly Glu Ile Trp Phe Arg Trp

20 25 30

Thr Ser Ile Leu Leu Leu Leu Ala Cys

35 40

<210> 20

<211> 41

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 20

Leu Trp Phe Pro Gly Glu Ser Glu Ser Phe Glu Asp Ala His Val Tyr

1. 5 10 15

Gly Gly Trp Gly Gly Trp Gly Pro Glu Gly Glu Ile Trp Phe Arg Trp

20 25 30

Thr Ser Ile Leu Leu Leu Leu Ala Cys

35 40

<210> 21

<211> 41

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 21

Leu Trp Phe Pro Gly Glu Ser Glu Ser Phe Glu Asp Ala His Val Glu

1. 5 10 15

Ile Pro Asp Ser Arg Ser Leu Leu Glu Gly Glu Ile Pro Phe Pro Pro

20 25 30

Thr Ser Ile Leu Leu Leu Leu Ala Cys

35 40

<210> 22

<211> 41

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 22

Leu Trp Phe Pro Gly Glu Ser Glu Ser Phe Glu Asp Ala His Val Glu

1. 5 10 15

Ile Pro Pro Ser Arg Ser Leu Leu Glu Gly Glu Ile Pro Phe Pro Pro

20 25 30

Thr Ser Ile Leu Leu Leu Leu Ala Cys

35 40

<210> 23

<211> 41

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 23

Leu Trp Phe Pro Gly Glu Ser Glu Ser Phe Glu Asp Ala His Val Glu

1. 5 10 15

Ile Asp Pro Ser Arg Ser Leu Leu Glu Gly Glu Ile Pro Phe Pro Pro

20 25 30

Thr Ser Ile Leu Leu Leu Leu Ala Cys

35 40

<210> 24

<211> 60

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 24

Ser Leu His Gly Ser Glu Ala Asp Thr Leu Arg Lys Val Leu Val Glu

1. 5 10 15

Val Leu Ala Asp Pro Leu Asp His Arg Asp Ala Gly Asp Leu Trp Phe

20 25 30

Pro Gly Glu Ser Glu Ser Phe Glu Asp Ala His Val Glu His Ser Ile

35 40 45

Ser Arg Ser Leu Leu Glu Gly Glu Ile Pro Phe Pro

50 55 60

<210> 25

<211> 20

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 25

Ser Leu His Gly Ser Glu Ala Asp Thr Leu Arg Lys Val Leu Val Glu

1. 5 10 15

Val Leu Ala Asp

20

<210> 26

<211> 20

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 26

Pro Leu Asp His Arg Asp Ala Gly Asp Leu Trp Phe Pro Gly Glu Ser

1. 5 10 15

Glu Ser Phe Glu

20

<210> 27

<211> 20

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 27

Asp Ala His Val Glu His Ser Ile Ser Arg Ser Leu Leu Glu Gly Glu

1. 5 10 15

Ile Pro Phe Pro

20

<210> 28

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 28

Val Leu Val Glu Val Leu Ala Asp Pro Leu Asp His Arg Asp

1. 5 10

<210> 29

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 29

Glu Ser Glu Ser Phe Glu Asp Ala His Val Glu His

1. 5 10

<210> 30

<211> 20

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 30

Asp Ala His Val Glu Ile Pro Pro Ser Arg Ser Leu Leu Glu Gly Glu

1. 5 10 15

Ile Pro Phe Pro

20

<210> 31

<211> 20

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 31

Asp Ala His Val Glu Ile Pro Asp Ser Arg Ser Leu Leu Glu Gly Glu

1. 5 10 15

Ile Pro Phe Pro

20

<210> 32

<211> 20

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 32

Asp Ala His Val Glu Ile Asp Pro Ser Arg Ser Leu Leu Glu Gly Glu

1. 5 10 15

Ile Pro Phe Pro

20

<210> 33

<211> 63

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 33

Ser Leu His Gly Ser Glu Ala Asp Thr Leu Arg Lys Val Leu Val Glu

1. 5 10 15

Val Leu Ala Asp Pro Leu Asp His Arg Asp Ala Gly Asp Leu Trp Phe

20 25 30

Pro Gly Glu Ser Glu Ser Phe Glu Asp Ala His Val Glu Ile Pro Asp

35 40 45

Ser Arg Ser Leu Leu Glu Gly Glu Ile Pro Phe Pro Pro Thr Ser

50 55 60

<210> 34

<211> 63

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 34

Ser Leu His Gly Ser Glu Ala Asp Thr Leu Arg Lys Val Leu Val Glu

1. 5 10 15

Val Leu Ala Asp Pro Leu Asp His Arg Asp Ala Gly Asp Leu Trp Phe

20 25 30

Pro Gly Glu Ser Glu Ser Phe Glu Asp Ala His Val Glu Ile Pro Pro

