Композиции и способы для производства т-клеток

Авторы патента:

ВАН БЮРЕН, Марит М. (US)

ЛЕНКЕЛА, Дайвайа Редди (US)

ВАН ДЕН БЕРГ, Йост Хейберт (NL)

КОХЛЕР, Джессика (US)

ГОЛДШТЕЙН, Мэттью (US)

ФРИТШ, Эд (US)

ДЕБУР, Ренате (NL)

СХЮМАГЕР, Тон (NL)

БАККЕР, Нор (NL)

C12N5/0783 - Недифференцированные клетки человека, животных или растений, например клеточные линии; ткани; культивирование или сохранение их; питательные среды для них (размножение растений из тканевых культур A01H 4/00)

A61P35/00 - Противоопухолевые средства

A61K39/00 - Лекарственные препараты, содержащие антигены или антитела (материалы для иммунологического анализа G01N 33/53)

A61K35/15 - Лекарственные препараты, содержащие вещества или продукты реакции неизвестного строения

Владельцы патента RU 2793344:

БайоНТек ЮЭс Инк. (US)
СТИХТИНГ ХЕТ НЕДЕРЛАНДС КАНКЕР ИНСТИТЮЮТ - АНТОНИ ВАН ЛЕВЕНГУК ЗИКЕНХЕЙС (NL)

Группа изобретений относится к области фармацевтики и медицины. Первый объект представляет собой способ получения опухолевых антигенспецифических Т-клеток ex vivo, включающий: (a) истощение CD14+ клеток и CD25+ клеток в популяции иммунных клеток, включающих антигенпрезентирующие клетки (APC) и Т-клетки, причем популяция иммунных клеток взята из биологического образца субъекта-человека, больного раком; (b) инкубирование истощенной по CD14/CD25 популяции иммунных клеток в присутствии: (i) лиганда рецептора FMS-подобной тирозинкиназы 3 (FLT3L) и (ii) (A) полипептида, содержащего по меньшей мере две последовательности эпитопа опухолевого антигена, экспрессируемые раковыми клетками субъекта-человека, или (B) полинуклеотида, кодирующего полипептид, тем самым формируя популяцию стимулированных Т-клеток; и (c) выращивание популяции стимулированных Т-клеток. Второй объект представляет собой фармацевтическую композицию для лечения рака, содержащую выращенную популяцию истощенных по CD14/CD25 Т-клеток. Технический результат заключается в образовании опухолевых антигенспецифических CD8+ и CD4+ Т-клеток, которое приводит к генерации популяции антигенспецифических Т-клеток для терапевтического использования для создания иммунного ответа, из наивных CD8+ и CD4+ Т-клеток. 2 н. и 16 з.п. ф-лы, 43 ил., 7 табл., 28 пр.

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] По настоящей заявке испрашивается приоритет по временной заявке США № 62/583229, поданной 8 ноября 2017 года; временной заявке США № 62/588590, поданной 20 ноября 2017 года; временной заявке США № 62/618445, поданной 17 января 2018 года; и временной заявке США № 62/737625, поданной 27 сентября 2018 года, включенных в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002] Противоопухолевые вакцины, как правило, состоят из опухолевых антигенов и иммуностимулирующих молекул (например, адъювантов, цитокинов или TLR-лигандов), действующих совместно, индуцируя антигенспецифические T-клетки (CTL), распознающие и лизирующие опухолевые клетки. Такие вакцины содержат перекрестно-реагирующие ткане-рестриктированные опухолевые антигены или смесь перекрестно-реагирующих антигенов и специфических для пациента антигенов в форме препаратов целых опухолевых клеток. Перекрестно-реагирующие ткане-рестриктированные опухолевые антигены теоретически являются иммуногенными белками с селективной экспрессией в опухолях среди множества индивидуумов, и их, как правило, вводят пациентам в виде синтетических пептидов или рекомбинантных белков. В отличие от этого, препараты целых опухолевых клеток вводят пациентам в виде аутологичных облученных клеток, клеточных лизатов, слитых клеток, препаратов белков теплового шока или тотальной мРНК. Т.к. целые опухолевые клетки выделяют из аутологичного пациента, клетки могут включать специфические для пациента опухолевые антигены, а также перекрестно-реагирующие ткане-рестриктированные опухолевые антигены. И наконец, существует третий класс опухолевых антигенов, неоантигены, которые редко используют в вакцинах, состоящих из белков с опухолеспецифическими мутациями (которые могут являться специфическими для пациента или перекрестно-реагирующими), приводящими к изменению аминокислотных последовательностей. Такие мутантные белки являются: (a) уникальными для опухолевой клетки, т.к. мутация и соответствующий ей белок присутствуют только в опухоли; (b) избегают центральной толерантности и, таким образом, более вероятно, что они будут иммуногенными; (c) представляют собой превосходную мишень для иммунного распознавания, включая гуморальный и клеточный иммунитет.

[0003] Адоптивная иммунотерапия или адоптивная клеточная терапия (ACT) представляет собой перенос генно-модифицированных T-лимфоцитов индивидууму для терапии заболевания. Потенциал адоптивной иммунотерапии в отношении лечения широкого спектра заболеваний, включая злокачественные новообразования, инфекционные заболевания, аутоиммунные заболевания, воспалительные заболевания и иммунодефицит, еще не реализован. Однако, для большинства, если не всех, стратегий адоптивной иммунотерапии необходимы стадии активации и экспансии T-клеток для получения клинически эффективных T-клеток в терапевтической дозе. Из-за характерной сложности культивирования живых клеток и межиндивидуальной вариабельности существующие технологии получения терапевтических доз T-клеток, включая сконструированные T-клетки, остаются ограниченными трудоемкими способами производства T-клеток. Существующие способы производства T-клеток нелегко масштабировать, воспроизводить, они ненадежны или неэффективны, и зачастую с их помощью получают T-клеточный продукт недостаточного качества, который может быть склонен к истощению и утрате эффекторной функции иммунных клеток. К настоящему времени, адоптивная иммунотерапия с использованием сконструированных T-клеток имеет лишь ограниченный успех и, как правило, демонстрирует переменную клиническую активность. Таким образом, такие способы терапии не подходят для широкого клинического использования. Таким образом, остается потребность в разработке композиций и способов для экспансии и индуцирования антигенспецифических T-клеток с подходящим фенотипом и функцией.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0004] В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей: популяцию иммунных клеток из биологического образца, содержащего по меньшей мере одну антигенспецифическую T-клетку, содержащую T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, и фармацевтически приемлемый эксципиент; где количество иммунных клеток, экспрессирующих CD14 и/или CD25, в популяции пропорционально отличается от количества иммунных клеток, экспрессирующих CD14 и/или CD25, в биологическом образце. В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей: популяцию иммунных клеток из биологического образца, содержащего по меньшей мере одну антигенспецифическую T-клетку, содержащую T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, и фармацевтически приемлемый эксципиент; где количество иммунных клеток, экспрессирующих CD14 и/или CD25, в популяции отличается от количества иммунных клеток, экспрессирующих CD14 и/или CD25, в биологическом образце. В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей: популяцию иммунных клеток из биологического образца, содержащего по меньшей мере одну антигенспецифическую T-клетку, содержащую T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, и фармацевтически приемлемый эксципиент; где процентная доля иммунных клеток, экспрессирующих CD14 и/или CD25, в популяции отличается от процентной доли иммунных клеток, экспрессирующих CD14 и/или CD25, в биологическом образце. В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей: популяцию иммунных клеток из биологического образца, содержащего по меньшей мере одну антигенспецифическую T-клетку, содержащую T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, и фармацевтически приемлемый эксципиент; где концентрация иммунных клеток, экспрессирующих CD14 и/или CD25, в популяции отличается от концентрации иммунных клеток, экспрессирующих CD14 и/или CD25, в биологическом образце.

[0005] В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к композиции, содержащей популяцию иммунных клеток из биологического образца, где количество иммунных клеток, экспрессирующих CD14 и CD25, в популяции пропорционально меньше количества иммунных клеток, экспрессирующих CD14 и CD25, в биологическом образце. В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к композиции, содержащей популяцию иммунных клеток из биологического образца, где количество иммунных клеток, экспрессирующих CD14 и CD25, в популяции меньше количества иммунных клеток, экспрессирующих CD14 и CD25, в биологическом образце. В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к композиции, содержащей популяцию иммунных клеток из биологического образца, где процентная доля иммунных клеток, экспрессирующих CD14 и CD25, в популяции меньше процентной доли иммунных клеток, экспрессирующих CD14 и CD25, в биологическом образце. В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к композиции, содержащей популяцию иммунных клеток из биологического образца, где концентрация иммунных клеток, экспрессирующих CD14 и CD25, в популяции меньше концентрации иммунных клеток, экспрессирующих CD14 и CD25, в биологическом образце.

[0006] В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей популяцию иммунных клеток, содержащую T-клетки из биологического образца, где T-клетки включают по меньшей мере одну антигенспецифическую T-клетку, являющуюся стимулированной антигенпрезентирующей клеткой (APC) T-клеткой и содержащую T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, где APC является FLT3L-стимулированной APC; и фармацевтически приемлемый эксципиент.

[0007] В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей популяцию иммунных клеток, содержащую T-клетки из биологического образца, где T-клетки включают по меньшей мере одну антигенспецифическую T-клетку, содержащую T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, и фармацевтически приемлемый эксципиент; где по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка составляет по меньшей мере, приблизительно 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% всех T-клеток, всех CD4⁺ T-клеток, всех CD8⁺ T-клеток или всех иммунных клеток; и где биологический образец содержит одну или более антигенспецифических T-клеток, где одна или более антигенспецифических T-клеток в биологическом образце составляет не более приблизительно 0,00001%, 0,00005%, 0,0001%, 0,0005%, 0,001%, 0,005%, 0,01% или 0,05% всех CD4⁺ T-клеток, всех CD8⁺ T-клеток, всех T-клеток или всех иммунных клеток в биологическом образце. В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей популяцию иммунных клеток, содержащую T-клетки, выращенные или индуцированные из биологического образца, где выращенные или индуцированные T-клетки из биологического образца содержат по меньшей мере одну антигенспецифическую T-клетку, содержащую T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, и фармацевтически приемлемый эксципиент; где количество, концентрация или процентная доля по меньшей мере одной антигенспецифической T-клетки составляет по меньшей мере приблизительно в 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,6, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 раз больше, чем количество, концентрация или процентная доля антигенспецифических T-клеток или всех T-клеток в биологическом образце. В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей популяцию иммунных клеток, содержащую T-клетки из биологического образца, где T-клетки включают по меньшей мере одну антигенспецифическую T-клетку, содержащую T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, и фармацевтически приемлемый эксципиент; где по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка включает выращенные или индуцированные антигенспецифические T-клетки, выращенные или индуцированные по меньшей мере приблизительно в 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,6, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 раз относительно биологического образца. В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей популяцию иммунных клеток, содержащую CD4⁺ T-клетки из биологического образца, где CD4⁺ T-клетки включают по меньшей мере одну антигенспецифическую CD4+ T-клетку, содержащую T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, и фармацевтически приемлемый эксципиент; где по меньшей мере одна антигенспецифическая CD4⁺ T-клетка составляет по меньшей мере приблизительно 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% всех T-клеток, всех CD4⁺ T-клеток, всех CD8⁺ T-клеток или всех иммунных клеток; и где биологический образец содержит одну или более антигенспецифических CD4⁺ T-клеток, где одна или более антигенспецифических CD4+ T-клеток в биологическом образце составляют не более приблизительно 0,00001%, 0,00005%, 0,0001%, 0,0005%, 0,001%, 0,005%, 0,01% или 0,05% всех CD4⁺ T-клеток, всех CD8⁺ T-клеток, всех T-клеток или всех иммунных клеток в биологическом образце. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит популяцию иммунных клеток, содержащую CD4⁺ T-клетки из биологического образца, где CD4⁺ T-клетки включают по меньшей мере одну антигенспецифическую CD4⁺ T-клетку, содержащую T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, и фармацевтически приемлемый эксципиент; где по меньшей мере одна антигенспецифическая CD4⁺ T-клетка составляет по меньшей мере приблизительно 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% всех CD4⁺ T-клеток; и где биологический образец содержит одну или более антигенспецифических CD4⁺ T-клеток, где одна или более антигенспецифических CD4⁺ T-клеток в биологическом образце составляет не более приблизительно 0,00001%, 0,00005%, 0,0001%, 0,0005%, 0,001%, 0,005%, 0,01% или 0,05% всех CD4⁺ T-клеток в биологическом образце. В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей популяцию иммунных клеток, содержащую CD4⁺ T-клетки, выращенные или индуцированные из биологического образца, где CD4⁺ T-клетки, выращенные или индуцированные из биологического образца, включают по меньшей мере одну антигенспецифическую CD4⁺ T-клетку, содержащую T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, и фармацевтически приемлемый эксципиент; где количество, концентрация или процентная доля по меньшей мере одной антигенспецифической T-клетки составляет по меньшей мере приблизительно в 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,6, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 больше количества, концентрации или процентной доли антигенспецифических CD4⁺ T-клеток, всех CD4+ T-клеток или всех T-клеток в биологическом образце. В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей популяцию иммунных клеток, содержащую CD4⁺ T-клетки из биологического образца, где CD4⁺ T-клетки включают по меньшей мере одну антигенспецифическую CD4⁺ T-клетку, содержащую T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, и фармацевтически приемлемый эксципиент; где по меньшей мере одна антигенспецифическая CD4⁺ T-клетка включает выращенные или индуцированные антигенспецифические CD4⁺ T-клетки, выращенные или индуцированные по меньшей мере приблизительно в 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,6, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 раз относительно биологического образца. В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей популяцию иммунных клеток, содержащую CD4⁺ T-клетки из биологического образца, истощенные в отношении CD25-экспрессирующих клеток или CD25- и CD14-экспрессирующих клеток, где CD4⁺ T-клетки включают по меньшей мере одну антигенспецифическую CD4⁺ T-клетку, содержащую T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, и фармацевтически приемлемый эксципиент; где по меньшей мере одна антигенспецифическая CD4⁺ T-клетка включает выращенные или индуцированные антигенспецифические CD4⁺ T-клетки, выращенные или индуцированные по меньшей мере приблизительно в 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,6, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475 или 500 раз по сравнению с биологическим образцом. В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей популяцию иммунных клеток, содержащую CD8⁺ T-клетки из биологического образца, где CD8⁺ T-клетки включают по меньшей мере одну антигенспецифическую CD8⁺ T-клетку, содержащую T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, и фармацевтически приемлемый эксципиент; где по меньшей мере одна антигенспецифическая CD8⁺ T-клетка составляет по меньшей мере приблизительно 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% всех T-клеток, всех CD4⁺ T-клеток, всех CD8⁺ T-клеток или всех иммунных клеток; и где биологический образец содержит одну или более антигенспецифических CD8⁺ T-клеток, где одна или более антигенспецифических CD8⁺ T-клеток в биологическом образце составляет не более приблизительно 0,00001%, 0,00005%, 0,0001%, 0,0005%, 0,001%, 0,005%, 0,01% или 0,05% всех CD4⁺ T-клеток, всех CD8⁺ T-клеток, всех T-клеток или всех иммунных клеток в биологическом образце. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит популяцию иммунных клеток, содержащую CD8⁺ T-клетки из биологического образца, где CD8⁺ T-клетки включают по меньшей мере одну антигенспецифическую CD8⁺ T-клетку, содержащую T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, и фармацевтически приемлемый эксципиент; где по меньшей мере одна антигенспецифическая CD8⁺ T-клетка составляет по меньшей мере приблизительно 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% всех CD8⁺ T-клеток; и где биологический образец содержит одну или более антигенспецифических CD4⁺ T-клеток, где одна или более антигенспецифических CD8⁺ T-клеток в биологическом образце составляет не более приблизительно 0,00001%, 0,00005%, 0,0001%, 0,0005%, 0,001%, 0,005%, 0,01% или 0,05% всех CD8⁺ T-клеток в биологическом образце. В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей популяцию иммунных клеток, содержащую CD8⁺ T-клетки, выращенные или индуцированные из биологического образца, где CD8⁺ T-клетки, выращенные или индуцированные из биологического образца, включают по меньшей мере одну антигенспецифическую CD8⁺ T-клетку, содержащую T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, и фармацевтически приемлемый эксципиент; где количество, концентрация или процентная доля по меньшей мере одной антигенспецифической T-клетки составляет по меньшей мере приблизительно в 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,6, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 раз больше количества, концентрации или процентной доли антигенспецифических CD8⁺ T-клеток, всех CD8⁺ T-клеток или всех T-клеток в биологическом образце. В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей популяцию иммунных клеток, содержащую CD8⁺ T-клетки из биологического образца, где CD8⁺ T-клетки включают по меньшей мере одну антигенспецифическую CD8⁺ T-клетку, содержащую T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, и фармацевтически приемлемый эксципиент; где по меньшей мере одна антигенспецифическая CD8⁺ T-клетка включает выращенные или индуцированные антигенспецифические CD4⁺ T-клетки, выращенные или индуцированные по меньшей мере приблизительно в 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,6, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 раз относительно биологического образца. В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей популяцию иммунных клеток, содержащую CD8⁺ T-клетки из биологического образца, где CD8⁺ T-клетки включают по меньшей мере одну антигенспецифическую CD8⁺ T-клетку, содержащую T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, и фармацевтически приемлемый эксципиент; где по меньшей мере одна антигенспецифическая CD8⁺ T-клетка включает выращенные или индуцированные антигенспецифические CD8⁺ T-клетки, выращенные или индуцированные по меньшей мере приблизительно в 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,6, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900 раз относительно биологического образца.

[0008] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка включает по меньшей мере одну APC-стимулированную T-клетку. В некоторых вариантах осуществления количество иммунных клеток, экспрессирующих CD14 и/или CD25, в популяции пропорционально меньше количества иммунных клеток, экспрессирующих CD14 и/или CD25, в биологическом образце. В некоторых вариантах осуществления количество иммунных клеток, экспрессирующих CD14 и/или CD25, в популяции пропорционально больше количества иммунных клеток, экспрессирующих CD14 и/или CD25, в биологическом образце. В некоторых вариантах осуществления процентная доля иммунных клеток, экспрессирующих CD14 и/или CD25, в популяции меньше процентной доли иммунных клеток, экспрессирующих CD14 и/или CD25, в биологическом образце. В некоторых вариантах осуществления процентная доля иммунных клеток, экспрессирующих CD14 и/или CD25, в популяции больше процентной доли иммунных клеток, экспрессирующих CD14 и/или CD25, в биологическом образце. В некоторых вариантах осуществления концентрация иммунных клеток, экспрессирующих CD14 и/или CD25, в популяции меньше концентрации иммунных клеток, экспрессирующих CD14 и/или CD25, в биологическом образце. В некоторых вариантах осуществления концентрация иммунных клеток, экспрессирующих CD14 и/или CD25, в популяции больше концентрации иммунных клеток, экспрессирующих CD14 и/или CD25, в биологическом образце.

[0009] В некоторых вариантах осуществления биологический образец получают из индивидуума. В некоторых вариантах осуществления индивидуум является человеком. В некоторых вариантах осуществления индивидуум имеет заболевание или нарушение. В некоторых вариантах осуществления заболевание или нарушение является злокачественным новообразованием. В некоторых вариантах осуществления злокачественное новообразование выбрано из группы, состоящей из рака яичников, рака легких и меланомы.

[0010] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка включает по меньшей мере одну CD4⁺ T-клетку. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка включает по меньшей мере одну CD8⁺ T-клетку. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка включает по меньшей мере одну CD4-обогащенную T-клетку. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка включает по меньшей мере одну CD8-обогащенную T-клетку. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка включает T-клетку памяти. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка включает наивную T-клетку. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка включает CD4⁺ T-клетку памяти. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка включает выращенную CD4⁺ T-клетку памяти. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка включает наивную CD4⁺ T-клетку. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка включает индуцированную наивную CD4⁺ T-клетку. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка включает CD8⁺ T-клетку памяти. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка включает выращенную CD8⁺ T-клетку памяти. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка включает наивную CD8⁺ T-клетку. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка включает индуцированную наивную CD8⁺ T-клетку.

[0011] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одну антигенспецифическую T-клетку стимулируют в среде, содержащей ИЛ-7, ИЛ-15, ингибитор индоламин-2,3-диоксигеназы-1 (IDO), антитело против PD-1, ИЛ-12 или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления ингибитор IDO является эпакадостатом, навоксимодом, 1-метилтриптофаном или их комбинацией.

[0012] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна пептидная последовательность антигена содержит мутацию, выбранную из (A) точечной мутации, (B) мутации участка сплайсинга, (C) мутации со сдвигом рамки считывания, (D) мутации сквозного прочитывания терминатора, (E) мутации со слиянием генов и их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна пептидная последовательность антигена связывается с белком HLA индивидуума с более высокой аффинностью, чем соответствующий пептид дикого типа. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна пептидная последовательность антигена связывается с белком HLA индивидуума с K_D или IC₅₀ менее 500 нМ, 250 нМ, 150 нМ, 100 нМ, 50 нМ, 25 нМ или 10 нМ. В некоторых вариантах осуществления каждая из по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена связывается с белком, кодируемым аллелем HLA, экспрессируемым индивидуумом. В некоторых вариантах осуществления TCR связывается с комплексом пептид-HLA с K_D или IC₅₀ менее 500 нМ, 250 нМ, 150 нМ, 100 нМ, 50 нМ, 25 нМ или 10 нМ. В некоторых вариантах осуществления каждая из по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена содержит мутацию, отсутствующую в незлокачественных клетках индивидуума. В некоторых вариантах осуществления каждая из по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена кодируется геном или экспрессируемым геном злокачественных клеток индивидуума.

[0013] В некоторых вариантах осуществления одна или более из по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена имеет длину по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 4000, 5000, 7500 или 10000 природных аминокислот. В некоторых вариантах осуществления одна или более из по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена связывается с белком, кодируемым аллелем HLA класса I и имеет длину 8-12 природных аминокислот. В некоторых вариантах осуществления одна или более из по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена связывается с белком, кодируемым аллелем HLA класса II и имеет длину 16-25 природных аминокислот.

[0014] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна пептидная последовательность антигена включает множество пептидных последовательностей антигена. В некоторых вариантах осуществления множество пептидных последовательностей антигена включает по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 или 500 пептидных последовательностей антигена. В некоторых вариантах осуществления антиген является неоантигеном, опухолеассоциированным антигеном, гиперэкспрессированным антигеном, вирусным антигеном, минорным антигеном гистосовместимости или их комбинацией.

[0015] В некоторых вариантах осуществления APC представляет собой один или более препаратов APC. В некоторых вариантах осуществления APC включает APC, нагруженные одним или более антигенными пептидами, содержащими одну или более из по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена. В некоторых вариантах осуществления APC является аутологичной APC, аллогенной APC или искусственной APC. В некоторых вариантах осуществления APC включает дендритную клетку (DC). В некоторых вариантах осуществления APC получают из CD14⁺ моноцита. В некоторых вариантах осуществления APC является CD14-обогащенной APC. В некоторых вариантах осуществления APC является CD141-обогащенной APC. В некоторых вариантах осуществления CD14⁺ моноцит обогащают в биологическом образце, содержащем PBMC, из индивидуума. В некоторых вариантах осуществления CD14⁺ моноцит стимулируют одним или более цитокинами или факторами роста. В некоторых вариантах осуществления один или более цитокинов или факторов роста включают ГМ-КСФ, ИЛ-4, FLT3L, ФНОα, ИЛ-1β, PGE1, ИЛ-6, ИЛ-7, ИФНα, R848, LPS, ss-rna40, поли-I:C или их комбинацию.

[0016] В некоторых вариантах осуществления CD14⁺ моноцит получают из второго биологического образца, содержащего PBMC. В некоторых вариантах осуществления второй биологический образец получают из того же индивидуума.

[0017] В некоторых вариантах осуществления биологический образец содержит мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC).

[0018] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка включает множество антигенспецифических T-клеток. В некоторых вариантах осуществления процентная доля по меньшей мере одной антигенспецифической T-клетки в композиции составляет по меньшей мере приблизительно 0,00001%, 0,00002%, 0,00005%, 0,0001%, 0,0005%, 0,001%, 0,005%, 0,01%, 0,05%, 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% всех T-клеток или всех иммунных клеток. В некоторых вариантах осуществления процентная доля по меньшей мере одной антигенспецифической CD8⁺ T-клетки в композиции составляет по меньшей мере приблизительно 0,00001%, 0,00002%, 0,00005%, 0,0001%, 0,0005%, 0,001%, 0,005%, 0,01%, 0,05%, 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% всех CD4⁺ T-клеток, всех CD8⁺ T-клеток, всех T-клеток или всех иммунных клеток. В некоторых вариантах осуществления процентная доля по меньшей мере одной антигенспецифической CD4⁺ T-клетки в композиции составляет по меньшей мере приблизительно 0,00001%, 0,00002%, 0,00005%, 0,0001%, 0,0005%, 0,001%, 0,005%, 0,01%, 0,05%, 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% всех CD4⁺ T-клеток, всех CD8⁺ T-клеток, всех T-клеток или всех иммунных клеток. В некоторых вариантах осуществления процентная доля по меньшей мере одной антигенспецифической T-клетки в биологическом образце составляет не более приблизительно 0,00001%, 0,00005%, 0,0001%, 0,0005%, 0,001%, 0,005%, 0,01%, 0,05%, 0,1% или 0,5% всех CD4⁺ T-клеток, всех CD8⁺ T-клеток, всех T-клеток или всех иммунных клеток. В некоторых вариантах осуществления процентная доля по меньшей мере одной антигенспецифической CD8⁺ T-клетки в биологическом образце составляет не более приблизительно 0,00001%, 0,00005%, 0,0001%, 0,0005%, 0,001%, 0,005%, 0,01%, 0,05%, 0,1% или 0,5% всех CD4⁺ T-клеток, всех CD8⁺ T-клеток, всех T-клеток или всех иммунных клеток. В некоторых вариантах осуществления процентная доля по меньшей мере одной антигенспецифической CD4+ T-клетки в биологическом образце составляет не более приблизительно 0,00001%, 0,00005%, 0,0001%, 0,0005%, 0,001%, 0,005%, 0,01%, 0,05%, 0,1% или 0,5% всех CD4⁺ T-клеток, всех CD8⁺ T-клеток, всех T-клеток или всех иммунных клеток.

