Способ получения и доставки растворов ооцист
Изобретение относится к ветеринарии, а именно к системам и способам разрушения внешней мембраны ооцисты в растворе и доставки раствора на слизистую оболочку морды птицы. Система включает сосуд, содержащий неразрушенные ооцисты в растворе, камеру для обработки ооцист и выпуск для доставки. Неразрушенные ооцисты перемещаются из сосуда через камеру для обработки, и часть мембран ооцист разрушается, высвобождая спороцисты, полученный раствор перемещается из камеры для обработки в выпуск для доставки, где раствор доставляется птице. Также предложены способы вакцинации, включая вакцинацию против инфекции Eimeria. Изобретение позволяет разрушать стенки ооцист и доставлять высвобожденные спороцисты реципиенту в режиме реального времени, повышая эффективность вакцинации. 3 н. и 18 з.п. ф-лы, 9 ил., 25 табл., 8 пр.
Перекрестная ссылка на родственные заявки
[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предвеарительной заявки на патент США №62/696261, поданной 10 июля 2018 г. Hutchins et al., содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки. Настоящая заявка относится к одновременно рассматриваемой заявке РСТ с серийным номером ______, поданной 10 июля 2019 г. автором изобретения James Hutchins, №дела поверенного 673-04-PCT. Данная одновременно рассматриваемая заявка РСТ полностью включена в настоящий документ посредством ссылки.
1. ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0002] Согласно настоящему изобретению предложены системы и способы разрушения внешней мембраны ооцисты в растворе и доставки раствора в организм животного. Система включает сосуд, содержащий неразрушенные ооцисты в растворе, камеру для обработки ооцист и выпуск для доставки. Неразрушенные ооцисты перемещают из сосуда через камеру для обработки, и часть мембран ооцист разрушают с высвобождением спороцист, и полученный раствор перемещают из камеры для обработки в выпуск для доставки, где раствор доставляется животному.
2. УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
2.1. Введение
[0003] Описание «уровня техники», представленное в настоящем документе, предназначено для общего представления контекста описания. Работа перечисленных в настоящем документе авторов в той мере, в какой она описана в данном разделе «Уровень техники», а также аспекты описания, которые иначе не могут быть квалифицированы как уровень техники на момент подачи заявки, ни прямо, ни косвенно не признаются известным уровнем техники в отношении настоящего описания.
[0004] Вакцины являются важным компонентом защиты людей и животных от патогенных микроорганизмов, включая вирусы, бактерии и паразиты. Вкратце, вакцина стимулирует иммунную систему для распознавания определенного патогена, тем самым создавая защитную систему, которая защищает от встречи с данным микроорганизмом в природе в будущем. Вакцины можно разделить на несколько основных классов, в частности: инактивированные или убитые вакцины, субъединичные вакцины, вакцины дикого типа и аттенуированные или модифицированные живые вакцины. Вакцины дикого типа и аттенуированные вакцины вызывают у животного-реципиента легкую инфекцию. Легкая инфекция часто вызывает иммунный ответ, что позволяет предотвратить более серьезную, возможно, смертельную инфекцию в будущем.
2.2. Apicomplexa, Eimeria, кокцидиоз и вакцины
[0005] Апикомплексы (Apicomplexa) - это тип одноклеточных и спорообразующих паразитов со сложным жизненным циклом. Хорошо известные болезни человека, вызываемые апикомплексами, включают бабезиоз (Babesia), криптоспоридиоз (Cryptosporidium parvum), малярию (Plasmodium) и токсоплазмоз (Toxoplasma gondii). Болезни, вызываемые апикомплексами, также поражают животных и домашний скот. Некоторые апикомплексы, такие как Cryptosporidium parvum и Toxoplasma gondii, поражают как людей, так и животных. Другие апикомплексы, такие как Eimeria или Theileria, поражают только животных. Жизненный цикл апикомплексов сложен тем, что он включает как стадии как полового, так и бесполого размножения. Жизненный цикл часто состоит из стадии выделения в окружающую среду, и других стадий, которые протекают внутри животного-хозяина. Для многих апикомплексов одни стадии жизненного цикла проходят в организме хозяина одного вида, а другие стадии - в организме хозяина другого вида. С другой стороны, апикомплекс-паразит, Eimeria, обычно является специфичным в отношении хозяина и моноксенным, то есть жизненный цикл специфичен для хозяина одного вида.
[0006] Eimeria вызывает кокцидиоз у диких и домашних позвоночных, таких как крупный рогатый скот, куры, рыба, козы, свиньи, кролики, рептилии, овцы и индейки. У различных видов Eimeria существует предпочтительный отдел желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), где они воспроизводятся и вызывают повреждение эпителия ЖКТ.
[0007] Части жизненного цикла ооцисты Eimeria дикого типа или аттенуированной проиллюстрированы на фиг.1A и фиг.1B. На фиг.1A изображен обзор внешнего процесса, который имеет место при поглощении ооцист Eimeria у цыплят. В день вылупления цыплят сначала инокулируют вакциной, содержащей спорулированные ооцисты (А). Затем спорулированная ооциста перерабатывается в пищеварительном тракте цыпленка, этот процесс более подробно показан на фиг.1 В. Инфекция продолжается в течение нескольких стадий жизненного цикла, в конечном итоге приводя к образованию неспорулированных ооцист, которые выделяются с фекалиями цыпленка (B). После выделения из организма птицы неспорулированные ооцисты подвергаются воздействию тепла, влаги и кислорода окружающей среды, и в течение нескольких дней они становятся спорулированными (С). Ооцисты не являются инфекционными до тех пор, пока они являются спорулированными. Затем эти спорулированные ооцисты попадают в организм цыпленка, и цикл повторяется.
[0008] На фиг.1B представлено увеличенное изображение внутренних процессов, которые происходят при поглощении ооцист Eimeria у цыплят. Область в рамке показывает упрощенное изображение репродуктивного жизненного цикла ооцисты, где спорулированная ооциста, содержащая четыре спороцисты, треснула, высвобождая спороцисты (D). Внутри каждой спороцисты находится по два спорозоита. Ферментативные реакции в кишечнике птицы расщепляют концевые элементы стенки спороцисты (не показано), высвобождая спорозоиты. Затем подвижные спорозоиты ищут и заражают клетки кишечника (E) в различных областях кишечника видоспецифичным образом. Например, у цыплят E. acervulina поражает верхнюю часть кишечника, E. maxima поражает тонкий кишечник, и E. tenella поражает слепую кишку.
[0009] После инфицирования клеток кишечника спорозоитами жизненный цикл паразита продолжается через несколько стадий бесполого размножения. Эти циклы состоят из нескольких раундов размножения и увеличения численности, которые приводят к значительному увеличению присутствия Eimeria в выбранных ими областях кишечного тракта. После увеличения численности, вызванного стадиями бесполого размножения, происходит половое размножение, в результате которого образуются ооцисты, которые затем выделяются с фекалиями цыпленка и потребляются другим цыпленком, как показано на фиг.1А.
[0010] Полный процесс занимает приблизительно 7 дней, причем точная продолжительность зависит от вида. Процесс выхода из цисты и последующая инвазия клетки-хозяина происходит между 0 и 3 днями. Цикл бесполого размножения происходит между 3 и 5 днями. Фаза полового размножения и последующее выделение ооцисты с фекалиями происходит между 5 и 7 днями.
[0011] Кокцидиоз представляет собой распространенное заболевание домашней птицы. Борьбу с кокцидиозом обычно осуществляют с помощью ионофоров или химических веществ в кормах. В настоящее время изыскиваются альтернативные меры контроля по ряду причин, включая, помимо прочего, высокую стоимость ионофоров и химикатов, воздействие ионофоров и других химических веществ на окружающую среду, потребительский спрос на птицу без пестицидов и развитие устойчивости у кокцидий. Вакцины от кокцидиоза могут резко снизить или полностью исключить потребность в ионофорах или химических веществах в кормах для борьбы с кокцидиозом. Вакцины не имеют широкого применения вследствие отсутствия единообразия при массовом применении вакцины. В настоящее время вакцины против Eimeria для домашней птицы приводят к неэффективной инфекционности и иммунитету на первой стадии и, как правило, приводят к появлению большой «наивной» популяции, подверженной заболеванию. Последующее формирование «наивной» популяции обуславливает необходимость повторения цикла на фермах, осуществляющих выращивание, для достижения иммунитета. Выделение из птиц, инфицированных на первой стадии, приводит к массовому заражению остаточной наивной популяции. Решение проблемы наличия наивной популяции обеспечивает высокий выход ооцист в период после первой стадии инфекции, что приводит к восприимчивости к вторичным бактериальным инфекциям, таким как некротический энтерит, требующим применения антибиотиков для устранения. Эффективная вакцинация всех птиц в день вылупления позволит избежать заболеваемости, смертности и снижения массы, связанных с инфекцией Eimeria. См. публикацию PCT WO 2017/083663Al, Karimpour.
[0012] В настоящее время глобальные последствия кокцидиоза вследствие плохих показателей, заболеваемости и смертности оцениваются в 300 миллионов долларов. Кроме того, по оценкам, 90 миллионов долларов ежегодно расходуется в США и 3 миллиарда долларов во всем мире на борьбу с кокцидиозом (5m Editor, 2013, High Cost of Coccidiosis in Broilers, The Poultry Site, https://thepoultrysite.com/news/2013/02/high-cost-of-coccidiosis-in-broilers).
[0013] В настоящее время считается, что процессу растрескивания мембраны ооцисты способствует истирание ооцист, вступающих в контакт с песком и кормом в желудке цыпленка. Доставка ооцист невакцинированным или наивным птицам в инкубаторе приводит к неэффективной вакцинации, поскольку кишечник не содержит достаточного количества корма или песка, чтобы способствовать процессу разрушения стенки ооцисты для высвобождения спороцист. Таким образом, доставка суточным птенцам непосредственно спороцист была бы предпочтительной, поскольку у них может не присутствовать песка или пищи в их пищеварительной системе, чтобы помочь разрушить стенку ооцисты и высвободить спороцисты. Непосредственная доставка спороцист наивным птицам в инкубаторе может повысить эффективность вакцинации, так как вакцина может быть инфекционной даже в отсутствие песка или корма. Молодые цыплята обладают способностью обеспечивать прохождение высвободившихся спороцист до стадии инфицированного спорозоита в кишечнике. Эта стратегия применения содержащей спороцисты вакцины может предотвратить необходимость повторения цикла и повторных раундов инфицирования для формирования полного иммунитета.
[0014] Ранее были предприняты некоторые попытки разрушить стенку ооцисты с целью получения вакцинного раствора, который производят и поставляют в форме содержащей спороцисты вакцины. Например, другие авторы описали истирание или встряхивание ооцист со стеклянными шариками. Кроме того, в европейском патенте 2111243 B1 (Hutchins et al., Embrex, Inc.) описаны способы высвобождения спороцист из ооцист с применением микроканалов.
[0015] Однако предыдущие попытки разрушить мембрану ооцисты были предприняты в контексте получения раствора для криоконсервации, замораживания, хранения, последующей доставки и оттаивания. В частности, предыдущие способы получения вакцин на основе спороцист имеют тот недостаток, что полученные спороцисты должны быть суспендированы в растворе криоконсерванта и храниться в жидком азоте в течение длительного времени. Такие способы хорошо известны в области паразитологии для сохранения основных посевных линий в форме спороцист. Также следует отметить, что восстановление жизнеспособных спороцист после криоконсервации является низким, часто составляет всего 5-10%. Получение и доставка спороцист в реальном времени позволяет избежать криоконсервации и, как следствие, низкого восстановления жизнеспособных организмов.
[0016] Другой задачей является разрушение мембраны ооцисты без повреждения спороцисты. Это становится еще более трудным при работе с вакцинами, которые состоят из нескольких видов Eimeria, которые имеют разные размеры и имеют разную толщину и прочность защитных стенок. Таким образом, условия, необходимые для разрушения стенок для небольших устойчивых к разрушению видов, таких как E. acervulina, могут либо повредить ранее высвободившиеся спороцисты, либо быть слишком жесткими для более крупных и более восприимчивых к разрушению видов, таких как E. maxima.
[0017] Попытки разрушения стенки ооцисты во время доставки или в непрерывном процессе, когда недавно высвобожденные спороцисты доставлялись непосредственно и немедленно предполагаемому реципиенту, не предпринимались.
3. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0018] Приведенные в настоящем документе варианты реализации относятся к системам и способам, относящимся к высвобождению спороцист in situ для улучшенной вакцинации. Некоторые варианты реализации, описанные в настоящем документе, относятся к системам и способам разрушения мембраны ооцисты и доставки мембраны и ее содержимого, жизнеспособных спороцист, животному.
[0019] Другие варианты реализации, описанные в настоящем документе, относятся к раствору ооцист, доставляемому в двух частях для создания гелевой смеси. См. заявку PCT ___, Hutchins, поданную 10 июля 2019 г., №дела поверенного 673-04-РСТ.
[0020] Один вариант реализации относится к способу вакцинации животного против Eimeria. Данный способ включает этапы обеспечения раствора на основе ооцист, вызывающего высвобождение жизнеспособных спороцист из ооцист, и доставки раствора, содержащего высвобожденные спороцисты, животному.
[0021] Другой вариант реализации относится к системе для разрушения внешней мембраны ооцисты и последующей ее доставки животному в режиме реального времени. Система включает сосуд, содержащий неразрушенные ооцисты в растворе, камеру для обработки ооцист и выпуск для доставки. Неразрушенные ооцисты перемещают из сосуда через камеру для обработки, и часть мембран ооцист разрушается, высвобождая спороцисты. Полученный раствор перемещают из камеры обработки к выпуску для доставки, где раствор доставляют животному.
[0022] Еще один вариант реализации относится к способу разрушения ооцист во время доставки животному. Способ включает этапы обеспечения первого сосуда для содержания объема неразрушенных ооцист в растворе, камеры для обработки и устройства доставки. Способ дополнительно включает перемещение раствора неразрушенных ооцист из первого сосуда в камеру для обработки и пропускание раствора через камеру для обработки, в результате чего по меньшей мере часть спороцист попадает в раствор. Способ также включает перемещение раствора из камеры для обработки к устройству доставки, где обработанный раствор, содержащий высвободившиеся спороцисты, доставляют животному.
[0023] Еще один вариант реализации относится к системе доставки раствора ооцист животному.
[0024] Предпочтительной коммерческой птицей, вакцинируемой способом согласно настоящему изобретению, является курица.