35 40 45

Ser Arg Ser Leu Leu Glu Gly Glu Ile Pro Phe Pro Pro Thr Ser

50 55 60

<210> 35

<211> 63

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 35

Ser Leu His Gly Ser Glu Ala Asp Thr Leu Arg Lys Val Leu Val Glu

1. 5 10 15

Val Leu Ala Asp Pro Leu Asp His Arg Asp Ala Gly Asp Leu Trp Phe

20 25 30

Pro Gly Glu Ser Glu Ser Phe Glu Asp Ala His Val Glu Ile Asp Pro

35 40 45

Ser Arg Ser Leu Leu Glu Gly Glu Ile Pro Phe Pro Pro Thr Ser

50 55 60

<210> 36

<211> 47

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 36

Ser Leu His Gly Ser Glu Ala Asp Thr Leu Arg Lys Val Leu Val Glu

1. 5 10 15

Val Leu Ala Asp Pro Leu Asp His Arg Asp Ala Gly Asp Leu Trp Phe

20 25 30

Pro Gly Glu Ser Glu Ser Phe Glu Asp Ala His Val Glu His Ser

35 40 45

<210> 37

<211> 57

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 37

Ser Leu His Gly Ser Glu Ala Asp Thr Leu Arg Lys Val Leu Val Glu

1. 5 10 15

Val Leu Ala Asp Pro Leu Asp His Arg Asp Ala Gly Asp Leu Trp Phe

20 25 30

Pro Gly Glu Ser Glu Ser Phe Glu Asp Ala His Val Glu His Ser Glu

35 40 45

Gly Glu Ile Pro Phe Pro Pro Thr Ser

50 55

<210> 38

<211> 63

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 38

Ser Leu His Gly Ser Glu Ala Asp Thr Leu Arg Lys Val Leu Val Glu

1. 5 10 15

Val Leu Ala Asp Pro Leu Asp His Arg Asp Ala Gly Asp Leu Trp Phe

20 25 30

Pro Gly Glu Ser Glu Ser Phe Glu Asp Ala His Val Tyr Gly Gly Trp

35 40 45

Gly Gly Trp Gly Pro Glu Gly Glu Ile Pro Phe Pro Pro Thr Ser

50 55 60

<210> 39

<211> 63

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 39

Ser Leu His Gly Ser Glu Ala Asp Thr Leu Arg Lys Val Leu Val Glu

1. 5 10 15

Val Leu Ala Asp Pro Leu Asp His Arg Asp Ala Gly Asp Leu Trp Phe

20 25 30

Pro Gly Glu Ser Glu Ser Phe Glu Asp Ala His Val Glu His Ser Ile

35 40 45

Ser Arg Ser Leu Leu Glu Gly Glu Ile Trp Phe Arg Trp Thr Ser

50 55 60

<210> 40

<211> 63

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 40

Ser Leu His Gly Ser Glu Ala Asp Thr Leu Arg Lys Val Leu Val Glu

1. 5 10 15

Val Leu Ala Asp Pro Leu Asp His Arg Asp Ala Gly Asp Leu Trp Phe

20 25 30

Pro Gly Glu Ser Glu Ser Phe Glu Asp Ala His Val Tyr Gly Gly Trp

35 40 45

Gly Gly Trp Gly Pro Glu Gly Glu Ile Trp Phe Arg Trp Thr Ser

50 55 60

<210> 41

<211> 230

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 41

Met Glu Pro Leu Arg Leu Leu Ile Leu Leu Phe Val Thr Glu Leu Ser

1. 5 10 15

Gly Ala His Asn Thr Thr Val Phe Gln Gly Val Ala Gly Gln Ser Leu

20 25 30

Gln Val Ser Cys Pro Tyr Asp Ser Met Lys His Trp Gly Arg Arg Lys

35 40 45

Ala Trp Cys Arg Gln Leu Gly Glu Lys Gly Pro Cys Gln Arg Val Val

50 55 60

Ser Thr His Asn Leu Trp Leu Leu Ser Phe Leu Arg Arg Trp Asn Gly

65 70 75 80

Ser Thr Ala Ile Thr Asp Asp Thr Leu Gly Gly Thr Leu Thr Ile Thr

85 90 95

Leu Arg Asn Leu Gln Pro His Asp Ala Gly Leu Tyr Gln Cys Gln Ser

100 105 110

Leu His Gly Ser Glu Ala Asp Thr Leu Arg Lys Val Leu Val Glu Val

115 120 125

Leu Ala Asp Pro Leu Asp His Arg Asp Ala Gly Asp Leu Trp Phe Pro

130 135 140

Gly Glu Ser Glu Ser Phe Glu Asp Ala His Val Glu Ile Pro Asp Ser

145 150 155 160

Arg Ser Leu Leu Glu Gly Glu Ile Pro Phe Pro Pro Thr Ser Ile Leu

165 170 175

Leu Leu Leu Ala Cys Ile Phe Leu Ile Lys Ile Leu Ala Ala Ser Ala

180 185 190

Leu Trp Ala Ala Ala Trp His Gly Gln Lys Pro Gly Thr His Pro Pro

195 200 205

Ser Glu Leu Asp Cys Gly His Asp Pro Gly Tyr Gln Leu Gln Thr Leu

210 215 220

Pro Gly Leu Arg Asp Thr

225 230

<210> 42

<211> 230