[0019] В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит: популяцию иммунных клеток из биологического образца, содержащую по меньшей мере одну антигенспецифическую T-клетку, содержащую T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, и фармацевтически приемлемый эксципиент; где количество иммунных клеток, экспрессирующих CD19 и/или CD16, в популяции отличается от количества иммунных клеток, экспрессирующих CD19 и/или CD16, в биологическом образце. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит: популяцию иммунных клеток из биологического образца, содержащую по меньшей мере одну антигенспецифическую T-клетку, содержащую T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, и фармацевтически приемлемый эксципиент; где количество иммунных клеток, экспрессирующих CD19 и/или CD16, в популяции меньше количества иммунных клеток, экспрессирующих CD19 и/или CD16, в биологическом образце.

[0020] В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к способу лечения, включающему введение композиции, представленной в настоящем описании, индивидууму с заболеванием или нарушением.

[0021] В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к способу применения композиции, представленной в настоящем описании, для производства лекарственного средства для применения в терапии.

[0022] В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения по меньшей мере одной антигенспецифической T-клетки, содержащей T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, включающему инкубацию APC с популяцией иммунных клеток из биологического образца, истощенного в отношении клеток, экспрессирующих CD25 или CD14 и CD25, где по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка включает количество выращенных или индуцированных антигенспецифических T-клеток, по меньшей мере приблизительно в 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,6, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475 или 500 раз более высокое, чем количество антигенспецифических T-клеток, выращенных или индуцированных способом, включающим инкубацию APC с популяцией иммунных клеток из биологического образца, истощенного в отношении клеток, экспрессирующих CD14. В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения по меньшей мере одной антигенспецифической CD4⁺ T-клетки, содержащей T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, включающему инкубацию APC с популяцией иммунных клеток из биологического образца, истощенного в отношении клеток, экспрессирующих CD25 или CD14 и CD25, где по меньшей мере одна антигенспецифическая CD4⁺ T-клетка включает количество выращенных или индуцированных антигенспецифических CD4⁺ T-клеток, по меньшей мере, приблизительно в 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,6, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475 или 500 раз более высокое, чем количество антигенспецифических CD4⁺ T-клеток, выращенных или индуцированных способом, включающим инкубацию APC с популяцией иммунных клеток из биологического образца, истощенного в отношении клеток, экспрессирующих CD14. В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения по меньшей мере одной антигенспецифической CD8⁺ T-клетки, содержащей T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, включающему инкубацию APC с популяцией иммунных клеток из биологического образца, истощенного в отношении клеток, экспрессирующих CD25 или CD14 и CD25, где по меньшей мере одна антигенспецифическая CD8⁺ T-клетка включает количество выращенных или индуцированных антигенспецифических CD8⁺ T-клеток, по меньшей мере приблизительно в 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,6, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475 или 500 раз более высокое, чем количество антигенспецифических CD8⁺ T-клеток, выращенных или индуцированных способом, включающим инкубацию APC с популяцией иммунных клеток из биологического образца, истощенного в отношении клеток, экспрессирующих CD14.

[0023] В некоторых вариантах осуществления биологический образец дополнительно истощают в отношении CD19-экспрессирующих клеток. В некоторых вариантах осуществления биологический образец дополнительно истощают в отношении CD19-экспрессирующих клеток. В некоторых вариантах осуществления APC является FLT3L-стимулированной APC. В некоторых вариантах осуществления инкубацию популяцию иммунных клеток осуществляют в среде, содержащей ИЛ-7, ИЛ-15 или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления среда дополнительно содержит ингибитор индоламин-2,3-диоксигеназы-1 (IDO), антитело против PD-1, ИЛ-12 или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления ингибитор IDO является эпакадостатом, навоксимодом, 1-метилтриптофаном или их комбинацией.

[0024] В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одну антигенспецифическую T-клетку, содержащую T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, включающему: инкубацию лиганда FMS-подобной тирозинкиназы 3 (FLT3L) с популяцией иммунных клеток из биологического образца в течение первого периода времени, а затем инкубацию по меньшей мере одной T-клетки из биологического образца с APC, где по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка включает количество выращенных или индуцированных антигенспецифических T-клеток, по меньшей мере приблизительно в 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,6, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475 или 500 раз более высокое, чем количество антигенспецифических T-клеток, выращенных или индуцированных способов, не включающим инкубацию лиганда FMS-подобной тирозинкиназы 3 (FLT3L) с популяцией иммунных клеток из биологического образца в течение первого периода времени; и не включающему затем инкубацию по меньшей мере одной T-клетки из биологического образца с APC. В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одну антигенспецифическую CD4⁺ T-клетку, содержащую T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, включающему: инкубацию лиганда FMS-подобной тирозинкиназы 3 (FLT3L) с популяцией иммунных клеток из биологического образца в течение первого периода времени, а затем инкубацию по меньшей мере одной CD4⁺T-клетки из биологического образца с APC, где по меньшей мере одна антигенспецифическая CD4⁺ T-клетка включает количество выращенных или индуцированных антигенспецифических CD4⁺ T-клеток, по меньшей мере приблизительно в 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,6, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475 или 500 раз более высокое, чем количество антигенспецифических CD4⁺ T-клеток, выращенных или индуцированных способом, не включающим инкубацию лиганда FMS-подобной тирозинкиназы 3 (FLT3L) с популяцией иммунных клеток из биологического образца в течение первого периода времени, и не включающему затем инкубацию по меньшей мере одной CD4⁺ T-клетки из биологического образца с APC. В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одну антигенспецифическую CD8⁺ T-клетку, содержащую T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, включающему: инкубацию лиганда FMS-подобной тирозинкиназы 3 (FLT3L) с популяцией иммунных клеток из биологического образца в течение первого периода времени, а затем инкубацию по меньшей мере одной CD8⁺ T-клетки из биологического образца с APC, где по меньшей мере одна антигенспецифическая CD8⁺ T-клетка включает количество выращенных или индуцированных антигенспецифических CD8⁺ T-клеток, по меньшей мере приблизительно в 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,6, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475 или 500 раз более высокое, чем количество антигенспецифических CD8⁺ T-клеток, выращенных или индуцированных способом, не включающим инкубацию лиганда FMS-подобной тирозинкиназы 3 (FLT3L) с популяцией иммунных клеток из биологического образца в течение первого периода времени, и не включающему затем инкубацию по меньшей мере одной CD8⁺ T-клетки из биологического образца с APC.

[0025] В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения по меньшей мере одной антигенспецифической T-клетки, содержащей T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, включающему инкубацию APC с популяцией иммунных клеток из биологического образца, истощенного в отношении клеток, экспрессирующих CD14 и/или CD25.

[0026] В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения по меньшей мере одной антигенспецифической T-клетки, содержащей T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, включающему инкубацию стимулированных лигандом FMS-подобной тирозинкиназы 3 (FLT3L) APC с популяцией иммунных клеток из биологического образца.

[0027] В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одну антигенспецифическую T-клетку, содержащую T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, включающему: инкубацию лиганда FMS-подобной тирозинкиназы 3 (FLT3L) с популяцией иммунных клеток из биологического образца в течение первого периода времени, а затем инкубацию по меньшей мере одной T-клетки из биологического образца с APC.

[0028] В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения по меньшей мере одной антигенспецифической T-клетки, содержащей T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, включающему инкубацию популяции иммунных клеток из биологического образца с одним или более препаратами APC в течение одного или более отдельных периодов времени менее 28 дней после инкубации популяции иммунных клеток с первым препаратом APC из одного или более препаратов APC, где выращивают по меньшей мере одну антигенспецифическую T-клетку памяти или индуцируют по меньшей мере одну антигенспецифическую наивную T-клетку.

[0029] В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения по меньшей мере одной антигенспецифической T-клетки, содержащей T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, включающему инкубацию популяции иммунных клеток из биологического образца с 3 или менее препаратами APC в течение 3 или менее отдельных периодов времени, где выращивают по меньшей мере одну антигенспецифическую T-клетку памяти или индуцируют по меньшей мере одну антигенспецифическую наивную T-клетку.

[0030] В некоторых вариантах осуществления популяцию иммунных клеток получают из биологического образца, истощенного в отношении CD14- и/или CD25-экспрессирующих клеток.

[0031] В некоторых вариантах осуществления APC является FLT3L-стимулированной APC. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из препаратов APC содержит FLT3L-стимулированные APC. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере два из препаратов APC содержат FLT3L-стимулированные APC. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере три из препаратов APC содержат FLT3L-стимулированные APC. В некоторых вариантах осуществления каждый из препаратов APC содержит FLT3L-стимулированные APC.

[0032] В некоторых вариантах осуществления APC включают один или более препаратов APC. В некоторых вариантах осуществления препараты APC содержат 3 или менее препаратов APC. В некоторых вариантах осуществления препараты APC инкубируют с иммунными клетками последовательно в течение одного или более отдельных периодов времени. В некоторых вариантах осуществления биологический образец получают из индивидуума. В некоторых вариантах осуществления индивидуум является человеком. В некоторых вариантах осуществления индивидуум имеет заболевание или нарушение. В некоторых вариантах осуществления заболевание или нарушение является злокачественным новообразованием. В некоторых вариантах осуществления злокачественное новообразование выбрано из группы, состоящей из рака яичников, рака легких и меланомы.

[0033] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка включает по меньшей мере одну CD4⁺ T-клетку. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка включает по меньшей мере одну CD8⁺ T-клетку. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка включает по меньшей мере одну CD4-обогащенную T-клетку. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка включает по меньшей мере одну CD8-обогащенную T-клетку. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка включает по меньшей мере одну T-клетку памяти. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка включает по меньшей мере одну наивную T-клетку. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка включает по меньшей мере одну CD4⁺ T-клетку памяти. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка включает по меньшей мере одну наивную CD4⁺ T-клетку. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка включает по меньшей мере одну CD8⁺ T-клетку памяти. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка включает по меньшей мере одну наивную CD8⁺ T-клетку.

[0034] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна пептидная последовательность антигена содержит мутацию, выбранную из (A) точечной мутации, (B) мутации участка сплайсинга, (C) мутации со сдвигом рамки считывания, (D) мутации сквозного прочитывания терминатора, (E) мутации со слиянием генов и их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна пептидная последовательность антигена содержит точечную мутацию и связывается с белком HLA индивидуума с большей аффинностью, чем соответствующий пептид дикого типа. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна пептидная последовательность антигена связывается с белком HLA индивидуума с K_D или IC₅₀ менее 500 нМ, 250 нМ, 150 нМ, 100 нМ, 50 нМ, 25 нМ или 10 нМ. В некоторых вариантах осуществления каждая из по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена связывается с белком, кодируемым аллелем HLA, экспрессируемым индивидуумом. В некоторых вариантах осуществления TCR связывается с комплексом пептид-HLA с K_D или IC₅₀ менее 500 нМ, 250 нМ, 150 нМ, 100 нМ, 50 нМ, 25 нМ или 10 нМ. В некоторых вариантах осуществления каждая из по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена содержит мутацию, отсутствующую в незлокачественных клетках индивидуума. В некоторых вариантах осуществления каждая из по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена кодируется геном или экспрессируемым геном злокачественных клеток индивидуума. В некоторых вариантах осуществления одна или более из по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена имеет длину по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 4000, 5000, 7500 или 10000 природных аминокислот. В некоторых вариантах осуществления одна или более из по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена связывается с белком, кодируемым аллелем HLA класса I и имеет длину 8-12 природных аминокислот. В некоторых вариантах осуществления одна или более из по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена связывается с белком, кодируемым аллелем HLA класса II и имеет длину 16-25 природных аминокислот. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна пептидная последовательность антигена содержит множество пептидных последовательностей антигена. В некоторых вариантах осуществления множество пептидных последовательностей антигена содержит по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 или 500 пептидных последовательностей антигена. В некоторых вариантах осуществления антиген является неоантигеном, опухолеассоциированным антигеном, вирусным антигеном, минорным антигеном гистосовместимости или их комбинацией.

[0035] В некоторых вариантах осуществления способ включает истощение клеток, экспрессирующих CD14 и/или CD25, в биологическом образце. В некоторых вариантах осуществления истощение клеток, экспрессирующих CD14 и/или CD25, включает связывание CD14- и/или CD25-связывающего средства с APC или APC из препаратов APC. В некоторых вариантах осуществления CD14- и/или CD25-связывающее средство является биотинилированным. В некоторых вариантах осуществления истощение клеток, экспрессирующих CD14 и/или CD25, дополнительно включает связывание реагента против биотина на твердой подложке с CD14- и/или CD25-связывающим средством. В некоторых вариантах осуществления CD14- и/или CD25-связывающее средство присоединяют к твердой подложке.

[0036] В некоторых вариантах осуществления APC или APC из препаратов APC включает APC, нагруженную одним или более антигенными пептидами, содержащими одну или более из по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена. В некоторых вариантах осуществления APC или APC из препаратов APC является аутологичной APC или аллогенной APC. В некоторых вариантах осуществления APC или APC из препаратов APC включает дендритную клетку (DC). В некоторых вариантах осуществления APC или APC из препаратов APC получают из CD14⁺ моноцита. В некоторых вариантах осуществления APC или APC из препаратов APC обогащают в биологическом образце. В некоторых вариантах осуществления APC или APC из препаратов APC стимулируют одним или более цитокинами или факторами роста. В некоторых вариантах осуществления один или более цитокинов или факторов роста включают ГМ-КСФ, ИЛ-4, FLT3L, ФНОα, ИЛ-1β, PGE1, ИЛ-6, ИФНα, R848, LPS, ss-rna40, поли-I:C или их комбинацию.

[0037] В некоторых вариантах осуществления APC или APC из препаратов APC получают из второго биологического образца. В некоторых вариантах осуществления второй биологический образец получают из того же индивидуума. В некоторых вариантах осуществления биологический образец содержит мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC).

[0038] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка включает множество антигенспецифических T-клеток. В некоторых вариантах осуществления процентная доля по меньшей мере одной антигенспецифической T-клетки составляет по меньшей мере приблизительно 0,00001%, 0,00002%, 0,00005%, 0,0001%, 0,0005%, 0,001%, 0,005%, 0,01%, 0,05%, 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% всех CD4⁺ T-клеток, всех CD8⁺ T-клеток, всех T-клеток или всех иммунных клеток. В некоторых вариантах осуществления процентная доля по меньшей мере одной антигенспецифической CD8⁺ T-клетки составляет по меньшей мере приблизительно 0,00001%, 0,00002%, 0,00005%, 0,0001%, 0,0005%, 0,001%, 0,005%, 0,01%, 0,05%, 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% всех CD4⁺ T-клеток, всех CD8⁺ T-клеток, всех T-клеток или всех иммунных клеток. В некоторых вариантах осуществления процентная доля по меньшей мере одной антигенспецифической CD4⁺ T-клетки составляет по меньшей мере приблизительно 0,00001%, 0,00002%, 0,00005%, 0,0001%, 0,0005%, 0,001%, 0,005%, 0,01%, 0,05%, 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% всех CD4⁺ T-клеток, всех CD8⁺ T-клеток, всех T-клеток или всех иммунных клеток. В некоторых вариантах осуществления процентная доля по меньшей мере одной антигенспецифической T-клетки в биологическом образце составляет не более приблизительно 0,00001%, 0,00005%, 0,0001%, 0,0005%, 0,001%, 0,005%, 0,01%, 0,05%, 0,1% или 0,5% всех CD4⁺ T-клеток, всех CD8⁺ T-клеток, всех T-клеток или всех иммунных клеток. В некоторых вариантах осуществления процентная доля по меньшей мере одной антигенспецифической CD8⁺ T-клетки в биологическом образце составляет не более приблизительно 0,00001%, 0,00005%, 0,0001%, 0,0005%, 0,001%, 0,005%, 0,01%, 0,05%, 0,1% или 0,5% всех CD4⁺ T-клеток, всех CD8⁺ T-клеток, всех T-клеток или всех иммунных клеток. В некоторых вариантах осуществления процентная доля по меньшей мере одной антигенспецифической CD4⁺ T-клетки в биологическом образце составляет не более приблизительно 0,00001%, 0,00005%, 0,0001%, 0,0005%, 0,001%, 0,005%, 0,01%, 0,05%, 0,1% или 0,5% всех CD4⁺ T-клеток, всех CD8⁺ T-клеток, всех T-клеток или всех иммунных клеток.

[0039] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение индивидууму одной или более из по меньшей мере одной антигенспецифической T-клетки.

[0040] В некоторых вариантах осуществления общий период времени из отдельных периодов времени составляет менее 28 дней. В некоторых вариантах осуществления инкубация включает инкубацию первого препарата APC из препаратов APC с T-клетками в течение более чем 7 дней. В некоторых вариантах осуществления способ включает инкубацию APC или одного или более из препаратов APC с первой средой, содержащей по меньшей мере один цитокин или фактор роста, в течение первого периода времени. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один цитокин или фактор роста включает ГМ-КСФ, ИЛ-4, FLT3L, ФНОα, ИЛ-1β, PGE1, ИЛ-6, ИФНα, R848, LPS, ss-rna40, поли-I:C или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления способ включает инкубацию одного или более из препаратов APC по меньшей мере с одним пептидом в течение второго периода времени. В некоторых вариантах осуществления способ включает инкубацию APC или одного или более из препаратов APC со второй средой, содержащей один или более цитокинов или факторов роста, в течение третьего периода времени и, таким образом, получение зрелых APC. В некоторых вариантах осуществления один или более цитокинов или факторов роста включает ГМ-КСФ, ИЛ-4, FLT3L, ФНОα, ИЛ-1β, PGE1, ИЛ-6, ИФНα, R848, LPS, ss-rna40, поли-I:C или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает удаление одного или более цитокинов или факторов роста из второй среды после третьего периода времени и перед началом четвертого периода времени.

[0041] В некоторых вариантах осуществления способ осуществляют ex vivo.

[0042] В некоторых вариантах осуществления биологический образец свежеполучен из индивидуума или является замороженным образцом.

[0043] В некоторых вариантах осуществления способ включает получение биологического образца, содержащего по меньшей мере одну APC и по меньшей мере одну PBMC, из индивидуума.

[0044] В некоторых вариантах осуществления способ включает истощение клеток, экспрессирующих CD14 и/или CD25, в биологическом образце и, таким образом, получение образца, истощенного в отношении CD14⁺ и/или CD25⁺ клеток.

[0045] В некоторых вариантах осуществления способ включает инкубацию образца, истощенного в отношении CD14⁺ и/или CD25⁺ клеток, с FLT3L в течение первого периода времени.

[0046] В некоторых вариантах осуществления способ включает инкубацию по меньшей мере одного пептида с образцом, истощенным в отношении CD14⁺ и/или CD25⁺ клеток, в течение второго периода времени и, таким образом, получение первого образца зрелых APC, нагруженных пептидом.

[0047] В некоторых вариантах осуществления способ включает инкубацию первого образца зрелых APC, нагруженных пептидом, по меньшей мере с одной PBMC в течение третьего периода времени и, таким образом, получение первого образца стимулированных PBMC.

[0048] В некоторых вариантах осуществления способ включает инкубацию PBMC из первого образца стимулированных PBMC с FLT3L-стимулированными APC из образца зрелых APC в течение четвертого периода времени и, таким образом, получение второго образца стимулированных PBMC.

[0049] В некоторых вариантах осуществления способ включает инкубацию PBMC из первого образца стимулированных PBMC с FLT3L и вторым образцом APC, нагруженных пептидом, из образца зрелых APC в течение четвертого периода времени и, таким образом, получение второго образца стимулированных PBMC.

[0050] В некоторых вариантах осуществления способ включает инкубацию PBMC из первого образца стимулированных PBMC с FLT3L и FLT3L-стимулированными APC из образца зрелых APC в течение четвертого периода времени и, таким образом, получение второго образца стимулированных PBMC.

[0051] В некоторых вариантах осуществления способ включает инкубацию PBMC из второго образца стимулированных PBMC с FLT3L-стимулированными APC из образца зрелых APC в течение пятого периода времени и, таким образом, получение третьего образца стимулированных PBMC.

[0052] В некоторых вариантах осуществления способ включает инкубацию PBMC из второго образца стимулированных PBMC с FLT3L и третьим образцом APC, нагруженных пептидом, из образца зрелых APC в течение пятого периода времени и, таким образом, получение третьего образца стимулированных PBMC

[0053] В некоторых вариантах осуществления способ включает инкубацию PBMC из второго образца стимулированных PBMC с FLT3L и FLT3L-стимулированными APC из образца зрелых APC в течение пятого периода времени и, таким образом, получение третьего образца стимулированных PBMC.

[0054] В некоторых вариантах осуществления способ включает введение по меньшей мере одной T-клетки из первого образца стимулированных PBMC нуждающемуся в этом индивидууму. В некоторых вариантах осуществления способ включает введение по меньшей мере одной T-клетки из второго образца стимулированных PBMC нуждающемуся в этом индивидууму. В некоторых вариантах осуществления способ включает введение по меньшей мере одной T-клетки из третьего образца стимулированных PBMC нуждающемуся в этом индивидууму.

[0055] В некоторых вариантах осуществления инкубацию PBMC из первого образца стимулированных PBMC осуществляют в присутствии ИЛ-7, ИЛ-15 или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления инкубацию PBMC из первого образца стимулированных PBMC осуществляют в присутствии ингибитора индоламин-2,3-диоксигеназы-1 (IDO), антитела против PD-1, ИЛ-12 или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления инкубацию PBMC из второго образца стимулированных PBMC осуществляют в присутствии ИЛ-7, ИЛ-15 или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления инкубацию PBMC из второго образца стимулированных PBMC осуществляют в присутствии ингибитора индоламин-2,3-диоксигеназы-1 (IDO), антитела против PD-1, ИЛ-12 или их комбинации.

[0056]

[0057] В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу, включающему: получение биологического образца, содержащего по меньшей мере одну антигенпрезентирующую клетку (APC), из индивидуума; обогащение клеток, экспрессирующих CD14, в биологическом образце и, таким образом, получение образца, обогащенного CD14⁺ клетками; инкубацию образца, обогащенного CD14⁺ клетками, по меньшей мере с одним цитокином или фактором роста в течение первого периода времени; инкубацию по меньшей мере одного пептида с образцом, обогащенным CD14⁺ клетками, в течение второго периода времени и, таким образом, получение образца APC, нагруженных пептидом; инкубацию образца APC, нагруженных пептидом, с одним или более цитокинами или факторами роста в течение третьего периода времени и, таким образом, получение образца зрелых APC; инкубацию APC из образца зрелых APC с образцом, истощенным в отношении CD14⁺ и/или CD25⁺ клеток, содержащим PBMC, в течение четвертого периода времени; инкубацию PBMC с APC из образца зрелых APC в течение пятого периода времени; инкубацию PBMC с APC из образца зрелых APC в течение шестого периода времени; и введение по меньшей мере одной T-клетки из PBMC нуждающемуся в этом индивидууму.

[0058] В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу, включающему: получение биологического образца, содержащего по меньшей мере одну APC и по меньшей мере одну PBMC, из индивидуума; истощение клеток, экспрессирующих CD14, и/или CD25, и/или CD19, в биологическом образце и, таким образом, получение образца, истощенного в отношении CD14⁺, и/или CD25⁺, и/или CD19⁺ клеток; инкубацию образца, истощенного в отношении CD14⁺, и/или CD25⁺, и/или CD19⁺ клеток, с FLT3L в течение первого периода времени; инкубацию по меньшей мере одного пептида с образцом, истощенным в отношении CD14⁺, и/или CD25⁺, и/или CD19⁺ клеток, в течение второго периода времени и, таким образом, получение образца APC, нагруженных пептидом; инкубацию образца APC, нагруженных пептидом, по меньшей мере с одной PBMC в течение третьего периода времени и, таким образом, получение первого образца стимулированных PBMC; инкубацию PBMC из первого образца стимулированных PBMC с APC из образца зрелых APC в течение четвертого периода времени и, таким образом, получение второго образца стимулированных PBMC; необязательно, инкубацию PBMC из второго образца стимулированных PBMC с APC из образца зрелых APC в течение пятого периода времени и, таким образом, получение третьего образца стимулированных PBMC; введение по меньшей мере одной T-клетки из первого, второго или третьего образца стимулированных PBMC нуждающемуся в этом индивидууму.

[0059] В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу, включающему получение биологического образца, содержащего по меньшей мере одну APC и по меньшей мере одну PBMC, из индивидуума; истощение клеток, экспрессирующих CD14, и/или CD25, и/или CD19, в биологическом образце и, таким образом получение образца, истощенного в отношении CD14⁺, и/или CD25⁺, и/или CD19⁺ клеток; инкубацию образца, истощенного в отношении CD14⁺, и/или CD25⁺, и/или CD19⁺ клеток, с FLT3L в течение первого периода времени; инкубацию по меньшей мере одного пептида с образцом, истощенным в отношении CD14⁺, и/или CD25⁺, и/или CD19⁺ клеток, в течение второго периода времени и, таким образом, получение образца APC, нагруженных пептидом; инкубацию образца APC, нагруженных пептидом, по меньшей мере с одной PBMC в течение третьего периода времени и, таким образом, получение первого образца стимулированных PBMC; необязательно, инкубацию PBMC из первого образца стимулированных PBMC с FLT3L-стимулированными APC из образца зрелых APC в течение четвертого периода времени и, таким образом, получение второго образца стимулированных PBMC; необязательно, инкубацию PBMC из второго образца стимулированных PBMC с FLT3L-стимулированными APC из образца зрелых APC в течение пятого периода времени и, таким образом, получение третьего образца стимулированных PBMC; и введение по меньшей мере одной T-клетки из первого, второго или третьего образца стимулированных PBMC нуждающемуся в этом индивидууму.

[0060] В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу, включающему: получение биологического образца, содержащего по меньшей мере одну APC и по меньшей мере одну PBMC, из индивидуума; истощение клеток, экспрессирующих CD14, и/или CD25, и/или CD19, в биологическом образце и, таким образом, получение образца, истощенного в отношении CD14⁺, и/или CD25⁺, и/или CD19⁺ клеток; инкубацию образца, истощенного в отношении CD14⁺, и/или CD25⁺, и/или CD19⁺ клеток, с FLT3L в течение первого периода времени; инкубацию по меньшей мере одного пептида с образцом, истощенным в отношении CD14⁺, и/или CD25⁺, и/или CD19⁺ клеток, в течение второго периода времени и, таким образом, получение первого образца APC, нагруженных пептидом; инкубацию первого образца APC, нагруженных пептидом, по меньшей мере с одной PBMC в течение третьего периода времени и, таким образом, получение первого образца стимулированных PBMC; необязательно, инкубацию PBMC из первого образца стимулированных PBMC с FLT3L и вторым образцом APC, нагруженных пептидом, из образца зрелых APC в течение четвертого периода времени и, таким образом, получение второго образца стимулированных PBMC; необязательно, инкубацию PBMC из второго образца стимулированных PBMC с FLT3L и третьим образцом APC, нагруженных пептидом, из образца зрелых APC в течение пятого периода времени и, таким образом, получение третьего образца стимулированных PBMC; и введение по меньшей мере одной T-клетки из первого, второго или третьего образца стимулированных PBMC нуждающемуся в этом индивидууму.