[0025] Предпочтительная композиция для введения цыпленку включает спороцисты или смесь спороцист и ооцист одного или более видов Eimeria, выбранных из группы, состоящей из E. tenella, E. acervulina, E. maxima, E. necatrix, E. mitis, E. praecox, E. hagani, E. mivati и E. brunetti.
[0026] Другой предпочтительной коммерческой птицей для вакцинации способом согласно настоящему изобретению является индейка. Предпочтительная композиция для введения индейке включает спороцисты или смесь спороцист и ооцист одного или более видов Eimeria, выбранных из группы, состоящей из E. meleagrimitis, E. adenoeides, E. gallopavonis, E. dispersa, E. meleagridis, E. innocua и E. subrotunda.
4. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0027] Таким образом, описывая различные варианты реализации настоящего изобретения в общих чертах, теперь будет приведена ссылка на сопроводительные чертежи, которые не выполнены в масштабе и не включают все компоненты системы.
[0028] На ФИГ. 1А представлено графическое изображение жизненного цикла ооцист Eimeria и вакцин.
[0029] На ФИГ. 1А представлено графическое изображение жизненного цикла ооцист Eimeria у цыпленка.
[0030] На ФИГ. 2 представлен схематический чертеж первого варианта реализации (гомогенизатор высокого давления).
[0031] На ФИГ. 3 представлен увеличенный вид системы обработки согласно первому варианту реализации.
[0032] На ФИГ. 4 представлен схематический чертеж второго варианта реализации (обработка шарами).
[0033] На ФИГ. 5 представлен схематический чертеж третьего варианта реализации (обработка ультразвуком).
[0034] На ФИГ. 6 представлен схематический чертеж четвертого варианта реализации (роторно-статорный смеситель).
[0035] На ФИГ. 7 представлен схематический чертеж пятого варианта реализации (вибрирующие пластины).
[0036] На ФИГ. 8 представлен схематический чертеж шестого варианта реализации (гидродинамическая кавитация).
[0037] На ФИГ. 9 представлен схематический чертеж седьмого варианта реализации (распыление под высоким давлением).
5. ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0038] Различные аспекты настоящего изобретения будут описаны более подробно ниже со ссылкой на прилагаемые чертежи, на которых показаны некоторые, но не все аспекты изобретения. Действительно, настоящее описание может быть воплощено во многих различных формах и не должно толковаться как ограниченное аспектами, изложенными в настоящем документе, скорее, данные варианты реализации предоставлены таким образом, чтобы настоящее описание было подробным и полным и полностью передавало объем настоящего изобретения специалистам в данной области техники.
[0039] Одинаковые номера относятся ко всем одинаковым элементам. На фигурах толщина некоторых линий, слоев, компонентов, элементов или признаков может быть увеличена для ясности. Все публикации, заявки на патенты, патенты и другие ссылки, упомянутые в настоящем документе, полностью включены в настоящую заявку посредством ссылки.
5.1. Определения
[0040] Используемая в настоящем документе терминология предназначена только для описания конкретных вариантов реализации и не предназначена для ограничения настоящего изобретения.
[0041] В настоящем документе термин Eimeria обозначает и включает виды Eimeria, инфицирующие цыплят, состоящие из E. maxima, E. mitis, E. tenella, E. acervulina, E. brunetti, E. necatrix, E. praecox, E. hagani, E. mivati и любой их комбинации. Eimeria включает виды, инфицирующие индеек, такие как E. meleagrimitis, E. adenoeides, E. gallopavonis, E. dispersa, E. innocua, E. meleagridis и E. subrotunda и любые их комбинации. Eimeria также включает виды, инфицирующие крупный рогатый скот, такие как E. zuernii, E. bovis, E. ellipsoidalis и любые их комбинации. Eimeria также включает E. ahsata, E. bakuensis, E. crandallis, E. faurei, E. granulosa, E. intricata, E. marsica, E. ovinoidalis, E. pallida, E. parva, E. weybridgensi и любые их комбинации. Кроме того, термин Eimeria включает E. intestinalis, E. vejdovskyi, E. piriformis, E. coecicola, E. irresidua, E. flavescens, E. exigua, E. magna, E. perforans, E. media, E. stiedae и любые их комбинации.
[0042] Термины «животное» и «субъекты-животные» включают, без ограничения перечисленными, млекопитающих и/или птиц. Подходящие субъекты-млекопитающие включают, без ограничения перечисленными, субъектов-приматов (например, субъектов-людей и субъектов-приматов, не являющихся людьми, таких как обезьяны), свиней, крупный рогатый скот (например, коров), коз, лошадей, кошек, овец, собак, мышей (например, мышей, крыс) и зайцеобразных субъектов.
[0043] Термины «птичий» и «субъект, относящийся к птицам» (т.е. «птица» и «субъект-птица»), используемые в настоящем документе, предназначены для включения самцов и самок любых видов птиц, но в первую очередь предназначены для охвата домашней птицы, выращиваемой в коммерческих целях для получения яиц, мяса или в качестве домашних животных. Соответственно, термины «птичий» и «субъект, относящийся к птицам» предназначены, в частности, для охвата кур, индеек, уток, гусей, перепелов, фазанов, попугаев, попугаевых, какаду, корелл, страусов, эму и т.п., но не ограничиваясь ими. В конкретных вариантах реализации субъект, относящийся к птицам, представляет собой курицу или индейку.
[0044] Доставка описанных в настоящем документе растворов в реальном времени обозначает систему или способ, в которых мембраны ооцист разрушаются или иным образом нарушаются, так что содержимое в них больше не содержится внутри мембран ооцист. Подразумевается, что указанные в настоящем документе системы и способы доставляют в течение примерно 24-часового периода при комнатной температуре или в течение 5-дневного периода при охлаждении. В инкубаторе вакцину обычно вводят, хранят и доставляют с помощью системы в течение интервала 4-8 часов.
[0045] В настоящем документе термин «процентное уменьшение ооцист» определяется как разрушение мембран ооцист для высвобождения внутренних компонентов, включая спороцисты. Например, уменьшение ооцист на 90% приводит к 10% остаточных ооцист и 90% превращению ооцист в высвобожденные спороцисты.
[0046] В настоящем документе термин «уход за оперением» или «ухаживать за оперением» определяется как действие курицы или другого животного с проглатыванием ооцист или других материалов при уходе за собой или другим животным с последующим потреблением материала при уходе за оперением, чтобы инициировать заражение.
[0047] В настоящем документе термин «реакция», «процент реакции» или «% реакции» в контексте инфекционности вакцины определяется как субъект, у которого была выявлена положительная реакция на апикомплексную инфекцию, включая, но не ограничиваясь этим, Eimeria, после вакцинации.
[0048] В настоящем документе подразумевается, что единственное число включает также множественное число, если контекст явно не указывает иное. Кроме того, следует понимать, что термины «содержит» и/или «содержащий» В процессе эксплуатации в настоящем документе определяют наличие указанных функций, этапов, операций, элементов и/или компонентов, но не исключают присутствие или добавление одной или более других функций, этапов, операций, элементов, компонентов и/или их групп. Настоящее описание может подходящим образом «включать», «состоять из» или «состоять по существу из» этапов, элементов и/или реагентов, описанных в формуле изобретения.
[0049] Кроме того, следует отметить, что формула изобретения может быть составлена так, чтобы исключить любой необязательный элемент. Таким образом, данное утверждение предназначено для использования в качестве предшествующей основы для применения такой исключающей терминологии, как «исключительно», «только» и т.п. в связи с перечислением элементов формулы изобретения или использованием «отрицательного» ограничения.
[0050] В настоящем документе термин «и/или» включает любые и все комбинации одного или более связанных перечисленных элементов. В настоящем документе фразы, такие как «от X до Y» и «от примерно X до Y», следует интерпретировать как включающие X и Y. В настоящем документе фразы, такие как «от примерно X до Y», означают «от примерно X до примерно Y». В настоящем документе фразы, такие как «от примерно X до Y», означают «от примерно X до примерно Y».
[0051] Если не указано иное, все термины (включая технические и научные термины), применяемые в настоящем описании, имеют то же значение, которое обычно понимают специалисты в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Далее будет понятно, что термины, такие как те, которые определены в обычно используемых словарях, должны интерпретироваться как имеющие значение, которое согласуется с их значением в контексте настоящего описания и соответствующей области техники, и не должны интерпретироваться в идеализированном или чрезмерно формальном смысле, если это не определено в настоящем документе. Хорошо известные функции или конструкции могут не описываться для краткости и/или ясности. Последовательность операций (или этапов) не ограничивается порядком, представленным в формуле изобретения или фигурах, если специально не указано иное.
[0052] В настоящем документе термины «примерно» и/или «приблизительно» можно применять в сочетании с числовыми значениями и/или диапазонами. Под термином «примерно» понимаются значения, близкие к приведенному значению. Например, «примерно 40 [единиц]» может означать в пределах ±25% от 40 (например, от 30 до 50), в пределах ±20%, ±15%, ±10%, ±9%, ±8%, ±7%, ±6%, ±5%, ±4%, ±3%, ±2%, ±1%, менее чем ±1% или любое другое значение или диапазон значений в нем или ниже. В качестве альтернативы, в зависимости от контекста, термин «примерно» может означать ± половину стандартного отклонения, ± одно стандартное отклонение или±два стандартных отклонения. Кроме того, фразы «примерно меньше [значение]» или «больше примерно [значение]» следует понимать с учетом определения термина «примерно», приведенного в настоящем документе. Термины «примерно» и «приблизительно» можно использовать взаимозаменяемо.
[0053] В настоящем описании для некоторых количеств указаны числовые диапазоны. Следует понимать, что эти диапазоны включают все внутренние диапазоны. Таким образом, диапазон «от 50 до 80» включает в себя все возможные диапазоны (например, 51-79, 52-78, 53-77, 54-76, 55-75, 60-70 и т.д.). Более того, все значения в пределах данного диапазона могут быть конечной точкой для охваченного им диапазона (например, диапазон 50-80 включает диапазоны с конечными точками, такими как 55-80, 50-75 и т.д.).
[0054] Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют те же значения, которые обычно понимают специалисты в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Описаны предпочтительные способы, устройства и материалы, хотя любые способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в настоящем документе, могут быть использованы на практике или при тестировании настоящего изобретения. Все ссылки, цитируемые в настоящем документе, полностью включены в качестве ссылок.
5.2. КОНКРЕТНЫЕ ВАРИАНТЫ РЕАЛИЗАЦИИ
5.2.1. Первый вариант реализации - гомогенизация высокого давления
[0055] Первый вариант реализации 10 показан на фиг.2. Первый вариант реализации 10 включает первый резервуар 12. Первый резервуар 12 выполнен с возможностью хранения объема раствора 14. Раствор 14 включает суспензию вакцины (не показана) в растворе. Раствор 14 согласно первому варианту реализации 10 содержит вакцину на основе ооцист видов Eimeria для доставки домашней птице, а именно суточным вылупившимся птенцам. Необязательно раствор 14 включает протеолитические ферменты. Протеолитические ферменты позволяют более эффективно поглощать вакцину в пищеварительном тракте вылупившегося птенца, что будет более подробно объяснено ниже.
[0056] Что касается раствора 14, варианты реализации, описанные в настоящем документе, включают, без ограничения перечисленными, ооцисты Eimeria и выбраны из группы, инфицирующей цыплят, состоящей из ооцист E. maxima, ооцист E. mitis, ооцист E. tenella, ооцист E. acervulina, ооцист E. brunetti, ооцист E. necatrix, ооцист E. praecox, ооцист E. hagani, ооцист E. mivati и любой их комбинации; ооцисты Eimeria, выбранные из группы, инфицирующей индеек, состоящей из ооцист E. meleagrimitis, ооцист E. adenoides, ооцист E. gallopavonis, ооцист E. dispa, ооцист E. innocua, ооцист E. meleagridis и ооцист E. subrotunda и любой их комбинации; ооцисты Eimeria, выбранные из группы, инфицирующей крупный рогатый скот, состоящей из ооцист E. zuernii, ооцист E. bovis, ооцист E. ellipsoidalis и любой их комбинации; ооцисты Eimeria, выбранные из группы, состоящей из ооцист E. ahsata, ооцист E. bakuensis, ооцист E. crandallis, ооцист E. faurei, ооцист E. granulosa, ооцист E. intricata, ооцист E. marsica, ооцист E. ovinoidalis, ооцист E. pallida, ооцист E. parva, ооцист E. weybridgensis и любой их комбинации; и ооцисты Eimeria, выбранные из группы, состоящей из ооцист E. intestinalis, ооцист E. vejdovskyi, ооцист E. piriformis, ооцист E. coecicola, ооцист E. irresidua, ооцист E. flavescens, ооцист E. exigua, ооцист E. magna, ооцист E. perforans, ооцист E. media, ооцист E. stiedae и любой их комбинации.
[0057] Приведенные в настоящем документе варианты реализации относятся к системам и способам высвобождения спороцист из ооцист. Ооцисты могут представлять собой ооцисты простейших, которые инфицируют любого животного, включая млекопитающих и птиц.
[0058] Некоторые варианты реализации, описанные в настоящем документе, также могут относиться к способам высвобождения спорозоитов из ооцист простейших. Хотя данное применение направлено на Eimeria, некоторые другие простейшие образуют стадию жизни, обозначенную как «ооциста», но могут содержать спорозоиты в ооцисте и не продуцировать спороцисты. Варианты реализации можно применять на практике для высвобождения спорозоитов из ооцист паразита любого вида, который содержит спорозоиты в ооцисте, и могут включать любые организмы типа Apicomplexa, и будут также включать, но не ограничиваясь ими, Cryptosporidium и Plasmodium. Термины «простейшие», «ооциста», «спороциста», «спорозоит» и «мерозоит» имеют свои общепринятые значения в данной области техники. Если не указано иное, эти термины предназначены для обозначения живых (т.е. жизнеспособных) простейших, ооцист, спороцист, спорозоитов и мерозоитов, включая формы дикого типа или аттенуированные формы. Также они охватывают генетически модифицированные простейшие, ооцисты, спороцисты, спорозоиты и мерозоиты.
[0059] Возвращаясь к фиг.2 и первому варианту реализации 10, впуск 16 первого резервуара прикреплен к верхней части первого резервуара 12. Впуск 16 первого резервуара принимает раствор 14 в первый резервуар 12. Выпуск 18 первого резервуара прикреплен к первому резервуару 12. Выпуск 18 первого резервуара соединен с насосом 20 системы. Насос 20 выполнен с возможностью перемещения раствора 14 из первого резервуара 12 через систему.
