Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантному получению сфингозин-1-фосфатного рецептора типа 5 (Sphingosine-1-phosphate receptor 5, S1P5), и может быть использовано для экспрессии S1P5 рецептора. Предложена генетическая конструкция с нуклеотидной последовательностью, которая оптимизирована для экспрессии S1P5 рецептора. Изобретение обеспечивает рекомбинантную экспрессию в эукариотической системе на клеточной поверхности за счет комбинации N-концевых пептидных фрагментов и положения партнерного белка в третьей внутриклеточной петле, что также стабилизирует белок и помогает образованию кристаллических контактов. 5 ил.

Модифицированная генетическая конструкция для рекомбинантной экспрессии и кристаллизации человеческого S1P5 рецептора

Изобретение относится к молекулярной биологии, генной инженерии, биотехнологиям и касается новых генетических конструкций и продуцентов, обеспечивающих экспрессию рекомбинантного человеческого сфингозин-1-фосфатный рецептор типа 5 класса GPCR, пригодного к дальнейшим структурно-функциональным исследованиям.

Известна конструкция дикого типа S1P5, депонированная в базе данных UniProtKB - Q9H228 (S1PR5_HUMAN, https://www.uniprot.org/uniprot/Q9H228)

Существует большое количество патентов, касающихся создания прототипов лекарственных препаратов, лигандов, антагонистов, имеющих своими мишенями S1P5 и методов их использования:

1. Производные тетрагидронафталина - модуляторы S1P5 (https://patents.google.com/patent/US20190031605A1/)

2. Орально биодоступные агонисты и антагонисты S1P5 (https://patents.google.com/patent/US7638637B2)

3. Гетероциклические соединения для лечения болезней, модулирующие рецепторы S1P (https://patents.google.com/patent/US20200325135A1/, https://patents.google.com/patent/WO2018211323A1/)

4. Соединения, обладающие агонистической активностью в отношении S1P5 (https://patents.google.com/patent/BR112020017036A2/)

5. Смеси и методы модуляции активности естественных киллеров и T-клеток через S1P5 (https://patents.google.com/patent/WO2009053481A1/)

6. Агенты, модулирующие ответ на S1P (https://patents.google.com/patent/US9765016B2)

7. Агонисты и антагонисты S1P5, а также методы их использования (https://patents.google.com/patent/CA2749960A1/)

8. Селективные модуляторы сфингозин-1-фосфатных рецепторов и методы хирального синтеза (включая озанимод) (https://patents.google.com/patent/ES2673160T3/)

9. N-(бензил)аминоалкилкарбоксилаты, фосфинаты, фосфонаты и тетразолы как агонисты edg-рецепторов (Edg-рецепторы - S1P_1-5 И LPA_1-3)

10. Соединения, активные в передаче сигналов сфингозин-1-фосфата (https://patents.google.com/patent/US7560477B2/)

11. В том числе финголимод (пример - https://patents.google.com/patent/CA2539033A1/), озанимод (https://patents.google.com/patent/US11111223B2/), сипонимод (https://patents.google.com/patent/JP2020535147A/)

Существуют генетические конструкции для проведения функциональных тестов рецептора S1P5 и поиска его лигандов (https://patents.google.com/patent/WO2011131747A1/), однако из данных отечественной и зарубежной литературы, патентов и патентных заявок авторам неизвестно, чтобы существовала конструкция S1P5 рецептора, обеспечивающая кристаллизацию белка методом in meso.

Отличительным признаком изобретения являются: комбинация N-концевых пептидных фрагментов, обеспечивающих рекомбинантную экспрессию в эукариотической системе на клеточной поверхности, а также ее детекцию; положение партнерного белка в третьей внутриклеточной петле, способствующего стабилизации белка и помогающего образованию кристаллических контактов; транкирование неупорядоченного C-конца S1P5 рецептора, препятствующего формированию кристаллов, комбинация С-концевых пептидных фрагментов, обеспечивающих очистку рецептора.