[0061] В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу, включающему: получение биологического образца, содержащего по меньшей мере одну APC и по меньшей мере одну PBMC, из индивидуума; истощение клеток, экспрессирующих CD14, и/или CD25, и/или CD19, в биологическом образце и, таким образом, получение образца, истощенного в отношении CD14⁺, и/или CD25⁺, и/или CD19⁺ клеток; инкубацию образца, истощенного в отношении CD14⁺, и/или CD25⁺, и/или CD19⁺ клеток, с FLT3L в течение первого периода времени; инкубацию по меньшей мере одного пептида с образцом, истощенным в отношении CD14⁺, и/или CD25⁺, и/или CD19⁺ клеток, в течение второго периода времени и, таким образом, получение первого образца APC, нагруженных пептидом; инкубацию первого образца APC, нагруженных пептидом, по меньшей мере с одной PBMC в течение третьего периода времени и, таким образом, получение первого образца стимулированных PBMC; необязательно, инкубацию PBMC первого образца стимулированных PBMC с FLT3L и FLT3L-стимулированными APC из образца зрелых APC в течение четвертого периода времени и, таким образом, получение второго образца стимулированных PBMC; необязательно, инкубацию PBMC из второго образца стимулированных PBMC с FLT3L и FLT3L-стимулированными APC из образца зрелых APC в течение пятого периода времени и, таким образом, получение третьего образца стимулированных PBMC; введение по меньшей мере одной T-клетки из первого, второго или третьего образца стимулированных PBMC нуждающемуся в этом индивидууму.

[0062] В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу, включающему определение экспрессии одного или более клеточных маркеров по меньшей мере одной иммунной клетки из образца стимулированных иммунных клеток; и определение связывания по меньшей мере одной иммунной клетки из образца стимулированных иммунных клеток с комплексом пептид-MHC; где определение экспрессии и определение связывания осуществляют одновременно. В некоторых вариантах осуществления образец стимулированных иммунных клеток представляют собой популяцию иммунных клеток, стимулированных APC, содержащими комплекс пептид-MHC. В некоторых вариантах осуществления популяцию иммунных клеток получают из биологического образца.

[0063] В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу, включающему инкубацию популяции иммунных клеток из биологического образца с APC, содержащими комплекс пептид-MHC, и, таким образом, получение образца стимулированных иммунных клеток; определение экспрессии одного или более клеточных маркеров по меньшей мере одной иммунной клетки из образца стимулированных иммунных клеток; и определение связывания по меньшей мере одной иммунной клетки из образца стимулированных иммунных клеток с комплексом пептид-MHC; где определение экспрессии и определение связывания осуществляют одновременно.

[0064] В некоторых вариантах осуществления один или более клеточных маркеров включают ФНОα, ИФНγ, LAMP-1, 4-1BB, ИЛ-2, ИЛ-17A, гранзим B, PD-1, CD25, CD69, TIM3, LAG3, CTLA-4, CD62L, CD45RA, CD45RO, FoxP3 или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления один или более клеточных маркеров включают цитокин. В некоторых вариантах осуществления один или более клеточных маркеров включают маркер дегрануляции. В некоторых вариантах осуществления один или более клеточных маркеров включают маркер поверхности клетки. В некоторых вариантах осуществления один или более клеточных маркеров включают белок. В некоторых вариантах осуществления определение связывания по меньшей мере одной иммунной клетки из образца стимулированных иммунных клеток с комплексом пептид-MHC включает определение связывания по меньшей мере одной иммунной клетки из образца стимулированных иммунных клеток с тетрамером MHC, содержащим пептид, и MHC из комплекса пептид-MHC. В некоторых вариантах осуществления MHC является MHC класса I или MHC класса II. В некоторых вариантах осуществления комплекс пептид-MHC содержит одну или более меток. В некоторых вариантах осуществления популяция иммунных клеток из биологического образца содержит два или более образца, каждый из которых содержит популяцию иммунных клеток из одного или более биологических образцов. В некоторых вариантах осуществления два или более образца метят двумя или более метками образцов. В некоторых вариантах осуществления определение экспрессии и определение связывания определяет посредством активируемой флуоресценцией сортировки клеток (FACS). В некоторых вариантах осуществления определение экспрессии и определение связывания включает анализ отдельных клеток. В некоторых вариантах осуществления определение экспрессии и определение связывания включает определение процентной доли иммунных клеток, экспрессирующих один или более клеточных маркеров и связывающихся с комплексом пептид-MHC. В некоторых вариантах осуществления метки включают флуорофор. В некоторых вариантах осуществления популяция иммунных клеток содержит популяцию иммунных клеток, типичную для популяции иммунных клеток из композиции, представленной в настоящем описании.

[0065] Если аспекты или варианты осуществления настоящего изобретения описаны в терминах группы Маркуша или группирования альтернатив, настоящее изобретение включает не только всю группу, указанную в целом, но также и каждого члена группы отдельно и все подгруппы основной группы, а также основную группу, в которой отсутствует один или более членов. В настоящем изобретении также предусмотрено конкретное исключение одного или более из любых членов группы в настоящем изобретении.

ВКЛЮЧЕНИЕ В КАЧЕСТВЕ ССЫЛКИ

[0066] Все публикации, патенты и патентные заявки, упомянутые в настоящем описании, включены в него в качестве ссылки в полном объеме для всех целей в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация, патент или патентная заявка была конкретна и отдельно указана как включенная в качестве ссылки. Например, все публикации и патенты, упомянутые в настоящем описании, включены в него в качестве ссылки в полном объеме в целях описания наборов, композиций и способов, описанных в публикациях, которые можно использовать в отношении способов, наборов и композиций, представленных в настоящем описании. Документы, обсуждаемые в настоящем описании, представлены исключительно для их раскрытия перед датой подачи настоящей заявки. Ничто в настоящем описании не следует истолковывать как признание того, что авторы настоящего изобретения не имеют права датировать задним числом такое раскрытие на основании предшествующего изобретения или по любой другой причине.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0067] На фиг. 1A показан пример схемы способа производства антигенспецифических T-клеток.

[0068] На фиг. 1B показан пример схемы производства антигенспецифических T-клеток.

[0069] На фиг. 2 показан пример результата, где представлена фракция антигенспецифических CD8⁺ T-клеток памяти, индуцированных длинным пептидом или коротким пептидом. Термин "совокупность" означает, что образец, содержащий T-клетки, используемые для индуцирования, представляет собой целые мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC). Термин "T_reg-" означает, что образец, содержащий T-клетки, используемые для индуцирования, представляет собой PBMC, истощенные в отношении CD25-экспрессирующих клеток.

[0070] На фиг. 3 показан пример проточного цитометрического анализа, где представлена фракция антигенспецифических CD8⁺ наивных T-клеток, индуцированных пептидом GAS7.

[0071] На фиг. 4 показан пример результата, где представлены ответы антигенспецифических CD8⁺ T-клеток на совокупность коротких пептидов HIV, коротких ранее идентифицированных неоантигенов (PIN) или длинных PIN. Термин "целые PBMC" означает, что образец, содержащий T-клетки, используемые для индуцирования, представляет собой целые PBMC. Термин "CD25^- PBMC" означает, что образец, содержащий T-клетки, используемые для индуцирования, истощен в отношении CD25⁺ клеток.

[0072] На фиг. 5A показан пример проточного цитометрического анализа ответов антигенспецифических CD8⁺ наивных T-клеток на отдельный ранее идентифицированный неоантиген (PIN) в указанных условиях.

[0073] На фиг. 5B показан пример проточного цитометрического анализа ответов антигенспецифических CD8⁺ наивных T-клеток с отдельными ранее идентифицированными неоантигенами (PIN) в указанных условиях.

[0074] На фиг. 6 показан пример результатов, где представлены ответы антигенспецифических CD8⁺ T-клеток на указанные пептиды с использованием образцов PBMC от двух людей-доноров.

[0075] На фиг. 7 показан пример графиков проточной цитометрии ответов антигенспецифических CD8⁺ T-клеток на указанные мутантные эпитопы у здорового донора перед стимуляцией и после до трех раундов стимуляции.

[0076] На фиг. 8A показан пример столбиковой диаграммы, на которой показаны результаты в отношении ответов антигенспецифических CD8⁺ T-клеток памяти на вирусные антигены. После до трех раундов стимуляции приблизительно 50% всех CD8⁺ T-клеток являлись специфическими для указанных вирусных эпитопов (pp65 CMV, YVL EBV, BMLF1 EBV и Mart-1).

[0077] На фиг. 8B показан пример результатов анализа вторичного иммунного ответа в случае ответов антигенспецифических CD8⁺ T-клеток памяти на нагруженные пептидом антигенпрезентирующие клетки и их инкубации с APC, нагруженными вирусными антигенами и без них. В таблицах показаны фракции CD8⁺ T-клеток, высвобождающие указанные цитокины, для двух временных точек.

[0078] На фиг. 9 показан пример результата анализа цитотоксичности, используемого для оценки того, могут ли культуры индуцированных T-клеток уничтожать линии экспрессирующих антиген опухолевых клеток. Показаны фракции живых и погибших положительных по каспазе 3 опухолевых клеток относительно всех опухолевых клеток. Положительные по каспазе 3 живые опухолевые клетки являются показателем клеток, подвергающихся ранней гибели клеток.

[0079] На фиг. 10 показан пример проточного цитометрического анализа ответов антигенспецифических CD4⁺ T-клеток на нагруженные пептидом антигенпрезентирующие клетки и их инкубации с APC с нагруженными PIN и без них. Показана процентная доля CD4⁺ T-клеток, высвобождающих ИФНγ.

[0080] На фиг. 11 показан пример результатов анализа процентной доли антигенспецифических CD4⁺ T-клеток, высвобождающих ИФНγ, после повторной стимуляции мутантными пептидами или пептидами дикого типа.

[0081] На фиг. 12 показан пример проточного цитометрического анализа, где показаны ответы антигенспецифических CD8⁺ наивных T-клеток на короткие пептиды HIV5. Показано кратковременное и длительное индуцирование.

[0082] На фиг. 13 показан пример проточного цитометрического анализа, где показаны ответы фракции антигенспецифических CD8⁺ наивных T-клеток на короткие пептиды ME1 с использованием образца целых PBMC человека-донора. Показано кратковременное и длительное индуцирование.

[0083] На фиг. 14 показан пример проточного цитометрического анализа, где показаны ответы антигенспецифических CD8⁺ наивных T-клеток на короткие пептиды HIV3 с использованием образца целых PBMC человека-донора. Показано кратковременное и длительное индуцирование.

[0084] На фиг. 15 показан пример проточного цитометрического анализа, где показаны ответы антигенспецифических CD8⁺ наивных T-клеток на длинные пептиды CSNK1A1 с использованием образца целых PBMC человека-донора. Показано кратковременное и длительное индуцирование.

[0085] На фиг. 16 показан пример проточного цитометрического анализа, где показаны ответы антигенспецифических CD8⁺ наивных T-клеток на длинные пептиды CSNK1A1 с использованием образца PBMC человека-донора, истощенного в отношении CD25⁺ клеток. Показано кратковременное и длительное индуцирование.

[0086] На фиг. 17 показан пример проточного цитометрического анализа, где показаны ответы антигенспецифических CD8⁺ наивных T-клеток на короткие пептиды GAS7 с использованием образца PBMC человека-донора, истощенного в отношении CD25⁺ клеток. Показано кратковременное и длительное индуцирование.

[0087] На фиг. 18 показан пример проточного цитометрического анализа, где показаны ответы антигенспецифических CD8⁺ наивных T-клеток на короткие пептиды ACTN4 с использованием образца PBMC человека-донора, истощенного в отношении CD25⁺ клеток. Показано кратковременное и длительное индуцирование.

[0088] На фиг. 19A показан пример проточного цитометрического анализа, где показаны ответы антигенспецифических CD8⁺ наивных T-клеток на короткие пептиды ACTN4 с использованием образца PBMC человека-донора, истощенного в отношении CD25⁺ клеток. Показано кратковременное индуцирование.

[0089] На фиг. 19B показан пример проточного цитометрического анализа, где показаны ответы антигенспецифических CD8⁺ наивных T-клеток на короткие пептиды HIV3 с использованием образца PBMC человека-донора, истощенного в отношении CD25⁺ клеток. Показано длительное индуцирование.

[0090] На фиг. 20 показан пример проточного цитометрического анализа ответов антигенспецифических CD8⁺ наивных T-клеток на короткие пептиды HIV5 с использованием образца целых PBMC человека-донора. Показано кратковременное и длительное индуцирование.

[0091] На фиг. 21 показан пример проточного цитометрического анализа, где показаны ответы антигенспецифических CD8⁺ наивных T-клеток на короткие пептиды HIV3 с использованием образца целых PBMC человека-донора. Показано кратковременное индуцирование.

[0092] На фиг. 22 показан пример проточного цитометрического анализа, где показаны ответы антигенспецифических CD8⁺ наивных T-клеток на короткие пептиды PRDX5 с использованием образца PBMC человека-донора, истощенного в отношении CD25⁺ клеток. Показано очень кратковременное и длительное индуцирование.

[0093] На фиг. 23 показан пример проточного цитометрического анализа, где показаны ответы антигенспецифических CD8⁺ наивных T-клеток на короткие пептиды HIV5 с использованием образца PBMC человека-донора, истощенного в отношении CD25⁺ клеток. Показано кратковременное и длительное индуцирование.

[0094] На фиг. 24 показана схема примеров способов получения терапевтической композиции T-клеток, включающих экспансию T-клеток памяти и индуцирование наивных T-клеток.

[0095] На фиг. 25 показан пример способа тестирования функциональности, фенотипа и/или функции T-клеток и/или ответов T-клеток.

[0096] На фиг. 26 показан пример анализа вторичного иммунного ответа для тестирования функциональности, фенотипа и/или функции T-клеток и/или ответов T-клеток.

[0097] На фиг. 27A показан пример проточного цитометрического анализа, где показана возможность деконволюции мультиплексированных образцов с помощью меченых образцов, полученных раздельно или в виде смеси в анализе вторичного иммунного ответа. Уникально меченые образцы разрешали с минимальной перекрестной контаминацией другими штрихкод-метками или без нее.

[0098] На фиг. 27B показан пример проточного цитометрического анализа, где показана детекция антигенспецифических CD8⁺ T-клеток посредством окрашивания по мультимеру смеси девяти уникально меченых образцов в анализе вторичного иммунного ответа.

[0099] На фиг. 28A показан пример проточного цитометрического анализа в случае анализа вторичного иммунного ответа с использованием шести уникально меченых штрихкодами образцов, вторично стимулируемых ненагруженными DC и нагруженными неоантигеном DC.

[0100] На фиг. 28B показан пример столбиковых диаграмм процента CD4⁺ T-клеток с количеством функций, инкубируемых с DC, нагруженных указанной концентрацией пептида в анализе вторичного иммунного ответа. Образцы двух индуцированных культур, включающих ответы de novo CD4⁺ T-клеток, анализировали в отдельности без штрихкодов или смешанными с неродственными образцами. Мечение штрихкод-метками не изменяло детектируемую функциональность. Количество функций и величина ответа клеток не изменялись значимо при мечении образцов штрихкод-метками.

[0101] На фиг. 29A показан пример столбиковой диаграммы, где показаны результаты анализа ответов антигенспецифических CD8⁺ T-клеток памяти на вирусные антигены. Ответы CD8⁺ T-клеток памяти на эпитопы pp65 CMV, MART-1 и BRLF1 и BMLF1 EBV можно индуцировать с 0,23% CD8⁺ T-клеток в исходном материале здорового донора до >60%.

[0102] На фиг. 29B показан пример результатов анализа вторичного иммунного ответа в случае ответов антигенспецифических CD8⁺ T-клеток памяти на вирусные антигены и вторичных ответов на DC, нагруженные и ненагруженные вирусными антигенами. В таблице показана фракция CD8⁺ T-клеток в два момента времени, высвобождающих указанные цитокины.

[0103] На фиг. 30A показан пример результатов идентификации совпадений посредством детекции и функциональной характеризации индуцированных de novo ответов CD4⁺ T-клеток с множественными специфичностями в одной культуре. В представленном примере индуцирование осуществляли в четырех параллельных культурах, используя в качестве мишени 10 полученных из ВИЧ эпитопов, являющихся наивными мишенями у ВИЧ-отрицательного здорового донора. Антигенспецифические ответы определяли в 4/4 параллелей с разной величиной ответа.

[0104] На фиг. 30B показан пример результатов деконволюции совокупности посредством детекции и функциональной характеризации индуцированных de novo ответов CD4⁺ T-клеток с множественными специфичностями в одной культуре. Множественные ответы определяли в каждой тестируемой параллели, и те же два эпитопа (ВИЧ №5 и ВИЧ №7) приводили к наибольшей величине ответа в каждом случае.

[0105] На фиг. 30C показан пример результатов определения чувствительности посредством детекции и функциональной характеризации индуцированных de novo ответов CD4⁺ T-клеток с множественными специфичностями в одной культуре. Наблюдали схожую величину для каждого ответа в анализе деконволюции совокупности. В случае ответов на ВИЧ №5, ВИЧ №6 и ВИЧ №4 определяли EC₅₀ 0,45 мкМ, 0,43 мкМ и 9,1 мкМ, соответственно.

[0106] На фиг. 31 показан пример схемы способа производства антигенспецифических T-клеток.

[0107] На фиг. 32 показан пример схемы способа индуцирования T-клеток.

[0108] На фиг. 33 показан пример схемы способа получения дендритных клеток.

[0109] На фиг. 34 показан пример графиков мультимера pMHC, где показаны ответы CD8⁺ T-клеток, индуцированных в лейкоферезном материале пациента с меланомой, направленно воздействующих на специфические для пациента эпитопы: SRSF1_E>K, ARAP1_Y>H и PKDREJ_G>R, в материале пациента с меланомой, направленно воздействующих на специфический для пациента эпитоп (AASDH_neoORF) и семь модельных неоантигенов: ACTN4_K>N, CSNK1A1_S>L, DHX40_neoORF, GLI3_P>L, QARSR_>W, FAM178B_P>L и RPS26_P>L. На графиках на первой панели в первом и втором рядах показаны анамнестические ответы, на остальных графиках показаны ответы de novo.

[0110] На фиг. 35 показан пример данных на графиках мультимеров pMHC SRSF1_E>K и ARAP1_Y>H до и после стимуляции пептидом (левые панели), секторные диаграммы, на которых показана функциональность неоантиген-специфических T-клеток после повторной стимуляции нагруженными неоантигеном DC; гейтирование по мультимер pMHC⁺ CD8⁺ или CD4⁺ T-клеткам. Полифункциональный профиль анамнестических ответов CD8⁺, ответов CD8⁺ de novo и CD4⁺ de novo, индуцированных у пациента с меланомой, показан с помощью комбинации 1, 2 или 3 функций (например, одна или более функции представляет собой продукцию одного или более факторов, выбранных из ИФНγ, ФНОα, CD107a и 4-1BB).

[0111] На фиг. 36 показана специфичность анамнестического ответа и ответа de novo, индуцированных у пациента с меланомой на мутантный пептид и пептид дикого типа. SRSF1_E>K- и ARAP1_Y>H-специфические T-клеточные ответы стимулировали с помощью DC, нагруженных мутантными неоантигенными пептидами или неоантигенными пептидами дикого типа в разных концентрациях (ось X: 0 мкМ, 0,05 мкМ, 0,2 мкМ, 0,8 мкМ и 3,2 мкМ), и измеряли ИФНγ⁺ и/или ФНОα⁺ и/или CD107a⁺ клетки от всех CD8⁺ T-клеток (ось Y) в образцах; оба ответа демонстрировали значимые различия при концентрации 0 мкМ, и не было ответа на неоантигенный пептид дикого типа. Статистический анализ: FDR для скорректированного значения p, значения P: *≤0,05, ***≤0,001, ****≤0,0001.

[0112] На фиг. 37A показан профиль цитотоксичности при анамнестическом ответе, индуцированном у пациента с меланомой, количественно анализируемом по доле CD8⁺CD107a⁺ T-клеток. Также показано уничтожение клеток-мишеней при этих T-клеточных ответах, количественно анализируемых по доле aCAS3⁺ опухолевые клетки. Цитотоксическую мощность ответов индуцированных CD8⁺ T-клеток анализировали посредством повторной стимуляции опухолевыми клетками, трансдуцированными с использованием мутантным неоантигеном или неоантигеном дикого типа. Использовали нетрансдуцированные опухолевые клетки (родительскую линию A375) или опухолевые клетки, трансдуцированные с использованием конструкции 200aa. Конструкция содержала мутантную последовательность или последовательность дикого типа, мутация находилась в центре. Положительную регуляцию CD107a на CD8⁺ T-клетках и активной каспазы 3 на опухолевых клетках измеряли после сокультивирования. Соотношение эффектор:мишень: 3,3:1 (SRSF1_E>K).

[0113] На фиг. 37B показан другой пример профиля цитотоксичности при анамнестическом ответе, индуцированном у пациента с меланомой, количественно анализируемом по доле CD8⁺CD107a⁺ T-клеток. Также показано уничтожение клеток-мишеней при этих T-клеточных ответах, количественно анализируемых по доле aCAS3⁺ опухолевых клеток. Цитотоксическую мощность ответов индуцированных CD8⁺ T-клеток анализировали посредством повторной стимуляции опухолевыми клетками, трансдуцированными с использованием мутантных неоантигенов или неоантигенов дикого типа. Использовали нетрансдуцированные опухолевые клетки (родительскую линию A375) или опухолевые клетки трансдуцированные с использованием конструкции из 200 аминокислот. Конструкция содержала мутантную последовательность или последовательность дикого типа, мутация находилась в центре. Положительную регуляцию CD107a на CD8⁺ T-клетках и активной каспазы 3 на опухолевых клетках измеряли после сокультивирования. Красными кругами указаны фракции pMHC⁺. Соотношение эффектор:мишень: 5:1 (SRSF1_E>K). Статистический анализ: непарный t-критерий Стьюдента, значения P **≤0,01, ****≤0,0001.

[0114] На фиг. 37C показан профиль цитотоксичности при ответе de novo, индуцированном у пациента с меланомой, количественно анализируемом по доле CD8⁺CD107a⁺ T-клеток. Также показано уничтожение клеток-мишеней при этих T-клеточных ответах, количественно анализируемых по доле aCAS3⁺ опухолевых клеток. Цитотоксическую мощность ответов индуцированных CD8⁺ T-клеток анализировали посредством повторной стимуляции опухолевыми клетками, трансдуцированными с использованием мутантных неоантигенов или неоантигенов дикого типа. Использовали нетрансдуцированные опухолевые клетки (родительскую линию A375) или опухолевые клетки трансдуцированные с использованием конструкции из 200 аминокислот. Конструкция содержала мутантную последовательность или последовательность дикого типа, мутация находилась в центре. Положительную регуляцию CD107a на CD8⁺ T-клетках и активной каспазы 3 на опухолевых клетках измеряли после сокультивирования. Красными кругами указаны фракции pMHC⁺. Соотношение эффектор:мишень: 0,66:1 (ARAP1_Y>H). Статистический анализ: непарный t-критерий Стьюдента, значения P **≤0,01, ****≤0,0001.

[0115] На фиг. 38A показана идентификация ответов неоантиген-специфических CD4⁺ T-клеток у пациента с меланомой. Ответы идентифицировали с учетом продукции ИФНγ и ФНОα (ось Y) при повторной стимуляции DC, нагруженными мутантным неоантигенным пептидом (0,8 мкМ). MKRN1_S>L, CREBBP_S>L и TPCN1_K>Eидентифицировали в качестве положительных ответов.

[0116] На фиг. 38B показана специфичность ответов CD4⁺ T-клеток, показанных на фиг. 38A, в отношении указанных мутантных пептидов и пептидов дикого типа. В подтверждающем исследовании ответы CD4⁺ T-клеток, показанные на фиг. 38A, провоцировали разными концентрациями (ось X - 0 мкМ, 0,05 мкМ, 0,2 мкМ, 0,8 мкМ и 3,2 мкМ) мутантных неоантигенных пептидов и неоантигенных пептидов дикого типа и измеряли ИФНγ⁺ и/или ФНОα⁺ клетки из всех CD4⁺ клеток (ось Y) в образцах. Два из ответов CD4⁺ T-клеток (MKRN1_S>L и CREEBP_S>L) демонстрировали значимые различия при концентрации 0 мкМ, и не было ответа на неоантигенный пептид дикого типа, но ответ на TPCN1_K>E являлся ответом и на мутантный неоантигенный пептид, и неоантигенный пептид дикого типа. Статистический анализ: FDR для скорректированного значения p, значение P <0,05.

[0117] На фиг. 38C показан профиль полифункциональности этих ответов CD4⁺ T-клеток, показанный с помощью комбинации 1, 2, 3 или 4 функций (например, одна или более функций представляют собой продукцию одного или более факторов, выбранных из ИФНγ, ФНОα, CD107a и 4-1BB). Полифункциональность идентифицированных ответов CD4⁺ T-клеток оценивали посредством повторной стимуляции DC, нагруженными мутантным неоантигенным пептидом (0,8 мкм). Процентные доли на секторной диаграмме представляют собой процентные доли функциональных CD4⁺ T-клеток (1, 2 и/или 3 функции). Показанные репрезентативные данные получали для ответов CD4⁺ T-клеток после стимуляции, индуцированных у пациента.

[0118] На фиг. 39 показана функциональность анамнестических ответов, индуцированных у двух здоровых доноров (например, HD66 и HD63) с добавлением эпакадостата или без него, о чем свидетельствует комбинация 1, 2 или 3 функций (например, одна или более одна или более функций представляют собой продукцию одного или более факторов, выбранных из ИФНγ, ФНОα и CD107a).

[0119] На фиг. 40 показан процент индуцированных ответов CD8⁺ T-клеток de novo ("коэффициент совпадений", усредненный по четырем здоровым донорам) в шести параллельных индуцированиях с добавлением эпакадостата или без него.