[0060] Выпуск 22 насоса закреплен между насосом 20 и системой 24 обработки. Система 24 обработки согласно первому варианту реализации 10 представляет собой гомогенизатор 32 высокого давления. Гомогенизатор 32 включает источник 26 высокого давления, управляемый клапаном 28 давления, и по меньшей мере одно отверстие 34, показанное на фиг.3. Система 24 обработки дополнительно включает выпуск 38 системы обработки, показанное на фиг.2. Выпуск 38 системы обработки расположен в системе обработки на конце, противоположном впуску 36 системы обработки. Выпуск 38 системы обработки соединен со вторым резервуаром 40 посредством впуска 42 второго резервуара. Второй резервуар 40 выполнен с возможностью хранения объема раствора, поступающего через впуск 42 второго резервуара.
[0061] Второй резервуар 40 также включает выпуск 44 второго резервуара. Выпуск 44 резервуара находится в сообщении по текучей среде с устройством 46 доставки. В этом первом варианте реализации 10 устройство 46 доставки представляет собой мелкодисперсный распылитель. Устройство 46 доставки имеет отверстие 48 доставки, форсунку 50 и впуск 54 для воздуха в форсунке 50 для распыления струи спрея во время доставки. Впуск 54 для воздуха находится в сообщении по текучей среде с источником 56 воздуха под давлением. В качестве альтернативы устройство 46 доставки может представлять собой гидравлическую распылительную форсунку или подобное.
[0062] В процессе эксплуатации насос 20 приводится в действие для перемещения раствора 14 из первого резервуара 12 через выпуск 18 первого резервуара в систему 24 обработки через впуск 36 системы обработки. Хотя для перемещения раствора применяют насос, другие способы, включая гравитацию, клапаны, давление воздуха и другие способы, можно применять для перемещения жидкости в любом из вариантов реализации. Воздух под высоким давлением, подаваемый гомогенизатором 32 высокого давления, применяют для перемещения раствора 14 через по меньшей мере одно отверстие 34. Воздух под высоким давлением составляет более 500 psi (фунтов на кв. дюйм) и предпочтительно в диапазоне от 500 до 6000 psi.
[0063] Когда раствор 14 движется через отверстие 34 под высоким давлением, ооцисты подвергаются сдвиговому усилию, и мембрана ооцисты разрушается или разрывается. После того, как раствор 14 проходит через отверстие 34, он выходит из гомогенизатора 32 через выпуск 38 и перемещается через впуск 42 во второй резервуар 40. Каждая ооциста, мембрана которой разрушена или разорвана, приведет к высвобождению свободных спороцист в модифицированный раствор 52. Модифицированный раствор 52 (комбинация высвободившихся спороцист и остаточных ооцист) временно хранят во втором резервуаре 40 до доставки.
[0064] Когда модифицированный раствор 52 готов к доставке, модифицированный раствор перекачивают из второго резервуара 40 через выпуск 44 второго резервуара во впуск 48 для доставки. Модифицированный раствор 52 закачивают в форсунку 50 и смешивают с воздухом под давлением из источника 56 воздуха под давлением. Воздух под давлением распыляет модифицированный раствор 52 в форсунке 50 с доставкой заданного объема модифицированного раствора в форме заданного профиля распыления к конкретной мишени на животном.
[0065] В альтернативном варианте гомогенизатор 32 высокого давления может быть напрямую соединен с устройством 46 доставки. Таким образом, раствор, производимый гомогенизатором 32, доставляется непосредственно через устройство 46 доставки, а не временно хранится во втором резервуаре 40.
[0066] Следует отметить, что описанные в настоящем документе варианты реализации, касающиеся разрушения ооцист, предназначены для доставки в режиме реального времени. Любой вакцине, изготавливаемое на основе спороцист, требуется криопротекторный состав для поддержания жизнеспособности спороцист для длительного хранения и реализация холодовой цепи с жидким азотом для доставки. Описанные в настоящем документе варианты реализации, касающиеся разрушения мембран ооцист для высвобождения жизнеспособных спороцист, не требуют криопротекторных растворов или каких-либо других специальных условий хранения, таких как криоконсервация.
[0067] Профиль распыления направляют таким образом, чтобы он контактировал с животным в заранее определенном месте. Настоящие системы предназначены для воздействия на слизистую оболочку морды животного, в частности, глаза или рот. См. публикацию PCT WO 2017/083663Al, Karimpour. Однако следует понимать, что профиль распыления может быть выполнен с возможностью нацеливания на другие части тела животного. Хотя понятно, что варианты реализации, описанные в настоящем документе, могут быть применимы ко всем животным, основное внимание уделяется доставке Eimeria, которая поражает домашнюю птицу, в частности, цыплятам, и, более конкретно, суточным вылупившимся птенцам. Свободные спороцисты в модифицированном растворе способны быстро проникать в пищеварительный тракт вылупившегося птенца. Спороцисты, попавшие в глаза, носовые ходы или рот птицы, попадают в пищеварительный тракт. Спороцисты, которые распыляют на другие части тела птицы, такие как перья, могут попасть в пищеварительный тракт при уходе за оперением, в том числе при самостоятельном уходе за оперением и уходе за оперением других птиц.
[0068] Протеолитические ферменты в кишечном тракте, включая, например, трипсин или химотрипсин, расщепляют тельца Штида на конце спороцисты, обеспечивая выход из цисты инфекционных спорозоитов. Это позволяет цыпленку быстро заразиться Eimeria и, таким образом, развить иммунный ответ.
[0069] Следует понимать, что гомогенизатор 24 высокого давления (или другая технологическая система, подробно описанная ниже) не обязательно должна быть подключена к системе, что позволяет производить обработку в автономном режиме и осуществлять доставку в емкость 40. Получение вакцины с помощью гомогенизатора 24 высокого давления или других систем может происходить вне системы доставки спрея, но в реальном времени одновременно с подготовкой вакцины для доставки в инкубатор.
5.2.2. Второй вариант реализации - обработка шариками
[0070] Второй вариант реализации 60 настоящего изобретения показан на фиг.4. Части, аналогичные первому варианту реализации 10, будут показаны с аналогичными ссылочными значениями. Второй вариант реализации 60 включает первый резервуар 12, имеющий впуск 16 и выпуск 18 и содержащий некоторый объем раствора 14. Второй вариант реализации 60 также включает насос 20 и источник 26 давления.
[0071] Второй вариант реализации 60 дополнительно включает вторую систему 62 обработки. Вторая система 62 обработки включает сосуд 64, выполненный с возможностью удерживания некоторого объема 14. Сосуд 64 имеет впуск 36 и выпуск 38. Сосуд 64 также содержит некоторый объем средств для перемешивания 70, таких как стеклянные, керамические или металлические шарики и т.п. Следует отметить, что средства для перемешивания 70 могут представлять собой сферические шарики или любой другой формы и материала, которые при перемешивании в объеме обладают способностью дробить, разбивать или иным образом разрушать любой раствор, содержащийся в объеме. Сосуд 64 установлен горизонтально, вертикально или под некоторым углом с возможностью вращения вокруг своей оси. Сосуд 64 соединен с вращающим устройством 72, которое выполнено с возможностью вращения сосуда 64 вокруг его горизонтальной оси. Вращающее устройство 72 также имеет функцию вибрации, которая позволяет ему вибрировать или трясти сосуд при активации. В процессе эксплуатации раствор 14 после воздействия средств для перемешивания в сосуде 64 приводит к получению второго модифицированного раствора 74, который будет более подробно описан ниже.
[0072] Выпуск 38 второй системы 62 обработки соединен со вторым резервуаром 40 посредством впуска 42. Как и в первом варианте реализации 10, выпуск 44 второго резервуара соединен с устройством 46 доставки, откуда в конечном итоге осуществляется доставка животному.
[0073] Устройство 46 доставки включает впуск 48, имеющий клапан для управления потоком второго модифицированного раствора 74 во впуск 48. Следует отметить, что устройство 46 доставки может быть изменено для изменения профиля распыления для обеспечения большего или меньшего распыления или обеспечения постоянного потока жидкости из форсунки 50 непосредственно к животному.
[0074] Альтернативная схема для второго варианта реализации 60 аналогична альтернативной схеме, описанной выше в отношении первого варианта реализации 10. Предполагается, что второй вариант реализации 60 может быть выполнен с возможностью подачи второго модифицированного раствора 74 непосредственно к форсунке 50 и, таким образом, устраняет необходимость во втором резервуаре 40.
[0075] При применении, когда насос 20 и источник 26 давления активированы, насос перемещает раствор 14 из первого резервуара 12 через выпуск 18 резервуара во вторую систему 62 обработки. Вторая система 62 обработки вращается вдоль своей оси с помощью вращающего устройства 72. Кроме того, вращающее устройство 72 заставляет сосуд 64 вибрировать и/или трястись. Вибрация и вращение заставляют средства для перемешивания 70 ударяться и отскакивать от внутренних стенок сосуда, вызывая разрушение по меньшей мере некоторых мембран ооцист в растворе и, таким образом, высвобождение содержащихся в них спороцист. Разрушенные мембраны ооцист и жизнеспособные спороцисты в растворе 14 образуют второй модифицированный раствор 74. Полученный второй модифицированный раствор 74 перекачивают из сосуда 64 во второй резервуар 40, где его временно содержат до осуществления доставки.
[0076] Когда наступает время доставки, второй модифицированный раствор 74 перекачивают из второго резервуара 40 в устройство 46 доставки. Второй модифицированный раствор 74 перекачивают из впуска 48 устройства доставки в форсунку 50 и смешивают с воздухом под давлением из источника 56 воздуха под давлением. Воздух под давлением распыляет второй модифицированный раствор 74 в форсунке 50, чтобы доставить заданный объем модифицированного раствора 74 в форме заданного профиля распыления к конкретной цели на животном, в настоящем варианте реализации - суточному птенцу.
[0077] В альтернативной схеме второго варианта реализации 60 второй модифицированный раствор 74 перекачивают непосредственно из сосуда 64 в форсунку 50 и на лицевую слизистую оболочку суточного птенца. Птенец поглощает недавно разрушенные мембраны ооцист и высвободившиеся спороцисты, и они быстро заражают пищеварительный тракт. Птенец способен быстро развить иммунный ответ на Eimeria и оставаться здоровым.
5.2.3. Третий вариант реализации - Обработка ультразвуком
[0078] Третий вариант реализации 80 является аналогичным первому 10 и второму 60 вариантам реализации, описанным выше, за исключением системы 81 обработки согласно третьему варианту реализации. Третий вариант реализации 80, показанный на фиг.5, включает первый резервуар 12 и насос 20. Третий вариант реализации 80 дополнительно включает ультразвуковой зонд 110 внутри сосуда 112. Ультразвуковой зонд 110 дополнительно включает источник питания (не показан). Обработка ультразвуком может происходить с помощью зонда, помещенного непосредственно в раствор, или с помощью непрямого источника, размещенного снаружи сосуда. Непрямой источник может представлять собой такую обработку ультразвуком в ванне, заполненной водой. Термин ультразвуковой прибор включает ультразвуковые зонды и непрямые источники, расположенные вне сосуда.
[0079] Ооцисты в жидкой суспензии в растворе 14 проходят через сосуд 112 в непосредственной близости от ультразвукового зонда 110, который при активации вибрирует. Предпочтительный диапазон вибрации составляет от 18 кГц до 1 МГц. Итоговая энергия, сообщаемая раствору 14, вызывает циклы кавитации, которые разрушают, по меньшей мере, некоторые мембраны ооцист. Частота колебаний и скорость потока через систему контролируются таким образом, что мембраны ооцист разрушаются, в то время как жизнеспособные спороцисты выходят из сосуда 112 неповрежденными. Полученный раствор 114 согласно третьему варианту реализации либо доставляют непосредственно в устройство 46 доставки, такое как распылитель, либо в емкость для хранения, такую как второй резервуар 40, как описано выше в отношении первого 10 и второго 60 вариантов реализации и их альтернатив.
[0080] В альтернативной схеме третьего варианта реализации 80 третий модифицированный раствор 114 перекачивают непосредственно из сосуда 112 в форсунку 50 и на лицевую слизистую оболочку суточного птенца. Птенец поглощает недавно высвободившиеся спороцисты и оставшиеся ооцисты, и они быстро заражают пищеварительный тракт. Птенец способен быстро развить иммунный ответ на Eimeria и оставаться здоровым.
[0081] Множество коммерческих поставщиков предлагают ультразвуковые устройства с различными конфигурациями. Примеры поставщиков включают Qsonica (Newton, CT) и Hielscher Ultrasonics GMBH (Teltow, Германия).
5.2.4. Четвертый вариант реализации - Роторно-статорный смеситель
[0082] В четвертом варианте реализации 120 применяют систему 116 обработки с роторно-статорным смесителем внутри емкости 122, и она показана на фиг.6. Роторно-статорный смеситель 116 имеет диспергирующую головку или генератор 124, который вращается с высокой скоростью. Четвертый вариант реализации 120 также включает первый резервуар 12, насос 20 и устройство 46 доставки, сообщающееся по жидкой среде с роторно-статорным смесителем 116.
[0083] В процессе эксплуатации роторно-статорный смеситель 116 приводится в действие, что заставляет диспергирующую головку или генератор 124 вращаться с высокой скоростью. Смеситель 116 принимает раствор 14 из первого резервуара 12. Раствор 14 подвергается воздействию диспергирующей головки или генератора 124, вращающегося с высокой скоростью. Это вызывает сдвиг по меньшей мере некоторой части мембран ооцист в результате сил, создаваемых внутри смесителя 116, высвобождая, таким образом, по меньшей мере часть спороцист. Полученный раствор 118 перемещается к устройству 46 доставки, где он доставляется животному. Как обсуждалось выше, альтернативная схема для четвертого варианта реализации 120 реализации будет включать второй резервуар 40 для приема раствора 118, который впоследствии доставляется суточному птенцу.
5.2.5. Пятый вариант реализации - Вибрирующие пластины
[0084] Пятый вариант реализации 140 показан на фиг.7 и является аналогичным первому 10, второму 60, третьему 80 и четвертому 120 вариантам реализации, описанным выше, за исключением системы 146 обработки. Пятый вариант реализации 140 включает первый резервуар 12 и насос 20. Пятый вариант реализации 140 включает пятую систему 146 обработки внутри защитной оболочки 147, состоящую из пары пластин 144, 145. Пластины 144, 145 установлены друг на друга с некоторым пространством между ними. Первая пластина 144 является плоской и соединена с механизмом вибрации (не показан). Механизм вибрации заставляет пластину 144 вибрировать. Вторая пластина 145 может иметь разную степень гладкости или шероховатости, если это необходимо для разрушения мембран ооцист во время их прохождения между пластинами 144 и 145. Когда пластины 144, 145 находятся друг над другом, вторая пластина 145 контактирует с первой пластиной 144.