Данное изобретение обеспечивает синтез модифицированного рецептора S1P5 при помощи бакуловирусной системы экспрессии в клетках насекомых, а также возможность получения его гомогенного стабилизированного препарата в количестве не менее 0.5 мг с литра клеточной культуры, подходящего для исследований методом рентгеноструктурного анализа и биофизическими функциональными тестами

Техническим результатом изобретения является возможность получения дифрагирующих кристаллов указанной конструкции, полученных методом кристаллизации в липидной кубической фазе, а также проведения функциональных тестов: анализа связывания лигандов, анализа стабилизирующего эффекта различных буферных растворов.

Описание способа получения генетической конструкции заявляемого изобретения.

Ген дикого типа был приобретен в компании cdna.org (США), плазмида, ген белка-партнера был синтезирован компанией GenScript (США). Используемый плазмидный вектор pFastBac1 (Invitrogen, США), модифицировался методом безлигазного клонирования с использованием праймеров, синтезированных в компании Евроген (Россия). Применялась ПЦР-смесь accuprime (Invitrogen, США), для избавления от исходной плазмиды использовалась DpnI рестриктаза (NEB, США), согласно рекомендациям фирмы-производителя. Для амплификации вектора использовался бактериальный копийный штамм E.coli, TOP10.

Сущность изобретения поясняется фигурами 1-5.

На фиг. 1 представлена заявляемая ДНК-последовательность.

ATGAAGACCATCATCGCTCTGTCCTACATCTTCTGCCTCGTGTTCGCCGACTACAAGGACGATGACGATGCTGGGCGCGCCatggaatcgggactcttgcgtccggctcctgtctctgaggtcatcgttctgcattacaactacactggaaaactgaggggtgcgaggtaccagcctggagctggattgagagctgacgcagtggtctgcctggcagtttgtgcgttcatcgtgctcgagaacttggctgtgctgctcgtcctgggaaggcacccaagattccatgctccgatgttcttgctgctcggttcactcaccttgagtgatttgctggctggcgctgcctacgcagcgaacatcctcttgtcgggaccactgaccctcaagttgtccccggctctgtggttcgccagagagggtggcgtcttcgttgctctgactgccagcgtcctctctctgctcgcaattgcgttggaacgctccctgacaatggcacgccgtggaccagcaccggtgtccagcagaggacgtacgctcgctatggctgcagcagcatggggagtctcattgctgctcggtttgctgccagctctgggatggaactgcctgggaagactcgacgcctgttccactgttctgccgctctacgctaaggcctacgttctcttctgcgtgttggccttcgtcggcatcctcgctgccatttgcgcattgtacgcgaggatctactgtcaggtgagagcaaacgctGCTGATCTGGAAGACAATTGGGAAACTCTGAACGACAATCTCAAGGTGATCGAGAAGGCTGACAATGCTGCACAAGTCAAAGACGCTCTGACCAAGATGAGGGCAGCAGCCCTGGACGCTCAGAAGGCCACTCCACCTAAGCTCGAGGACAAGAGCCCAGATAGCCCTGAAATGAAAGACTTTCGGCATGGATTCGACATTCTGGTGGGACAGATTGATGATGCACTCAAGCTGGCCAATGAAGGGAAAGTCAAGGAAGCACAAGCAGCCGCTGAGCAGCTGAAGACCACCCGGAATGCATACATTCAGAAGTACCTGcgccgtaaaccacgtagcctggctctcttgaggacactctctgttgtgctgctcgctttcgtcgcctgctggggaccactgttcttgctgctcttgctggacgtcgcatgccctgcgcgtacgtgtcccgttctcttgcaagccgatcctttcttgggtctggctatggccaactctctgctcaaccccatcatttacacattgacgaaccgcgacctgcgtcacgctttgctgaggctggtgGGAAGACCTCTGGAGGTGCTCTTCCAGGGTCCCCACCATCATCACCATCATCACCACCACCACTAA

На фиг.2 представлена схема с аминокислотной последовательностью.