[0120] На фиг. 41A показано абсолютное количество антигенспецифических клеток от донора HD55 после индуцирования способом производства T-клеток, представленным в настоящем описании, с добавлением PD-1-блокирующего антитела или без него.

[0121] На фиг. 41B показано абсолютное количество антигенспецифических клеток от донора HD67 после индуцирования способом производства T-клеток, представленным в настоящем описании, с добавлением PD-1-блокирующего антитела или без него.

[0122] На фиг. 42A показана фракция pMHC⁺ CD8⁺ T-клеток в ответах CD8⁺ T-клеток de novo с добавлением ИЛ-12 или без него.

[0123] На фиг. 42B показана процентная доля CD8⁺ T-клеток в ответах CD8⁺ T-клеток de novo с добавлением ИЛ-12 или без него.

[0124] На фиг. 43 показан пример способов, представленных в настоящем описании. Специфические для пациента неоантигены прогнозировали с использованием биоинформатического программного обеспечения. Синтетические длинные пептиды, охватывающие прогнозируемые неоантигены, используют в качестве иммуногенов в способах стимуляции для оценки иммуногенной активности. Способ стимуляции включает подачу этих кодирующих неоантиген пептидов к полученным из пациента APC, которые затем сокультивируют с полученными из пациента T-клетками для примирования неоантиген-специфических T-клеток.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0125] Настоящее изобретение относится новым иммунотерапевтическим средствам и их применению на основе открытия неоантигенов, являющихся результатом мутационных явлений, уникальных для опухоли индивидуума. Таким образом, настоящее изобретение относится к способам получения антигенспецифических иммунных клеток, например, T-клеток, для применения в лечении заболевания.

Определения

[0126] Терминология, используемая в настоящем описании, предназначена исключительно для описания конкретных случаев, а не для ограничения. В рамках изобретения формы в единственном числе предназначены для включения форм во множественном числе, если контекст четко не указывает на иное. Кроме того, в той степени, в которой термины "включающий", "включает", "имеющий", "имеет", "с" или их варианты используют в подробном описании и/или формуле изобретения, такие термины должны быть инклюзивными аналогично термину "содержащий".

[0127] Следует понимать, что такие термины как "содержит", "содержащийся", "содержащий" и т.п. могут иметь значение, приписываемое им в патентном законодательстве США; например, они могут означать "включает", "включенный", "включающий" и т.п.; и что термины, такие как "состоящий, по существу, из" и "состоит, по существу, из", имеют значение, приписываемое им в патентном законодательстве США, например, они позволяют не конкретно перечислять элементы, но исключать элементы, обнаруживаемые на современном уровне техники или влияющие на основные или новые характеристики изобретения. Ничто в настоящем описании не следует истолковывать как обязательство.

[0128] Термин "и/или", как используют в такой фразе, как "A и/или B", в настоящем описании, предназначен для включения и A, и B; A или B; A (в отдельности) и B (в отдельности). Аналогично, термин "и/или", как используют в такой фразе, как "A, B и/или C", предназначен для включения каждого из следующих вариантов осуществления: A, B, и C; A, B, или C; A или C; A или B; B или C; A и C; A и B; B и C; A (в отдельности); B (в отдельности) и C (в отдельности).

[0129] Термин "приблизительно" может означать нахождение в пределах приемлемого интервала ошибок для конкретного значения, определяемого специалистом в этой области, что будет частично зависеть от того, как значение измеряют или определяют, т.е. ограничений системы измерения. Например, термин "приблизительно" может означать в пределах 1 или более 1 стандартного отклонения в соответствии с практикой в этой области. Альтернативно, термин "приблизительно" может означать диапазон до 20%, до 10%, до 5% или до 1% от указанного значения. Альтернативно, в частности, в отношении процессов в биологических системах, термин может означать в пределах порядка величины, в пределах 5-кратной величины и, более предпочтительно, в пределах 2-кратной величины. Если в заявке и формуле изобретения описывают конкретные значения, если не указано иначе, термин "приблизительно" означает в пределах в пределах приемлемого интервала ошибок для конкретного значения.

[0130] Для облегчения понимания настоящего изобретения далее определен ряд терминов и фраз.

[0131] Термин "неоантиген" относится к классу опухолевых антигенов, возникающих при опухолеспецифических изменениях в белках. Неоантигены включают, в качестве неограничивающих примеров, опухолевые антигены, возникающие, например, при замене в белковой последовательности, мутации со сдвигом рамки считывания, слиянии полипептидов, делеции в рамке считывания, инсерции и экспрессии эндогенного ретровирусного полипептида.

[0132] Термин "неоэпитоп" относится к эпитопу, отсутствующему в референсном образце, таком как непораженная заболеванием клетка, например, незлокачественная клетка или клетка зародышевой линии, но обнаруживаемому в пораженной заболеванием клетке, например, злокачественной клетке. Это включает случаи, когда соответствующий эпитоп обнаруживают в нормальной, непораженной заболеванием клетке или клетке зародышевой линии в результате одной или более мутаций в пораженной заболеванием клетке, например, злокачественной клетке, последовательность эпитопа изменена, что приводит к образованию неоэпитопа.

[0133] Термин "референс" можно использовать для определения корреляции и/или сравнения результатов, полученных способами по настоящему изобретению с помощью пораженного заболеванием образца. Как правило, "референс" можно получать на основе одного или более нормальных образцов, в частности, образцов не пораженных заболеванием, полученных от индивидуума или одного или более разных индивидуумов (например, здоровых индивидуумов), таких как индивидуумы одного биологического вида. "Референс" можно определять эмпирически посредством тестирования достаточно большого количества нормальных образцов.

[0134] Термин "мутация" относится к изменению или отличию последовательности нуклеиновой кислоты (например, замене, добавлению или делеции нуклеотида) по сравнению с референсной нуклеиновой кислотой. "Соматическая мутация" может возникать в любой из клеток организма, за исключением половых клеток (сперматозоида и яйцеклетки), и не передается детям. Это изменение может (но не обязательно) может вызывать злокачественное новообразование или заболевание. В некоторых вариантах осуществления мутация является несинонимичной мутацией. Термин "несинонимичная мутация" относится к мутации (например, замене нуклеотида), приводящей к изменению аминокислоты, такому как замена аминокислоты в продукте трансляции. "Сдвиг рамки считывания" происходит, когда мутация нарушает нормальную фазу повторяемости кодонов гена (также известной как "рамка считывания"), что приводит к трансляции ненативной белковой последовательности. Разные мутации в гене могут приводить к одной и той же измененной рамке считывания.

[0135] Термин "аффинность" относится к мере силы связывания между членами связывающейся пары (например, пептида, связывающего лейкоцитарный антиген человека (HLA), и HLA класса I или II или комплекса пептид-HLA и T-клеточного рецептора (TCR)). Термин "K_D" относится к константе диссоциации между двумя членами связывающейся пары и измеряется в единицах молярности. Термин "K_A" относится к константе аффинности между двумя членами связывающейся пары и является обратным константе диссоциации. Аффинность можно определять экспериментально, например, с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR) с использованием коммерчески доступных модулей Biacore SPR. Термин "K_off" относится к константе скорости обратной реакции между двумя членами связывающейся пары (например, константе скорости обратной реакции HLA-связывающего пептида и HLA класса I или II или комплекса пептид-HLA и TCR). Термин "K_on" относится к константе скорости прямой реакции между двумя членами связывающейся пары (например, константе скорости прямой реакции HLA-связывающего пептида и HLA класса I или II или комплекса пептид-HLA и TCR).

[0136] На всем протяжении настоящего описания результаты, касающиеся "данных о связывании", можно выражать как "IC₅₀". Аффинность также можно выражать как ингибиторную концентрацию 50 (IC₅₀) или концентрацию, при которой замещается 50% первого члена связывающейся пары (например, пептида). Аналогично, термин "ln(IC₅₀)" относится к натуральному логарифму IC₅₀. Например, IC₅₀ может представлять собой концентрацию тестируемого пептида в анализе связывания, при которой наблюдают 50%-ное ингибирование связывания меченого референсного пептида. Учитывая условия, в которых осуществляют анализы (например, предельные концентрации белка HLA и/или концентрации меченого референсного пептида), эти значения могут являться приблизительными значениями K_D. Анализы для определения связывания хорошо известны в этой области и подробно описаны, например, в публикациях PCT WO94/20127 и WO94/03205 и других публикациях, таких как Sidney et al., Current Protocols in Immunology 18.3.1 (1998); Sidney, et al., J. Immunol. 154:247 (1995) и Sette, et al., Mol. Immunol. 31:813 (1994). Альтернативно, связывание можно выражать относительно связывания референсного стандартного пептида. Связывание также можно определять с использованием других анализов, включая анализы с использованием: живых клеток (например, Ceppellini et al., Nature 339:392 (1989); Christnick et al., Nature 352:67 (1991); Busch et al., Int. Immunol. 2:443 (1990); Hill et al., J. Immunol. 147:189 (1991); del Guercio et al., J. Immunol. 154:685 (1995)), бесклеточных систем с использованием лизатов после обработки детергентом (например, Cerundolo et al., J. Immunol. 21:2069 (1991)), иммобилизованного очищенного MHC (например, Hill et al., J. Immunol. 152.2890 (1994); Marshall et al., J. Immunol. 152:4946 (1994)), систем ELISA (например, Reay et al., EMBOJ. 11:2829 (1992)), поверхностного плазмонного резонанса (например, Khilko et al., J. Biol. Chem. 268:15425 (1993)); высокопоточных гомогенных анализов (Hammer et al., J. Exp. Med. 180:2353 (1994)) и измерения стабилизации или сборки MHC класса I (например, Ljunggren et al., Nature 346:476 (1990);Schumacher et al., Cell 62:563 (1990); Townsend et al., Cell 62:285 (1990);Parker et al.,J. Immunol. 149:1896 (1992)).

[0137] Термин "полученный" при использовании для обсуждения эпитопа является синонимом термина "полученный". Полученный эпитоп можно выделять из натурального источника или можно синтезировать стандартным в этой области способом. Синтетические эпитопы могут содержать искусственные аминокислотные остатки "миметики аминокислот", такие как D-изомеры встречающихся в природе L-аминокислотных остатков или неприродные аминокислотные остатки, такие как циклогексилаланин. Полученный эпитоп может являться аналогом нативного эпитопа. Термин "полученный из" относится к происхождению или источнику и может включать природные, рекомбинантные, неочищенные, очищенные или дифференцированные молекулы или клетки. Например, выращенную или индуцированную антигенспецифическую T-клетку можно получать из T-клетки. Например, выращенную или индуцированную антигенспецифическую T-клетку можно получать из антигенспецифической T-клетки в биологическом образце. Например, зрелую APC (например, профессиональную APC) можно получать из незрелой APC. Например, APC можно получать из моноцита (например, CD14⁺ моноцита). Например, дендритную клетку можно получать из моноцита (например, CD14⁺ моноцита). Например, APC можно получать из клетки костного мозга.

[0138] "Эпитоп" представляет собой совокупные признаки молекулы (например, заряд пептида и первичную, вторичную и третичную структуру), которые вместе образуют участок, распознаваемый другой молекулой (например, иммуноглобулином, T-клеточным рецептором, молекулой HLA или химерным антигенным рецептором). Например, эпитоп может представлять собой набор аминокислотных остатков, вовлеченных в распознавание конкретным иммуноглобулином, рецептором главного комплекса гистосовместимости (MHC) или, в контексте T-клеток, остатков, распознаваемых T-клеточным рецепторным белком и/или химерным антигенным рецептором. Эпитопы можно получать посредством выделения из природного источника или можно синтезировать стандартными в этой области способами. Синтетические эпитопы могут содержать искусственные аминокислотные остатки, миметики аминокислот (такие как D-изомеры природных L-аминокислотных остатков или неприродные аминокислотные остатки). На всем протяжении настоящего описания эпитопы в некоторых случаях могут являться пептидами или пептидными эпитопами. В некоторых вариантах осуществления существует ограничение длины пептида по настоящему изобретению. Вариант осуществления, ограниченный по длине, получают, когда белок или пептид, содержащий эпитоп, представленный в настоящем изобретении, содержит область (т.е. серию смежных аминокислотных остатков), имеющую 100% идентичности в отношении нативной последовательности. Во избежание распространения определения эпитопа, например, на целые природные молекулы, существует ограничение длины любой области, имеющей 100% идентичности в отношении нативной пептидной последовательности. Таким образом, в случае пептида, содержащего эпитоп, представленный в настоящем описании, и область с 100% идентичности в отношении нативной пептидной последовательности, область с 100% идентичности в отношении нативной пептидной последовательности, как правило, имеет длину: 600 аминокислотных остатков или менее, 500 аминокислотных остатков или менее, 400 аминокислотных остатков или менее, 250 аминокислотных остатков или менее, 100 аминокислотных остатков или менее, 85 аминокислотных остатков или менее, 75 аминокислотных остатков или менее, 65 аминокислотных остатков или менее и 50 аминокислотных остатков или менее. В некоторых вариантах осуществления "эпитоп", представленный в настоящем описании, содержится в пептиде, содержащем область с 51 аминокислотным остатком или менее, имеющую 100% идентичности в отношении нативной пептидной последовательности, с любым шагом до 5 аминокислотных остатков; например, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотный остаток.

[0139] Термин "T-клеточный эпитоп" относится к пептидной последовательности, связанной молекулой MHC в форме комплекса пептид-MHC (pMHC). Комплекс пептид-MHC может распознаваться и связываться TCR T-клетки (например, цитотоксического T-лимфоцита или хелперной T-клетки).

[0140] Термин "T-клетка" включает CD4⁺ T-клетки и CD8⁺ T-клетки. Термин "T-клетка" также включает хелперные T-клетки 1 типа и хелперные T-клетки 2 типа.

[0141] Термин "иммунная клетка" относится к клетке, играющей роль в иммунном ответе. Иммунные клетки имеют гемопоэтическое происхождение и включают лимфоциты, такие как B-клетки и T-клетки; естественные киллеры; миелоидные клетки, такие как моноциты, макрофаги, эозинофилы, тучные клетки, базофилы и гранулоциты.

[0142] "Иммуногенный" пептид, или "иммуногенный" эпитоп, или "иммуногенный" пептидный эпитоп является пептидом, связывающимся с молекулой HLA и индуцирующим клеточно-опосредованный гуморальный ответ, например, ответ цитотоксических T-лимфоцитов (CTL), ответ хелперных T-лимфоцитов (HTL) и/или B-лимфоцитарный ответ. Иммуногенные пептиды, представленные в настоящем описании, могут связываться с молекулой HLA, а затем индуцировать клеточно-опосредованный гуморальный ответ (например, ответ CTL (цитотоксический) или ответ HTL) на пептид.

[0143] Термины "протективный иммунный ответ" или "терапевтический иммунный ответ" относятся к ответу CTL и/или HTL на антиген, полученный из патогенного антигена (например, опухолевого антигена), который каким-то образом предотвращает или по меньшей мере частично прекращает развитие симптомов, побочных эффектов или прогрессирования заболевания. Иммунный ответ также может включать гуморальный ответ, облегчаемый стимуляцией хелперных T-клеток.

[0144] Термин "T-клеточный рецептор" ("TCR") относится к молекуле, природной или частично или полностью синтетически полученной, обнаруживаемой на поверхности T-лимфоцитов (T-клеток), распознающих антиген, связанный с молекулой главного комплекса гистосовместимости (MHC). Способность T-клеток распознавать антиген, ассоциированный с различными заболеваниями (например, злокачественными новообразованиями) или возбудителями инфекций, придает им их TCR, состоящий из альфа-цепи (α) и бета-цепи (β) или гамма-цепи (γ) и дельта-цепи (δ). Белки, составляющие эти цепи, кодируются ДНК, при этом используется уникальный механизм создания огромного разнообразия TCR. Этот иммунный распознающий рецептор из множества единиц соединяется с комплексом CD3 и связывается с пептидами, презентируемыми белками MHC класса I и II на поверхности антигенпрезентирующих клеток (APC). Связывание TCR с пептидом на APC является центральным событием при T-клеточной активации.

[0145] В рамках изобретения термин "химерный антигенный рецептор" или "CAR" относится к антигенсвязывающему белку, включающему иммуноглобулиновый антигенсвязывающий домен (например, вариабельный домен иммуноглобулин) и константный домен T-клеточного рецептора (TCR). В рамках изобретения "константный домен" полипептида TCR включает проксимальный к мембране константный домен TCR, трансмембранный домен TCR и/или цитоплазматический домен TCR или их фрагменты. Например, в некоторых вариантах осуществления CAR является мономером, включающим полипептид, содержащий вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, соединенный с константным доменом TCRβ. В некоторых вариантах осуществления CAR является димером, включающим первый полипептид, содержащий вариабельный домен тяжелой или легкой цепи иммуноглобулина, соединенный с константным доменом TCRα или TCRβ, и второй полипептид, содержащий вариабельный домен тяжелой или легкой цепи иммуноглобулина (например, вариабельный домен κ или λ), соединенный с константным доменом TCRβ или TCRα.

[0146] "Главный комплекс гистосовместимости" или "MHC" представляет собой кластер генов, играющий роль в контроле клеточных взаимодействий, отвечающих за физиологические иммунные ответы. Термины "главный комплекс гистосовместимости" и сокращение "MHC" могут включать любой класс молекул MHC, такой как MHC класса I и MHC класса II, и относятся к комплексу генов, встречающемуся у всех позвоночных. У людей комплекс MHC также известен как комплекс лейкоцитарного антигена человека (HLA). Таким образом, термин "лейкоцитарный антиген человека" или "HLA" относится к белку главного комплекса гистосовместимости (MHC) человека (см., например, Stites, et al., Immunology, 8TH Ed., Lange Publishing, Los Altos, Calif. (1994)). Подробное описание комплексов MHC и HLA см. в Paul, Fundamental Immunology, 3rd Ed., Raven Press, New York (1993).

[0147] Главный комплекс гистосовместимости в геноме содержит генетическую область, продукты генов которой, экспрессируемые на поверхности клеток, важны для связывания и презентирования эндогенных и/или чужеродных антигенов и, таким образом, для регуляции иммунологических процессов. Белки или молекулы MHC важны для передачи сигнала между лимфоцитами и антигенпрезентирующими клетками или пораженными заболеванием клетками в иммунных реакциях. Белки или молекулы MHC связываются с пептидами и презентируют их для распознавания T-клеточными рецепторами. Белки, кодируемые MHC, могут экспрессироваться на поверхности клеток и экспонировать аутоантигены (пептидные фрагменты из самой клетки) и не-аутоантигены (например, фрагменты инвазивных микроорганизмов) для T-клетки. MHC-связывающие пептиды могут образовываться при протеолитическом расщеплении белковых антигенов и представляют собой потенциальные лимфоцитарные эпитопы (например, T-клеточный эпитоп и B-клеточный эпитоп). MHC могут транспортировать пептиды к поверхности клетки и презентировать их специфическим клеткам, таким как цитотоксические T-лимфоциты, хелперные T-клетки или B-клетки. Область MHC можно разделять на три подгруппы, класс I, класс II и класс III. Белки MHC класса I могут содержать α-цепь и β2-микроглобулин (не являющийся частью MHC, кодируемого хромосомой 15). Они могут презентировать фрагменты антигена цитотоксическим T-клеткам. Белки MHC класса II могут содержать α- и β-цепи и могут презентировать фрагменты антигена хелперным T-клеткам. Область MHC класса III может кодировать другие иммунные компоненты, такие как компоненты комплемента и цитокины. MHC может являться полигенным (существует несколько генов MHC класса I и MHC класса II) и полиморфным (существует множество аллелей каждого гена).

[0148] Термин "процессинг антигена" или "процессинг" относится к деградации полипептида или антигена до продуктов процессинга, являющихся фрагментами указанного полипептида или антигена (например, деградации полипептида до пептидов), и соединения одного или более из этих фрагментов (например, посредством связывания) с молекулами MHC для презентирования клетками, например, антигенпрезентирующими клетками, специфическим T-клеткам.

[0149] Термин "антигенпрезентирующая клетка" (APC) относится к клетке, презентирующей пептидные фрагменты белковых антигенов в соединении с молекулами MHC на поверхности клетки. Термин включает профессиональные антигенпрезентирующие клетки (например, B-лимфоциты, моноциты, дендритные клетки, клетки Лангерганса), а также другие антигенпрезентирующие клетки (например, кератиноциты, эндотелиальные клетки, астроциты, фибробласты, олигодендроциты).

[0150] Термин "рецептор" относится к биологической молекуле или группировке молекул, способных связываться с лигандами. Рецептор может служить для передачи информации в клетке, клеточном образовании или организме. Рецептор содержит по меньшей мере одну рецепторную единицу, например, где каждая рецепторная единица может состоять из белковой молекулы. Рецептор имеет структуру, которая дополняет структуру лиганда и может образовывать комплекс с лигандом в качестве партнера по связыванию. Информация передается, в частности, посредством конформационных изменений рецептора после комплексирования лиганда на поверхности клетки. В некоторых вариантах осуществления термин "рецептор" следует понимать как означающий, в частности, белки MHC классов I и II, способные образовывать комплекс рецептор/лиганд с лигандом, в частности, пептидом или пептидным фрагментом подходящей длины. Термин "лиганд" относится к молекуле, имеющей структуру, комплементарную структуре рецептора и способную образовывать комплекс со своим рецептором. В некоторых вариантах осуществления термин "лиганд" следует понимать как означающий пептид или пептидный фрагмент, имеющий подходящую длину и подходящие связывающие мотивы в своей аминокислотной последовательности таким образом, что пептид или пептидный фрагмент может образовывать комплекс с белками MHC, такими как белки MHC класса I или MHC класса II. В некоторых вариантах осуществления термин "комплекс рецептор/лиганд" также следует понимать как означающий "комплекс рецептор/пептид" или "комплекс рецептор/пептидный фрагмент", включая молекулу MHC, презентирующую пептид или пептидный фрагмент, такую как молекулы MHC класса I или MHC класса II.

[0151] Термин "нативная" последовательность или последовательность "дикого типа" означает последовательность, обнаруживаемую в природе. В рамках изобретения термин "природный" относится к тому факту, что объект можно найти в природе. Например, пептид или нуклеиновая кислота, присутствующие в организме (включая вирусы), и которые можно выделять из источника в природе, и которые не модифицированы человеком преднамеренно в лаборатории, являются природными.

[0152] Термины "пептид" и "пептидный эпитоп" используют в настоящем описании взаимозаменяемо с термином "олигопептид" для обозначения серии остатков, соединенных друг с другом, как правило, пептидными связями между α-аминогруппой и карбоксильной группой смежных аминокислотных остатков. Термин "синтетический пептид" означает пептид, получаемый из неприродного источника, например, сделанный человеком. Такие пептиды можно получать с использованием таких способов, как химический синтез или технологии рекомбинантной ДНК. Термин "синтетические пептиды" включает слитые белки.

[0153] Термин "мотив" относится к паттерну остатков в аминокислотной последовательности определенной длины, например, пептиду длиной менее приблизительно 15 аминокислотных остатков или менее приблизительно 13 аминокислотных остатков, например, от приблизительно 8 до приблизительно 13 аминокислотных остатков (например, 8, 9, 10, 11, 12 или 13) в случае мотива HLA класса I и от приблизительно 6 до приблизительно 25 аминокислотных остатков (например, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25) в случае мотива HLA класса II, распознаваемому конкретной молекулой HLA. Мотивы, как правило, отличаются для каждого белка HLA, кодируемого определенным аллелем HLA человека. Эти мотивы отличаются по своему паттерну первичных и вторичных якорных остатков. В некоторых вариантах осуществления мотив MHC класса I идентифицирует пептид длиной 7, 8 9, 10, 11, 12 или 13 аминокислотных остатков. В некоторых вариантах осуществления мотив MHC класса II идентифицирует пептид длиной 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или 26 аминокислотных остатков. Термин "перекрестно-реактивный связывающий" пептид относится к пептиду, связывающемуся с несколькими членами класса членов связывающейся пары (например, пептиду, связанному и молекулой HLA класса I, и молекулой HLA класса II).

[0154] Термин "остаток" относится к аминокислотному остатку или остатку миметика аминокислоты, встроенному в пептид или белок посредством амидной связи или миметика амидной связи или кодируемому нуклеиновой кислотой (ДНК или РНК). Номенклатура, используемая для описания пептидов или белков, соответствует общепринятой практике. Аминогруппа находится на левой стороне (амино- или N-конце), и карбоксильная группа находится на правой стороне (карбокси- или C-конце) каждого аминокислотного остатка. Когда положения аминокислотных остатков приписывают пептидному эпитопу, их нумеруют в направлении от амино-конца к карбоксильному концу, при этом первое положение представляет собой остаток, находящийся на амино-конце эпитопа или пептида или белка, частью которых он является. В формулах, представляющих собой выбранные конкретные варианты осуществления настоящего изобретения, амино-концевые и карбокси-концевые группы, хотя они и не представлены конкретно, находятся в форме, которую они, как считают, принимают при физиологических значениях pH, если не указано иначе. В формулах структур аминокислот каждый остаток, как правило, представлен с помощью стандартного трехбуквенного или однобуквенного обозначения. L-форма аминокислотного остатка представлена одной прописной буквой или прописной первой буквой трехбуквенного обозначения, и D-форма тех аминокислотных остатков, которые имеют D-форму, представлена одной строчной буквой или строчным трехбуквенным обозначением. Однако если используют трехбуквенные обозначения или полные названия без прописных букв, они могут относиться к L-аминокислотным остаткам. Глицин не имеет асимметричного атома углерода, и его просто обозначают как "Gly" или "G". Аминокислотные последовательности пептидов, приведенные в настоящем описании, как правило, обозначают с использованием стандартного однобуквенного обозначения (A, аланин; C, цистеин; D, аспарагиновая кислота; E, глутаминовая кислота; F, фенилаланин; G, глицин; H, гистидин; I, изолейцин; K, лизин; L, лейцин; M, метионин; N, аспарагин; P, пролин; Q, глутамин; R, аргинин; S, серин; T, треонин; V, валин; W, триптофан; и Y, тирозин).

[0155] "Консервативная аминокислотная замена" представляют собой замену, при которой один аминокислотный остаток заменяют другим аминокислотным остатком, имеющим схожую боковую цепь. В этой области определены семейства аминокислотных остатков, имеющих схожие боковые цепи, включая основные боковые цепи (например, лизин, аргинин, гистидин), кислые боковые цепи (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженные полярные боковые цепи (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярные боковые цепи (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленные боковые цепи (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматические боковые цепи (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Например, замена фенилаланина тирозином является консервативной заменой. В этой области хорошо известны способы идентификации консервативных замен нуклеотидов и аминокислот, не устраняющих функцию пептида.