[0085] В процессе эксплуатации раствор 14 перемещается в пятую систему 146 обработки. Между пластинами 144, 145 направляется поток раствора 14. Вибрационный механизм активируется, заставляя первую пластину 144 вибрировать относительно второй пластины 145. По мере того как раствор 14 перемещается между пластинами 144, 145, по меньшей мере некоторые мембраны ооцист в растворе 14 разрушаются, когда они проходят между двумя пластинами, образуя модифицированный раствор 148. Модифицированный раствор 148 доставляют либо непосредственно в устройство 46 доставки, либо в емкость для хранения, такую как второй резервуар 40.
5.3. Шестой вариант реализации - Гидродинамическая кавитация
[0086] Шестой вариант реализации 150 описывает способ испарения, образования пузырьков и схлопывания пузырьков, который происходит в жидкости в результате снижения и последующего увеличения местного давления. Кавитация (явление, при котором быстрые изменения давления в жидкости приводят к образованию небольших заполненных паром полостей, которые могут разрушаться при воздействии повышенного давления) произойдет, если давление упадет ниже давления насыщенного пара жидкости, и затем восстановится выше точки парообразования. Это можно осуществить, пропустив жидкость через суженный канал. Процесс образования пузырьков и последующее образование и схлопывание кавитационных пузырьков приводит к высокой плотности энергии и давлению на поверхности пузырьков. В первоначальных исследованиях изучалась кавитация с азотом, но для получения аналогичных результатов можно было применять любой газ. В этом примере азот растворяется в цитоплазме организма-мишени (Eimeria) под давлением. После достижения равновесия с окружающей средой целевую суспензию резко подвергают изменению давления, в результате чего в цитоплазме Eimeria образуются пузырьки азота. Процесс образования внутриклеточных пузырьков и последующего расширения пузырьков заставляет клеточную мембрану растягиваться и в конечном итоге разрываться. Эти пузырьки повреждают внешнюю часть клетки в результате вспенивания (выход газа из водного раствора в результате падения давления, которое может привести к образованию пены, а также к лизису клеток). При тестировании на многовидовой суспензии ооцист Eimeria наблюдался лизис внешней стенки ооцисты и последующее высвобождение внутренних спороцист. Этот процесс обычно происходит в сосуде под давлением. Сосуд состоит из толстого корпуса из нержавеющей стали, способного выдерживать высокое давление, с впуском для подачи газа и выпуском с регулируемым выпускным клапаном.
[0087] Шестой вариант реализации 150 показан на фиг.8 и является аналогичным первому 10, второму 60, третьему 80, четвертому 120 и пятому 140 вариантам реализации, описанным выше, за исключением шестой системы 154 обработки. Шестой вариант реализации 150 включает первый резервуар 12 и насос 20. Шестой вариант реализации 150 включает шестую систему 154 обработки, состоящую из находящейся под давлением металлической оболочки 152 и впуска 156 для газа. Металлический корпус 152 под давлением соединен с баллоном 160 источником газа через заправочный патрубок 158. Газ проходит через заправочный патрубок 158 во впуск 156, где он насыщает водный раствор, присутствующий (не показан) внутри металлического корпуса 154. Раствор входит в корпус через впуск 36 аналогично предыдущим вариантам реализации. Регуляторы (не показаны) применяют для управления результирующим давлением газового потока для достижения оптимального насыщения.
[0088] В процессе эксплуатации раствор 14 перемещается в шестую систему 154 обработки. Шестую систему 154 обработки затем герметизируют и помещают под давление. Когда из резервуара 160 поступает азот в герметичный резервуар 152 под давлением, азот растворяется в цитоплазме ооцист под давлением. После достижения равновесия с окружающей средой поток азота из резервуара 160 перекрывают, и корпус 152 разгерметизируют. Гидродинамическая кавитация возникает в цитоплазме ооцист вследствие резкого изменения давления, вызывая нарушение по меньшей мере некоторой части внешних мембран и высвобождение внутреннего содержимого, а именно спороцист. Это обеспечивает получение модифицированного раствора 162, который либо доставляют непосредственно в устройство 46 доставки, либо в емкость для хранения, такую как второй резервуар 40.
5.4. Седьмой вариант реализации - распыление с помощью высокого давления
[0089] Способ разрушения ооцист и высвобождения интактных спороцист может включать распыление суспензии ооцист с высокой скоростью на статический объект, благодаря чему сила удара разрушает стенку ооцисты с высвобождением жизнеспособных спороцист. Кроме того, суспензия ооцист может быть распылена на движущуюся цель, такую как вращающийся диск, благодаря чему комбинация встречных сил разрушает ооцисты. Скорость распыляемой суспензии и скорость вращающегося диска можно регулировать, чтобы обеспечить оптимизацию процесса разрушения. Поверхность вращающегося диска может быть модифицирована для получения различной степени гладкости или шероховатости, необходимой для разрушения ооцист.
[0090] Седьмой вариант реализации 170 показан на фиг.9 и является аналогичным первому 10, второму 60, третьему 80, четвертому 120, пятому 140 и шестому 150 вариантам реализации, описанным выше, за исключением седьмой системы 172 обработки. Седьмой вариант реализации 170 включает первый резервуар 12 и насос 20. Седьмой вариант реализации 170 включает седьмую систему 172 обработки, содержащую форсунку 178 или другую систему для подачи струи или потока жидкости под высоким давлением. Жидкость выпускается из форсунки и ударяется либо о твердую неподвижную поверхность, например, стенку сосуда 174, либо о вращающуюся пластину 176.
[0091] В процессе эксплуатации раствор 14 перемещается в седьмую систему 172 обработки. Поток раствора 14 направляют через форсунку 178. Сила удара раствора 14 о стенку сосуда 174 или вращающуюся пластину 176 приведет к разрушению по меньшей мере некоторой части мембран ооцист, образуя модифицированный раствор 180. Модифицированный раствор 180 доставляют либо непосредственно в устройство 46 доставки, либо в емкость для хранения, такую как второй резервуар 40.
5.5. Дополнительные варианты реализации
[0092] Кроме того, следует понимать, что хотя в описанных выше вариантах реализации насосы часто упоминаются как средства для перемещения раствора через систему, предполагается, что также можно применять другие устройства, такие как воздух под высоким давлением и гравитационная подача.
[0093] Кроме того, следует понимать, что хотя данные варианты реализации сосредоточены на растворах на основе ооцист и спороцист, описанные в настоящем документе растворы могут содержать другие живые вакцины, включая вакцины, содержащие вирусы, бактерии, дрожжи, клетки млекопитающих, клетки растений или любые генетически модифицированные организмы. Для специалиста в данной области должно быть очевидно, что растворы, содержащие любой такой вирус, бактерии и т.п., могут лучше подходить для одного варианта реализации, чем для другого, на основании конкретных характеристик вакцины.
[0094] Система и способы, описанные в настоящем документе, демонстрируют, что повышенная эффективность вакцинного ответа может быть достигнута с применением спороцист, недавно высвобожденных из треснувших ооцист и впоследствии доставленных посредством распыления для инициации инфекции Eimeria. Проведена серия экспериментов с применением описанных выше систем и способов. Результаты представлены ниже. Преимущества получения спороцисты во время вакцинации и доставки вакцины на основе спороцисты по сравнению с вакциной на основе ооцист оказались неожиданно положительными и дали более высокие, чем ожидалось, ответы у реципиентов.
[0095] Следует принимать во внимание, что хотя описанный в настоящем документе раствор представляет собой вакцину на основе ооцист Eimeria, предполагается, что могут существовать и другие вакцины на основе ооцист, которые также могут быть доставлены с применением системы и способов, описанных в настоящем документе. В то время как предпочтительные варианты реализации в первую очередь относятся к вакцинам Eimeria для кур и индеек, рядовой специалист распознает другие варианты реализации, относящиеся к вакцинам Eimeria для млекопитающих, таких как крупный рогатый скот, козы, кролики или овцы. Более того, раскрытые в настоящем документе способы применимы для улучшенных апикомплексных вакцин для любых видов, независимо от того, являются ли такие вакцины дикого типа или аттенуированными.
[0096] Раскрытые в настоящем документе системы и способы могут быть адаптированы для применения в аквакультуре. Примеры Eimeria, которые инфицируют рыб, включают, без ограничения перечисленными, E. aurati, E. baueri, E. lepidosirenis, E. leucisci, E. rutili и E. vanasi. К этим видам можно применять способы разрыва, где это применимо, для облегчения высвобождения большего количества инфекционных стадий жизни с целью вакцинации.
[0097] Следует также отметить, что все варианты реализации, описанные в настоящем документе, можно применять к животному индивидуально или в массе. Следует понимать, что варианты реализации, описанные в настоящем документе, можно применять к большой группе вылупившихся птенцов или других животных, содержащихся в клетке или другом контейнере и подлежащих получению водного раствора. Доставка может быть в форме двухкомпонентного водного раствора, который при смешивании образует гель. См. заявку РСТ с серийным номером ______, поданную 10 июля 2019 г. автором изобретения James Hutchins, Atty. Dkt. 673-04-PCT.
5.6. Eimeria в качестве вектора для доставки рекомбинантных белков
[0098] Раскрытые в настоящем документе способы и системы можно применять с рекомбинантно модифицированной Eimeria, которая служит в качестве вектора для доставки другого антигена(ов). Вакцины для птиц или других животных, содержащие разрушенные клеточные материалы, можно вводить с помощью систем и способов, описанных в настоящем документе, включая вакцины, полученные из инфицированных вирусом клеток, или вакцины, полученные из клеточных линий, используемых для получения природных или рекомбинантных белковых продуктов или субклеточных фрагментов, таких как клетки млекопитающих, клетки растений, клетки грибов, клетки дрожжей или клетки бактерий.
[0099] Недавние исследования показывают, что Eimeria может быть успешно трансфицирована и использована для экспрессии чужеродных антигенов. Можно было ожидать, что такие антигены могут включать вирусные, бактериальные или другие антигены заболеваний, поражающих домашнюю птицу, или другие белки или последовательности для стимуляции иммунной системы, которые будут использоваться отдельно или в комбинации с антигенами. Кроме того, могут быть экспрессированы антигены от других видов Eimeria, что обеспечивает развитие перекрестной защиты для нескольких видов Eimeria при введении Eimeria одного вида. Например, Clark et al. показали результаты, демонстрирующие, что паразиты Eimeria могут быть предложены в качестве мультивалентных вакцинных векторов, и способствуют расширению этих исследований. См. Clark et al., 2012, Eimeria species parasites as novel vaccine delivery vectors: Anti-Campylobacter jejuni protective immunity induced by Eimeria tenella-delivered CjaA, Vaccine 30(16) 2683-2688; Yan et al., 2009, Stable transfection of Eimeria tenella: Constitutive expression of the YFP-YFP molecule throughout the life cycle, Int’l Journal for Parasitology, 39(1) 109-117; and Marugan-Hernandez et al., 2016, Viral proteins expressed in the protozoan parasite Eimeria tenella are detected by the chicken immune system, Parasites & Vectors 9:463 (pub. Aug. 26, 2016, 14 pages). Точно так же Eimeria или другие апикомплексы могут быть сконструированы как векторы для доставки других антигенов к конкретным хозяевам.
[00100] Следующие ниже примеры дополнительно иллюстрируют изобретение и не предназначены для ограничения объема. Следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными описанными вариантами реализации, поскольку они, конечно, могут варьироваться. Также следует понимать, что терминология, используемая в настоящем документе, предназначена только для описания конкретных вариантов реализации и не предназначена для ограничения, поскольку объем настоящего изобретения будет ограничен только прилагаемой формулой изобретения.
6. ПРИМЕРЫ
6.1. Зондовое введение (Ооцисты относительно спороцист)
[00101] Пероральное зондовое введение (гаваж), доставка через рот, считается золотым стандартом доставки ооцист птице. В исследованиях с применением коммерческой вакцины для бройлеров результаты при пероральном введении через зонд оказались более изменчивыми, чем ожидалось. В частности, приведенные ниже результаты показали, что инфекционность ооцист, доставленных через зонд, сильно варьировалась в зависимости от вида Eimeria и в разные даты испытаний. Это наблюдение привело авторов изобретения к тестированию введения в глаза (глазные капли) в качестве альтернативного средства доставки для положительного контроля. Кроме того, разрушение ооцист с целью высвобождения спороцист оказалось более эффективным при доставке через зонд. Разрушение мембраны ооцисты осуществлялось путем ручного встряхивания суспензии многовидовых ооцист с 4-миллиметровыми стеклянными шариками. Можно предположить, что суточных птенцов нужно кормить через зоб, чтобы разрушить ооцисты. В экспериментальных условиях и в обычных условиях инкубатора вылупившиеся птенцы не получают пищи в течение 3-8 часов из-за хранения и транспортировки, что позволяет ооцистам проходить через кишечник в наивном виде. Вакцинация с помощью глазных капель может замедлить движение ооцист, достигающих кишечника, и может подвергнуть ооцисты воздействию различных ферментов.
[00102] Механическое разрушение мембран ооцист перед вакцинацией позволяет упростить обработку спороцист, в результате чего эффективно вакцинируется больший процент птиц, а также более высокий уровень продукции (выхода) ооцист обнаруживают на 7 день. Это кажется более важным для более крупных видов, таких как E. maxima, и средних видов, таких как E. tenella, чем для более мелких видов, например, E. acervulina. Более мелкие виды, по-видимому, являются в одинаковой степени инфекционными, будучи разрушенными или нет. Исследования были сосредоточены на разрушении мембран больших, а затем средних ооцист. Цыплят бройлеров вакцинировали в день вылупления однократной дозой коммерческой вакцины. Кишечное содержимое собирали у каждой птицы на 7 день, и ооцисты подсчитывали с помощью камер Макмастера по видам.
[00103] Таблица 1: Сравнение инфекционности при зондовом введении ооцист или спороцист
| Лечение | N | Процент инфицирования | ||
| # птиц | E. maxima | E. tenella | E. acervulina | |
| Зондовое введение ооцист | 9 | 70% | 80% | 90% |
| Зондовое введение ооцист | 15 | 93% | 93% | 100% |
| Зондовое введение ооцист | 15 | 53% | 53% | 60% |
| Зондовое введение ооцист | 15 | 60% | 67% | 93% |
| Зондовое введение ооцист | 15 | 73% | 67% | 100% |
| Зондовое введение ооцист | 14 | 79% | 93% | 100% |
| Зондовое введение ооцист | 16 | 25% | 25% | 81% |
| Зондовое введение ооцист | 15 | 87% | 93% | 100% |
| Зондовое введение спороцист | 15 | 100% | 100% | 100% |
| Глазные капли с ооцистами | 15 | 80% | 100% | 100% |
[00104] Со временем вакцинация через зонд приводила к непостоянной инфекционности, что определялось различающимися результатами на 7 день. Более обнадеживающие результаты были получены с вакциной, обработанной для высвобождения спороцист, а также с вакциной, доставляемой с помощью глазных капель.