Оценка эффективности заявляемой генетической конструкции для реализации указанного назначения проводилась следующим образом. Плазмидой трансформировались бактериальные клетки E.coli штамма DH10Bac, в котором методом сайт-специфичной транспозиции ген интереса встраивался в челночный вектор бакмиду, содержащую геном бакуловируса AcNPV. Клетки Sf9 трансфецировались бакмидой, и формировался вирус, в геноме которого содержался ген S1P5 рецептора. В результате чего получалась клеточная культура, экспрессирующая белок на клеточной мембране, что проверялось методом проточной цитометрии. После наработки биомассы проводилось выделение мембранной фракции путем лизиса клеток в гипотоническом буфере и отделения цитозольной фракции в гипертоническом буфере, затем солюбилизация белка мягким детергентом и очистка при помощи металл-аффинной хроматографии, белок при этом стабилизировался добавлением лиганда, начиная с шага солюбилизации. Чистота белкового препарата проверялась электрофоретическим методом. Затем исследовалась степень агрегации рецептора методом аналитической гель-фильтрационной ВЭЖХ и стабильность методом анализа кривой плавления с CPM красителем (C1484, Sigma, США). Чистота препарата составляла более 90%, степень мономерности - более 90%, температура плавления составляла 63 градусов с лигандом и 45 градусов для Апо формы. Проводилась кристаллизация в липидной кубической фазе, и были получены белковые кристаллы с обратным агонистом ONO-5430608, продифрагировавшие до 2.2 Å (фиг. 3).

На фиг. 3. представлены характеристика и кристаллизация S1P5-ONO-5430608: (a) Анализ очищенного S1P5 в комплексе с ONO-5430608 методом гель-фильтрации, показывающий преимущественно мономерный белковый препарат (пик мономера показан стрелкой); (b) Анализ термического сдвига с использованием флуоресценции CPM. Обратный агонист (ONO-5430608) повышает термостабильность S1P5 на 19°С. (с) Микрофотографии в поляризованном и видимом свете характерных кристаллов комплексов с лигандом ONO-5430608

Использование заявляемой генетической конструкции позволяет проводить рентгеноструктурный анализ кристаллов S1P5 рецептора и изучать белок при помощи различных биофизических методов исследования.

На фиг. 4 представлены примеры дифракционных картин, полученных на PAL XFEL. (a) Дифракционная картины, (b) радиальный профиль.

Кристаллы, полученные с помощью этой конструкции, достигали размера 30 мкм и давали кристаллические данные разрешением до 4 Å при криоохлаждении на синхротронном источнике. Также оптимизировались условия для получения большого количества более мелких (5-10 мкм) кристаллов, которые пригодны для измерений с помощью серийной фемтосекундной кристаллографии при комнатной температуре на рентгеновском лазере на свободных электронах.

Полученные дифракционные картины позволили определить структуру S1P5 с разрешением 2.2 Å в комплексе с обратным агонистом (депонирована в PDB под идентификатором 7YXA). Соответствующая публикация доступна по адресу https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.02.25.480536v1

На фиг. 5. Представлена структура S1P5 в комплексе с обратным агонистом в сравнении с (a) структурой неактивного S1P1 в комплексе с ML056 (структура 3V2Y в PDB, получена методом рентгеноструктурного анализа) (b) структурой активного S1P5 в комплексе с сипонимодом (структура 7EW1 в PDB, получена методом криоэлектронной микроскопии)

Изобретение создано при выполнении работ по госзаданию FSMG-2020-0003, по теме "Влияние аллостерических модуляторов на структуру и конформационную динамику A2a-аденозинового рецептора», Соглашение №075 03 2022-107 от 14.01.2022, заказчик- Министерство науки и высшего образования Российской Федерации.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Modified S1P5

sequence.xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.1"

productionDate="2022-07-19">

</ApplicationIdentification>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное

автономное образовательное учреждение высшего образования «Московский

физико-технический институт (национальный исследовательский

университет)»</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Moscow Institute of Physics and

Technology</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Ляпина Елизавета

Алексеевна</InventorName>

<InventorNameLatin>Lyapina Elizaveta</InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Модифицированная генетическая