[0156] Термин "фармацевтически приемлемый" относится к, в целом, нетоксичной, инертной и/или физиологически совместимой композиции или компоненту композиции. Термин "фармацевтический эксципиент" или "эксципиент" включает материал, такой как вспомогательное вещество, носитель, средства для коррекции pH и буферные средства, средства для регуляции тоничности, увлажнители, консерванты и т.п. "Фармацевтический эксципиент" является эксципиентом, являющимся фармацевтически приемлемым.

[0157] В рамках изобретения термин "вакцина" относится к фармацевтическому препарату (фармацевтической композиции) или продукту, который после введения индуцирует иммунный ответ, например, клеточный или гуморальный иммунный ответ, и распознает и атакует патоген или пораженную заболеванием клетку, такую как злокачественная клетка. Вакцину можно использовать для профилактики или лечения заболевания. Термин "индивидуализированная противоопухолевая вакцина" или "персонализированная противоопухолевая вакцина", "персональная противоопухолевая вакцина" относится к конкретному пациенту со злокачественным новообразованием и означает, что противоопухолевая вакцина адаптирована к потребностям или конкретным обстоятельствам отдельного пациента со злокачественным новообразованием.

[0158] Термины "полинуклеотид" и "нуклеиновая кислота" используют в настоящем описании взаимозаменяемо, и они относятся к полимерам нуклеотидов любой длины и включают ДНК и РНК, например, мРНК. Нуклеотиды могут являться дезоксирибонуклеотидами, рибонуклеотидами, модифицированными нуклеотидами или основаниями, и/или их аналогами, или любым субстратом, который может встраиваться в полимер ДНК- или РНК-полимеразой. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид и нуклеиновая кислота могут являться транскрибированной in vitro мРНК. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, вводимый способами по настоящему изобретению, является мРНК.

[0159] Термины "выделенный" или "биологически чистый" относятся к материалу, по существу, не содержащему компоненты, как правило, сопутствующие материалу в его нативном состоянии. Таким образом, выделенные пептиды, представленные в настоящем описании, не содержат некоторые или все из материалов, как правило, ассоциированных с пептидами в их окружении in situ. Например, "выделенный" эпитоп может являться эпитопом, не включающим целую последовательность белка, из которого эпитоп получали. Например, природный полинуклеотид или пептид, присутствующий у живого животного, не является выделенным, но тот же полинуклеотид или пептид, отделенный от некоторых или всех сосуществующих материалов в природной системе, является выделенным. Такой полинуклеотид может являться частью вектора, и/или такой полинуклеотид или пептид может являться частью композиции и все равно быть "выделенным" в том смысле, что такой вектор или композиция не является частью его природного окружения. Выделенные молекулы РНК включают транскрипты РНК in vivo или in vitro молекул ДНК, представленных в настоящем описании, и дополнительно включают такие молекулы, полученные синтетически. В некоторых вариантах осуществления полипептид, антитело, полинуклеотид, вектор, клетка или композиция, являющаяся выделенной, является, по существу, чистой. В рамках изобретения термин "по существу, чистый" относится к материалу, являющемуся по меньшей мере на 50% чистым (т.е. несодержащим загрязнения), по меньшей мере на 90% чистым, по меньшей мере на 95% чистым, по меньшей мере на 98% чистым или по меньшей мере на 99% чистым.

[0160] Термины "идентичный" или процент "идентичности" в контексте двух или более нуклеиновых кислот или полипептидов относится к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, являющимся одинаковыми или имеющими определенную процентную долю нуклеотидов или аминокислотных остатков, являющихся одинаковыми при сравнении и выравнивании (включении пропусков, при необходимости) для максимального соответствия без учета любых консервативных аминокислотных замен как части идентичности последовательности. Процент идентичности можно измерять с использованием программного обеспечения или алгоритмов для сравнения последовательности или посредством визуального осмотра. Различные алгоритмы и программное обеспечение, которые можно использовать для достижения выравнивания аминокислотных или нуклеотидных последовательностей, хорошо известны в этой области. Они включают, в качестве неограничивающих примеров, BLAST, ALIGN, Megalign, BestFit, GCG Wisconsin Package и их варианты. В некоторых вариантах осуществления две нуклеиновые кислоты или полипептида, представленные в настоящем описании, являются, по существу, идентичными, что означает, что они имеют по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% и в некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичности нуклеотидов или аминокислотных остатков при сравнении и выравнивании для максимального соответствия, что измеряют с использованием алгоритмов для сравнения последовательностей или посредством визуального осмотра. В некоторых вариантах осуществления идентичность существует в области последовательности, длина которой составляет по меньшей мере приблизительно 10, по меньшей мере приблизительно 20, по меньшей мере приблизительно 40-60 остатков, по меньшей мере приблизительно 60-80 остатков или имеет любое целое значение между ними. В некоторых вариантах осуществления идентичность существует в более длинной области, чем 60-80 остатков, такой как по меньшей мере приблизительно 80-100 остатков, и в некоторых вариантах осуществления последовательности являются, по существу, идентичными по всей длине сравниваемых последовательностей, такими как аминокислотная последовательность пептида или кодирующая область нуклеотидной последовательности.

[0161] Термин "индивидуум" относится к любому животному (например, млекопитающему), включая, в качестве неограничивающих примеров, людей, не являющихся человеком приматов, собак, кошек, грызунов и т.п., которое будет реципиентом конкретного лечения. Как правило, термины "индивидуум" и "пациент" используют в настоящем описании взаимозаменяемо в отношении человека.

[0162] Термины "эффективное количество", или "терапевтически эффективное количество", или "терапевтический эффект" относятся к количеству, терапевтически эффективному для "лечения" заболевания или нарушения у индивидуума или млекопитающего. Терапевтически эффективное количество лекарственного средства имеет терапевтический эффект и, по существу, может предотвращать развитие заболевания или нарушения; замедлять развитие заболевания или нарушения; замедлять прогрессирование заболевания или нарушения; облегчать в некоторой степени один или более из симптомов, ассоциированных с заболеванием или нарушением; снижать заболеваемость и смертность; улучшать качество жизни; или иметь комбинацию таких эффектов.

[0163] Термины "лечение", или "лечить", или "облегчение", или "облегчать" относятся к (1) терапевтическим мерам, позволяющим излечивать, замедлять, уменьшать симптомы и/или останавливать прогрессирование диагностированного патологического состояния или нарушения, и (2) профилактическим или превентивным мерам, позволяющим предотвращать или замедлять развитие определенного патологического состояния или нарушения. Таким образом, нуждающиеся в лечении индивидуумы включают индивидуумов, уже имеющих нарушение; индивидуумов, предрасположенных к развитию нарушения; и индивидуумов, у которых развитие нарушения подвергают профилактике.

[0164] Термин "истощенный" при использовании для описания образца клеток (например, образца мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC)) относится к образцу клеток, в котором субпопуляция клеток удалена или истощена. Например, термин "образец иммунных клеток, истощенный в отношении CD25-экспрессирующих клеток" относится к образцу иммунных клеток, в котором CD25-экспрессирующие клетки удалены или истощены. Например, одно или более связывающих средств можно использовать для удаления или истощения одной или более клеток или типов клеток в образце. Например, CD14⁺ клетки можно истощать или удалять из образца PBMC, например, с использованием антитела, связывающегося с CD14.

[165] Термин "стимуляция" относится к ответу, индуцируемому связыванием стимулирующей молекулы с ее когнатным лигандом, таким образом, опосредующим событие передачи сигнала. Например, термин "стимуляция T-клетки" может относиться к связыванию TCR T-клетки с комплексом пептид-MHC. Например, термин "стимуляция T-клетки" может относиться к стадии способа 1 или способа 2, в котором PBMC культивируют совместно с APC, нагруженными пептидом.

[166] Термин "обогащенный" относится к композиции или фракции, где вид объекта частично очищен таким образом, что концентрация вида объекта является, по существу, более высокой, чем природный уровень вида объекта в конечном продукте без обогащения. Термин "индуцированная клетка" относится к клетке, обработанной индуцирующим соединением, клеткой или популяцией клеток, влияющими на экспрессию белка, экспрессию генов, статус дифференцировки, форму, морфологию, жизнеспособность клетки и т.п.

Обзор T-клеточных терапевтических средств и их производства

[0167] Получение антигенспецифических T-клеток посредством контролируемого индуцирования или экспансии T-клеток (например, аутологичных T-клеток) ex vivo может обеспечивать получение высокоспецифических и полезных T-клеточных терапевтических средств (например, адоптивных T-клеточных терапевтических средств). Настоящее изобретение относится к способам производства T-клеток и терапевтическим композициям T-клеток, которые можно использовать для лечения индивидуумов со злокачественными новообразованиями и другими состояниями, заболеваниями и нарушениями. Целью являются экспансия и индуцирование антигенспецифических T-клеток с благоприятным фенотипом и функцией. Настоящее изобретение относится к композициям и способам для производства T-клеток, которые можно использовать для терапии антигенспецифическими T-клетками (например, персональными или персонализированными T-клеточными терапевтическими средствами). Композиции T-клеток, представленные в настоящем описании, могут представлять собой персональные антигенспецифические T-клеточные терапевтические средства.

[0168] Настоящее изобретение относится к способам стимуляции T-клеток. Например, способы, представленные в настоящем описании, можно использовать для стимуляции антигенспецифических T-клеток. Способы, представленные в настоящем описании, можно использовать для экспансии или индуцирования антигенспецифических T-клетки. Например, способы, представленные в настоящем описании, можно использовать для экспансии антигенспецифических T-клеток памяти. Например, способы, представленные в настоящем описании, можно использовать для индуцирования антигенспецифических наивных T-клеток. Например, способы, представленные в настоящем описании, можно использовать для экспансии антигенспецифических CD8⁺ T-клеток памяти. Например, способы, представленные в настоящем описании, можно использовать для индуцирования антигенспецифических CD8⁺ наивных T-клеток. Например, способы, представленные в настоящем описании, можно использовать для экспансии антигенспецифических CD4⁺ T-клеток памяти. Например, способы, представленные в настоящем описании, можно использовать для индуцирования антигенспецифических CD4⁺ наивных T-клеток. Настоящее изобретение также относится к терапевтическим композициям, содержащим антигенспецифические T-клетки. Например, терапевтические композиции могут содержать антигенспецифические T-клетки памяти. Например, терапевтические композиции могут содержать антигенспецифические наивные T-клетки. Настоящее изобретение также относится к способам применения или способам лечения с применением терапевтических композиций, представленных в настоящем описании.

Композиции T-клеток

[0169] Настоящее изобретение относится к композициям (например, фармацевтическим композициям), содержащим популяцию иммунных клеток. Композиции могут содержать по меньшей мере одну антигенспецифическую T-клетку, содержащую T-клеточный рецептор (TCR). Композиции могут содержать по меньшей мере одну антигенспецифическую T-клетку, содержащую T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена.

[0170] В некоторых вариантах осуществления композиции, представленные в настоящем описании, содержат T-клетки, стимулированные APC, такими как APC, предварительно нагруженные антигенными пептидами. Композиции могут содержать популяцию иммунных клеток, содержащую T-клетки из образца (например, биологического образца), где T-клетки содержат APC-стимулированные T-клетки. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит популяцию иммунных клеток, инкубированных с одним или более цитокинами, факторами роста или лигандами, такими как лиганд, связывающийся с рецептором поверхности клетки APC или T-клетки. Неограничивающие примеры таких цитокинов, факторов роста и лигандов включают ГМ-КСФ, ИЛ-4, FLT3L, ФНОα, ИЛ-1β, PGE1, ИЛ-6, ИФНα, R848, LPS, ss-rna40 и поли-I:C. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит популяцию иммунных клеток, инкубированных с одной или более APC или препаратами APC. Например, композиция может содержать популяцию иммунных клеток, инкубированных с одной или более APC, стимулированными цитокинами, факторами роста и/или лигандами, или препаратами APC, стимулированными цитокинами, факторами роста и/или лигандами. Например, композиция может содержать популяцию иммунных клеток, инкубированных с одной или более стимулированными цитокинами APC или препаратами стимулированных цитокинами APC. Например, композиция может содержать популяцию иммунных клеток, инкубированных с одной или более стимулированными факторами роста APC или препаратами стимулированных факторами роста APC. Например, композиция может содержать популяцию иммунных клеток, инкубированных с одной или более стимулированными лигандами APC или стимулированными лигандами препаратами APC.

[0171] В некоторых вариантах осуществления APC является аутологичной APC, аллогенной APC или искусственной APC. В некоторых вариантах осуществления APC включает дендритную клетку (DC). В некоторых вариантах осуществления APC получают из CD14⁺ моноцита. В некоторых вариантах осуществления APC можно получать из кожи, селезенки, костного мозга, тимуса, лимфоузлов, периферической крови или пуповинной крови. В некоторых вариантах осуществления CD14⁺ моноцит получают из биологического образца индивидуума, содержащего PBMC. Например, CD14⁺ моноцит можно выделять, обогащать или очищать из биологического образца индивидуума, содержащего PBMC. В некоторых вариантах осуществления CD14⁺ моноцит стимулируют одним или более цитокинами или факторами роста. В некоторых вариантах осуществления один или более цитокинов или факторов роста включает ГМ-КСФ, ИЛ-4, FLT3L, ФНОα, ИЛ-1β, PGE1, ИЛ-6, ИФНα, R848, LPS, ss-rna40, поли-I:C или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления CD14⁺ моноцит получают из второго биологического образца, содержащего PBMC.

[0172] В некоторых вариантах осуществления выделенные популяции CD14⁺ APC можно обогащать или, по существу, обогащать. В некоторых вариантах осуществления выделенная популяция CD14⁺ APC является по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 75% или по меньшей мере на 90% гомогенной. В некоторых вариантах осуществления выделенная популяция CD14⁺ APC является по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 75% или по меньшей мере на 90% гомогенной. APC, такие как CD14⁺ APC, могут включать, например, APC, полученные в культуре из моноцитарных дендритных предшественников, а также эндогенно полученных APC, присутствующих в тканях, таких как, например, периферическая кровь, пуповинная кровь, кожа, селезенка, костный мозг, тимус и лимфоузлы.

[0173] CD14⁺ APC и популяции клеток, по существу, обогащенные CD14⁺ APC, можно выделять способами по настоящему изобретению. Способы, как правило, включают получение популяции клеток, включающих предшественников APC, дифференцировку предшественников APC в незрелые или зрелые APC, а также могут включать выделение CD14⁺ APC из популяции дифференцированных незрелых или зрелых APC.

[0174] Клетки-предшественники APC можно получать известными в этой области способами. Предшественников APC можно выделять, например, посредством разделения в градиенте плотности, активируемой флуоресценцией сортировки клеток (FACS), иммунологических способов разделения клеток, таких как пэннинг, лизис комплементом, розеткообразование, способы магнитного разделения клеток, разделения с помощью нейлоновой ваты и комбинаций таких способов. Способы иммуноселекции APC включают, например, использование антител против поверхностных клеточных маркеров, ассоциированных с предшественниками APC, таких как антитела против CD34 и/или против CD14, соединенные с субстратом.

[0175] Также можно получать обогащенные популяции предшественников APC. В этой области известны способы получения таких обогащенных популяций предшественников. Например, обогащенные популяции предшественников APC можно выделять из тканевого источника посредством селективного удаления клеток, прикрепляющихся к субстрату. Используя тканевой источник, такой как, например, костный мозг или периферическая кровь, адгезивные моноциты можно удалять из препаратов клеток с использованием коммерчески обработанного пластикового субстрата (например, бусин или магнитных бусин) для получения популяции, обогащенной неадгезивными предшественниками APC.

[0176] Также можно получать моноцитарные предшественники APC из тканевого источника с использованием субстрата для прикрепления предшественников APC. Например, лейкоциты периферической крови, выделенные посредством, например, лейкофереза, приводят в контакт с субстратом для прикрепления моноцитарных предшественников APC, имеющим высокое соотношение площади поверхности и объема, и отделяют адгезивные моноцитарные предшественники APC. В дополнительных вариантах осуществления субстрат для прикрепления может являться субстратом из твердых частиц или волокон, имеющим высокое соотношение поверхности и объема, таким как, например, микрочастицы, бусины микроносителя, пеллеты, гранулы, порошок, капиллярные трубки, микроворсинчатая мембрана и т.п. Кроме того, субстрат из твердых частиц или волокон может являться стеклом, полистиролом, пластиком, покрытыми стеклом полистироловыми микрочастицами и т.п.

[0177] Предшественников APC также можно культивировать in vitro для дифференцировки и/или экспансии. В этой области известны способы дифференцировки/экспансии предшественников APC. Как правило, экспансии можно достигать посредством культивирования предшественников в присутствии, по меньшей мере, одного цитокина, индуцирующего дифференцировку/пролиферацию APC (например, дендритной клетки). Как правило, эти цитокины представляют собой гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ) или гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ). Кроме того, для ингибирования пролиферации и/или созревания не-APC типов клеток в культуре можно использовать другие средства, таким образом, дополнительно обогащая популяцию предшественников APC. Как правило, такие средства включают цитокины, такие как, например, ИЛ-13, ИЛ-4 или ИЛ-15 и т.п.

[0178] Выделенные популяции предшественников APC культивируют и подвергают дифференцировке для получения незрелых или зрелых APC. Подходящие среды для культивирования тканей включают, в качестве неограничивающих примеров, AIM-V®, RPMI 1640, DMEM, X-VIVO 15® и т.п. Среды для культивирования ткани, как правило, дополняют аминокислотами, витаминами, двухвалентными катионами и цитокинами для стимуляции дифференцировки предшественников в направлении фенотипа APC. Как правило, способствующими дифференцировке цитокинами являются ГМ-КСФ и/или ИЛ-4.

[0179] Кроме того, культуры предшественников APC во время экспансии, дифференцировки и созревания до фенотипа APC могут включать плазму для стимуляции развития CD14⁺ APC. Типичная концентрация плазмы составляет приблизительно 5%. Кроме того, если, например, предшественников APC выделяют посредством прикрепления к субстрату, плазму можно включать в среды для культивирования на стадии прикрепления для стимуляции развития фенотипа CD14⁺ на ранних стадиях культивирования. Типичная концентрация плазмы во время прикрепления составляет приблизительно 1% или более.

[0180] Моноцитарных предшественников APC можно культивировать в течение любого подходящего времени. В некоторых вариантах осуществления подходящее время культивирования для дифференцировки предшественников в незрелые APC может составлять от приблизительно 1 до приблизительно 10 дней, например, от приблизительно 4 до приблизительно 7 дней. Дифференцировку незрелых APC из предшественников можно подвергать мониторингу способами, известными специалистам в этой области, например, по наличию или отсутствию поверхностных клеточных маркеров (например, CD11c⁺, CD83^low, CD86^−/low, HLA-DR⁺). Незрелые APC также можно культивировать в подходящей среде для культивирования ткани для поддержания незрелых APC в состоянии для дальнейшей дифференцировки или захвата, процессинга и презентирования антигена. Например, незрелые APC можно поддерживать в присутствии ГМ-КСФ и ИЛ-4.

[0181] После дифференцировки из предшественников APC CD14⁺ клетки можно выделять для получения выделенной популяции CD14⁺ APC. Как правило, если CD14⁺ APC выделяют перед созреванием из обогащенных или, по существу, обогащенных APC, выделенную популяцию будут обогащать или, по существу, обогащать незрелыми CD14⁺ APC. Как правило, выделение CD14⁺ APC включает приведение популяции клеток, из которой будут выделять CD14⁺ клетки, в контакт с CD14-специфическим зондом. В одном примере варианта осуществления CD14-экспрессирующие клетки определяют посредством FACS с использованием CD14-специфического зонда, напрямую конъюгированного с флуоресцентной молекулой (например, FITC или PE), или немеченого антитела, специфического в отношении CD14, и меченого второго антитела, специфического в отношении первого антитела. CD14⁺ клетки также можно отделять от CD14^low и CD14⁻ клеток посредством сортировки FACS. Гейтирование по положительности по CD14^high можно определять по отношению к окрашиванию по CD14, например, полученных из PBMC моноцитов. Как правило, CD14-специфическое связывающее средство является, например, антителом против CD14 (например, моноклональным антителом или их антигенсвязывающими фрагментами). Ряд антител против CD14, подходящих для использования в настоящем изобретении, хорошо известен специалистам в этой области, и многие из них можно приобретать в коммерческих источниках.

[0182] В другом варианте осуществления CD14-специфический зонд соединяют с субстратом и CD14⁺ клетки выделяют посредством аффинной селекции. Популяцию клеток, включающих CD14⁺ клетки, подвергают воздействию субстрата для присоединения и CD14⁺ клеткам позволяют специфически прикрепляться. Затем неадгезивные CD14⁻ клетки отмывают от субстрата, а адгезивные клетки элюируют для получения популяции выделенных клеток, по существу, обогащенной CD14⁺ APC. CD14-специфический зонд может являться, например, антителом против CD14. Субстрат может представлять собой, например, коммерчески доступные планшеты для культивирования тканей или бусины (например, стеклянные или магнитные бусины). Способы аффинного выделения популяций клеток с использованием присоединенных к субстрату антител, специфических для поверхностных маркеров, как правило, известны.

[0183] Во время культивирования незрелые APC (выделенную популяцию CD14⁻ незрелых APC или всех незрелых APC перед выделением), необязательно, можно подвергать воздействию заранее определенного антигена. Подходящие заранее определенные антигены могут включать любой антиген, в случае которого желательна модуляция T-клеток. В одном из вариантов осуществления незрелые APC культивируют в присутствии простатспецифического мембранного антигена (PSMA) для иммунотерапии злокачественных новообразований и/или ингибирования роста опухоли. Другие антигены могут включать, например, бактериальные клетки, вирусы, частично очищенные или очищенные бактериальные или вирусные антигены, опухолевые клетки, опухолеспецифические или опухолеассоциированные антигены (например, лизат опухолевых клеток, препараты мембран опухолевых клеток), выделенные антигены из опухолей, слитые белки, липосомы и т.п., рекомбинантные клетки, экспрессирующие антиген на своей поверхности, аутоантигены и любой другой антиген. Любые из антигенов также могут находиться в форме пептида, или рекомбинантно получаемого белка, или его части. После контакта с антигеном клетки можно культивировать в течение любого подходящего времени, чтобы сделать возможным захват и процессинг антигена, для экспансии популяции антигенспецифических APC и т.п.

[0184] Например, в одном из вариантов осуществления незрелые APC можно культивировать после захвата антигена для стимуляции созревания незрелых APC в зрелые APC, презентирующие антиген в контексте молекул MHC. Известны способы созревания APC. Такое созревание можно осуществлять, например, посредством культивирования в присутствии известных факторов созревания, таких как цитокины (например, ФНОα, ИЛ-1β или лиганд CD40), бактериальные продукты (например, LPS или BCG) и т.п. Созревание незрелых APC в зрелые APC можно подвергать мониторингу известными в этой области способами, например, посредством измерения наличия или отсутствия поверхностных клеточных маркеров (например, положительной регуляции CD83, CD86 и молекул MHC) или тестирования на экспрессию специфических для зрелых APC мРНК или белков с использованием, например, олигонуклеотидного чипа.

[0185] Необязательно, незрелые APC можно культивировать в подходящей среде для культивирования тканей для экспансии популяции клеток и/или поддержания незрелых APC в состоянии для дальнейшей дифференцировки или захвата антигена. Например, незрелые APC можно поддерживать и/или выращивать в присутствии ГМ-КСФ и ИЛ-4. Кроме того, незрелые APC можно культивировать в присутствии противовоспалительных молекул, таких как, например, противовоспалительные цитокины (например, ИЛ-10 и TGF-β), для ингибирования созревания незрелых APC.

[0186] В другом аспекте выделенную популяцию CD14⁺ APC обогащают зрелыми APC. Выделенную популяцию CD14⁺ зрелых APC можно получать посредством культивирования выделенной популяции CD14⁺ незрелых APC в присутствии факторов созревания, как описано выше (например, бактериальных продуктов и/или провоспалительных цитокинов), таким образом, индуцируя созревание. Необязательно, смешанную популяцию CD14⁺ и CD14⁻ незрелых APC (дифференцированных из предшественников APC) можно культивировать для индуцирования созревания, стадию созревания можно подвергать мониторингу, как описано выше, и на соответствующей стадии обогащения зрелых APC CD14⁺ клетки можно отделять, как описано выше, для получения выделенной популяции, обогащенной или, по существу, обогащенной CD14⁺ зрелыми APC.

[0187] В другом аспекте изобретения APC можно сохранять, например, посредством криоконсервации до или после воздействия антигена рака предстательной железы. Средства для криоконсервации, которые можно использовать, включают в качестве неограничивающих примеров, диметилсульфоксид (DMSO), глицерин, поливинилпирролидон, полиэтиленгликоль, альбумин, декстран, сахарозу, этиленгликоль, i-эритрит, D-рибит, D-маннит, D-сорбит, i-инозитол, D-лактозу, холинхлорид, аминокислоты, метанол, ацетамид, глицерин моноацетат и неорганические соли. Контролируемая небольшая скорость охлаждения может быть критической. Разные криопротекторы и разные типы клеток, как правило, имеют разные оптимальные скорости охлаждения. Теплота фазы плавления, когда вода превращается в лед, как правило, должна быть минимальной. Охлаждение можно осуществлять с использованием, например, программируемого устройства для замораживания или метаноловой бани. Программируемые устройства для замораживания позволяют определять оптимальные скорости охлаждения и облегчать стандартное воспроизводимое охлаждение. Программируемые морозильные камеры с контролируемой скоростью, такие как Cryomed или Planar, позволяют настраивать режим замораживания на желаемую кривую скорости охлаждения.

[0188] После тщательного замораживания APC можно быстро переносить в сосуд для длительного криогенного хранения. В типичном варианте осуществления образцы можно подвергать криогенному хранению в жидком азоте (−196°C) или его парах (−165°C). Принципы и способы обработки, криоконсервации и длительного хранения гемопоэтических стволовых клеток, в частности, из костного мозга или периферической крови, в значительной степени можно использовать в отношении APC по изобретению.