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 42

Met Glu Pro Leu Arg Leu Leu Ile Leu Leu Phe Val Thr Glu Leu Ser

1. 5 10 15

Gly Ala His Asn Thr Thr Val Phe Gln Gly Val Ala Gly Gln Ser Leu

20 25 30

Gln Val Ser Cys Pro Tyr Asp Ser Met Lys His Trp Gly Arg Arg Lys

35 40 45

Ala Trp Cys Arg Gln Leu Gly Glu Lys Gly Pro Cys Gln Arg Val Val

50 55 60

Ser Thr His Asn Leu Trp Leu Leu Ser Phe Leu Arg Arg Trp Asn Gly

65 70 75 80

Ser Thr Ala Ile Thr Asp Asp Thr Leu Gly Gly Thr Leu Thr Ile Thr

85 90 95

Leu Arg Asn Leu Gln Pro His Asp Ala Gly Leu Tyr Gln Cys Gln Ser

100 105 110

Leu His Gly Ser Glu Ala Asp Thr Leu Arg Lys Val Leu Val Glu Val

115 120 125

Leu Ala Asp Pro Leu Asp His Arg Asp Ala Gly Asp Leu Trp Phe Pro

130 135 140

Gly Glu Ser Glu Ser Phe Glu Asp Ala His Val Glu Ile Pro Pro Ser

145 150 155 160

Arg Ser Leu Leu Glu Gly Glu Ile Pro Phe Pro Pro Thr Ser Ile Leu

165 170 175

Leu Leu Leu Ala Cys Ile Phe Leu Ile Lys Ile Leu Ala Ala Ser Ala

180 185 190

Leu Trp Ala Ala Ala Trp His Gly Gln Lys Pro Gly Thr His Pro Pro

195 200 205

Ser Glu Leu Asp Cys Gly His Asp Pro Gly Tyr Gln Leu Gln Thr Leu

210 215 220

Pro Gly Leu Arg Asp Thr

225 230

<210> 43

<211> 230

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 43

Met Glu Pro Leu Arg Leu Leu Ile Leu Leu Phe Val Thr Glu Leu Ser

1. 5 10 15

Gly Ala His Asn Thr Thr Val Phe Gln Gly Val Ala Gly Gln Ser Leu

20 25 30

Gln Val Ser Cys Pro Tyr Asp Ser Met Lys His Trp Gly Arg Arg Lys

35 40 45

Ala Trp Cys Arg Gln Leu Gly Glu Lys Gly Pro Cys Gln Arg Val Val

50 55 60

Ser Thr His Asn Leu Trp Leu Leu Ser Phe Leu Arg Arg Trp Asn Gly

65 70 75 80

Ser Thr Ala Ile Thr Asp Asp Thr Leu Gly Gly Thr Leu Thr Ile Thr

85 90 95

Leu Arg Asn Leu Gln Pro His Asp Ala Gly Leu Tyr Gln Cys Gln Ser

100 105 110

Leu His Gly Ser Glu Ala Asp Thr Leu Arg Lys Val Leu Val Glu Val

115 120 125

Leu Ala Asp Pro Leu Asp His Arg Asp Ala Gly Asp Leu Trp Phe Pro

130 135 140

Gly Glu Ser Glu Ser Phe Glu Asp Ala His Val Glu Ile Asp Pro Ser

145 150 155 160

Arg Ser Leu Leu Glu Gly Glu Ile Pro Phe Pro Pro Thr Ser Ile Leu

165 170 175

Leu Leu Leu Ala Cys Ile Phe Leu Ile Lys Ile Leu Ala Ala Ser Ala

180 185 190

Leu Trp Ala Ala Ala Trp His Gly Gln Lys Pro Gly Thr His Pro Pro

195 200 205

Ser Glu Leu Asp Cys Gly His Asp Pro Gly Tyr Gln Leu Gln Thr Leu

210 215 220

Pro Gly Leu Arg Asp Thr

225 230

<210> 44

<211> 214

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 44

Met Glu Pro Leu Arg Leu Leu Ile Leu Leu Phe Val Thr Glu Leu Ser

1. 5 10 15

Gly Ala His Asn Thr Thr Val Phe Gln Gly Val Ala Gly Gln Ser Leu

20 25 30

Gln Val Ser Cys Pro Tyr Asp Ser Met Lys His Trp Gly Arg Arg Lys

35 40 45

Ala Trp Cys Arg Gln Leu Gly Glu Lys Gly Pro Cys Gln Arg Val Val

50 55 60

Ser Thr His Asn Leu Trp Leu Leu Ser Phe Leu Arg Arg Trp Asn Gly

65 70 75 80

Ser Thr Ala Ile Thr Asp Asp Thr Leu Gly Gly Thr Leu Thr Ile Thr

85 90 95

Leu Arg Asn Leu Gln Pro His Asp Ala Gly Leu Tyr Gln Cys Gln Ser

100 105 110

Leu His Gly Ser Glu Ala Asp Thr Leu Arg Lys Val Leu Val Glu Val

115 120 125

Leu Ala Asp Pro Leu Asp His Arg Asp Ala Gly Asp Leu Trp Phe Pro

130 135 140

Gly Glu Ser Glu Ser Phe Glu Asp Ala His Val Glu His Ser Ile Leu

145 150 155 160

Leu Leu Leu Ala Cys Ile Phe Leu Ile Lys Ile Leu Ala Ala Ser Ala

165 170 175

Leu Trp Ala Ala Ala Trp His Gly Gln Lys Pro Gly Thr His Pro Pro

180 185 190

Ser Glu Leu Asp Cys Gly His Asp Pro Gly Tyr Gln Leu Gln Thr Leu

195 200 205

Pro Gly Leu Arg Asp Thr

210

<210> 45

<211> 224