6.2. Зондовое введение ооцист относительно спороцист
[00105] В другом эксперименте разрушение ооцист осуществляли путем ручного встряхивания суспензии многовидовых ооцист с 4-миллиметровыми стеклянными шариками. Подсчет оставшихся ооцист показал превращение приблизительно 64% ооцист E. maxima в спороцисты, 51% ооцист E. tenella в спороцисты и 17% ооцист E. acervulina в спороцисты. В день вылупления цыплят (15 на обработку) инокулировали ооцистами или спороцистами, высвобожденными с помощью стеклянных шариков, с остаточными ооцистами через пероральный зонд, и содержимое кишечника собирали на 7 день.
[00106] Таблица 2: Сравнение частоты и амплитуды ответа при зондовом введении ооцист или спороцист с остаточными ооцистами
| Лечение через желудочный зонд | Частота ответа (Инфицированные птицы/Вакцинированные птицы) |
Амплитуда ответа (Средний выход ооцист на птицу) |
||||
| E. maxima | E. tenella | E. acervulina | E. maxima | E. tenella | E. acervulina | |
| Ооцисты | 13/15 (87%) | 14/15 (93%) | 15/15 (100%) | 2,30 × 105 | 4,71 × 105 | 8,94 × 105 |
| Спороцисты | 15/15 (100%) | 15/15 (100%) | 15/15 (100%) | 3,41 × 105 | 8,68 × 105 | 1,08 × 106 |
| Улучшение | 13% | 7% | 0% | 1,48-кратно | 1,84-кратно | 1,21-кратно |
[00107] Показанное выше улучшение частоты ответа представляет собой разницу между процентом птиц, инфицированных обработкой спороцистами и ооцистами. Показанное улучшение амплитуды ответа представляет собой выход ооцист на птицу при обработке спороцистами, деленный на количество ооцист на птицу при обработке ооцистами.
[00108] В этом конкретном случае как частота ответа, так и амплитуда ответа были увеличены у цыплят, перорально вакцинированных спороцистной вакциной, содержащей остаточные ооцисты, по сравнению с вакциной на основе ооцист.
[00109] Различные уровни инфекционности, наблюдаемые у птиц после введения зонда, вызывают вопросы об эффективности вакцин на основе ооцист, вводимых в инкубаторе. У птиц, которым вводят вакцины на основе ооцист в инкубаторе, не хватает пищи и песка в пищеварительном тракте, что может быть особенно важным для обработки ооцист E. maxima до стадии спороцисты. В этом случае эти птицы будут подвергаться риску низкого уровня инфекционности E. maxima во время первой стадии заражения. Из этого следует, что во время второй стадии инфекции, в основном наивная популяция будет подвергаться риску чрезвычайно высокой инфекции и показателей выхода, с дополнительным риском вторичных бактериальных инфекций в поврежденных тканях кишечника. Действительно, такая ситуация часто имеет место и является одной из основных причин, по которой некоторые избегают вакцинации и вместо этого используют противококцидизоные средства и химические вещества в кормах. Применение вакцины на основе спороцист, вводимой в виде спрея для глаз в инкубаторе, может значительно улучшить инфекционность E. maxima во время первой стадии инфекции и, таким образом, избежать тяжелых кокцидиозных инфекций и риска вторичных инфекций во время второй стадии инфицирования на предприятии для выращивания.
6.3. Введение ооцист относительно спороцист с помощью глазных капель
[00110] В другом эксперименте разрушение мембраны ооцисты было выполнено путем ручного встряхивания суспензии многовидовых ооцист с 4-миллиметровыми стеклянными шариками. Подсчет оставшихся ооцист показал превращение приблизительно 52% ооцист E. maxima в спороцисты, 26% ооцист E. tenella в спороцисты и 47% ооцист E. acervulina в спороцисты. В день вылупления цыплят (15 на обработку) инокулировали ооцистами или спороцистами, высвобожденными с помощью стеклянных шариков, и остаточными ооцистами с помощью глазных капель, и содержимое кишечника собирали на 7 день.
[00111] Таблица 3: Сравнение частоты и амплитуды ответа при введении глазных капель ооцистной или спороцистной вакцины, содержащей остаточные ооцисты
| Обработка глазными каплями | Частота ответа (Инфицированные птицы/Вакцинированные птицы) |
Амплитуда ответа (Средний выход ооцист на птицу) |
||||
| E. maxima | E. tenella | E. acervulina | E. maxima | E. tenella | E. acervulina | |
| Ооцисты | 11/14 (79%) | 11/14 (79%) | 14/14 (100%) | 2,82 × 105 | 7,89 × 104 | 7,60 × 105 |
| Спороцисты | 15/15 (100%) | 15/15 (100%) | 15/15 (100%) | 7,14 × 105 | 3,06 × 105 | 5,66 × 105 |
| Улучшение | 21% | 21% | 0% | 2,5-кратно | 3,9-кратно | нет |
[00112] Было обнаружено, что группа обработки спороцистами обеспечивает получение улучшенных результатов как по частоте, так и по амплитуде ответа для E. maxima и E. tenella. В содержимом кишечника наивных контрольных птиц ооцист не наблюдалось.
6.4. Доставка спороцист посредством спрея
[00113] В следующей серии экспериментов высвобождение спороцист достигалось путем встряхивания многовидовой суспензии ооцист с 4-миллиметровыми стеклянными шариками вручную. Путем подсчета оставшихся ооцист было рассчитано, что с применением данного способа было преобразовано как минимум 66% больших ооцист (вид E. maxima) в спороцисты, 75% средних ооцист (вид E. tenella) в спороцисты и 13% мелких ооцист (E. acervulina и другие мелкие виды) в спороцисты. В день вылупления цыплят (15 на обработку) держали в неподвижном положении и опрыскивали из устройства наивными ооцистами либо спороцистами с высвобождением с применением стеклянных шариков, как описано выше. Спрей вводили через распылительную форсунку с применением жидкости и воздуха под давлением, направленного на лицевую слизистую оболочку цыпленка. Затем птицам обеспечили доступ к пище и воде, выращивали в течение 7 дней и затем умерщвляли для сбора содержимого кишечника каждой птицы. Ниже приведены таблицы данных, связанные с этими соответствующими экспериментами по вакцинации распылением.
[00114] Таблица 4: Частота и амплитуда ответа у птиц, обработанных ооцистами или спороцистами для исследования A
| Обработка | Частота ответа (Инфицированные птицы/Вакцинированные птицы) |
Амплитуда ответа (Средний выход ооцист на птицу) |
||||
| E. maxima | E. tenella | E. acervulina | E. maxima | E. tenella | E. acervulina | |
| Ооцисты | 7/15 (47%) | 11/15 (73%) | 13/15 (87%) | 2,74 × 104 | 2,40 × 104 | 5,66 × 104 |
| Спороцисты | 14/15 (93%) | 14/15 (93%) | 15/15 (100%) | 2,55 × 105 | 1,84 × 105 | 2,9 × 105 |
| Улучшение | 46% | 20% | 13% | 9,7-кратно | 7,7-кратно | 5,1-кратно |
[00115] Таблица 5: Частота и амплитуда ответа у птиц, обработанных ооцистами или спороцистами для исследования B
| Обработка | Частота ответа (Инфицированные птицы/Вакцинированные птицы) |
Амплитуда ответа (Средний выход ооцист на птицу) |
||||
| E. maxima | E. tenella | E. acervulina | E. maxima | E. tenella | E. acervulina | |
| Ооцисты | 5/15 (33%) | 9/15 (60%) | 15/15 (100%) | 7,39 × 104 | 2,70 × 104 | 7,32 × 104 |
| Спороцисты | 12/15 (80%) | 13/15 (87%) | 15/15 (100%) | 1,37 × 105 | 1,46 × 105 | 1,39 × 105 |
| Улучшение | 47% | 27% | 0% | 1,85-кратно | 5,4-кратно | 1,9-кратно |
[00116] Таблица 6: Частота и амплитуда ответа у птиц, обработанных ооцистами или спороцистами для C
| Обработка спреем | Частота ответа (Инфицированные птицы/Вакцинированные птицы) |
Амплитуда ответа (Средний выход ооцист на птицу) |
||||
| E. maxima | E. tenella | E. acervulina | E. maxima | E. tenella | E. acervulina | |
| Ооцисты | 10/15 (67%) | 11/15 (73%) | 13/15 (87%) | 1,10 × 105 | 2,27 × 105 | 1,60 × 105 |
| Спороцисты | 14/15 (93%) | 12/15 (80%) | 14/15 (93%) | 4,31 × 105 | 7,25 × 105 | 1,72 × 105 |
| Улучшение | 27% | 7% | 6% | 3,9-кратно | 3,2-кратно | 1,1-кратно |
[00117] Путем подсчета ооцист было обнаружено, что частота инфицирования и амплитуда ответа улучшились при обработке спороцистами.
[00118] Во всех трех экспериментах ооцисты не наблюдались в кишечном содержимом наивных контрольных птиц, а положительные контроли, инокулированные с помощью глазных капель, показали частоты и амплитуды инфекционности выше, чем у экспериментальных групп, обработанных спреем.
[00119] Следует принять во внимание, что результаты, представленные в таблицах 4, 5 и 6, были неожиданными. Результаты показывают, что у цыплят наблюдалось более высокий, чем ожидалось, ответ на вакцины при вакцинации спороцистами. Полагают, что это отчасти объясняется неспособностью цыпленка должным образом обрабатывать неразрушенные ооцисты в пищеварительном тракте. Заражение цыплят спороцистами указывает на то, что значительное количество цыплят можно обрабатывать и инфицировать спороцистами, но не ооцистами. Эффект больше заметен для E. maxima и E. tenella, чем для E. acervulina. Таким образом, считается, что из-за отсутствия абразивного материала в верхних отделах пищеварительной системы цыплят, включая зоб и мускульный желудок, ооцисты E. maxima и E. tenella не разрушаются легко. Спороцистам не требуется абразивный материал в пищеварительной системе цыплят для выхода спорозоитов из цист. Спороцисты легко преобразуются до стадии жизнедеятельности инфекционных спорозоитов ферментами, такими как протеазы, в пищеварительном тракте.
[00120] В другом эксперименте, где птиц вакцинировали в стационарных условиях, выращивали и умерщвляли на 7 день для сбора кишечного содержимого, наблюдали эффекты инокуляции спороцистами по сравнению с инокуляцией ооцистами. Однако в данном случае цыплят опрыскивали с помощью форсунки, использующей исключительно давление жидкости, а не давление жидкости и воздуха. Отсутствие давления воздуха обеспечивало распыление, аналогичное потоку жидкости, по сравнению с распылительной форсункой для вакцины. Результаты этого эксперимента можно увидеть в таблице ниже.
[00121] Таблица 7: Частота и амплитуда ответа у птиц, обработанных ооцистами или спороцистами без воздуха под давлением
| Обработка | Частота ответа (Инфицированные птицы/Вакцинированные птицы) |
Амплитуда ответа (Средний выход ооцист на птицу) |
||||
| E. maxima | E. tenella | E. acervulina | E. maxima | E. tenella | E. acervulina | |
| Ооцисты | 53/60 (88%) | 58/60 (97%) | 59/60 (98%) | 1,31 × 105 | 4,37 × 105 | 4,74 × 105 |
| Спороцисты | 15/15 (100%) | 15/15 (100%) | 15/15 (100%) | 3,80 × 105 | 4,78 × 105 | 6,63 × 105 |
| Улучшение | 12% | 3% | 2% | 2,91-кратно | 1,09-кратно | 1,40-кратно |
[00122] Ооцисты не наблюдались в кишечном содержимом наивных контрольных птиц, а положительные контроли, инокулированные с помощью глазных капель, показали частоты и амплитуды инфекционности выше, чем у экспериментальных групп, обработанных спреем. Частота ответа и амплитуда ответа были численно больше для E. maxima и в меньшей степени для E. tenella и E. acervulina. Эти результаты показывают, что независимо от формы распыления из форсунки, введение раствора спороцист с остаточными ооцистами обеспечивает улучшенные результаты по сравнению с таковыми для раствора ооцист.
[00123] Помимо ручной обработки ооцист для высвобождения спороцист применяли автоматизированный способ с применением устройства IKA Ultra Turrax (IKA®-Werke GmbH & Co., Штауфен, Германия) со стеклянными шариками. В объем вакцины добавляли стеклянные шарики (шарики из боросиликатного стекла, размер 1-6 мм) и обрабатывали в течение 20-240 секунд при 4000-8000 об/мин. Результаты по разрушению ооцист были эквивалентны ручным способам с улучшенной повторяемостью. Подсчет оставшихся ооцист после обработки посредством устройства IKA UTTD показал превращение приблизительно 76% ооцист E. maxima в спороцисты, 70% ооцист E. tenella в спороцисты и 46% ооцист E. acervulina в спороцисты. Эксперимент с применением цыплят-бройлеров по той же методике, как указано выше, обеспечил получение следующих результатов.