[0189] Замороженные клетки, предпочтительно, быстро размораживают (например, на водяной бане, поддерживаемой при 37-41°C) и охлаждают непосредственно после размораживания. Желательной может являться обработка клеток для предотвращения агрегации клеток после размораживания. Для предотвращения агрегации можно использовать различные способы, включая, в качестве неограничивающих примеров, добавление ДНКазы, низкомолекулярного декстрана и цитрата, гидроксиэтилкрахмала и т.п. до и/или после замораживания. Если криопротектор токсичен для людей, необходимо удалять его перед терапевтическим использованием размороженных APC. Одним из способов удаления криопротектора является разведение до незначительной концентрации. После размораживания и выделения замороженных APC, их можно использовать для активации T-клеток, как представлено в настоящем описании, на основе незамороженных APC.

[0190] В некоторых вариантах осуществления композиция содержит популяцию иммунных клеток, истощенную в отношении одного или более типов иммунных клеток. Например, композиция может содержать популяцию иммунных клеток, истощенную в отношении одного или более типов иммунных клеток, экспрессирующих один или более белков, таких как один или более рецепторов поверхности клетки. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит популяцию иммунных клеток из биологического образца, содержащую по меньшей мере одну антигенспецифическую T-клетку, содержащую T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, где количество CD14- и/или CD25-экспрессирующих иммунных клеток в популяции пропорционально отличается от количества иммунных клеток, экспрессирующих CD14 и/или CD25, в биологическом образце. Например, композиция может содержать популяцию иммунных клеток из биологического образца, содержащую по меньшей мере одну антигенспецифическую T-клетку, содержащую T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, где количество CD14-экспрессирующих иммунных клеток в популяции пропорционально отличается от количества иммунных клеток, экспрессирующих CD14, в биологическом образце. Например, композиция может содержать популяцию иммунных клеток из биологического образца, содержащую по меньшей мере одну антигенспецифическую T-клетку, содержащую T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, где количество CD25-экспрессирующих иммунных клеток в популяции пропорционально отличается от количества иммунных клеток, экспрессирующих CD25, в биологическом образце. Например, композиция может содержать популяцию иммунных клеток из биологического образца, содержащую по меньшей мере одну антигенспецифическую T-клетку, содержащую T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, где количество CD14- и CD25-экспрессирующих иммунных клеток в популяции пропорционально отличается от количества иммунных клеток, экспрессирующих CD14 и CD25, в биологическом образце. Например, композиция может содержать популяцию иммунных клеток из биологического образца, где количество иммунных клеток, экспрессирующих CD14 и CD25, в популяции пропорционально меньше количества иммунных клеток, экспрессирующих CD14 и CD25, в биологическом образце.

[0191] В некоторых вариантах осуществления композиция содержит популяцию иммунных клеток, содержащую T-клетки из образца (например, биологического образца), где T-клетки содержат APC-стимулированные T-клетки, где APC являются FLT3L-стимулированными APC. Например, композиция может содержать популяцию иммунных клеток, содержащую T-клетки из образца (например, биологического образца), где T-клетки содержат APC-стимулированные T-клетки и антигенспецифические T-клетки, содержащие T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, где APC являются FLT3L-стимулированными APC. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит популяцию иммунных клеток, содержащую T-клетки из биологического образца, где T-клетки включают по меньшей мере одну антигенспецифическую T-клетку, являющуюся APC-стимулированной T-клеткой и содержащую T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, где APC является FLT3L-стимулированной APC, и где количество антигенспецифических T-клеток в популяции пропорционально больше количества антигенспецифических T-клеток в биологическом образце. В некоторых вариантах осуществления T-клетки содержат множество антигенспецифических T-клеток, содержащих T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена. В некоторых вариантах осуществления T-клетки содержат множество антигенспецифических T-клеток, содержащих множество T-клеточных рецепторов (TCR), специфических в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена. В некоторых вариантах осуществления T-клетки содержат множество антигенспецифических T-клеток, содержащих множество T-клеточных рецепторов (TCR), специфических в отношении множества пептидных последовательностей антигена. Например, множество антигенспецифических T-клеток в композиции может включать 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 11000, 12000, 13000, 14000, 15000, 16000, 17000, 18000, 19000, 20000, 25000, 30000, 35000, 40000, 45000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200000, 300000, 400000, 500000, 600000, 700000, 800000, 900000, 1×10⁶, 2×10⁶, 3×10⁶, 4×10⁶, 5×10⁶, 6×10⁶, 7×10⁶, 8×10⁶, 9×10⁶, 1×10⁷, 2×10⁷, 3×10⁷, 4×10⁷, 5×10⁷, 6×10⁷, 7×10⁷, 8×10⁷, 9×10⁷, 1×10⁸, 2×10⁸, 3×10⁸, 4×10⁸, 5×10⁸, 6×10⁸, 7×10⁸, 8×10⁸, 9×10⁸, 1×10⁹, 2×10⁹, 3×10⁹, 4×10⁹, 5×10⁹, 6×10⁹, 7×10⁹, 8×10⁹, 9×10⁹, 1×10¹⁰, 2×10¹⁰, 3×10¹⁰, 4×10¹⁰, 5×10¹⁰, 6×10¹⁰, 7×10¹⁰, 8×10¹⁰, 9×10¹⁰, 1×10¹¹, 2×10¹¹, 3×10¹¹, 4×10¹¹, 5×10¹¹, 6×10¹¹, 7×10¹¹, 8×10¹¹, 9×10¹¹, 1×10¹², 2×10¹², 3×10¹², 4×10¹², 5×10¹², 6×10¹², 7×10¹², 8×10¹² или 9×10¹² антигенспецифических T-клеток. Например, множество T-клеточных рецепторов (TCR), специфических в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, может включать 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900 или 1000 различных TCR, специфических в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена. Например, множество T-клеточных рецепторов (TCR), специфических в отношении множества пептидных последовательностей антигена, может включать 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900 или 1000 разных TCR, специфических в отношении множества пептидных последовательностей антигена. Например, множество пептидных последовательностей антигена может включать 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900 или 1000 разных пептидных последовательностей антигена.

[0192] В некоторых вариантах осуществления композиция или фармацевтическая композиция содержит популяцию иммунных клеток из биологического образца. В некоторых вариантах осуществления иммунные клетки включают множество антигенспецифических T-клеток. В некоторых вариантах осуществления каждая из антигенспецифических T-клеток содержит T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена. В некоторых вариантах осуществления композиция или фармацевтическая композиция содержит популяцию иммунных клеток, где количество CD14- и/или CD25-экспрессирующих иммунных клеток в популяции меньше количества CD14- и/или CD25-экспрессирующих иммунных клеток в биологическом образце. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый эксципиент.

[0193] В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция, представленная в настоящем описании, содержит: популяцию иммунных клеток из биологического образца, содержащую по меньшей мере одну антигенспецифическую T-клетку, содержащую T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, и фармацевтически приемлемый эксципиент; где количество иммунных клеток, экспрессирующих CD14 и/или CD25, в популяции пропорционально отличается от количества иммунных клеток, экспрессирующих CD14 и/или CD25, в биологическом образце.

[0194] В некоторых вариантах осуществления композиция, представленная в настоящем описании, содержит популяцию иммунных клеток из биологического образца, где количество иммунных клеток, экспрессирующих CD14 и CD25, в популяции пропорционально меньше количества иммунных клеток, экспрессирующих CD14 и CD25, в биологическом образце.

[0195] В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция, представленная в настоящем описании, содержит: популяцию иммунных клеток, содержащую T-клетки из биологического образца, где T-клетки включают по меньшей мере одну антигенспецифическую T-клетку, являющуюся APC-стимулированной T-клеткой и содержащую T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, где APC является FLT3L-стимулированной APC; и фармацевтически приемлемый эксципиент. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка включает по меньшей мере одну APC-стимулированную T-клетку. В некоторых вариантах осуществления количество иммунных клеток, экспрессирующих CD14 и/или CD25, в популяции пропорционально меньше количества иммунных клеток, экспрессирующих CD14 и/или CD25, в биологическом образце. В некоторых вариантах осуществления количество иммунных клеток, экспрессирующих CD14 и/или CD25, в популяции пропорционально больше количества иммунных клеток, экспрессирующих CD14 и/или CD25, в биологическом образце.

[0196] В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит CD4⁺ T-клетки, где процентная доля антигенспецифических T-клеток среди CD4⁺ T-клеток составляет по меньшей мере приблизительно 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90%. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит наивные CD8⁺ T-клетки, где процентная доля антигенспецифических T-клеток среди наивных CD8⁺ T-клеток составляет по меньшей мере приблизительно 0,2%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90%. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит CD8⁺ T-клетки памяти, где процентная доля антигенспецифических T-клеток среди CD8⁺ T-клеток памяти составляет по меньшей мере приблизительно 0,2%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90%.

[0197] В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит популяцию иммунных клеток, содержащую T-клетки из биологического образца, где T-клетки содержат APC-стимулированные T-клетки и антигенспецифические T-клетки, содержащие T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, где APC являются FLT3L-стимулированными APC; и фармацевтически приемлемый эксципиент.

[0198] В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит популяцию иммунных клеток, содержащую T-клетки из биологического образца, где T-клетки содержат множество неоантиген-специфических T-клеток, содержащих T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, и фармацевтически приемлемый эксципиент; где процентная доля антигенспецифических T-клеток среди T-клеток составляет по меньшей мере приблизительно 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% или 80%.

[0199] В некоторых вариантах осуществления неоантиген-специфические T-клетки содержат APC-стимулированные T-клетки. В некоторых вариантах осуществления процентная доля CD14- и/или CD25-экспрессирующих иммунных клеток в популяции меньше процентной доли CD14- и/или CD25-экспрессирующих иммунных клеток в биологическом образце. В некоторых вариантах осуществления биологический образец получают из индивидуума. В некоторых вариантах осуществления индивидуум является человеком. В некоторых вариантах осуществления индивидуум является заболеванием или нарушением. В некоторых вариантах осуществления заболевание или нарушение является злокачественным новообразованием. В некоторых вариантах осуществления неоантиген-специфические T-клетки включают CD4⁺ и/или CD8⁺ T-клетки. В некоторых вариантах осуществления неоантиген-специфические T-клетки включают CD4-обогащенные T-клетки и/или CD8-обогащенные T-клетки. Например, CD4⁺ T-клетка или CD8⁺ T-клетку можно выделять, обогащать или очищать из биологического образца индивидуума, содержащего PBMC. В некоторых вариантах осуществления неоантиген-специфические T-клетки являются наивными CD4⁺ и/или наивными CD8⁺ T-клетками. В некоторых вариантах осуществления наивная T-клетка отличается поверхностной экспрессией L-селектина (CD62L). В некоторых вариантах осуществления наивная T-клетка отличается отсутствием одного или более маркеров активации CD25, CD44 или CD69. В некоторых вариантах осуществления наивная T-клетка отличается отсутствием изоформы CD45RO клеток памяти. В некоторых вариантах осуществления наивная T-клетка отличается экспрессией функциональных рецепторов ИЛ-7, состоящих из α-субъединиц рецептора ИЛ-7 CD127 и общей γ-цепи CD132. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна пептидная последовательность неоантигена содержит мутацию, выбранную из (A) точечной мутации, и пептид неоантигена злокачественного новообразования связывается с белком HLA индивидуума с IC₅₀ менее 500 нМ и большей аффинностью, чем соответствующий пептид дикого типа, (B) мутации участка сплайсинга, (C) мутации со сдвигом рамки считывания, (D) мутации сквозного прочитывания терминатора, (E) мутации со слиянием генов и их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления каждая из по меньшей мере одной пептидной последовательности неоантигена связывается с белком, кодируемым аллелем HLA, экспрессируемым индивидуумом. В некоторых вариантах осуществления каждая из по меньшей мере одной пептидной последовательности неоантигена содержит мутацию, отсутствующую в незлокачественных клетках индивидуума. В некоторых вариантах осуществления каждая из по меньшей мере одной пептидной последовательности неоантигена кодируется экспрессируемым геном злокачественных клеток индивидуума.

[0200] В некоторых вариантах осуществления одна или более из по меньшей мере одной пептидной последовательности неоантигена имеет длину 8-50 природных аминокислот. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна пептидная последовательность неоантигена включает множество пептидных последовательностей неоантигена. В некоторых вариантах осуществления множество пептидных последовательности неоантигена включает 2-50, 3-50, 4-50, 5-50, 6-50, 7-50, 8-50, 9-50 или 10-50 пептидных последовательностей неоантигена.

[0201] В некоторых вариантах осуществления APC представляют собой один или более препаратов APC. В некоторых вариантах осуществления APC содержат APC, нагруженные одним или более неоантигенными пептидами, содержащими одну или более из по меньшей мере одной пептидной последовательности неоантигена. В некоторых вариантах осуществления APC являются аутологичными APC или аллогенными APC.

[0202] В некоторых вариантах осуществления APC содержат дендритные клетки (DC). В некоторых вариантах осуществления APC получают из CD14⁺ моноцитов. В некоторых вариантах осуществления CD14⁺ моноциты обогащают из биологического образца индивидуума, содержащего PBMC. Например, CD14⁺ моноциты можно выделять, обогащать или очищать из биологического образца индивидуума, содержащего PBMC.

[0203] В некоторых вариантах осуществления CD14⁺ моноциты стимулируют одним или более цитокинами или факторами роста. В некоторых вариантах осуществления один или более цитокинов или факторов роста включают ГМ-КСФ, ИЛ-4, FLT3L или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления CD14⁺ моноциты получают из второго биологического образца, содержащего PBMC. В некоторых вариантах осуществления второй биологический образец получают из того же индивидуума.

[0204] В некоторых вариантах осуществления биологический образец содержит мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC). В некоторых вариантах осуществления процентная доля по меньшей мере одной антигенспецифической T-клетки в композиции составляет по меньшей мере приблизительно 0,00001%, 0,00002%, 0,00005%, 0,0001%, 0,0005%, 0,001%, 0,005%, 0,01%, 0,05%, 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% всех T-клеток или всех иммунных клеток. В некоторых вариантах осуществления процентная доля по меньшей мере одной антигенспецифической CD8⁺ T-клетки в композиции составляет по меньшей мере приблизительно 0,00001%, 0,00002%, 0,00005%, 0,0001%, 0,0005%, 0,001%, 0,005%, 0,01%, 0,05%, 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% всех CD4⁺ T-клеток, всех CD8⁺ T-клеток, всех T-клеток или всех иммунных клеток. В некоторых вариантах осуществления процентная доля по меньшей мере одной антигенспецифической CD4⁺ T-клетки в композиции составляет по меньшей мере приблизительно 0,00001%, 0,00002%, 0,00005%, 0,0001%, 0,0005%, 0,001%, 0,005%, 0,01%, 0,05%, 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% всех CD4⁺ T-клеток, всех CD8⁺ T-клеток, всех T-клеток или всех иммунных клеток. В некоторых вариантах осуществления процентная доля по меньшей мере одной антигенспецифической T-клетки в биологическом образце составляет не более приблизительно 0,00001%, 0,00005%, 0,0001%, 0,0005%, 0,001%, 0,005%, 0,01%, 0,05%, 0,1% или 0,5% всех CD4⁺ T-клеток, всех CD8⁺ T-клеток, всех T-клеток или всех иммунных клеток. В некоторых вариантах осуществления процентная доля по меньшей мере одной антигенспецифической CD8⁺ T-клетки в биологическом образце составляет не более приблизительно 0,00001%, 0,00005%, 0,0001%, 0,0005%, 0,001%, 0,005%, 0,01%, 0,05%, 0,1% или 0,5% всех CD4⁺ T-клеток, всех CD8⁺ T-клеток, всех T-клеток или всех иммунных клеток. В некоторых вариантах осуществления процентная доля по меньшей мере одной антигенспецифической CD4⁺ T-клетки в биологическом образце составляет не более приблизительно 0,00001%, 0,00005%, 0,0001%, 0,0005%, 0,001%, 0,005%, 0,01%, 0,05%, 0,1% или 0,5% всех CD4⁺ T-клеток, всех CD8⁺ T-клеток, всех T-клеток или всех иммунных клеток. В некоторых вариантах осуществления процентная доля антигенспецифических T-клеток в биологическом образце составляет не более приблизительно 0,5%. В некоторых вариантах осуществления процентная доля неоантиген-специфических CD8⁺ T-клеток в биологическом образце составляет не более приблизительно 0,5%. В некоторых вариантах осуществления процентная доля антигенспецифических CD4⁺ T-клеток в биологическом образце составляет не более приблизительно 0,5%.

[0205] В некоторых вариантах осуществления процентная доля антигенспецифических T-клеток в фармацевтической композиции составляет по меньшей мере приблизительно 0,00001%, 0,00002%, 0,00005%, 0,0001%, 0,0005%, 0,001%, 0,005%, 0,01%, 0,05%, 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% всех CD4⁺ T-клеток, всех CD8⁺ T-клеток, всех T-клеток или всех иммунных клеток. В некоторых вариантах осуществления процентная доля антигенспецифических CD8⁺ T-клеток в фармацевтической композиции составляет по меньшей мере приблизительно 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% или 20% всех CD4⁺ T-клеток, всех CD8⁺ T-клеток, всех T-клеток или всех иммунных клеток. В некоторых вариантах осуществления процентная доля антигенспецифических наивных CD8⁺ T-клеток в фармацевтической композиции составляет по меньшей мере приблизительно 0,00001%, 0,00002%, 0,00005%, 0,0001%, 0,0005%, 0,001%, 0,005%, 0,01%, 0,05%, 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% всех CD4⁺ T-клеток, всех CD8⁺ T-клеток, всех T-клеток или всех иммунных клеток. В некоторых вариантах осуществления процентная доля антигенспецифических CD8⁺ T-клеток памяти в фармацевтической композиции составляет по меньшей мере, приблизительно 0,00001%, 0,00002%, 0,00005%, 0,0001%, 0,0005%, 0,001%, 0,005%, 0,01%, 0,05%, 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% всех CD4⁺ T-клеток, всех CD8⁺ T-клеток, всех T-клеток или всех иммунных клеток. В некоторых вариантах осуществления процентная доля антигенспецифических CD4⁺ T-клеток в фармацевтической композиции составляет по меньшей мере, приблизительно 0,00001%, 0,00002%, 0,00005%, 0,0001%, 0,0005%, 0,001%, 0,005%, 0,01%, 0,05%, 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% всех CD4⁺ T-клеток, всех CD8⁺ T-клеток, всех T-клеток или всех иммунных клеток.

Способы производства

[0206] Настоящее изобретение относится к способам производства антигенспецифических T-клеток. Настоящее изобретение относится к способам получения композиций T-клеток, таких как терапевтические композиции T-клеток. Например, способ может включать экспансию или индуцирование антигенспецифических T-клеток. Термин "получение" (например, индуцирование или экспансия) T-клеток также может относиться к производству T-клеток и в широком смысле включает способы выделения, стимуляции, культивирования, индуцирования и/или экспансии любого типа T-клеток (например, CD4⁺ T-клеток и CD8⁺ T-клеток). В первом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения по меньшей мере одной антигенспецифической T-клетки, содержащей T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, включающему инкубацию APC с популяцией иммунных клеток из биологического образца, истощенного в отношении клеток, экспрессирующих CD14 и/или CD25.

[0207] Во втором аспекте настоящее изобретение относится к способу получения по меньшей мере одной антигенспецифической T-клетки, содержащей T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, включающему инкубацию стимулированных лигандом FMS-подобной тирозинкиназы 3 (FLT3L) APC с популяцией иммунных клеток из биологического образца.

[0208] В третьем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одну антигенспецифическую T-клетку, содержащую T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, включающему: инкубацию лиганда FMS-подобной тирозинкиназы 3 (FLT3L) с популяцией иммунных клеток из биологического образца в течение первого периода времени, а затем инкубацию по меньшей мере одной T-клетки из биологического образца с APC.

[0209] В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения по меньшей мере одной антигенспецифической T-клетки, содержащей T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, включающему инкубацию популяции иммунных клеток из биологического образца с одним или более препаратами APC в течение одного или более отдельных периодов времени менее 28 дней от инкубации популяции иммунных клеток с первым препаратом APC из одного или более препаратов APC, где выращивают по меньшей мере одну антигенспецифическую T-клетку памяти или индуцируют по меньшей мере одну антигенспецифическую наивную T-клетку.

[0210] В пятом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения по меньшей мере одной антигенспецифической T-клетки, содержащей T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, включающему инкубацию популяции иммунных клеток из биологического образца с 3 или менее препаратами APC в течение 3 или менее отдельных периодов времени, где выращивают по меньшей мере одну антигенспецифическую T-клетку памяти или индуцируют по меньшей мере одну антигенспецифическую наивную T-клетку.

[0211] В некоторых вариантах осуществления способ получения антигенспецифических T-клеток включает T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, включает инкубацию популяции иммунных клеток из биологического образца с одним или более препаратами APC в течение одного или более отдельных периодов времени и, таким образом, стимуляцию T-клеток для получения антигенспецифических T-клеток, где процентная доля антигенспецифических T-клеток составляет по меньшей мере приблизительно 0,00001%, 0,00002%, 0,00005%, 0,0001%, 0,0005%, 0,001%, 0,005%, 0,01%, 0,05%, 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% всех CD4⁺ T-клеток, всех CD8⁺ T-клеток, всех T-клеток или всех иммунных клеток. В некоторых вариантах осуществления способ получения антигенспецифических T-клеток, содержащих T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, включает инкубацию популяции иммунных клеток из биологического образца с 3 или менее препаратами APC в течение 3 или менее отдельных периодов времени и, таким образом, стимуляцию T-клеток для получения антигенспецифических T-клеток. В некоторых вариантах осуществления способ получения антигенспецифических T-клеток, содержащих T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, включает инкубацию популяции иммунных клеток из биологического образца с 2 или менее препаратами APC в течение 2 или менее отдельных периодов времени и, таким образом, стимуляцию T-клеток для получения антигенспецифических T-клеток.

[0212] В некоторых вариантах осуществления способ включает: (a) получение биологического образца, содержащего по меньшей мере одну антигенпрезентирующую клетку (APC), из индивидуума; (b) обогащение клеток, экспрессирующих CD14, из биологического образца и, таким образом, получение образца, обогащенного CD14⁺ клетками; (c) инкубацию образца, обогащенного CD14⁺ клетками, по меньшей мере с одним цитокином или фактором роста в течение первого периода времени; (d) инкубацию по меньшей мере одного пептида с образцом, обогащенным CD14⁺ клетками (c), в течение второго периода времени и, таким образом, получение образца APC, нагруженных пептидом; (e) инкубацию образца APC, нагруженных пептидом, с одним или более цитокинами или факторами роста в течение третьего периода времени и, таким образом, получение образца зрелых APC; (f) инкубацию APC из образца зрелых APC с CD14- и/или CD25-истощенным образцом, содержащим PBMC, в течение четвертого периода времени; (g) инкубацию PBMC с APC из образца зрелых APC в течение пятого периода времени; (h) инкубацию PBMC с APC из образца зрелых APC в течение шестого периода времени; и (i) введение по меньшей мере одной T-клетки из PBMC нуждающемуся в этом индивидууму.

[0213] В некоторых вариантах осуществления способ включает: (a) получение биологического образца, содержащего по меньшей мере одну APC и по меньшей мере одну PBMC, из индивидуума; (b) истощение клеток, экспрессирующих CD14 и/или CD25, в биологическом образце и, таким образом, получение образца, истощенного в отношении CD14⁺ и/или CD25⁺ клеток; (c) инкубацию образца, истощенного в отношении CD14⁺ и/или CD25⁺ клеток, с FLT3L в течение первого периода времени; (d) инкубацию по меньшей мере одного пептида с образцом, истощенным в отношении CD14⁺ и/или CD25⁺ клеток (c), в течение второго периода времени и, таким образом, получение образца APC, нагруженных пептидом; (e) инкубацию образца APC, нагруженных пептидом, по меньшей мере с одной PBMC в течение третьего периода времени и, таким образом, получение первого образца стимулированных PBMC; (f) инкубацию PBMC из первого образца стимулированных PBMC с APC из образца зрелых APC в течение четвертого периода времени и, таким образом, получение второго образца стимулированных PBMC; (g) инкубацию PBMC из второго образца стимулированных PBMC с APC из образца зрелых APC в течение пятого периода времени и, таким образом, получение третьего образца стимулированных PBMC; (h) введение по меньшей мере одной T-клетки из третьего образца стимулированных PBMC нуждающемуся в этом индивидууму.

[0214] В некоторых вариантах осуществления способ получения по меньшей мере одной антигенспецифической T-клетки, содержащей T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, включает инкубацию APC с популяцией иммунных клеток из биологического образца, истощенного в отношении клеток, экспрессирующих CD14 и/или CD25.

[0215] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу получения по меньшей мере одной антигенспецифической T-клетки, содержащей T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, включающему инкубацию популяции иммунных клеток из биологического образца с одним или более препаратами APC в течение одного или более отдельных периодов времени менее 28 дней от инкубации популяции иммунных клеток с первым препаратом APC из одного или более препаратов APC, где выращивают по меньшей мере одну антигенспецифическую T-клетку памяти или индуцируют по меньшей мере одну антигенспецифическую наивную T-клетку. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу получения по меньшей мере одной антигенспецифической T-клетки, содержащей T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, включающему инкубацию популяции иммунных клеток из биологического образца с 3 или менее препаратами APC в течение 3 или менее отдельных периодов времени, где выращивают по меньшей мере одну антигенспецифическую T-клетку памяти или индуцируют по меньшей мере одну антигенспецифическую наивную T-клетку.

[0216] В некоторых вариантах осуществления способ получения антигенспецифических T-клеток, содержащих T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, включает приведение популяции иммунных клеток (например, PBMC) в контакт с APC. В некоторых вариантах осуществления способ получения антигенспецифических T-клеток, содержащих T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, включает инкубацию популяции иммунных клеток (например, PBMC) с APC в течение периода времени. В некоторых вариантах осуществления популяцию иммунных клеток получают из биологического образца. В некоторых вариантах осуществления популяцию иммунных клеток получают из образца (например, биологического образца), истощенного в отношении CD14-экспрессирующих клеток. В некоторых вариантах осуществления популяцию иммунных клеток получают из образца (например, биологического образца), истощенного в отношении CD25-экспрессирующих клеток. В некоторых вариантах осуществления популяцию иммунных клеток получают из образца (например, биологического образца), истощенного в отношении CD14-экспрессирующих клеток и CD25-экспрессирующих клеток.

[0217] В некоторых вариантах осуществления способ получения по меньшей мере одной антигенспецифической T-клетки, содержащей T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, включает инкубацию стимулированных лигандом FMS-подобной тирозинкиназы 3 (FLT3L) APC с популяцией иммунных клеток из биологического образца. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу получения фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одну антигенспецифическую T-клетку, содержащую T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, включающему: инкубацию лиганда FMS-подобной тирозинкиназы 3 (FLT3L) с популяцией иммунных клеток из биологического образца в течение первого периода времени, а затем инкубацию по меньшей мере одной T-клетки из биологического образца с APC.