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 45

Met Glu Pro Leu Arg Leu Leu Ile Leu Leu Phe Val Thr Glu Leu Ser

1. 5 10 15

Gly Ala His Asn Thr Thr Val Phe Gln Gly Val Ala Gly Gln Ser Leu

20 25 30

Gln Val Ser Cys Pro Tyr Asp Ser Met Lys His Trp Gly Arg Arg Lys

35 40 45

Ala Trp Cys Arg Gln Leu Gly Glu Lys Gly Pro Cys Gln Arg Val Val

50 55 60

Ser Thr His Asn Leu Trp Leu Leu Ser Phe Leu Arg Arg Trp Asn Gly

65 70 75 80

Ser Thr Ala Ile Thr Asp Asp Thr Leu Gly Gly Thr Leu Thr Ile Thr

85 90 95

Leu Arg Asn Leu Gln Pro His Asp Ala Gly Leu Tyr Gln Cys Gln Ser

100 105 110

Leu His Gly Ser Glu Ala Asp Thr Leu Arg Lys Val Leu Val Glu Val

115 120 125

Leu Ala Asp Pro Leu Asp His Arg Asp Ala Gly Asp Leu Trp Phe Pro

130 135 140

Gly Glu Ser Glu Ser Phe Glu Asp Ala His Val Glu His Ser Glu Gly

145 150 155 160

Glu Ile Pro Phe Pro Pro Thr Ser Ile Leu Leu Leu Leu Ala Cys Ile

165 170 175

Phe Leu Ile Lys Ile Leu Ala Ala Ser Ala Leu Trp Ala Ala Ala Trp

180 185 190

His Gly Gln Lys Pro Gly Thr His Pro Pro Ser Glu Leu Asp Cys Gly

195 200 205

His Asp Pro Gly Tyr Gln Leu Gln Thr Leu Pro Gly Leu Arg Asp Thr

210 215 220

<210> 46

<211> 230

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 46

Met Glu Pro Leu Arg Leu Leu Ile Leu Leu Phe Val Thr Glu Leu Ser

1. 5 10 15

Gly Ala His Asn Thr Thr Val Phe Gln Gly Val Ala Gly Gln Ser Leu

20 25 30

Gln Val Ser Cys Pro Tyr Asp Ser Met Lys His Trp Gly Arg Arg Lys

35 40 45

Ala Trp Cys Arg Gln Leu Gly Glu Lys Gly Pro Cys Gln Arg Val Val

50 55 60

Ser Thr His Asn Leu Trp Leu Leu Ser Phe Leu Arg Arg Trp Asn Gly

65 70 75 80

Ser Thr Ala Ile Thr Asp Asp Thr Leu Gly Gly Thr Leu Thr Ile Thr

85 90 95

Leu Arg Asn Leu Gln Pro His Asp Ala Gly Leu Tyr Gln Cys Gln Ser

100 105 110

Leu His Gly Ser Glu Ala Asp Thr Leu Arg Lys Val Leu Val Glu Val

115 120 125

Leu Ala Asp Pro Leu Asp His Arg Asp Ala Gly Asp Leu Trp Phe Pro

130 135 140

Gly Glu Ser Glu Ser Phe Glu Asp Ala His Val Tyr Gly Gly Trp Gly

145 150 155 160

Gly Trp Gly Pro Glu Gly Glu Ile Pro Phe Pro Pro Thr Ser Ile Leu

165 170 175

Leu Leu Leu Ala Cys Ile Phe Leu Ile Lys Ile Leu Ala Ala Ser Ala

180 185 190

Leu Trp Ala Ala Ala Trp His Gly Gln Lys Pro Gly Thr His Pro Pro

195 200 205

Ser Glu Leu Asp Cys Gly His Asp Pro Gly Tyr Gln Leu Gln Thr Leu

210 215 220

Pro Gly Leu Arg Asp Thr

225 230

<210> 47

<211> 230

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 47

Met Glu Pro Leu Arg Leu Leu Ile Leu Leu Phe Val Thr Glu Leu Ser

1. 5 10 15

Gly Ala His Asn Thr Thr Val Phe Gln Gly Val Ala Gly Gln Ser Leu

20 25 30

Gln Val Ser Cys Pro Tyr Asp Ser Met Lys His Trp Gly Arg Arg Lys

35 40 45

Ala Trp Cys Arg Gln Leu Gly Glu Lys Gly Pro Cys Gln Arg Val Val

50 55 60

Ser Thr His Asn Leu Trp Leu Leu Ser Phe Leu Arg Arg Trp Asn Gly

65 70 75 80

Ser Thr Ala Ile Thr Asp Asp Thr Leu Gly Gly Thr Leu Thr Ile Thr

85 90 95

Leu Arg Asn Leu Gln Pro His Asp Ala Gly Leu Tyr Gln Cys Gln Ser

100 105 110

Leu His Gly Ser Glu Ala Asp Thr Leu Arg Lys Val Leu Val Glu Val

115 120 125

Leu Ala Asp Pro Leu Asp His Arg Asp Ala Gly Asp Leu Trp Phe Pro

130 135 140

Gly Glu Ser Glu Ser Phe Glu Asp Ala His Val Glu His Ser Ile Ser

145 150 155 160

Arg Ser Leu Leu Glu Gly Glu Ile Trp Phe Arg Trp Thr Ser Ile Leu

165 170 175

Leu Leu Leu Ala Cys Ile Phe Leu Ile Lys Ile Leu Ala Ala Ser Ala

180 185 190

Leu Trp Ala Ala Ala Trp His Gly Gln Lys Pro Gly Thr His Pro Pro

195 200 205

Ser Glu Leu Asp Cys Gly His Asp Pro Gly Tyr Gln Leu Gln Thr Leu

210 215 220

Pro Gly Leu Arg Asp Thr