конструкция для рекомбинантной экспрессии и кристаллизации

человеческого S1P5 рецептора</InventionTitle>

<INSDSeq_length>1377</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..1377</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atgaagaccatcatcgctctgtcctacatcttctgcctcgtgttcgccg

actacaaggacgatgacgatgctgggcgcgccatggaatcgggactcttgcgtccggctcctgtctctga

ggtcatcgttctgcattacaactacactggaaaactgaggggtgcgaggtaccagcctggagctggattg

agagctgacgcagtggtctgcctggcagtttgtgcgttcatcgtgctcgagaacttggctgtgctgctcg

tcctgggaaggcacccaagattccatgctccgatgttcttgctgctcggttcactcaccttgagtgattt

gctggctggcgctgcctacgcagcgaacatcctcttgtcgggaccactgaccctcaagttgtccccggct

ctgtggttcgccagagagggtggcgtcttcgttgctctgactgccagcgtcctctctctgctcgcaattg

cgttggaacgctccctgacaatggcacgccgtggaccagcaccggtgtccagcagaggacgtacgctcgc

tatggctgcagcagcatggggagtctcattgctgctcggtttgctgccagctctgggatggaactgcctg

ggaagactcgacgcctgttccactgttctgccgctctacgctaaggcctacgttctcttctgcgtgttgg

ccttcgtcggcatcctcgctgccatttgcgcattgtacgcgaggatctactgtcaggtgagagcaaacgc

tgctgatctggaagacaattgggaaactctgaacgacaatctcaaggtgatcgagaaggctgacaatgct

gcacaagtcaaagacgctctgaccaagatgagggcagcagccctggacgctcagaaggccactccaccta

agctcgaggacaagagcccagatagccctgaaatgaaagactttcggcatggattcgacattctggtggg

acagattgatgatgcactcaagctggccaatgaagggaaagtcaaggaagcacaagcagccgctgagcag

ctgaagaccacccggaatgcatacattcagaagtacctgcgccgtaaaccacgtagcctggctctcttga

ggacactctctgttgtgctgctcgctttcgtcgcctgctggggaccactgttcttgctgctcttgctgga

cgtcgcatgccctgcgcgtacgtgtcccgttctcttgcaagccgatcctttcttgggtctggctatggcc

aactctctgctcaaccccatcatttacacattgacgaaccgcgacctgcgtcacgctttgctgaggctgg

tgggaagacctctggaggtgctcttccagggtccccaccatcatcaccatcatcaccaccaccactaa</

INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Генетическая конструкция с нуклеотидной последовательностью SEQ ID No: 1, кодирующая человеческий сфингозин-1-фосфатный рецептор типа 5 (human sphingosine-1-phosphate receptor 5, S1P5).

Изобретение относится к области биотехнологии и ветеринарии, в частности к клетке насекомого, обеспечивающей оптимизированную экспрессию мутантного белка ORF2 PCV2b; к вирусоподобной частице (VLP) мутантного белка ORF2 PCV2b; к способу экспрессии и получения мутантного белка ORF2 PCV2b в клетках насекомых; к вакцине для свиней для подавления PCV2 инфекции или связанных с ней признаков заболевания, содержащей мутантный белок ORF2 PCV2b, и способу ее получения; к способу подавления PCV2 инфекции или связанных с ней признаков заболевания у свиньи с помощью вышеупомянутой вакцины, а также к мутантному белку ORF2 PCV2b и его применению.

Экспрессионный вектор на основе аденоассоциированного вируса и способ его применения для экстренной профилактики и профилактики заболеваний, вызываемых вирусом sars-cov-2 (варианты) // 2777404

Группа изобретений относится к биотехнологии, иммунологии и микробиологии. Создан экспрессионный вектор на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса, со встроенной генетической конструкцией, экспрессирующий рекомбинантное антитело, имеющее CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3, либо имеющее CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:4, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:5, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:6, либо имеющее CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:8, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:9, а также предложено применение данного вектора для экстренной профилактики и профилактики заболевания, вызванного вирусом SARS-CoV-2.