[0218] В некоторых вариантах осуществления способ получения, по меньшей мере одной антигенспецифической T-клетки, содержащей T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, включает приведение популяции иммунных клеток из образца (например, биологического образца) в контакт с лигандом FMS-подобной тирозинкиназы 3 (FLT3L). В некоторых вариантах осуществления способ получения по меньшей мере одной антигенспецифической T-клетки, содержащей T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, включает приведение популяции иммунных клеток из образца (например, биологического образца) в контакт с APC, стимулированными лигандом FMS-подобной тирозинкиназы 3 (FLT3L). В некоторых вариантах осуществления способ получения по меньшей мере одной антигенспецифической T-клетки, содержащей T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, включает инкубацию популяции иммунных клеток из образца (например, биологического образца) с APC, стимулированными лигандом FMS-подобной тирозинкиназы 3 (FLT3L). В некоторых вариантах осуществления способ получения фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одну антигенспецифическую T-клетку, содержащую T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, включает инкубацию лиганда FMS-подобной тирозинкиназы 3 (FLT3L) с популяцией иммунных клеток из биологического образца (например, в течение периода времени); а затем приведение T-клеток из биологического образца в контакт с APC. В некоторых вариантах осуществления способ получения по меньшей мере одной антигенспецифической T-клетки, содержащей T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, включает приведение популяции иммунных клеток из образца (например, биологического образца) в контакт с одним или более препаратами APC. В некоторых вариантах осуществления способ получения по меньшей мере одной антигенспецифической T-клетки, содержащей T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, включает инкубацию популяции иммунных клеток из образца (например, биологического образца) с одним или более препаратами APC в течение одного или более отдельных периодов времени. В некоторых вариантах осуществления способ получения по меньшей мере одной антигенспецифической T-клетки, содержащей T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, включает инкубацию популяции иммунных клеток из образца (например, биологического образца) с одним или более препаратами APC в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 отдельных периодов времени. В некоторых вариантах осуществления один или более отдельных периодов времени составляет менее 28 дней, отсчитываемых от инкубации популяции иммунных клеток с первым препаратом APC из одного или более препаратов APC.

[0219] В некоторых вариантах осуществления способ получения антигенспецифических T-клеток, содержащих T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, включает инкубацию популяции иммунных клеток с APC в течение периода времени, где популяцию иммунных клеток получают из биологического образца, содержащего PBMC. В некоторых вариантах осуществления способ получения антигенспецифических T-клеток, содержащих T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, включает инкубацию популяции иммунных клеток с APC в течение периода времени, где популяцию иммунных клеток получают из биологического образца, истощенного в отношении CD14- и/или CD25-экспрессирующих клеток.

[0220] В некоторых вариантах осуществления способ получения антигенспецифических T-клеток, содержащих T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, включает инкубацию популяции иммунных клеток из биологического образца с APC, стимулированными лигандом FMS-подобной тирозинкиназы 3 (FLT3L), в течение периода времени.

[0221] В некоторых вариантах осуществления способ получения фармацевтической композиции, содержащей антигенспецифические T-клетки, содержащие T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, включает инкубацию лиганда FMS-подобной тирозинкиназы 3 (FLT3L) с популяцией иммунных клеток из биологического образца, а затем приведение T-клеток из биологического образца в контакт с APC.

[0222] В некоторых вариантах осуществления способ получения антигенспецифических T-клеток, содержащих T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, включает инкубацию популяции иммунных клеток из биологического образца с одним или более препаратами APC в течение одного или более отдельных периодов времени и, таким образом, индуцирование или экспансию антигенспецифических T-клеток, где один или более отдельных периодов времени составляет менее 28 дней, отсчитываемых от инкубации популяции иммунных клеток с первым препаратом APC из одного или более препаратов APC. В некоторых вариантах осуществления инкубацию популяции иммунных клеток из биологического образца с одним или более препаратами APC в течение одного или более отдельных периодов времени осуществляют в среде, содержащей ИЛ-7, ИЛ-15 или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления среда дополнительно содержит ингибитор индоламин-2,3-диоксигеназы-1 (IDO), антитело против PD-1, ИЛ-12 или их комбинацию. Ингибитор IDO может являться эпакадостатом, навоксимодом, 1-метилтриптофаном или их комбинацией. В некоторых вариантах осуществления ингибитор IDO может повышать количество антигенспецифических CD8⁺ клеток. В некоторых вариантах осуществления ингибитор IDO может поддерживать функциональный профиль ответов CD8⁺ T-клеток памяти. Антитело против PD-1 может повышать абсолютное количество ответов антигенспецифических CD8⁺ T-клеток памяти. Антитело против PD-1 может повышать скорость пролиферации клеток, обработанных таким антителом. Добавление ИЛ-12 может приводить к повышению антигенспецифических клеток и/или повышению доли CD8⁺ T-клеток.

[0223] В некоторых вариантах осуществления способ получения антигенспецифических T-клеток, содержащих T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, включает инкубацию популяции иммунных клеток из биологического образца с одним или более препаратами APC в течение одного или более отдельных периодов времени и, таким образом, экспансию или индуцирование антигенспецифических T-клеток, где процентная доля антигенспецифических T-клеток, антигенспецифических CD4⁺ T-клеток или антигенспецифических CD8⁺ T-клеток составляет по меньшей мере приблизительно 0,00001%, 0,00002%, 0,00005%, 0,0001%, 0,0005%, 0,001%, 0,005%, 0,01%, 0,05%, 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% всех T-клеток, всех CD4⁺ T-клеток, всех CD8⁺ T-клеток, всех иммунных клеток или всех клеток.

[0224] В некоторых вариантах осуществления способ получения антигенспецифических T-клеток, содержащих T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, включает инкубацию популяции иммунных клеток из биологического образца с 3 или менее препаратами APC в течение 3 или менее отдельных периодов времени и, таким образом, стимуляцию T-клеток для получения антигенспецифических T-клеток.

[0225] В некоторых вариантах осуществления популяцию иммунных клеток получают из биологического образца, истощенного в отношении CD14- и/или CD25-экспрессирующих клеток. В некоторых вариантах осуществления APC являются стимулированными лигандом FMS-подобной тирозинкиназы 3 (FLT3L) APC. В некоторых вариантах осуществления APC включают один или более препаратов APC. В некоторых вариантах осуществления препараты APC включают 3 или менее препаратов APC. В некоторых вариантах осуществления препараты APC инкубируют с иммунными клетками последовательно в течение одного или более отдельных периодов времени.

[0226] В некоторых вариантах осуществления биологический образец получают из индивидуума. В некоторых вариантах осуществления индивидуум является человеком. Например, индивидуум может являться пациентом или донором. В некоторых вариантах осуществления индивидуум имеет заболевание или нарушение. В некоторых вариантах осуществления заболевание или нарушение является злокачественным новообразованием. В некоторых вариантах осуществления антигенспецифические T-клетки включают CD4⁺ и/или CD8⁺ T-клетки. В некоторых вариантах осуществления антигенспецифические T-клетки включают CD4-обогащенные T-клетки и/или CD8-обогащенные T-клетки. Например, CD4⁺ T-клетку и/или CD8⁺ T-клетку можно выделять, обогащать или очищать из биологического образца индивидуума, содержащего PBMC. В некоторых вариантах осуществления антигенспецифические T-клетки являются наивными CD4⁺ и/или наивными CD8⁺ T-клетками. В некоторых вариантах осуществления антигенспецифические T-клетки являются CD4⁺ и/или CD8⁺ T-клетками памяти.

[0227] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна пептидная последовательность антигена содержит мутацию, выбранную из (A) точечной мутации, и пептид антигена злокачественной опухоли связывается с белком HLA индивидуума с IC₅₀ менее 500 нМ и большей аффинностью, чем соответствующий пептид дикого типа, (B) мутации участка сплайсинга, (C) мутации со сдвигом рамки считывания, (D) мутации сквозного прочитывания терминатора, (E) мутации со слиянием генов и их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления каждая из по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена связывается с белком, кодируемым аллелем HLA, экспрессируемым индивидуумом. В некоторых вариантах осуществления каждая из по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена содержит мутацию, отсутствующую в незлокачественных клетках индивидуума. В некоторых вариантах осуществления каждая из по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена кодируется экспрессируемым геном злокачественных клеток индивидуума. В некоторых вариантах осуществления одна или более из по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена имеет длину 8-50 природных аминокислот. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна пептидная последовательность антигена содержит множество пептидных последовательностей антигена. В некоторых вариантах осуществления множество пептидных последовательностей антигена содержит 2-50, 3-50, 4-50, 5-5, 6-50, 7-50, 8-50, 9-50 или 10-50 пептидных последовательностей антигена.

[0228] В некоторых вариантах осуществления APC включают APC, нагруженные одним или более антигенными пептидами, содержащими одну или более из по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена. В некоторых вариантах осуществления APC являются аутологичными APC или аллогенными APC. В некоторых вариантах осуществления APC включают дендритные клетки (DC).

[0229] В некоторых вариантах осуществления способ включает истощение CD14- и/или CD25-экспрессирующих клеток из биологического образца. В некоторых вариантах осуществления истощение CD14⁺ клеток включает приведение CD14-связывающего средства в контакт с APC. В некоторых вариантах осуществления APC получают из CD14⁺ моноцитов. В некоторых вариантах осуществления APC обогащают из биологического образца. Например, APC можно выделять, обогащать или очищать из биологического образца индивидуума, содержащего PBMC.

[0230] В некоторых вариантах осуществления APC стимулируют одним или более цитокинами или факторами роста. В некоторых вариантах осуществления один или более цитокинов или факторов роста включают ГМ-КСФ, ИЛ-4, FLT3L или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления один или более цитокинов или факторов роста включают ИЛ-4, ГМ-КСФ, ФНОα, ИЛ-1β, PGE1, ИЛ-6, ИЛ-7 или их комбинацию.

[0231] В некоторых вариантах осуществления APC получают из второго биологического образца. В некоторых вариантах осуществления второй биологический образец получают из того же индивидуума.

[0232] В некоторых вариантах осуществления биологический образец содержит мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC). В некоторых вариантах осуществления процентная доля антигенспецифических T-клеток в способе составляет по меньшей мере приблизительно 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% или 20% всех T-клеток или всех иммунных клеток. В некоторых вариантах осуществления процентная доля антигенспецифических T-клеток в способе составляет от приблизительно 0,1% до приблизительно 5%, приблизительно от 5% до 10%, приблизительно от 10% до 15%, приблизительно от 15% до 20%, приблизительно от 20% до 25%, приблизительно от 25% до 30%, приблизительно от 30% до 35%, от приблизительно 35% до приблизительно 40%, от приблизительно 40% до приблизительно 45%, от приблизительно 45% до приблизительно 50%, от приблизительно 50% до приблизительно 55%, от приблизительно 55% до приблизительно 60%, приблизительно от 60% до 65% или от приблизительно 65% до приблизительно 70% всех T-клеток или всех иммунных клеток. В некоторых вариантах осуществления процентная доля антигенспецифических CD8⁺ T-клеток в способе составляет по меньшей мере приблизительно 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% или 20% всех T-клеток или всех иммунных клеток. В некоторых вариантах осуществления процентная доля антигенспецифических наивных CD8⁺ T-клеток в способе составляет по меньшей мере приблизительно 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% или 20% всех T-клеток или всех иммунных клеток. В некоторых вариантах осуществления процентная доля антигенспецифических CD8⁺ T-клеток памяти в способе составляет по меньшей мере приблизительно 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% или 20% всех T-клеток или всех иммунных клеток. В некоторых вариантах осуществления процентная доля антигенспецифических CD4⁺ T-клеток в способе составляет по меньшей мере приблизительно 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% или 20% всех T-клеток или всех иммунных клеток. В некоторых вариантах осуществления процентная доля антигенспецифических CD4⁺ T-клеток в способе составляет по меньшей мере приблизительно 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% или 20% всех T-клеток или всех иммунных клеток. В некоторых вариантах осуществления процентная доля антигенспецифических T-клеток в биологическом образце составляет не более приблизительно 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% или 20%. В некоторых вариантах осуществления процентная доля антигенспецифических CD8⁺ T-клеток в биологическом образце составляет не более приблизительно 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% или 20%. В некоторых вариантах осуществления процентная доля антигенспецифических наивных CD8⁺ T-клеток в биологическом образце составляет не более приблизительно 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% или 20%. В некоторых вариантах осуществления процентная доля антигенспецифических CD8⁺ T-клеток памяти в биологическом образце составляет не более приблизительно 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% или 20%. В некоторых вариантах осуществления процентная доля антигенспецифических CD4⁺ T-клеток в биологическом образце составляет не более приблизительно 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% или 20%.

[0233] В некоторых вариантах осуществления способ включает стимуляцию T-клеток с помощью ИЛ-7, ИЛ-15 или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления способ включает стимуляцию T-клеток с помощью ИЛ-7, ИЛ-15 или их комбинации в присутствии ингибитора IDO, антитела против PD-1 или ИЛ-12. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение антигенспецифических T-клеток индивидууму.

[0234] В некоторых вариантах осуществления первый период времени из одного или более периодов времени составляет приблизительно 1, 2 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 дней.

[0235] В некоторых вариантах осуществления общий период времени из отдельных периодов времени составляет менее 28 дней. В некоторых вариантах осуществления общий период времени из отдельных периодов времени составляет 20-27 дней. В некоторых вариантах осуществления общий период времени из отдельных периодов времени составляет 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 или 39 дней.

[0236] В некоторых вариантах осуществления способ включает инкубацию первого препарата APC из препаратов APC с T-клетками в течение более чем 7 дней. В некоторых вариантах осуществления способ включает инкубацию первого препарата APC из препаратов APC с T-клетками в течение более чем 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 дней. В некоторых вариантах осуществления способ включает инкубацию первого препарата APC из препаратов APC с T-клетками в течение 7-20, 8-20, 9-20, 10-20, 11-20 или 12-20 дней. В некоторых вариантах осуществления способ включает инкубацию первого препарата APC из препаратов APC с T-клетками в течение приблизительно 10-15 дней.

[0237] В некоторых вариантах осуществления способ включает инкубацию второго препарата APC из препаратов APC с T-клетками в течение 5-9 дней. В некоторых вариантах осуществления способ включает инкубацию второго препарата APC из препаратов APC с T-клетками в течение 5, 6, 7, 8 или 9 дней.

[0238] В некоторых вариантах осуществления способ включает инкубацию третьего препарата APC из препаратов APC с T-клетками в течение 5-9 дней. В некоторых вариантах осуществления способ включает инкубацию третьего препарата APC из препаратов APC с T-клетками в течение 5, 6, 7, 8,или 9 дней.

[0239] В некоторых вариантах осуществления способ включает инкубацию первого препарата APC из препаратов APC с T-клетками в течение приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 дней, инкубацию второго препарата APC из препаратов APC с T-клетками в течение приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 дней и инкубацию третьего препарата APC из препаратов APC с T-клетками в течение приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 дней.

[0240] В некоторых вариантах осуществления биологический образец свежеполучен из индивидуума или является замороженным образцом.

[0241] В некоторых вариантах осуществления способ включает инкубацию одного или более препаратов APC с первой средой, содержащей по меньшей мере один цитокин или фактор роста в течение первого периода времени. В некоторых вариантах осуществления первый период времени составляет по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, или 17, или 18 дней. В некоторых вариантах осуществления первый период времени составляет не более 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18 дней. В некоторых вариантах осуществления первый период времени составляет по меньшей мере 1, 2 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 дней. В некоторых вариантах осуществления первый период времени составляет не более 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дней. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один цитокин или фактор роста включает ГМ-КСФ, ИЛ-4, FLT3L, ФНОα, ИЛ-1β, PGE1, ИЛ-6, ИЛ-7, ИФНα, R848, LPS, ss-rna40, поли-I:C или любую их комбинацию.

[0242] В некоторых вариантах осуществления способ включает инкубацию одного или более препаратов APC по меньшей мере с одним пептидом в течение второго периода времени. В некоторых вариантах осуществления второй период времени составляет не более 1 часа.

[0243] В некоторых вариантах осуществления способ включает инкубацию одного или более препаратов APC со второй средой, содержащей один или более цитокинов или факторов роста в течение третьего периода времени и, таким образом, получение зрелых APC. В некоторых вариантах осуществления один или более цитокинов или факторов роста включает ГМ-КСФ (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор), ИЛ-4, FLT3L, ФНОα, ИЛ-1β, PGE1, ИЛ-6, ИЛ-7, ИФНα, R848 (резиквимод), LPS, ss-rna40, поли-I:C, CpG или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления третий период времени составляет не более 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18 дней. В некоторых вариантах осуществления третий период времени составляет по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 дней. В некоторых вариантах осуществления третий период времени составляет не более 2, 3, 4 или 5 дней. В некоторых вариантах осуществления третий период времени составляет по меньшей мере 1, 2, 3 или 4 дня.

[0244] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает удаление одного или более цитокинов или факторов роста из второй среды после третьего периода времени и перед началом четвертого периода времени.

[0245] В некоторых вариантах осуществления способ осуществляют ex vivo.

[0246] В некоторых вариантах осуществления способ получения T-клетки включает получение биологического образца индивидуума, содержащего APC. В некоторых вариантах осуществления способ включает обогащение CD14⁺ клеток из биологического образца и, таким образом, получение CD14⁺ обогащенного образца. В некоторых вариантах осуществления способ включает инкубацию CD14⁺ обогащенного образца с первой средой, содержащей по меньшей мере один цитокин или фактор роста, в течение первого периода времени. В некоторых вариантах осуществления способ включает инкубацию по меньшей мере одного пептида с CD14⁺ обогащенным образцом в течение второго периода времени и, таким образом, получение образца APC, нагруженных пептидом. В некоторых вариантах осуществления способ включает инкубацию образца APC, нагруженных пептидом, со второй средой, содержащей один или более цитокинов или факторов роста, в течение третьего периода времени и, таким образом, получение образца зрелых APC. В некоторых вариантах осуществления способ включает приведение APC из образца зрелых APC в контакт с мононуклеарными клетками периферической крови (PBMC) и третьей средой, содержащей по меньшей мере один цитокин или фактор роста, в течение четвертого периода времени. В некоторых вариантах осуществления способ включает инкубацию PBMC с APC из образца зрелых APC в течение пятого периода времени. В некоторых вариантах осуществления способ включает инкубацию PBMC с APC из образца зрелых APC в течение шестого периода времени. В некоторых вариантах осуществления способ включает введение T-клеток из PBMC нуждающемуся в этом индивидууму.

[0247] В некоторых других вариантах осуществления способ получения T-клеток включает получение биологического образца индивидуума, содержащего APC. В некоторых вариантах осуществления способ включает обогащение CD14⁺ клеток из биологического образца и, таким образом, получение CD14⁺ обогащенного образца. В некоторых вариантах осуществления способ включает инкубацию CD14⁺ обогащенного образца с первой средой, содержащей по меньшей мере один цитокин или фактор роста, в течение по меньшей мере, или не более, или приблизительно 30, 40 или 50 минут; или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23 часа; или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 дней.

[0248] В некоторых вариантах осуществления способ включает инкубацию по меньшей мере одного пептида с CD14⁺ обогащенным образцом в течение по меньшей мере, или не более, или приблизительно 30, 40 или 50 минут; или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23 часа; или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 дней и, таким образом, получение образца APC, нагруженных пептидом. В некоторых вариантах осуществления способ включает инкубацию образца APC, нагруженных пептидом, со средой, содержащей один или более цитокинов или факторов роста, в течение по меньшей мере, или не более, или приблизительно 30, 40 или 50 минут; или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23 часа; или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 дней и, таким образом, получение образца зрелых APC. В некоторых вариантах осуществления способ включает приведение APC из образца зрелых APC в контакт с PBMC и средой, содержащей по меньшей мере один цитокин или фактор роста в течение по меньшей мере, или не более, или приблизительно 30, 40 или 50 минут; или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23 часа; или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 дней. В некоторых вариантах осуществления способ включает инкубацию PBMC с APC из образца зрелых APC в течение по меньшей мере, или не более, или приблизительно 30, 40 или 50 минут; или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23 часа; или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 дней. В некоторых вариантах осуществления способ включает инкубацию PBMC с APC из образца зрелых APC в течение по меньшей мере, или не более, или приблизительно 30, 40 или 50 минут; или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23 часа; или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 дней. В некоторых вариантах осуществления способ включает введение T-клеток из PBMC нуждающемуся в этом индивидууму.

[0249] В некоторых вариантах осуществления способ включает: (a) получение биологического образца, содержащего по меньшей мере одну антигенпрезентирующую клетку (APC), из индивидуума; (b) обогащение клеток, экспрессирующих CD14, из биологического образца и, таким образом, получение обогащенного CD14⁺ клетками образца; (c) инкубацию обогащенного CD14⁺ клетками образца по меньшей мере с одним цитокином или фактором роста в течение первого периода времени; (d) инкубацию по меньшей мере одного пептида с обогащенным CD14⁺ клетками образцом (c) в течение второго периода времени и, таким образом, получение образца APC, нагруженных пептидом; (e) инкубацию образца APC, нагруженных пептидом, с одним или более цитокинами или факторами роста в течение третьего периода времени и, таким образом, получение образца зрелых APC; (f) инкубацию APC из образца зрелых APC с CD14- и/или CD25-истощенным образцом, содержащим PBMC, в течение четвертого периода времени; (g) инкубацию PBMC с APC из образца зрелых APC в течение пятого периода времени; (h) инкубацию PBMC с APC из образца зрелых APC в течение шестого периода времени; и (i) введение по меньшей мере одной T-клетки из PBMC нуждающемуся в этом индивидууму. В некоторых вариантах осуществления первый период времени составляет по меньшей мере, или не более, или приблизительно 30, 40 или 50 минут; или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23 часа; или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 дней. В некоторых вариантах осуществления второй период времени составляет по меньшей мере, или не более, или приблизительно 30, 40 или 50 минут; или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23 часа; или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 дней. В некоторых вариантах осуществления третий период времени составляет по меньшей мере, или не более, или приблизительно 30, 40 или 50 минут; или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23 часа; или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 дней. В некоторых вариантах осуществления четвертый период времени составляет по меньшей мере, или не более, или приблизительно 30, 40 или 50 минут; или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23 часа; или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 дней. В некоторых вариантах осуществления пятый период времени составляет по меньшей мере, или не более, или приблизительно 30, 40 или 50 минут; или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23 часа; или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 дней.

[0250] В некоторых вариантах осуществления способ включает: (a) получение биологического образца, содержащего по меньшей мере одну APC и по меньшей мере одну PBMC, из индивидуума; (b) истощение клеток, экспрессирующих CD14, и/или CD25, и/или CD19, в биологическом образце и, таким образом, получение образца, истощенного в отношении CD14⁺, и/или CD25⁺, и/или CD19⁺ клеток; (c) инкубацию образца, истощенного в отношении CD14⁺, и/или CD25⁺, и/или CD19⁺ клеток, с FLT3L в течение первого периода времени; (d) инкубацию по меньшей мере одного пептида с образцом, истощенным в отношении CD14⁺, и/или CD25⁺, и/или CD19⁺, клеток (c), в течение второго периода времени и, таким образом, получение образца APC, нагруженных пептидом; (e) инкубацию образца APC, нагруженных пептидом, по меньшей мере с одной PBMC в течение третьего периода времени и, таким образом, получение первого образца стимулированных PBMC; (f) инкубацию PBMC из первого образца стимулированных PBMC с APC из образца зрелых APC в течение четвертого периода времени и, таким образом, получение второго образца стимулированных PBMC; (g) необязательно, инкубацию PBMC из второго образца стимулированных PBMC с APC из образца зрелых APC в течение пятого периода времени и, таким образом, получение третьего образца стимулированных PBMC; (h) введение по меньшей мере одной T-клетки из первого, второго или третьего образца стимулированных PBMC нуждающемуся в этом индивидууму. В некоторых вариантах осуществления первый период времени составляет по меньшей мере, или не более, или приблизительно 30, 40 или 50 минут; или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23 часа; или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 дней. В некоторых вариантах осуществления второй период времени составляет по меньшей мере, или не более, или приблизительно 30, 40 или 50 минут; или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23 часа; или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 дней. В некоторых вариантах осуществления третий период времени составляет по меньшей мере, или не более, или приблизительно 30, 40 или 50 минут; или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23 часа; или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 дней. В некоторых вариантах осуществления четвертый период времени составляет по меньшей мере, или не более, или приблизительно 30, 40 или 50 минут; или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23 часа; или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 дней. В некоторых вариантах осуществления пятый период времени составляет по меньшей мере, или не более, или приблизительно 30, 40 или 50 минут; или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23 часа; или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 дней.

[0251] В некоторых других вариантах осуществления способ получения T-клеток включает (a) получение биологического образца, содержащего APC и T-клетки, из индивидуума; (b) инкубацию биологического образца с первой средой, содержащей по меньшей мере один цитокин или фактор роста, в течение первого периода времени; (c) инкубацию по меньшей мере одного пептида с биологическим образцом (c) в течение второго периода времени и, таким образом, получение образца APC, нагруженных пептидом; (d) инкубацию образца APC, нагруженных пептидом, со второй средой, содержащей один или более цитокинов или факторов роста в течение третьего периода времени и, таким образом, получение образца зрелых PBMC; (e) инкубацию образца зрелых PBMC с сывороткой человека после третьего периода времени в течение четвертого периода времени; (f) инкубацию биологический образец с одним или более цитокинами в течение пятого периода времени; и (g) введение T-клеток из биологического образца нуждающемуся в этом индивидууму. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один цитокин или фактор роста включает FLT3L. В некоторых вариантах осуществления первый период времени составляет по меньшей мере 5 часов, по меньшей мере 8 часов, по меньшей мере 10 часов, по меньшей мере 12 часов, по меньшей мере 15 часов, по меньшей мере 20 часов, по меньшей мере 22 часа, по меньшей мере 1 день, по меньшей мере 2 дня, по меньшей мере 3 дня, по меньшей мере 4 дня или по меньшей мере 5 дней. В некоторых вариантах осуществления второй период времени составляет по меньшей мере 30 минут, 40 минут, 50 минут, 1 час, 2 часа или 3 часа. В некоторых вариантах осуществления третий период времени составляет по меньшей мере 10 часов, по меньшей мере 12 часов, по меньшей мере 15 часов, по меньшей мере 20 часов, по меньшей мере 22 часа, по меньшей мере 1 день, по меньшей мере 2 дня, по меньшей мере 3 дня, по меньшей мере 4 дня или по меньшей мере 5 дней. В некоторых вариантах осуществления четвертый период времени составляет приблизительно 2, 3 или 4 дня. В некоторых вариантах осуществления пятый период времени составляет по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 дней. В некоторых вариантах осуществления первый период времени составляет по меньшей мере, или не более, или приблизительно 30, 40 или 50 минут; или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23 часа; или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 дней. В некоторых вариантах осуществления второй период времени составляет по меньшей мере, или не более, или приблизительно 30, 40 или 50 минут; или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23 часа; или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 дней. В некоторых вариантах осуществления третий период времени составляет по меньшей мере, или не более, или приблизительно 30, 40 или 50 минут; или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23 часа; или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 дней. В некоторых вариантах осуществления четвертый период времени составляет по меньшей мере, или не более, или приблизительно 30, 40 или 50 минут; или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23 часа; или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 дней. В некоторых вариантах осуществления пятый период времени составляет по меньшей мере, или не более, или приблизительно 30, 40 или 50 минут; или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23 часа; или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 дней.