225 230

<210> 48

<211> 230

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 48

Met Glu Pro Leu Arg Leu Leu Ile Leu Leu Phe Val Thr Glu Leu Ser

1. 5 10 15

Gly Ala His Asn Thr Thr Val Phe Gln Gly Val Ala Gly Gln Ser Leu

20 25 30

Gln Val Ser Cys Pro Tyr Asp Ser Met Lys His Trp Gly Arg Arg Lys

35 40 45

Ala Trp Cys Arg Gln Leu Gly Glu Lys Gly Pro Cys Gln Arg Val Val

50 55 60

Ser Thr His Asn Leu Trp Leu Leu Ser Phe Leu Arg Arg Trp Asn Gly

65 70 75 80

Ser Thr Ala Ile Thr Asp Asp Thr Leu Gly Gly Thr Leu Thr Ile Thr

85 90 95

Leu Arg Asn Leu Gln Pro His Asp Ala Gly Leu Tyr Gln Cys Gln Ser

100 105 110

Leu His Gly Ser Glu Ala Asp Thr Leu Arg Lys Val Leu Val Glu Val

115 120 125

Leu Ala Asp Pro Leu Asp His Arg Asp Ala Gly Asp Leu Trp Phe Pro

130 135 140

Gly Glu Ser Glu Ser Phe Glu Asp Ala His Val Tyr Gly Gly Trp Gly

145 150 155 160

Gly Trp Gly Pro Glu Gly Glu Ile Trp Phe Arg Trp Thr Ser Ile Leu

165 170 175

Leu Leu Leu Ala Cys Ile Phe Leu Ile Lys Ile Leu Ala Ala Ser Ala

180 185 190

Leu Trp Ala Ala Ala Trp His Gly Gln Lys Pro Gly Thr His Pro Pro

195 200 205

Ser Glu Leu Asp Cys Gly His Asp Pro Gly Tyr Gln Leu Gln Thr Leu

210 215 220

Pro Gly Leu Arg Asp Thr

225 230

<210> 49

<211> 113

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 49

Met Gly Gly Leu Glu Pro Cys Ser Arg Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu

1. 5 10 15

Leu Ala Val Ser Gly Leu Arg Pro Val Gln Ala Gln Ala Gln Ser Asp

20 25 30

Cys Ser Cys Ser Thr Val Ser Pro Gly Val Leu Ala Gly Ile Val Met

35 40 45

Gly Asp Leu Val Leu Thr Val Leu Ile Ala Leu Ala Val Tyr Phe Leu

50 55 60

Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Arg Gly Ala Ala Glu Ala Ala Thr Arg

65 70 75 80

Lys Gln Arg Ile Thr Glu Thr Glu Ser Pro Tyr Gln Glu Leu Gln Gly

85 90 95

Gln Arg Ser Asp Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Gln Arg Pro Tyr Tyr

100 105 110

Lys

<210> 50

<211> 608

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 50

agacttcctc cttcacttgc ctggacgctg cgccacatcc caccggccct tacactgtgg 60

tgtccagcag catccggctt catgggggga cttgaaccct gcagcaggct cctgctcctg 120

cctctcctgc tggctgtaag tggtctccgt cctgtccagg cccaggccca gagcgattgc 180

agttgctcta cggtgagccc gggcgtgctg gcagggatcg tgatgggaga cctggtgctg 240

acagtgctca ttgccctggc cgtgtacttc ctgggccggc tggtccctcg ggggcgaggg 300

gctgcggagg cagcgacccg gaaacagcgt atcactgaga ccgagtcgcc ttatcaggag 360

ctccagggtc agaggtcgga tgtctacagc gacctcaaca cacagaggcc gtattacaaa 420

tgagcccgaa tcatgacagt cagcaacatg atacctggat ccagccattc ctgaagccca 480

ccctgcacct cattccaact cctaccgcga tacagaccca cagagtgcca tccctgagag 540

accagaccgc tccccaatac tctcctaaaa taaacatgaa gcacaaaaac aaaaaaaaaa 600

aaaaaaaa 608

<210> 51

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 51

Ser Ile Ser Arg Ser Leu Leu Glu Gly Glu Ile Pro Phe Pro

1. 5 10

<210> 52

<211> 18

<212> БЕЛОК

<213> Вирус Thosea asigna

<400> 52

Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro

1. 5 10 15

Gly Pro

<210> 53

<211> 21

<212> БЕЛОК

<213> Вирус Thosea asigna

<400> 53

Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu

1. 5 10 15

Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 54

<211> 19

<212> БЕЛОК

<213> Тешовирус-1 свиней

<400> 54

Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn

1. 5 10 15

Pro Gly Pro

<210> 55

<211> 22

<212> БЕЛОК

<213> Тешовирус-1 свиней

<400> 55

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1. 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 56