[00124] Таблица 8: Частота и амплитуда ответа для птиц, обработанных ооцистами или спороцистами с остаточными ооцистами, обработанными устройством IKA UTTD
| Обработка | Частота ответа (Инфицированные птицы/Вакцинированные птицы) |
Амплитуда ответа (Средний выход ооцист на птицу) |
||||
| E. maxima | E. tenella | E. acervulina | E. maxima | E. tenella | E. acervulina | |
| Ооцисты | 5/15 (33%) | 4/15 (27%) | 13/15 (87%) | 2,3 × 104 | 4,16 × 103 | 8,91 × 104 |
| Спороцисты | 11/14 (79%) | 11/14 (79%) | 12/14 (86%) | 2,83 × 105 | 2,70 × 105 | 1,2 × 105 |
| Улучшение | 46% | 52% | 0% | 12,3-кратно | 64,8-кратно | 1,2-кратно |
[00125] Ооцисты не наблюдались в кишечном содержимом наивных контрольных птиц, а положительные контроли, инокулированные с помощью глазных капель, показали частоты и амплитуды инфекционности выше, чем у экспериментальных групп, обработанных спреем. Частота ответа и амплитуда ответа были численно больше для E. maxima и E. tenella, и в меньшей степени для E. acervulina. Эти данные свидетельствуют о том, что устройство IKA UTTD может разрушить ооцисту для получения раствора спороцист/остаточных ооцист и обеспечивать результаты, аналогичные результатам способа с ручным встряхиванием. В еще одном эксперименте можно увидеть различия между вакцинацией спороцистами и ооцистами. В данном эксперименте высвобождение спороцист достигалось путем встряхивания многовидовой суспензии ооцист с 4-миллиметровыми стеклянными шариками вручную. Данный раствор спороцист/остаточных ооцист и раствор только ооцист вводили в день вылупления на лицевую слизистую оболочку. Применяли два набора форсунок: первым набором вводили 2% раствор альгината натрия, и вторым набором вводили вакцину в 3,0% растворе хлорида кальция. Когда эти два раствора вступают в контакт на поверхности птицы, образуется гель. Предполагается, что получение геля позволит сохранить гидратированную вакцину ооцист/спороцист дольше по сравнению с обычным водным спреем, увеличивая возможное время осуществления ухода за оперением для птиц. См. PCT №___, Hutchins, поданную 10 июля 2019 г., №дела поверенного 673-04-РСТ. Результаты этого эксперимента можно увидеть в таблице ниже.
[00126] Таблица 9: Частота и амплитуда ответа для птиц, обработанных ооцистами или спороцистами с остаточными ооцистами в геле
| Обработка распылением геля | Частота ответа (Инфицированные птицы/Вакцинированные птицы) |
Амплитуда ответа (Средний выход ооцист на птицу) |
||||
| E. maxima | E. tenella | E. acervulina | E. maxima | E. tenella | E. acervulina | |
| Ооцисты | 6/15 (40%) | 7/15 (47%) | 13/15 (87%) | 7,67 × 104 | 1,26 × 105 | 8,46 × 104 |
| Спороцисты | 15/15 (100%) | 15/15 (100%) | 15/15 (100%) | 2,51 × 105 | 4,83 × 105 | 1,90 × 105 |
| Улучшение | 60% | 53% | 13% | 3,3-кратно | 3,8-кратно | 2,24-кратно |
[00127] Ооцисты не наблюдались в кишечном содержимом наивных контрольных птиц, и положительные контроли, инокулированные с помощью глазных капель, показали частоты и амплитуды инфекционности выше, чем у экспериментальных групп, обработанных спреем. Эти результаты показывают, что спороцисты из гелевого состава превосходили ооцисты только по частоте и амплитуде ответа. Было отмечено, что инфекционность более мелких видов E. acervulina относительно высока, даже если их вводят в виде ооцист, а не спороцист. Данные по инфекционности могут указывать на то, что ооцисты E. acervulina могут эффективно обрабатываться до стадии жизненного цикла в форме спороцисты, а затем до стадии жизненного цикла в форме спорозоитов в пищеварительном тракте цыпленка независимо от наличия корма и песка.
[00128] Доказательства инфекционности при введении через желудочный зонд могут указывать на то, что E. maxima, в особенности, in vivo не могут обрабатываться до стадии спороцисты без корма или песка, присутствующих в пищеварительном тракте. Инфекционность E. maxima и, в несколько меньшей степени, E. tenella усиливается за счет предварительного прохождения стадии жизненного цикла ооцисты до стадии жизненного цикла спороцисты перед введением. Однако in vitro сила сдвига, необходимая для разрушения более крупных ооцист E. maxima, намного меньше, чем сила сдвига, необходимая для разрушения более мелких ооцист E. acervulina. (Европейский патент 2111 243 B1 (Hutchins et al., Embrex, Inc.)). Следовательно, система получения спороцист в момент применения обеспечивает дополнительное действие, сочетая эффективность in vitro расщепления более крупных видов ооцист с эффективностью обработки in vivo более мелких видов ооцист для обеспечения более надежной эффективности вакцины.
6.5. Результаты, полученные для гомогенизатора высокого давления
6.5.1. Подсчет уменьшения ооцист - in vitro
[00129] Жидкую суспензию, содержащую ооцисты смешанных видов Eimeria, обрабатывали в гомогенизаторе высокого давления (HPH) IKA model 2000-4 при различных давлениях. Суспензию клеток загружали во впуск HPH, обрабатывали в диапазоне давлений (200-1500 бар), а затем распределяли через выпуск. Интактные ооцисты, содержащиеся в жидком препарате, подсчитывали с применением флотационных камер Макмастера до и после воздействия HPH. Результаты представлены в таблице ниже.
[00130] Таблица 10: Сравнение остаточных ооцист, обработанных при разном давлении с гомогенизацией под высоким давлением (HPH)
| HPH | Общее количество ооцист в образце (среднее) | Процент уменьшения ооцист по сравнению с исходным материалом | |||||
| E. maxima | E. tenella | E. acervulina | E. maxima | E. tenella | E. acervulina | Общее количество ооцист | |
| Исходный материал | 1,74 × 102 | 8,31 × 101 | 5,46 × 102 | - | - | - | - |
| 200 бар | 7,47 × 101 | 4,2 × 101 | 4,48 × 102 | 57% | 49% | 18% | 30% |
| 500 бар | 4,67 × 100 | 4,20 × 101 | 2,99 × 102 | 97% | 49% | 45% | 73% |
[00131] Результаты показали, что чем выше давление, тем выше процент уменьшения ооцист и, следовательно, выше процент высвобождения спороцист.
[00132] Частота и амплитуда ответа у птиц, опрысканных ооцистами или спороцистами - In vivo
[00133] В данном эксперименте птиц обрабатывали либо спреем из форсунки, состоящим или из раствора ооцист или из раствора спороцист с остаточными ооцистами, обработанным устройством IKA HPH 2000-4. Затем птиц обеспечивали кормом и водой, выращивали и умерщвляли на 7 день для сбора индивидуального кишечного содержимого. Результаты данного эксперимента представлены в таблицах ниже.
[00134] Таблица 11: Сравнение инфекционности наивных ооцист и ооцист, обработанных IKA HPH 2000-4 при 200 бар.
| Лечение | Частота ответа (Инфицированные птицы/Опрысканные птицы) |
Амплитуда ответа (Средний выход ооцист на птицу) |
||||
| E. maxima | E. tenella | E. acervulina | E. maxima | E. tenella | E. acervulina | |
| Ооцисты | 7/15 (47%) | 6/15 (40%) | 15/15 (100%) | 8,42 × 104 | 5,09 × 103 | 8,1 × 104 |
| 200 бар | 8/14 (57%) | 1/14 (7%) | 7/14 (50%) | 1,26 × 104 | 1,17 × 104 | 1,31 × 104 |
| Улучшение | 10% | 0% | 0% | нет | 2,29-кратно | нет |
[00135] Таблица 12: Сравнение инфекционности наивных ооцист и ооцист, обработанных IKA HPH 2000-4 при 500 бар.
| Лечение | Частота ответа (Инфицированные птицы/ Опрысканные птицы) |
Амплитуда ответа (Средний выход ооцист на птицу) |
||||
| E. maxima | E. tenella | E. acervulina | E. maxima | E. tenella | E. acervulina | |
| Ооцисты | 7/15 (47%) | 6/15 (40%) | 15/15 (100%) | 8,42 × 104 | 5,09 × 103 | 8,1 × 104 |
| 500 бар | 3/15 (20%) | 7/15 (47%) | 13/15 (87%) | 2,23 × 103 | 1,05 × 105 | 3,63 × 104 |
| Улучшение | 0% | 7% | 0% | нет | 20,66-кратно | нет |
[00136] В содержимом кишечника 15 наивных контрольных птиц не наблюдалось ооцист ни одного вида. Положительные контроли, инокулированные посредством глазных капель, показали частоту инфицирования 100% (для всех видов) и более высокие амплитуды (для всех видов) по сравнению с экспериментальными группами обработки. Хотя процент уменьшения ооцист для IKA HPH выглядел удовлетворительно по данным in vitro, предполагается, что спороцисты, образовавшиеся в процессе гомогенизации, также были повреждены, что привело к плохим частотным и амплитудным ответам в данных in vivo.
6.6. Результаты роторно-статорного устройства
6.6.1. Подсчет уменьшения ооцист - in vitro
[00137] Жидкую суспензию ооцист, содержащую смешанные виды Eimeria, обрабатывали с различной скоростью с помощью IKA Magic Lab, однопроходного встроенного устройства, аналогичного роторно-статорному устройству. Суспензию клеток загружали в бункер Magic Lab, обрабатывали с помощью 1-3 роторно-статорных генераторов с различными скоростями (3000-26000 об/мин), а затем распределяли через выпуск. В данном эксперименте применяли генераторы модели 6F. Неповрежденные ооцисты в жидком препарате подсчитывали с помощью флотационных камер Макмастера до и после обработки с помощью устройства Magic Lab. Результаты представлены в таблице ниже:
[00138] Таблица 13: Сравнение остаточных ооцист, обработанных на разных скоростях с помощью ротора-статора
| Ротор-статор | Общее количество ооцист в образце (среднее) | Процент снижения по сравнению с исходным материалом | |||||
| E. maxima | E. tenella | E. acervulina | E. maxima | E. tenella | E. acervulina | Общее количество ооцист | |
| Исходный материал | 1,86 × 102 | 8,87 × 101 | 5,22 × 102 | - | - | - | - |
| 16000 об/мин | 1,26 × 102 | 5,13 × 101 | 5,04 × 102 | 32% | 42% | 3% | 14% |
| 26000 об/мин | 1,03 × 102 | 8,4 × 101 | 5,09 × 102 | 45% | 5% | 2% | 13% |
[00139] Уменьшение ооцист постоянно наблюдалось для E. maxima, в то время как переменное уменьшение наблюдалось для E. tenella и минимальное уменьшение наблюдалось для E. acervulina.
[00140] Частота и амплитуда ответа у птиц, опрысканных ооцистами или спороцистами - In vivo
[00141] В данном эксперименте цыплят-бройлеров в день вылупления подвергали воздействию спрея и форсунки, состоящего из раствора ооцист или раствора спороцист с остаточными ооцистами, обработанного устройством IKA Magic Lab. Затем птиц обеспечивали кормом и водой, выращивали и умерщвляли на 7 день для сбора индивидуального кишечного содержимого. Результаты этого эксперимента отображены в таблицах ниже.
[00142] Таблица 14: Сравнение инфекционности наивных ооцист и ооцист, обработанных посредством IKA Magic Lab при 16000 об/мин
| Лечение | Частота ответа (Инфицированные птицы/ Опрысканные птицы) |
Амплитуда ответа (Средний выход ооцист на птицу) |
||||
| E. maxima | E. tenella | E. acervulina | E. maxima | E. tenella | E. acervulina | |
| Ооцисты | 7/15 (47%) | 6/15 (40%) | 15/15 (100%) | 8,42 × 104 | 5,09 × 103 | 8,1 × 104 |
| 16000 об/мин | 9/15 (60%) | 4/15 (27%) | 14/15 (93%) | 5,26 × 104 | 1,05 × 103 | 1,12 × 105 |
| Улучшение | 13% | 0% | 0% | нет | нет | 1,47-кратно |
[00143] Таблица 15: Сравнение инфекционности наивных ооцист и ооцист, обработанных посредством IKA Magic Lab при 26000 об/мин
| Обработка | Частота ответа (Инфицированные птицы/ Опрысканные птицы) |
Амплитуда ответа (Средний выход ооцист на птицу) |
||||
| E. maxima | E. tenella | E. acervulina | E. maxima | E. tenella | E. acervulina | |
| Ооцисты | 7/15 (47%) | 6/15 (40%) | 15/15 (100%) | 8,42 × 104 | 5,09 × 103 | 8,1 × 104 |
| 26000 об/мин | 9/15 (60%) | 11/15 (73%) | 14/15 (93%) | 5,68 × 104 | 3,42 × 105 | 1,22 × 105 |
| Улучшение | 13% | 33% | 0% | нет | 67-кратно | 1,51-кратно |
[00144] В содержимом кишечника 15 наивных контрольных птиц не наблюдалось ооцист ни одного вида. Положительные контроли, инокулированные посредством глазных капель, показали частоту инфицирования 100% (для всех видов) и более высокие амплитуды (для всех видов) по сравнению с экспериментальными группами обработки. Частота ответа была увеличена для E. maxima в обеих группах обработки Magic Lab, однако амплитуда ответа для данных соответствующих групп лечения была меньше, чем у принадлежащих к группе лечения ооцистами, но все еще в приемлемом диапазоне. Частота и амплитуда ответа были наиболее заметно увеличены для E. tenella. Данные результаты могут указывать на то, что ооцисты E. maxima подверглись избыточной обработке в применяемых условиях.
6.7. Эксперименты гидродинамической кавитации
6.7.1. Исследования in vitro с гидродинамической кавитацией
[00145] Для первоначального тестирования применяли недорогой герметичный диспенсер для взбитых сливок из армированного алюминия (EurKitchen EK-WHIP-18) с насадкой для загрузки азота и выпуска. Жидкость, содержащую смешанный препарат Eimeria, загружали в канистру, добавляли картридж с азотом, и затем канистру несколько раз переворачивали, чтобы газ мог насыщать жидкость. Канистру переворачивали вверх дном, и клапан открывали, чтобы создать перепад давления и выпустить жидкость. Производили подсчет в жидком препарате до и после воздействия гидродинамической кавитации для определения процента ооцист, разрушенных для разных видов. В некоторых случаях жидкость обрабатывали и выгружали из системы, загружали обратно в систему, и затем снова подвергали гидродинамической кавитации еще два или три раза, чтобы разрушить большее количество клеток, поскольку давление и количество газа невозможно контролировать в начале тестирования системы.
[00146] Для целей настоящего описания выгрузка жидкости, которая уже подверглась гидродинамической кавитации, с последующей загрузкой той же жидкости обратно в тот же сосуд для повторного воздействия гидродинамической кавитации, будет называться «Проходом». Таким образом, с этого момента терминология «Проход 1», «Проход 2» или «Проход 3» будет использоваться для обозначения действия подвергания жидкости процессу гидродинамической кавитации заданное количество раз. Количество раз будет определяться числом последующих «проходов».