Рекомбинантные вирусоподобные частицы для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома sars-cov-2 // 2769224

Группа изобретений относится к области биотехнологии и генной инженерии. Описана рекомбинантная вирусоподобная частица для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2, содержащая рекомбинантные белки коронавируса E, M, N и один или несколько S белков различных штаммов коронавируса, содержащие нуклеотидные последовательности SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, которые получены в бакуловирусной системе экспрессии насекомых, при этом вирусоподобная частица имитирует вирион SARS-CoV-2.

Продуцирование aav в клетках насекомых, способы и композиции для этого // 2739596

Изобретение относится к биотехнологии. Раскрыты композиции и способы для продуцирования аденоассоциированного вируса (AAV) в клетках насекомых in vitro.

Модифицированная генетическая конструкция для рекомбинантной экспрессии и кристаллизации человеческого cyslt1 рецептора // 2735281

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантному получению человеческого лейкотриенового рецептора типа 1 (human cysteinyl leikotriene receptor 1, CysLTR1), и может быть использовано для экспрессии CysLT1 рецептора. Предложена генетическая конструкция с нуклеотидной последовательностью, которая оптимизирована для экспрессии CysLTR1 в клетках насекомых.

Элементы рекомбинантной днк для экспрессии рекомбинантных белков в клетке-хозяине // 2619161

Настоящая группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены рекомбинантный бакуловирус для экспрессии рекомбинантного белка, вектор переноса, клонирующий вектор и последовательность нуклеиновой кислоты, подходящие для получения указанного бакуловируса, и их применение, а также клетка-хозяин и способ продукции рекомбинантного белка.

Векторы // 2569183

Изобретение относится к области генетической инженерии. Предложен вектор переноса для встраивания гена в генетический локус последовательности бакуловируса, содержащий кассету экспрессии, содержащую эукариотический промотор, функционально связанный с указанным геном, удаляемую кассету двойной селекции, которая фланкирована последовательностями рекомбинации LoxP, причем указанные последовательности LoxP модифицированы, чтобы обеспечить прохождение только одного цикла рекомбинации, содержащую экспрессируемую последовательность, кодирующую первый селектируемый маркер, экспрессируемую последовательность, кодирующую второй селектируемый маркер, последовательности, фланкирующие указанные кассету экспрессии и кассету двойной селекции, причем указанные последовательности в существенной степени соответствуют последовательностям указанного генетического локуса в последовательности бакуловируса, что обеспечивает гомологическую рекомбинацию между указанным вектором переноса и указанным бакуловирусом.

Бакуловирусные векторы с двойным промотором, включающим в себя промотор позвоночного и промотор бакуловируса, контролирующим иммуногенный слитый ген // 2491093

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. .

Полипептиды для лечения заболеваний // 2792848

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к новым пептидам для лечения рака. Изобретение раскрывает пептид, эффективный в блокировании CXC-хемокинового рецептора 4 (CXCR4).

Моноклональное антитело, специфично связывающееся с эпитопом тиоредоксина-1, его получение и применение // 2791264

Группа изобретений относится к иммунологии. Предложено моноклональное антитело, специфично связывающееся с тиоредоксином-1 (Trx1), или его антигенсвязывающий фрагмент, включающее вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 с SEQ ID NO: 7, CDR2 с SEQ ID NO: 8, CDR3 с SEQ ID NO: 9, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 с SEQ ID NO: 10, CDR2 с SEQ ID NO: 11, CDR3 с SEQ ID NO: 12.

Моноклональное антитело, специфично связывающееся с эпитопом тиоредоксина-1, его получение и применение // 2790687

Группа изобретений относится к иммунологии. Предложено моноклональное антитело, специфично связывающееся с тиоредоксином-1 (Trx1), или его антигенсвязывающий фрагмент, включающие вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 с SEQ ID NO: 1, CDR2 с SEQ ID NO: 2, CDR3 с SEQ ID NO: 3, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 с SEQ ID NO: 4, CDR2 с SEQ ID NO: 5, CDR3 с SEQ ID NO: 6.