<211> 20

<212> БЕЛОК

<213> Вирус ринита A лошадей

<400> 56

Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser

1. 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 57

<211> 23

<212> БЕЛОК

<213> Вирус ринита A лошадей

<400> 57

Gly Ser Gly Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp

1. 5 10 15

Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro

20

<210> 58

<211> 22

<212> БЕЛОК

<213> Вирус ящура

<400> 58

Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val

1. 5 10 15

Glu Ser Asn Pro Gly Pro

20

<210> 59

<211> 25

<212> БЕЛОК

<213> Вирус ящура

<400> 59

Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala

1. 5 10 15

Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro

20 25

<210> 60

<211> 25

<212> БЕЛОК

<213> Strongylocentrotus purpuratus

<400> 60

Asp Gly Phe Cys Ile Leu Tyr Leu Leu Leu Ile Leu Leu Met Arg Ser

1. 5 10 15

Gly Asp Val Glu Thr Asn Pro Gly Pro

20 25

<210> 61

<211> 20

<212> БЕЛОК

<213> Amphimedon queenslandica

<400> 61

Leu Leu Cys Phe Met Leu Leu Leu Leu Leu Ser Gly Asp Val Glu Leu

1. 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 62

<211> 20

<212> БЕЛОК

<213> Amphimedon queenslandica

<400> 62

His His Phe Met Phe Leu Leu Leu Leu Leu Ala Gly Asp Ile Glu Leu

1. 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 63

<211> 20

<212> БЕЛОК

<213> Saccoglossus kowalevskii

<400> 63

Trp Phe Leu Val Leu Leu Ser Phe Ile Leu Ser Gly Asp Ile Glu Val

1. 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 64

<211> 20

<212> БЕЛОК

<213> Branchiostoma floridae

<400> 64

Lys Asn Cys Ala Met Tyr Met Leu Leu Leu Ser Gly Asp Val Glu Thr

1. 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 65

<211> 20

<212> БЕЛОК

<213> Branchiostoma floridae

<400> 65

Met Val Ile Ser Gln Leu Met Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Glu

1. 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 66

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Неустановленное

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание незивестного: Консенсусная

последовательность 2A"

<220>

<221> MOD_RES

<222> (2)..(2)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> MOD_RES

<222> (4)..(4)