[00147] Таблица 16: Сравнение остаточных ооцист, обработанных с помощью нескольких циклов гидродинамической кавитации в диспенсере для взбитых сливок.
| Гидродинамическая кавитация | Общее количество ооцист в образце (среднее) | Процент снижения по сравнению с исходным материалом | |||||
| E. maxima | E. tenella | E. acervulina | E. maxima | E. tenella | E. acervulina | Всего | |
| Эксперимент 1 | |||||||
| Исходный материал | 4,15 × 102 | 1,63 × 102 | 1,19 × 103 | - | - | - | - |
| Проход 1 | 2,88 × 102 | 9,8 × 101 | 8,7 × 102 | 31% | 40% | 30% | 31% |
| Эксперимент 2 | |||||||
| Исходный материал | 3,03 × 102 | 2,12 × 102 | 7,63 × 102 | - | - | - | - |
| Проход 1 | 2,05 × 102 | 1,14 × 102 | 6,14 × 102 | 32% | 46% | 20% | 27% |
| Проход 2 | 1,62 × 102 | 5,83 × 101 | 3,56 × 102 | 47% | 73% | 53% | 55% |
| Проход 3 | 1,70 × 102 | 6,65 × 101 | 4,35 × 102 | 44% | 69% | 43% | 47% |
[00148] Эксперимент 1 (см. таблицу 16) проводили, чтобы оценить целесообразность применения новой методики разрушения клеток, и эксперимент 2 проводили для дальнейшего изучения данной методики. В конечном итоге, эксперимент 1 показал сопоставимое превращение ооцист в спороцисты у всех видов, для которых проводили тесты, аналогичные проведенным ранее тестам, с ранее изученными способами разрушения ооцист, такими как встряхивание со стеклянными шариками. В эксперименте 2 «Проход 2» продемонстрировал лучшее превращение по сравнению с «Проходом 1», в то время как «Проход 3» показал результаты, сопоставимые с «Проходом 2», что указывает на то, что повышенное воздействие кавитации азота не обязательно улучшает превращение в дальнейшем.
[00149] После успеха гидродинамической кавитации при ограниченных параметрах ранее установленного подхода с применением EurKitchen, протокол был дополнительно доработан для включения в него гидродинамического разрушителя клеток коммерческого класса, данный способ более подробно исследуется в шестом варианте реализации.
[00150] Дальнейшие исследования проводили с применением сосуда для разрушения клеток (Parr™ 4639) газообразным азотом, подаваемым через соединение для заполнения азотом (Parr™ 1831) при различных давлениях, 1000 psi и 1500 psi, и затем обеспечивая растворение газообразного азота в разбавленной вакцине для 5 минут.
[00151] Несмотря на то, что указаны конкретные параметры давления и времени, следует указать, что особенности способа могут проявляться в более широком диапазоне. Данный диапазон может включать давление от 500 до 5000 psi, время выдержки от 1 до 30 минут и разбавители, которые различаются по композиции. Данные композиции могут состоять из дистиллированной воды, забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS) и других их вариантов.
[00152] Таблица 17: сравнение in vitro остаточных ооцист, обработанных с применением нескольких вариантов давления гидродинамической кавитации в сосуде для разрушения клеток
| Гидродинамическая кавитация | Общее количество ооцист в образце (среднее) | Процент снижения по сравнению с соответствующим исходным материалом | |||||
| Большое | Среднее | Маленькое | Большое | Среднее | Маленькое | Общее количество ооцист | |
| Исходный материал (1000 psi) | 2,22 × 102 | 1,12 × 102 | 4,06 × 102 | - | - | - | - |
| 1000 psi/ 5 мин | 9,10 × 101 | 6,30 × 101 | 3,34 × 102 | 47% | 5% | 23% | 27% |
| Исходный материал (1500 psi) | 2,59 × 102 | 1,54 × 102 | 4,48 × 102 | - | - | - | - |
| 1500 psi/ 5 мин | 1,14 × 102 | 8,17 × 101 | 3,22 × 102 | 56% | 47% | 28% | 40% |
[00153] Подсчет в жидком препарате проводили способом флотационной камеры Макмастера до и после обработки гидродинамической кавитацией. Результаты показали, что оба испытанных давления были способны преобразовать примерно 50% и 25% ооцист в спороцисты у крупных и мелких видов соответственно. При более высоком испытанном давлении наблюдалось повышенное преобразование для видов среднего размера.
6.7.2. Исследование гидродинамической кавитации in vitro (1й способ)
[00154] В данной серии экспериментов разрушение мембраны ооцист было завершено с применением гидродинамической кавитации, и инфекционность оценивали с помощью модели выхода ооцисты. Осуществляли подсчет оставшихся ооцист, и он показан ниже. В день вылупления цыплят (15 на обработку) инокулировали ооцистами или спороцистами, высвобожденными с помощью гидродинамической кавитации, с остаточными ооцистами посредством вакцинации спреем, и содержимое кишечника собирали на 7 день.
[00155] Данные в таблицах 18 и 19 ниже демонстрируют эффективность доставки in vivo спороцист, высвобождаемых гидродинамической кавитацией в EurKitchen. Данные в таблице 19 были собраны в эксперименте отдельно от данных, представленных в таблице 18.
[00156] Таблица 18: Сравнение инфекционности in vivo нескольких циклов гидродинамической кавитации ручного диспенсера для взбитых сливок
| Гидродинамическая кавитация | Частота ответа (Инфицированные птицы/Опрысканные птицы) |
Амплитуда ответа (Средний выход ооцист на птицу) |
||||
| E. maxima | E. tenella | E. acervulina | E. maxima | E. tenella | E. acervulina | |
| Проход 1 | 6/15 (40%) | 8/15 (53%) | 9/15 (60%) | 5,77 × 104 | 1,44 × 105 | 1,35 × 105 |
| Проход 2 | 9/15 (60%) | 5/15 (33%) | 13/15 (87%) | 2,08 × 104 | 1,13 × 103 | 1,36 × 104 |
| Проход 3 | 6/15 (40%) | 4/15 (27%) | 12/15 (80%) | 8,23 × 103 | 1,45 × 105 | 3,00 × 104 |
[00157] Таблица 19: Сравнение инфекционности in vivo гидродинамической кавитации ручного диспенсера для взбитых сливок
| Гидродинамическая кавитация | Частота ответа (Инфицированные птицы/ Опрысканные птицы) |
Амплитуда ответа (Средний выход ооцист на птицу) |
||||
| E. maxima | E. tenella | E. acervulina | E. maxima | E. tenella | E. acervulina | |
| Ооцисты | 10/12 (83%) | 10/12 (83%) | 12/12 (100%) | 5,23 × 105 | 6,84 × 104 | 3,71 × 105 |
| Проход 2 | 14/15 (93%) | 14/15 (93%) | 15/15 (100%) | 4,13 × 105 | 4,21 × 105 | 7,26 × 105 |
| Улучшение | 10% | 10% | 0% | нет | 6,2-кратно | 2,0-кратно |
[00158] В содержимом кишечника наивных контрольных птиц ооцист не наблюдалось. Контрольные глазные капли для этого эксперимента продемонстрировали более высокую частоту и амплитуду ответа по сравнению с экспериментальными группами обработки. В таблице 18 продемонстрирована сравнительная эффективность различных количеств «Проходов», и в таблице 19 продемонстрирована эффективность наиболее эффективного «Прохода 2» по сравнению с доставкой глазного спрея с ооцистами.
6.7.3. Исследование гидродинамической кавитации in vitro (2й способ)
[00159] Данные в таблицах 20 и 21 ниже демонстрируют эффективность способа разрушения клеток посредством гидродинамической кавитации в сосуде для разрушения клеток. Данные в таблицах 20 и 21 были получены в одном эксперименте.
[00160] Таблица 20: Сравнение инфекционности in vivo гидродинамической кавитации в сосуде для разрушения клеток (1000 psi)
| Гидродинамическая кавитация | Частота ответа (Инфицированные птицы/Опрысканные птицы) |
Амплитуда ответа (Средний выход ооцист на птицу) |
||||
| E. maxima | E. tenella | E. acervulina | E. maxima | E. tenella | E. acervulina | |
| Ооцисты | 7/15 (47%) | 6/15 (40%) | 15/15 (100%) | 8,42 × 104 | 5,09 × 103 | 8,10 × 104 |
| 1000 psi | 12/15 (80%) | 9/15 (60%) | 13/15 (87%) | 3,38 × 105 | 2,38 × 105 | 1,11 × 105 |
| Улучшение | 33% | 20% | 0% | 4,0-кратно | 46,6-кратно | 1,4-кратно |
[00161] Таблица 21: Сравнение инфекционности in vivo гидродинамической кавитации в сосуде для разрушения клеток (1500 psi)
| Гидродинамическая кавитация | Частота ответа (Инфицированные птицы/ Опрысканные птицы) |
Амплитуда ответа (Средний выход ооцист на птицу) |
||||
| E. maxima | E. tenella | E. acervulina | E. maxima | E. tenella | E. acervulina | |
| Ооцисты | 7/15 (47%) | 6/15 (40%) | 15/15 (100%) | 8,42 × 104 | 5,09 × 103 | 8,10 × 104 |
| 1500 psi | 11/15 (73%) | 10/15 (67%) | 15/15 (100%) | 8,27 × 103 | 1,69 × 105 | 4,35 × 104 |
| Улучшение | 26% | 27% | 0% | нет | 33,2-кратно | нет |
[00162] В содержимом кишечника наивных контрольных птиц ооцист не наблюдалось. Контрольные глазные капли для этого эксперимента продемонстрировали более высокую частоту и амплитуду ответа по сравнению с экспериментальными группами обработки. Обработка с применением 1000 psi продемонстрировала улучшенную частоту ответа для E. maxima и E. tenella и улучшенную амплитуду ответа для всех видов. Обработка с применением 1500 psi продемонстрировала улучшенную частоту ответа для E. maxima и E. tenella, но не повлияла на амплитуду для E. maxima и E. acervulina, однако, наблюдалось значительное увеличение амплитуды ответа для E. tenella.
[00163] Как и ожидалось, усовершенствованная методика гидродинамической кавитации, продемонстрированная с применением сосуда для разрушения клеток, превзошла менее контролируемый подход с применением диспенсера для взбитых сливок. Все виды, за исключением E. acervulina, показали улучшенную инфекционность, и с точки зрения выхода ооцист E. tenella оба параметра давления в сосуде для разрушения клеток показали заметное увеличение.
6.8. Эксперименты in vitro с дополнительными вакцинами
[00164] В предыдущих разделах были описаны способы разрушения мембран ооцист с целью высвобождения спороцист для улучшения эффективности вакцины. Первоначальный тест проводили с применением 1-й вакцины против кокцидий для цыплят-бройлеров как в ручном, так и в автоматическом режиме. Здесь описан способ разрушения мембран ооцист во 2-й вакцине против кокцидии для цыплят-бройлеров, 1-й и 2-й вакцине против кокцидий для кур и 1-й вакцине против кокцидий для индеек.
[00165] Для ручной обработки к вакцине добавляли стеклянные шарики и энергично встряхивали. Подсчитывали и сравнивали количество крупных, средних и мелких ооцист до и после ручной обработки. Кроме того, применяли автоматизированную систему, в которой аликвоту вакцины добавляли в шаровую мельницу и обрабатывали образцы. В этом случае применяли систему диспергирования одноразового действия (система IKA ULTRA-TURRAX Tube Drive), но ожидается, что любая подобная система даст аналогичные результаты.
[00166] С целью подсчета ооцисты, содержащиеся в тестируемых вакцинах, были классифицированы как большие, средние и маленькие в зависимости от их размера, как указано у Conway и McKenzie (Poultry Coccidiosis: Diagnostic and Testing Procedures, 3rd Edition, June 2007, Wiley-Blackwell). В ряд для проведения тестов были включены следующие виды Eimeria: E. acervulina, E. adenoeids, E.brunetti, E. hagani, E. meleagrimitis E. mivati, E. maxima, E. necatrix, E. praecox и E. tenella из различных коммерческих источников. Ряд включал по меньшей мере один вид как неаттенуированных, так и аттенуированных (ранее) штаммов. Подсчет проводили три раза для каждого образца, а среднее значение указано ниже.
[00167] Таблица 22: Уменьшение ооцист в процессе эксплуатации 1-й вакцины против кокцидий у кур
| 1-я вакцина против кокцидии у кур | Общее количество ооцист в образце (среднее) | Процент снижения по сравнению с исходным материалом | |||||
| Большое | Среднее | Маленькое | Большое | Среднее | Маленькое | Всего | |
| Исходный материал | 8,56 × 101 | 1,88 × 102 | 4,46 × 102 | - | - | - | - |
| Ручное | 2,22 × 101 | 5,89 × 101 | 1,58 × 102 | 74% | 69% | 65% | 67% |
| Автоматическое | 2,56 × 101 | 9,67 × 101 | 2,11 × 102 | 70% | 49% | 53% | 54% |
[00168] Таблица 23: Уменьшение ооцист В процессе эксплуатации 2-й вакцины против кокцидий у кур
| 2-я вакцина против кокцидии у кур | Общее количество ооцист в образце (среднее) | Процент снижения по сравнению с исходным материалом | |||||
| Большое | Среднее | Маленькое | Большое | Среднее | Маленькое | Всего | |
| Исходный материал | 1,86 × 102 | 4,94 × 101 | 1,26 × 103 | - | - | - | - |
| Ручное | 3,33 × 101 | 1,72 × 102 | 4,10 × 102 | 82% | 65% | 67% | 68% |
| Автоматическое | 6,89 × 101 | 2,08 × 101 | 5,98 × 102 | 63% | 58% | 52% | 55% |
[00169] Таблица 24: Уменьшение ооцист В процессе эксплуатации 2-й вакцины против кокцидий у бройлерных кур
| 2-я вакцина против кокцидии у бройлерных кур | Общее количество ооцист в образце (среднее) | Процент снижения по сравнению с исходным материалом | |||||
| Большое | Среднее | Маленькое | Большое | Среднее | Маленькое | Всего | |
| Исходный материал | 4,22 × 102 | 3,43 × 102 | 1,24 × 103 | - | - | - | - |
| Ручное | 6,22 × 102 | 1,66 × 102 | 4,32 × 102 | 85% | 52% | 65% | 67% |
| Автоматическое | 5,33 × 101 | 1,47 × 101 | 5,82 × 102 | 87% | 57% | 53% | 61% |
[00170] Таблица 25: Уменьшение ооцист В процессе эксплуатации 1-й вакцины против кокцидий у индеек
| 1-я вакцина против кокцидии у индеек | Общее количество ооцист в образце (среднее) | Процент снижения по сравнению с исходным материалом |
| Среднее* | Среднее | |
| Исходный материал | 3,11 × 102 | |
| Ручное | 1,12 × 102 | 64% |
| Автоматическое | 1,20 × 101 | 61% |
* В вакцине отсутствуют крупные или мелкие ооцисты.