<223> Любая аминокислота

<400> 66

Asp Xaa Glu Xaa Asn Pro Gly Pro

1. 5

<210> 67

<211> 189

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 67

agcctgcatg gcagcgaagc ggataccctg cgcaaagtgc tggtggaagt gctggcggat 60

ccgctggatc atcgcgatgc gggcgatctg tggtttccgg gcgaaagcga aagctttgaa 120

gatgcgcatg tggaaattcc ggatagccgc agcctgctgg aaggcgaaat tccgtttccg 180

ccgaccagc 189

<210> 68

<211> 189

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 68

agcctgcatg gcagcgaagc ggataccctg cgcaaagtgc tggtggaagt gctggcggat 60

ccgctggatc atcgcgatgc gggcgatctg tggtttccgg gcgaaagcga aagctttgaa 120

gatgcgcatg tggaaattcc gccgagccgc agcctgctgg aaggcgaaat tccgtttccg 180

ccgaccagc 189

<210> 69

<211> 189

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 69

agcctgcatg gcagcgaagc ggataccctg cgcaaagtgc tggtggaagt gctggcggat 60

ccgctggatc atcgcgatgc gggcgatctg tggtttccgg gcgaaagcga aagctttgaa 120

gatgcgcatg tggaaattga tccgagccgc agcctgctgg aaggcgaaat tccgtttccg 180

ccgaccagc 189

<210> 70

<211> 141

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 70

agcctgcatg gcagcgaagc ggataccctg cgcaaagtgc tggtggaagt gctggcggat 60

ccgctggatc atcgcgatgc gggcgatctg tggtttccgg gcgaaagcga aagctttgaa 120

gatgcgcatg tggaacatag c 141

<210> 71

<211> 171

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 71

agcctgcatg gcagcgaagc ggataccctg cgcaaagtgc tggtggaagt gctggcggat 60

ccgctggatc atcgcgatgc gggcgatctg tggtttccgg gcgaaagcga aagctttgaa 120

gatgcgcatg tggaacatag cgaaggcgaa attccgtttc cgccgaccag c 171

<210> 72

<211> 189

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 72

agcctgcatg gcagcgaagc ggataccctg cgcaaagtgc tggtggaagt gctggcggat 60

ccgctggatc atcgcgatgc gggcgatctg tggtttccgg gcgaaagcga aagctttgaa 120

gatgcgcatg tgtatggcgg ctggggcggc tggggcccgg aaggcgaaat tccgtttccg 180

ccgaccagc 189

<210> 73

<211> 189

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 73

agcctgcatg gcagcgaagc ggataccctg cgcaaagtgc tggtggaagt gctggcggat 60

ccgctggatc atcgcgatgc gggcgatctg tggtttccgg gcgaaagcga aagctttgaa 120

gatgcgcatg tggaacatag cattagccgc agcctgctgg aaggcgaaat ttggtttcgc 180

tggaccagc 189

<210> 74

<211> 189

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 74

agcctgcatg gcagcgaagc ggataccctg cgcaaagtgc tggtggaagt gctggcggat 60

ccgctggatc atcgcgatgc gggcgatctg tggtttccgg gcgaaagcga aagctttgaa 120

gatgcgcatg tgtatggcgg ctggggcggc tggggcccgg aaggcgaaat ttggtttcgc 180

tggaccagc 189

<210> 75

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

cинтетический олигонуклеотид"

<400> 75

gtaatgtgag agactttggg 20

<210> 76

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

Синтетический олигонуклеотид"

<400> 76

ccgaagcccg ggtcatccgg 20

<210> 77

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

Синтетический праймер"

<400> 77

attagacaat acttactggg gatcc 25

<210> 78

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

Синтетический праймер"

<400> 78

ggaagctctg gaggaatatg tg 22

<210> 79

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

Синтетический праймер"

<400> 79

cccccaaaca cctgatagac 20

<210> 80

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

Синтетический праймер"

<400> 80

ccagagaggt ggagtcggta 20

<210> 81

<211> 33

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

Синтетический олигонуклеотид"

<400> 81

tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cag 33

<210> 82

<211> 34

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

Синтетический олигонуклеотид"

<400> 82

gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acag 34

<210> 83

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 83

Leu Leu Glu Gly Glu Ile Pro Phe Pro

1. 5

<210> 84

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 84

Ser Arg Ser Leu Leu Glu Gly Glu Ile Pro Phe Pro

1. 5 10

<210> 85

<211> 21

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 85

Asp Ala Gly Asp Leu Trp Phe Pro Gly Glu Ser Glu Ser Phe Glu Asp

1. 5 10 15

Ala His Val Glu His

20

<210> 86

<211> 19

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 86

Ser Leu Leu Glu Gly Glu Ile Pro Phe Pro Pro Thr Ser His His His

1. 5 10 15

His His His

<210> 87

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 87

His Ser Ile Ser Arg Ser Leu Leu Glu

1. 5

<210> 88

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 88

Gly Glu Ile Pro Phe Pro Pro Thr Ser His His His His His His

1. 5 10 15

<210> 89

<211> 63

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 89

Ser Leu His Gly Ser Glu Ala Asp Thr Leu Arg Lys Val Leu Val Glu

1. 5 10 15

Val Leu Ala Asp Pro Leu Asp His Arg Asp Ala Gly Asp Leu Trp Phe

20 25 30

Pro Gly Glu Ser Glu Ser Phe Glu Asp Ala His Val Glu His Ser Ile

35 40 45

Ser Arg Ser Leu Leu Glu Gly Glu Ile Pro Phe Pro Pro Thr Ser

50 55 60

<---

1. Нуклеиновая кислота, содержащая последовательность, кодирующую TREM2 человека, отличающаяся тем, что TREM2 человека содержит мутантный стеблевой участок, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 33-40, который придает устойчивость к расщеплению шеддазой.

2. Нуклеиновая кислота по п. 1, где шеддаза представляет собой ADAM17 или ADAM10.

3. Нуклеиновая кислота по п. 1 или 2, где мутантный вариант TREM2 человека содержит стеблевой участок, состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из любой из SEQ ID NO: 33-40.

4. Нуклеиновая кислота по любому из пп. 1-3, где мутантный вариант TREM2 человека содержит стеблевой участок, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из любой из SEQ ID NO: 33-35.

5. Нуклеиновая кислота по любому из пп. 1-4, где мутантный вариант TREM2 человека содержит или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из любой из SEQ ID NO: 41-48.

6. Нуклеиновая кислота по любому из пп. 1-5, где последовательность содержит любую из SEQ ID NO: 67-74.

7. Нуклеиновая кислота по любому из пп. 1-6, дополнительно содержащая промотор.

8. Нуклеиновая кислота по п. 7, где промотор специфически управляет экспрессией нуклеиновой кислоты в клетках микроглии, макрофагах или дендритных клетках.

9. Нуклеиновая кислота по п. 8, где промотор выбран из промотора гена TREM2, промотора гена TMEM119, промотора гена Hexb, промотора гена IBA1, промотора гена CD45, промотора гена CD11b, промотора гена Cst7, промотора гена Lpl, промотора гена Csf1, промотора гена Cs1R, промотора гена Itgax, промотора гена Clec7a, промотора гена Lilrb4, промотора гена Tyrobp, промотора гена Ctsb, промотора гена Ctsd, промотора гена B2m, промотора гена Lyz2, промотора гена Cx3cr1, промотора гена Cst3, промотора гена Ctss, промотора гена P2ry12, промотора гена C1qa или промотора гена C1qb.

10. Нуклеиновая кислота по любому из пп. 1-9, дополнительно содержащая сигнал полиаденилирования.

11. Нуклеиновая кислота по любому из пп. 1-10, дополнительно содержащая вторую последовательность, кодирующую белок DAP12.

12. Нуклеиновая кислота по п. 11, где белок DAP12 содержит или состоит из SEQ ID NO: 49.

13. Вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту по любому из пп. 1-12.

14. Вектор по п. 13, где вектор выбран из ДНК-вектора, РНК-вектора, плазмиды, космиды или вирусного вектора.

15. Вектор по п. 14, где вирусный вектор выбран из вектора на основе любого из следующих вирусов: лентивируса, аденовируса, аденоассоциированного вируса (AAV), вируса простого герпеса (HSV), парвовируса, ретровируса, вируса осповакцины, вируса Синбис, вируса гриппа, реовируса, вируса ньюкаслской болезни (NDV), вируса кори, вируса везикулярного стоматита (VSV), полиовируса, поксвируса, вируса долины Сенека, вируса Коксаки, энтеровируса, вируса миксомы или вируса Мараба.

16. Вектор по п. 15, где вирусный вектор представляет собой вектор на основе AAV.

17. Клетка для экспрессии TREM2 человека, содержащая нуклеиновую кислоту по любому из пп. 1-11 или вектор по любому из пп. 13-16.

18. Клетка по п. 17, где клетка выбрана из макрофага, дендритной клетки или клетки микроглии.

19. Полипептид TREM2 человека, отличающийся тем, что TREM2 человека содержит мутантный стеблевой участок, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 33-40, где указанный TREM2 человека, содержащий мутантный стеблевой участок, устойчив к расщеплению шеддазой.

20. Полипептид по п. 19, где полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 41-48.

21. Способ повышения уровня экспрессии TREM2 у субъекта, при этом способ включает введение субъекту нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-12, вектора по любому из пп. 13-16, клетки по любому из пп. 17, 18 или полипептида по любому из пп. 19, 20.

22. Способ лечения связанного с TREM2 заболевания или нарушения у субъекта, нуждающегося в этом, при этом способ включает введение субъекту нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-12, вектора по любому из пп. 13-16, клетки по любому из пп. 17, 18 или полипептида по любому из пп. 19, 20.

23. Способ по п. 22, где у субъекта имеется связанное с TREM2 заболевание или нарушение.

24. Способ по любому из пп. 21-23, где субъект представляет собой человека.

25. Способ по любому из пп. 21-24, где связанное с TREM2 заболевание или нарушение представляет собой нейровоспалительное или нейродегенеративное заболевание, выбранное из болезни Альцгеймера, лобно-височной деменции, болезни Паркинсона, бокового амиотрофического склероза, болезни Насу-Хакола, рассеянного склероза, бокового амиотрофического склероза (ALS), энцефалита с антителами к NMDA-рецепторам, аутизма, волчанки головного мозга (NP-SLE), химиоиндуцированной периферической нейропатии (CIPN), посттерапевтической невралгии, хронической воспалительной демиелинизирующей полинейропатии (CIDP), эпилепсии, синдрома Гийена-Барре (GBS), миозита с тельцами включения, заболеваний лизосомального накопления, сфингомиелинлипидоза (Ниманна-Пика C), мукополисахаридоза II/IIIB, метахроматической лейкодистрофии, мультифокальной моторной нейропатии, тяжелой миастении, болезни Бехчета с вовлечением нервных структур, оптиконейромиелита (NMO), неврита зрительного нерва, полимиозита, дерматомиозита, энцефалита Расмуссена, синдрома Ретта, инсульта, поперечного миелита, травматического повреждения головного мозга, повреждения спинного мозга, вирусного энцефалита или бактериального менингита.

26. Способ по любому из пп. 21-25, где связанное с TREM2 заболевание или нарушение представляет собой болезнь Альцгеймера.

27. Способ по любому из пп. 21-25, где связанное с TREM2 заболевание или нарушение представляет собой лобно-височную деменцию.

28. Способ по любому из пп. 21-27, где нуклеиновую кислоту, вектор или клетку вводят субъекту внутривенным, внутричерепным, интратекальным, подкожным или интраназальным путем.

29. Способ по любому из пп. 21-28, где способ дополнительно включает введение субъекту второго средства.

30. Способ по любому из пп. 21-29, где способ дополнительно включает:

проведение анализа уровня TREM2 человека на клеточной поверхности в образце, полученном от субъекта.

31. Способ по п. 30, где образец предусматривает спинномозговую жидкость.

32. Способ по п. 30, где уровень TREM2 человека на клеточной поверхности в образце определяют с помощью анализа, выбранного из проточной цитометрии, иммуногистохимического исследования, вестерн-блоттинга, иммунофлуоресцентного анализа, радиоиммуноанализа (RIA), твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), гомогенной флуоресценции с временным разрешением (HTRF) или позитронно-эмиссионной томографии (PET).

33. Применение нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-12, вектора по любому из пп. 13-16, клетки по любому из пп. 17, 18 или полипептида по п. 19 или 20 для лечения у субъекта связанного с TREM2 заболевания или нарушения.

34. Применение нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-12, вектора по любому из пп. 13-16, клетки по любому из пп. 17, 18 или полипептида по п. 19 или 20 в изготовлении лекарственного препарата для лечения у субъекта связанного с TREM2 заболевания или нарушения.