[00171] Результаты указывают на общую восприимчивость ооцист к сдвигу для широкого спектра протестированных вакцин, указывая на то, что описанные системы и процессы имеют широкое применение.
ОБЩИЕ ЗАЯВЛЕННЫЕ ОБЪЕКТЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[00172] Следующие пронумерованные утверждения обеспечивают общее описание изобретения и не предназначены для ограничения прилагаемой формулы изобретения.
[00173] Объект 1: Способ вакцинации животного против Eimeria, включающий этапы: обеспечения раствора ооцист Eimeria, причем ооцисты имеют внешнюю мембрану и содержат в себе жизнеспособные спороцисты; разрушения по меньшей мере некоторой части внешних мембран ооцисты Eimeria с получением модифицированного раствора; и доставку модифицированного раствора животному.
[00174] Объект 2: Способ защиты животного от нарушения, вызванного апикомплексом, включающий этапы: обеспечения раствора ооцист апикомплекса, причем ооцисты имеют внешнюю мембрану и содержат в себе жизнеспособные спороцисты; разрушения по меньшей мере некоторой части внешних мембран ооцисты апикомплекса с получением модифицированного раствора; и доставку модифицированного раствора животному.
[00175] Объект 3: Способ по любому из пп.1-2, отличающийся тем, что жизнеспособные спороцисты высвобождаются из разрушенной мембраны.
[00176] Объект 4: Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что модифицированный раствор доставляют животному во время разрушения мембран.
[00177] Объект 5: Способ по пп.1-3, отличающийся тем, что модифицированный раствор доставляют животному в течение 5 дней после разрушения, в результате которого получают модифицированный раствор.
[00178] Объект 6: Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что модифицированный раствор доставляют посредством распыления.
[00179] Объект 7: Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что ооцисты Eimeria или апикомплексов представляют собой ооцисты Eimeria одного вида Eimeria или ооцисты апикомплексов одного вида апикомплексов.
[00180] Объект 8: Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что ооцисты Eimeria или апикомплексов представляют собой ооцисты Eimeria из вакцины против Eimeria, содержащей два или более видов Eimeria или ооцисты апикомплексов одного или более видов апикомплексов.
[00181] Объект 9: Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что раствор ооцист Eimeria или апикомплексов представляет собой концентрированный вакцинный раствор.
[00182] Объект 10: Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что раствор ооцист Eimeria или апикомплексов представляет собой разбавленный вакцинный раствор.
[00183] Объект 11: Система для разрушения внешней мембраны ооцист Eimeria и доставки полученного раствора животному в режиме реального времени, включающая: сосуд, содержащий ооцисты Eimeria в растворе, при этом ооцисты имеют внешнюю мембрану и содержат в себе жизнеспособные спороцисты; камеру для обработки ооцист, в которой разрушается внешняя мембрана по меньшей мере некоторой части ооцист Eimeria с получением модифицированного раствора; и выпуск для доставки, посредством которого модифицированный раствор перемещается из сосуда через камеру для обработки к выпуску для доставки, где модифицированный раствор доставляют животному.
[00184] Объект 12: Система для разрушения внешней мембраны ооцист апикомплексов и доставки полученного раствора животному в режиме реального времени, включающая: сосуд, содержащий ооцисты апикомплексов в растворе, при этом ооцисты имеют внешнюю мембрану и содержат в себе жизнеспособные спороцисты; камеру для обработки ооцист, в которой разрушается внешняя мембрана по меньшей мере некоторой части ооцист апикомплексов с получением модифицированного раствора; и выпуск для доставки, посредством которого модифицированный раствор перемещается из сосуда через камеру для обработки к выпуску для доставки, где модифицированный раствор доставляют животному.
[00185] Объект 13: Система по пп.11-12, отличающаяся тем, что жизнеспособные спороцисты высвобождаются из разрушенной мембраны.
[00186] Объект 14: Система по любому из пп.11-13, отличающаяся тем, что камера для обработки ооцист представляет собой по меньшей мере одну из группы, состоящей из: гомогенизатора высокого давления, роторно-статорного смесителя, камеры, содержащей твердые шарики и прикрепленную к ней мешалку, пары вибрирующих пластин, ультразвукового аппарата, устройства гидродинамической кавитации, распылителя высокого давления или их комбинации.
[00187] Объект 15: Система по любому из пп.11-14, отличающаяся тем, что гомогенизатор обеспечивает давление примерно 3000 psi.
[00188] Объект 16: Система по любому из пп.11-15, отличающаяся тем, что количество разорванных ооцист Eimeria или апикомплексов составляет от примерно 5 до 50% для ооцист размером менее 20 микрометров по их наибольшему измерению, от примерно 15 до 75% для ооцист размером от 20 микрометров до 30 микрометров по их наибольшему измерению и от примерно 25 до 90% для ооцист размером более 30 микрометров по их наибольшему измерению.
[00189] Объект 17: Система по любому из пп.11-16, отличающаяся тем, что раствор, содержащий ооцисты Eimeria или апикомплексов, включает по меньшей мере один протеолитический фермент.
[00190] Объект 18: Система по п.17, отличающаяся тем, что протеолитический фермент представляет собой трипсин, химотрипсин или их смесь.
[00191] Объект 19: Система по любому из пп.11-18, отличающаяся тем, что раствор, содержащий ооцисты Eimeria или апикомплексов, представляет собой концентрированный вакцинный раствор.
[00192] Объект 20: Система по любому из пп.11-18, отличающаяся тем, что раствор, содержащий ооцисты Eimeria или апикомплексов, дополнительно включает водный разбавитель, который содержит буферные соли; сахара; белки или гидролизаты белков; красители; или загустители.
[00193] Объект 21: Способ разрушения мембран ооцист во время доставки животному, включающий следующие этапы: обеспечение сосуда для содержания объема ооцист Eimeria в растворе, причем ооцисты имеют внешнюю мембрану и содержат в себе жизнеспособные спороцисты; обеспечение системы разрушения внешней мембраны ооцисты; обеспечение устройства доставки; перемещение раствора из первого сосуда в систему; пропускание раствора через камеру для обработки, в результате чего по меньшей мере некоторые из мембран ооцист Eimeria разрушаются с получением модифицированного раствора; и перемещение модифицированного раствора из системы в устройство доставки, где модифицированный раствор доставляется животному.
[00194] Объект 22: Способ разрушения мембран ооцист во время доставки животному, включающий следующие этапы: обеспечение сосуда для содержания объема ооцист апикомплексов в растворе, причем ооцисты имеют внешнюю мембрану и содержат в себе жизнеспособные спороцисты; обеспечение системы разрушения внешней мембраны ооцисты; обеспечение устройства доставки; перемещение раствора из первого сосуда в систему; пропускание раствора через камеру для обработки, в результате чего по меньшей мере некоторые из мембран ооцист апикомплексов разрушаются с получением модифицированного раствора; и перемещение модифицированного раствора из системы устройству доставки, где модифицированный раствор доставляется животному.
[00195] Объект 23: Способ по любому из пп.21-22, отличающийся тем, что система содержит по меньшей мере одно из группы, состоящей из: гомогенизатора высокого давления, ультразвукового устройства, роторно-статорного смесителя, сосуда, содержащего твердые шарики и прикрепленную к нему мешалку, пары вибрирующих пластин, устройства гидродинамической кавитации, распылителя высокого давления или их комбинации.
[00196] Объект 24: Способ по любому из пп.21-23, отличающийся тем, что гомогенизатор обеспечивает давление более примерно 3000 psi.
[00197] Объект 25: Способ по любому из пп.21-24, отличающийся тем, что количество разорванных ооцист составляет по меньшей мере примерно 5% для ооцист размером менее 20 микрометров по их наибольшему измерению, по меньшей мере примерно 15% для ооцист размером от 20 микрометров до 30 микрометров по их наибольшему измерению и по меньшей мере примерно 25% для ооцист размером более 30 микрометров по их наибольшему измерению.
[00198] Объект 26: Способ по любому из пп.21-25, отличающийся тем, что раствор ооцист Eimeria или апикомплексов представляет собой концентрированный вакцинный раствор.
[00199] Следует понимать, что приведенное выше описание представляет только иллюстративные варианты реализации и примеры. Для удобства читателя приведенное выше описание сосредоточено на ограниченном количестве репрезентативных примеров всех возможных вариантов реализации, примеров, которые раскрывают принципы изобретения. В описании не предпринимается попыток исчерпывающего перечисления всех возможных вариаций или даже комбинаций данных описанных вариаций. То, что альтернативные варианты реализации могут не быть представлены для конкретной части изобретения, или что дополнительные неописанные альтернативные варианты реализации могут быть доступны частично, не следует рассматривать как ограничение этих альтернативных вариантов реализации. Обычному специалисту в данной области будет понятно, что многие из данных неописанных вариантов реализации включают различия в технологии и материалах, а не различия в применении принципов описания. Соответственно, описание не предназначено для ограничения меньше, чем объем, изложенный в следующей формуле изобретения и ее эквивалентах.
[00200] ВКЛЮЧЕНИЕ ПОСРЕДСТВОМ ССЫЛКИ
[00201] Все ссылки, статьи, публикации, патенты, патентные публикации и заявки на патенты, процитированные в настоящем документе, включены посредством ссылки во всей их полноте для всех целей. Однако упоминание любых ссылок, статей, публикаций, патентов, патентных публикаций и патентных заявок, цитируемых в настоящем документе, не является и не должно восприниматься как подтверждение или любая форма предположения, что они составляют действительный предшествующий уровень техники или являются частью общего знания в любой стране мира. Следует понимать, что, хотя изобретение было описано в сочетании с его подробным описанием, вышеприведенное описание предназначено для иллюстрации, а не для ограничения объема. Другие аспекты, преимущества и модификации находятся в пределах объема формулы изобретения, изложенной ниже. Все публикации, патенты и патентные заявки, процитированные в настоящем описании, включены в него посредством ссылки, как если бы каждая отдельная публикация или патентная заявка были специально и индивидуально указаны для включения посредством ссылки.
1. Способ вакцинации птицы против Eimeria в режиме реального времени, включающий следующие этапы:
обеспечение раствора ооцист Eimeria, причем ооцисты имеют внешнюю мембрану и содержат в себе жизнеспособные спороцисты;
разрушение по меньшей мере некоторой части внешних мембран ооцист Eimeria с получением модифицированного раствора; и
доставку модифицированного раствора на слизистую оболочку морды птицы.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что жизнеспособные спороцисты высвобождаются из разрушенной мембраны.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что модифицированный раствор доставляют птице во время разрушения мембран.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что модифицированный раствор доставляют птице в течение 5 дней после разрушения, в результате которого получают модифицированный раствор.
5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что модифицированный раствор доставляют посредством распыления.
6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ооцисты Eimeria представляют собой ооцисты отдельных видов Eimeria.
7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ооцисты Eimeria представляют собой ооцисты Eimeria из вакцины против Eimeria, содержащей два или более видов Eimeria.
8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что раствор ооцист Eimeria представляет собой концентрированный вакцинный раствор.
9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что раствор ооцист Eimeria представляет собой разбавленный вакцинный раствор.
10. Система для разрушения внешних мембран ооцист Eimeria и доставки полученного раствора на слизистую оболочку морды птицы в режиме реального времени, включающая:
сосуд, содержащий ооцисты Eimeria в растворе, причем ооцисты имеют внешнюю мембрану и содержат в себе жизнеспособные спороцисты;
камеру для обработки ооцист, в которой разрушается внешняя мембрана по меньшей мере некоторой части ооцист Eimeria с получением модифицированного раствора; и
выпуск для доставки, причем модифицированный раствор перемещается из сосуда через камеру для обработки к выпуску для доставки, где полученный раствор доставляется на слизистую оболочку морды птицы в режиме реального времени.
11. Система по п. 10, отличающаяся тем, что жизнеспособные спороцисты высвобождаются из разрушенной мембраны.
12. Система по п. 10, отличающаяся тем, что камера для обработки ооцист представляет собой по меньшей мере одно из группы, состоящей из: гомогенизатора высокого давления, роторно-статорного смесителя, камеры, содержащей множество средств для перемешивания и присоединенное к ней вращающее устройство, пары вибрирующих пластин, ультразвукового аппарата, устройства гидродинамической кавитации, распылителя высокого давления или их комбинации.
13. Система по п. 12, отличающаяся тем, что средства перемешивания имеют цилиндрическую форму.
14. Система по п. 10, отличающаяся тем, что количество разорванных ооцист Eimeria составляет от примерно 5 до 50% для ооцист Eimeria размером менее 20 микрометров по их наибольшему измерению, от примерно 15 до 75% для ооцист Eimeria размером от 20 микрометров до 30 микрометров по их наибольшему измерению и от примерно 25 до 90% для ооцист Eimeria размером более 30 микрометров по их наибольшему измерению.
15. Система по п. 12, отличающаяся тем, что вращающее устройство при активации заставляет сосуд вращаться, вибрировать или трястись.
16. Система по п. 15, отличающаяся тем, что протеолитический фермент представляет собой трипсин, химотрипсин или их смесь.
17. Система по п. 10, отличающаяся тем, что раствор, содержащий ооцисты Eimeria, представляет собой концентрированный вакцинный раствор.
18. Система по п. 10, отличающаяся тем, что раствор, содержащий ооцисты Eimeria, дополнительно содержит водный разбавитель, который содержит буферные соли; сахара; белки или гидролизаты белков; красители; или загустители.
19. Способ разрушения мембран ооцист во время доставки на слизистую оболочку морды птицы, при этом способ включает этапы:
обеспечения сосуда, выполненного с возможностью содержать некоторый объем ооцист Eimeria в растворе, причем ооцисты имеют внешнюю мембрану и содержат в себе жизнеспособные спороцисты;
обеспечения системы для разрушения внешней мембраны ооцист;
обеспечения устройства доставки;
перемещения раствора из первого сосуда в систему;
пропускания раствора через камеру для обработки, в которой разрушаются по меньшей мере некоторые мембраны ооцист Eimeria, с получением модифицированного раствора; и
перемещения модифицированного раствора из системы к устройству доставки, где модифицированный раствор доставляется на слизистую оболочку морды птицы в режиме реального времени.
20. Способ по п. 19, отличающийся тем, что система содержит по меньшей мере одно из группы, состоящей из: гомогенизатора высокого давления, ультразвукового устройства, роторно-статорного смесителя, сосуда, содержащего средства перемешивания и присоединенное к нему вращающее устройство, пары вибрирующих пластин, устройства гидродинамической кавитации, распылителя высокого давления или их комбинации.
21. Способ по п. 20, отличающийся тем, что вращающее устройство при активации заставляет сосуд вращаться, вибрировать или трястись.