[0252] Индуцированные или выращенные T-клетки могут содержать различные типы T-клеток. В некоторых вариантах осуществления антигенспецифические T-клетки включают по меньшей мере одну CD4⁺ T-клетку. В некоторых вариантах осуществления антигенспецифические T-клетки включают по меньшей мере одну CD8⁺ T-клетку. В некоторых вариантах осуществления антигенспецифические T-клетки включают по меньшей мере одну CD4-обогащенную T-клетку. В некоторых вариантах осуществления антигенспецифические T-клетки включают по меньшей мере одну CD8-обогащенную T-клетку. В некоторых вариантах осуществления антигенспецифические T-клетки включают по меньшей мере одну T-клетку памяти. В некоторых вариантах осуществления антигенспецифические T-клетки включают по меньшей мере одну наивную T-клетку. В некоторых вариантах осуществления антигенспецифические T-клетки включают по меньшей мере одну CD4⁺ T-клетку памяти. В некоторых вариантах осуществления антигенспецифические T-клетки включают по меньшей мере одну наивную CD4⁺ T-клетку. В некоторых вариантах осуществления антигенспецифические T-клетки включают по меньшей мере одну CD8⁺ T-клетку памяти. В некоторых вариантах осуществления антигенспецифические T-клетки включают по меньшей мере одну наивную CD8⁺ T-клетку.

[0253] Для индуцирования или экспансии T-клеток можно использовать различные антигенные пептиды. В некоторых вариантах осуществления пептид содержит мутацию, выбранную из (A) точечной мутации, (B) мутации участка сплайсинга, (C) мутации со сдвигом рамки считывания, (D) мутации сквозного прочитывания терминатора, (E) мутации со слиянием генов и их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления пептид содержит точечную мутацию и связывается с белком HLA индивидуума с большей аффинностью, чем соответствующий пептид дикого типа. В некоторых вариантах осуществления пептид связывается с белком HLA индивидуума с IC₅₀ менее 500 нМ, 250 нМ, 150 нМ, 100 нМ, 50 нМ, 25 нМ или 10 нМ. В некоторых вариантах осуществления пептид связывается с белком HLA индивидуума с IC₅₀ или K_D менее 500 нМ, 250 нМ, 150 нМ, 100 нМ, 50 нМ, 25 нМ или 10 нМ. В некоторых вариантах осуществления каждый пептид связывается с белком, кодируемым аллелем HLA, экспрессируемым индивидуумом. В некоторых вариантах осуществления TCR индуцированной или выращенной антигенспецифической T-клетки связывается с комплексом пептид-HLA с IC₅₀или K_D менее 500 нМ, 250 нМ, 150 нМ, 100 нМ, 50 нМ, 25 нМ или 10 нМ. В некоторых вариантах осуществления TCR связывается с комплексом пептид-HLA с IC₅₀ или K_D менее 500 нМ, 250 нМ, 150 нМ, 100 нМ, 50 нМ, 25 нМ или 10 нМ. В некоторых вариантах осуществления каждая из по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена содержит мутацию, отсутствующую в незлокачественных клетках индивидуума. В некоторых вариантах осуществления каждая из по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена кодируется геном или экспрессируемым геном злокачественных клеток индивидуума. В некоторых вариантах осуществления пептид имеет длину по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 4000, 5000, 7500 или 10000 или более природных аминокислот. В некоторых вариантах осуществления пептид связывается с белком, кодируемым аллелем HLA класса I, и имеет длину 8-12 природных аминокислот. В некоторых вариантах осуществления пептид связывается с белком, кодируемым аллелем HLA класса II, и имеет длину 16-25 природных аминокислот. В некоторых вариантах осуществления пептид включает множество пептидов. В некоторых вариантах осуществления множество пептидов включает по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 или 500 или более антигенных пептидов.

[0254] В различных вариантах осуществления APC используют для стимуляции/индуцирования T-клеток. В некоторых вариантах осуществления APC или APC из препарата APC нагружают одним или более антигенными пептидами. В некоторых вариантах осуществления APC или APC из препарата APC являются аутологичными APC или аллогенными APC. В некоторых вариантах осуществления APC или APC из препарата APC включает дендритную клетку (DC). В некоторых вариантах осуществления способ включает истощение клеток, экспрессирующих CD14 и/или CD25, в биологическом образце. В некоторых вариантах осуществления способ включает истощение клеток, экспрессирующих CD19, в биологическом образце. В некоторых вариантах осуществления истощение клеток, экспрессирующих CD14 и/или CD25, включает связывание CD14- и/или CD25-связывающего средства с APC или APC из препарата APC. В некоторых вариантах осуществления CD14- и/или CD25-связывающее средство является биотинилированным. В некоторых вариантах осуществления истощение клеток, экспрессирующих CD14 и/или CD25, включает связывание реагента против биотина на твердой подложке с CD14- и/или CD25-связывающим средством. В некоторых вариантах осуществления CD14- и/или CD25-связывающее средство прикрепляют к твердой подложке. В некоторых вариантах осуществления истощение клеток, экспрессирующих CD19, включает связывание CD19-связывающего средства с APC или APC из препарата APC. В некоторых вариантах осуществления CD19-связывающее средство является биотинилированным. В некоторых вариантах осуществления истощение клеток, экспрессирующих CD19, включает связывание реагента против биотина на твердой подложке с CD19-связывающим средством. В некоторых вариантах осуществления CD19-связывающее средство прикрепляют к твердой подложке. В некоторых вариантах осуществления APC или APC из препарата APC получают из CD14⁺ моноцита. В некоторых вариантах осуществления APC или APC из препарата APC является CD141-обогащенной APC или CD141-обогащенной дендритной клеткой.

[0255] В некоторых вариантах осуществления APC или APC из препарата APC обогащают из биологического образца. В некоторых вариантах осуществления APC или APC из препарата APC стимулируют одним или более цитокинами или факторами роста. В некоторых вариантах осуществления один или более цитокинов или факторов роста включают ГМ-КСФ, ИЛ-4, FLT3L, ФНОα, ИЛ-1β, PGE1, ИЛ-6, ИЛ-7, ИФНα, R848, LPS, ss-rna40, поли-I:C или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления APC или APC из препарата APC получают из второго биологического образца. В некоторых вариантах осуществления второй биологический образец получают из того же индивидуума. В некоторых вариантах осуществления биологический образец содержит мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC). В некоторых вариантах осуществления биологический образец свежеполучен из индивидуума или является замороженным образцом.

[0256] В некоторых вариантах осуществления процентная доля по меньшей мере одной антигенспецифической T-клетки составляет по меньшей мере приблизительно 0,00001%, 0,00002%, 0,00005%, 0,0001%, 0,0005%, 0,001%, 0,005%, 0,01%, 0,05%, 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% всех CD4⁺ T-клеток, всех CD8⁺ T-клеток, всех T-клеток или всех иммунных клеток. В некоторых вариантах осуществления процентная доля по меньшей мере одной антигенспецифической CD8⁺ T-клетки составляет по меньшей мере приблизительно 0,00001%, 0,00002%, 0,00005%, 0,0001%, 0,0005%, 0,001%, 0,005%, 0,01%, 0,05%, 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% всех CD4⁺ T-клеток, всех CD8⁺ T-клеток, всех T-клеток или всех иммунных клеток. В некоторых вариантах осуществления процентная доля по меньшей мере одной антигенспецифической CD4⁺ T-клетки составляет по меньшей мере приблизительно 0,00001%, 0,00002%, 0,00005%, 0,0001%, 0,0005%, 0,001%, 0,005%, 0,01%, 0,05%, 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% всех CD4⁺ T-клеток, всех CD8⁺ T-клеток, всех T-клеток или всех иммунных клеток.

[0257] В некоторых вариантах осуществления процентная доля по меньшей мере одной антигенспецифической T-клетки в биологическом образце составляет не более приблизительно 0,00001%, 0,00005%, 0,0001%, 0,0005%, 0,001%, 0,005%, 0,01%, 0,05%, 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% или 1% всех CD4⁺ T-клеток, всех CD8⁺ T-клеток, всех T-клеток или всех иммунных клеток. В некоторых вариантах осуществления процентная доля по меньшей мере одной антигенспецифической CD8⁺ T-клетки в биологическом образце составляет не более приблизительно 0,00001%, 0,00005%, 0,0001%, 0,0005%, 0,001%, 0,005%, 0,01%, 0,05%, 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% или 1% всех CD4⁺ T-клеток, всех CD8⁺ T-клеток, всех T-клеток или всех иммунных клеток. В некоторых вариантах осуществления процентная доля по меньшей мере одной антигенспецифической CD4⁺ T-клетки в биологическом образце составляет не более приблизительно 0,00001%, 0,00005%, 0,0001%, 0,0005%, 0,001%, 0,005%, 0,01%, 0,05%, 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% или 1% всех CD4⁺ T-клеток, всех CD8⁺ T-клеток, всех T-клеток или всех иммунных клеток.

[0258] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение индивидууму одной или более из по меньшей мере одной антигенспецифической T-клетки. В некоторых вариантах осуществления общий период времени из отдельных периодов времени составляет менее 28 дней. В некоторых вариантах осуществления инкубация включает инкубацию препарата APC из препаратов APC с T-клетками в течение более чем 7 дней. В некоторых вариантах осуществления инкубация включает инкубацию первого, второго, третьего или четвертого препарата APC из препаратов APC с T-клетками в течение более чем 7 дней. В некоторых вариантах осуществления способ включает инкубацию APC или одного или более из препаратов APC с первой средой, содержащей по меньшей мере один цитокин или фактор роста, в течение первого периода времени. В некоторых вариантах осуществления первый период времени составляет по меньшей мере, или не более, или приблизительно 30, 40 или 50 минут; или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23 часа; или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 дней. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один цитокин или фактор роста включает ГМ-КСФ, ИЛ-4, FLT3L, ФНОα, ИЛ-1β, PGE1, ИЛ-6, ИЛ-7, ИФНα, R848, LPS, ss-rna40, поли-I:C или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления способ включает инкубацию одного или более из препаратов APC по меньшей мере с одним пептидом в течение второго периода времени. В некоторых вариантах осуществления второй период времени составляет по меньшей мере, или не более, или приблизительно 30, 40 или 50 минут; или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23 часа; или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 дней. В некоторых вариантах осуществления способ включает инкубацию APC или одной или более APC со второй средой, содержащей один или более цитокинов или факторов роста, в течение третьего периода времени и, таким образом, получение зрелых APC. В некоторых вариантах осуществления третий период времени составляет по меньшей мере, или не более, или приблизительно 30, 40 или 50 минут; или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23 часа; или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 дней. В некоторых вариантах осуществления один или более цитокинов или факторов роста включает ГМ-КСФ, ИЛ-4, FLT3L, ФНОα, ИЛ-1β, PGE1, ИЛ-6, ИЛ-7, ИФНα, R848, LPS, ss-rna40, поли-I:C или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает удаление одного или более цитокинов или факторов роста из второй среды после третьего периода времени и до начала четвертого периода времени. В некоторых вариантах осуществления четвертый период времени составляет по меньшей мере, или не более, или приблизительно 30, 40 или 50 минут; или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23 часа; или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 дней. В некоторых вариантах осуществления антиген является неоантигеном, опухолеассоциированным антигеном, вирусным антиген, минорным антигеном гистосовместимости или их комбинацией. В некоторых вариантах осуществления способ осуществляют ex vivo. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка включает множество антигенспецифических T-клеток.

Антигенпрезентирующие клетки (APC) и способы их получения

[0259] В некоторых вариантах осуществления способ включает индуцирование, или стимуляцию, или экспансию T-клеток с помощью антигенпрезентирующих клеток (APC). APC можно предварительно нагружать антигенными пептидами перед приведением в контакт с T-клетками. В некоторых вариантах осуществления способ экспансии или индуцирования антигенспецифических T-клеток включает стимуляцию популяции иммунных клеток, содержащей T-клетки, с помощью APC. В некоторых вариантах осуществления популяцию иммунных клеток получают из биологического образца, истощенного в отношении CD14- и/или CD25-экспрессирующих клеток. В некоторых вариантах осуществления APC является FLT3L-стимулированной APC. В некоторых вариантах осуществления APC включает один или более препаратов APC. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из одного или более препаратов APC включает FLT3L-стимулированные APC. В некоторых вариантах осуществления один или более препаратов APC включает 3 или менее препаратов APC. В некоторых вариантах осуществления один или более препаратов APC инкубируют с иммунными клетками последовательно в течение одного или более отдельных периодов времени

[0260] Антигенпрезентирующие клетки (APC) презентируют пептидные фрагменты белковых антигенов вместе с молекулами MHC на своей поверхности. Презентируемый пептид связан с молекулой MHC в виде комплекса пептид-MHC (pMHC) на поверхности APC. Процессинг и презентирование комплексов пептид-MHC может включать серию последовательных стадий, включающих: опосредованное протеазами расщепление белков; транспорт пептидов в эндоплазматический ретикулум (ER), опосредованный транспортером, ассоциированным с процессингом антигенов (TAP); образование молекулы пептид-MHC класса I с использованием недавно синтезированных молекул MHC; и транспорт молекул пептид-MHC к поверхности клетки.

[0261] Некоторые APC могут активировать антигенспецифические T-клетки. Например, T-клетку, содержащую T-клеточный рецептор (TCR), взаимодействующий с pMHC, можно активировать, стимулировать, индуцировать или выращивать после образования TCR-pMHC. В некоторых вариантах осуществления MHC (например, MHC класса I или MHC класса II) антигенпрезентирующей клетки можно нагружать пептидом и вызывать его презентирование APC посредством встраивания в APC нуклеиновой кислоты (например, РНК), кодирующей антигенный пептид или полипептид, содержащий пептидную последовательность, подлежащую презентированию.

[0262] С биологической точки зрения, для того, чтобы соматическая мутация привела к иммунному ответу необходимо соответствие нескольким критериям: аллель, содержащий мутацию, должен экспрессироваться клеткой, мутация должна находиться в кодирующей белок области и быть несинонимичной, транслируемый белок должен расщепляться протеасомой или другим клеточным аппаратом деградации белка, и эпитоп, содержащий мутацию, должен презентироваться комплексом MHC, презентируемый эпитоп должен распознаваться TCR и, наконец, комплекс TCR-pMHC должен запускать сигнальный каскад, активирующий T-клетку.

[0263] Моноциты могут циркулировать в кровотоке, а затем мигрировать в ткани, где они могут дифференцироваться в макрофаги и дендритные клетки. Классические моноциты, как правило, отличаются высокими уровнями экспрессии рецептора поверхности клетки CD14. Моноциты и B-клетки могут являться компетентными APC, хотя их антигенпрезентирующая способность, по-видимому, ограничена реактивацией ранее сенсибилизированных T-клеток. Эти типы клеток могут быть неспособны напрямую активировать функционально наивные или непримированные популяции T-клеток. Профессиональные антигенпрезентирующие клетки очень эффективны в интернализации антигена посредством фагоцитоза или рецептор-опосредованного эндоцитоза, а затем экспонируют фрагмент антигена, связанный с молекулой MHC, на своей мембране. T-клетка распознает комплекс антиген-молекула MHC на мембране антигенпрезентирующей клетки и взаимодействует с ним. Затем антигенпрезентирующая клетка генерирует дополнительный костимуляторный сигнал, что приводит к активации T-клетки. Экспрессия костимуляторных молекул является типичным признаком профессиональных антигенпрезентирующих клеток.

[0264] Профессиональные антигенпрезентирующие клетки очень эффективны в интернализации антигена посредством фагоцитоза или рецептор-опосредованного эндоцитоза, а затем экспонируют фрагмент антигена, связанный с молекулой MHC, на своей мембране. T-клетка может распознавать и взаимодействовать с комплексом антиген-молекула MHC на мембране APC. Затем APC может генерировать дополнительный костимуляторный сигнал, что приводит к активации T-клетки. Экспрессия костимуляторных молекул может являться определяющим признаком профессиональных антигенпрезентирующих клеток. Неограничивающие примеры профессиональных APC могут включать дендритные клетки (DC), макрофаги и B-клетки. Профессиональные APC могут экспрессировать высокие уровни MHC класса II, ICAM-1 и B7-2.

[0265] Одним из основных типов профессиональных антигенпрезентирующих клеток являются дендритные клетки, имеющие наиболее широкий диапазон презентирования антигена. Другие основные типы профессиональных антигенпрезентирующих клеток включают макрофаги, B-клетки и некоторые активированные эпителиальные клетки. Дендритные клетки представляют собой популяции лейкоцитов, презентирующие антигены (например, антигены, захваченные в периферических тканях) T-клетках с помощью путей презентирования антигенов MHC класса II и I. Дендритные клетки могут активировать наивные и ранее примированные T-клетки (например, T-клетки памяти). Дендритные клетки (DC) могут представлять собой популяции лейкоцитов, презентирующие антигены, захваченные в периферических тканях, T-клеткам с помощью путей презентирования антигенов MHC класса I и II. Дендритные клетки могут являться мощными индукторами иммунных ответов, и активация этих клеток может являться критической стадией индуцирования противоопухолевого иммунитета. Дендритные клетки являются мощными индукторами иммунных ответов, и активация этих клеток является критической стадией индуцирования противоопухолевого иммунитета.

[0266] Дендритные клетки можно классифицировать как "незрелые" и "зрелые" клетки, что является простым способом различения двух хорошо описанных фенотипов. Однако эту номенклатуру не следует истолковывать как исключающую все возможные промежуточные стадии дифференцировки. Незрелые дендритные клетки можно характеризовать как антигенпрезентирующие клетки с высокой способностью к захвату и процессингу антигена, коррелирующей с высокой экспрессии рецептора Fcγ и рецептора маннозы. Зрелый фенотип, как правило, может отличаться более низкой экспрессией этих маркеров, но высокой экспрессией молекул поверхности клетки, отвечающих за активацию T-клеток, таких как MHC класса I и класса II, молекулы адгезии (например, CD54 и CD11) и костимуляторные молекулы (например, CD40, CD80, CD86 и 4-1BB). Зрелые дендритные клетки могут являться CD11b⁺, CD11c⁺, HLA-DR⁺, CD80⁺, CD86⁺, CD54⁺, CD3⁻, CD19⁻, CD14⁻, CD141⁺ (BDCA-3) и/или CD1a⁺. Созревание дендритных клеток можно обозначать как статус активации дендритных клеток, при котором такие антигенпрезентирующие дендритные клетки приводят к примированию T-клеток, хотя презентирование незрелыми дендритными клетками приводит к толерантности. Созревание дендритных клеток может быть вызвано биомолекулами с признаками микроорганизмов, определяемыми врожденными рецепторами (например, бактериальной ДНК, вирусной РНК, эндотоксинами и т.д.), провоспалительными цитокинами (например, ФНО, интерлейкинами и интерферонами), лигированием CD40 на поверхности дендритных клеток под действием CD40L и веществами, высвобождаемыми клетками, подвергаемыми гибели клеток. Дополнительные неограничивающие примеры цитокинов, которые могут индуцировать созревание дендритных клеток, включают ИЛ-4, ГМ-КСФ, ФНОα, ИЛ-1β, PGE1 и ИЛ-6. Например, дендритные клетки можно получать посредством культивирования клеток костного мозга in vitro с цитокинами, такими как гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) и фактор некроза опухоли альфа (ФНОα). Например, дендритные клетки можно получать из CD14⁺ моноцитов, выделенных из PBMC. Цитокины или факторы роста, которые можно использовать для превращения моноцитов в дендритные клетки, включают, в качестве неограничивающих примеров, ГМ-КСФ, ИЛ-4, FLT3L, ФНОα, ИЛ-1β, PGE1, ИЛ-6, ИЛ-7, ИФНα, R848, LPS, ss-rna40 и полиI:C.

[0267] Как правило, непрофессиональные антигенпрезентирующие клетки не экспрессируют конститутивно белки MHC класса II. Белки MHC класса II, как правило, экспрессируются только после стимуляции непрофессиональных антигенпрезентирующих клеток некоторыми цитокинами, такими как ИФНγ.

[0268] Источник антигенпрезентирующих клеток (APC), как правило, может являться тканевым источником, содержащим APC или предшественники APC, способные экспрессировать и презентировать антигенные пептиды in vitro. В некоторых вариантах осуществления APC могут пролиферировать и становиться профессиональными APC при нагрузке целевой РНК и/или обработке необходимыми цитокинами или факторами.

[0269] В одном из аспектов клетки-предшественники APC могут пролиферировать и созревать in vitro в дендритные клетки (DC). Хотя можно использовать множество тканевых источников, типичные тканевые источники могут включать селезенку, тимус, биоптат ткани, опухоль, афферентную лимфу, лимфоузлы, костный мозг, продукт афереза или лейкофереза и/или периферическую кровь. В некоторых вариантах осуществления источниками могут являться продукт афереза, костный мозг и периферическая кровь. В качестве источника крови для получения APC и/или предшественников APC также можно использовать ткань плода, эмбриональную или пуповинную кровь, которые также богаты факторами роста. Неограничивающие примеры клеток-предшественников включают эмбриональные стволовые клетки, CD34⁺ клетки, моноцитарных предшественников, моноциты и пре-B-клетки. Например, APC можно получать из клеток-предшественников, содержащих моноциты или CD34⁺ клетки.

[0270] В одном из аспектов источником APC и/или предшественников APC может являться продукт афереза или лейкофереза. Клетки можно собирать способами афереза, известными в этой области (например, Bishop et al., Blood, vol. 83, No. 2, pp. 610-616 (1994)). Продукт афереза, как правило, может содержать лимфоциты, включая T-клетки, моноциты, гранулоциты, B-клетки, другие ядерные лейкоциты, эритроциты и тромбоциты. В одном из вариантов осуществления клетки, собранные посредством афереза, можно промывать для удаления фракции плазмы и помещения клеток в подходящий буфер или среды для последующих стадий обработки. В другом варианте осуществления изобретения клетки можно промывать фосфатно-солевым буфером (PBS). В альтернативном варианте осуществления в промывочном растворе могут отсутствовать кальций, магний или многие, если не все, из двухвалентных катионов. Стадию промывки можно осуществлять способами, известными в этой области, например, с использованием полуавтоматизированной "проточной" центрифуги. После промывки клетки можно ресуспендировать в различных биосовместимых буферах, таких как, например, несодержащий Ca, несодержащий Мg PBS. Альтернативно, можно удалять нежелательные компоненты из аферезного образца и напрямую ресуспендировать клетки в средах для культивирования.

[0271] APC можно получать из различных источников, включая человека и не являющихся человеком приматов, других млекопитающих и позвоночных. В некоторых вариантах осуществления APC можно получать из крови человека или не являющегося человеком позвоночного. APC также можно выделять из обогащенной популяции лейкоцитов. Популяции лейкоцитов можно получать способами, известными специалистам в этой области. Такие способы, как правило, включают сбор гепаринизированной крови, аферез или лейкоферез, получение лейкоцитарной пленки, розеткообразование, центрифугирование, центрифугирование в градиенте плотности (например, с использованием фиколла, коллоидных частиц диоксида кремния и сахарозы), дифференциальный лизис нелейкоцитарных клеток и фильтрацию. Популяцию лейкоцитов также можно получать посредством забора крови у индивидуума, дефибринирования для удаления тромбоцитов и лизиса эритроцитов. Популяцию лейкоцитов, необязательно, можно обогащать моноцитарными предшественниками дендритных клеток.

[0272] Популяции клеток крови можно получать из разных индивидуумов в соответствии с желаемым использованием обогащенной популяции лейкоцитов. Индивидуум может являться здоровым индивидуумом. Альтернативно, клетки крови можно получать из индивидуума, нуждающегося в иммуностимуляции, такого как, например, пациент со злокачественным новообразованием или другой пациент, для которого иммуностимуляция будет благоприятной. Аналогично, клетки крови можно получать из индивидуума, нуждающегося в иммуносупрессии, такого как, например, пациент, имеющий аутоиммунное нарушение (например, ревматоидный артрит, диабет, системную красную волчанку, рассеянный склероз и т.п.). Популяцию лейкоцитов также можно получать из совпадающего по HLA здорового индивидуума.

[0273] Если в качестве источника APC используют кровь, лейкоциты крови можно получать общепринятыми способами, с помощью которых можно поддерживать их жизнеспособность. По одному из аспектов изобретения кровь можно разводить в среде, которая может содержать или не содержать гепарин или другой подходящий антикоагулянт. Соотношение объемов крови и среды может составлять приблизительно 1:1. Клетки можно концентрировать посредством центрифугирования крови в среде при приблизительно 1000 об./мин. (150×g) и 4°C. Тромбоциты и эритроциты можно истощать посредством ресуспендирования клеток в любом количестве растворов, известных в этой области, с помощью которых будут лизировать эритроциты, например, хлорида аммония. Например, смесь может являться средой и хлоридом аммония в соотношении приблизительно 1:1 по объему. Клетки можно концентрировать посредством центрифугирования и промывать в желаемом растворе до получения популяции лейкоцитов, по существу, несодержащей тромбоциты и эритроциты. В качестве среды для отделения лейкоцитов крови от тромбоцитов и эритроцитов можно использовать любой изотонический раствор, общеупотребительный в культивировании ткани. Примерами таких изотонических растворов могут являться фосфатно-солевой буфер, сбалансированный солевой раствор Хенкса и полные среды для выращивания. APC и/или клетки-предшественники APC также можно очищать посредством элютриации.

[0274] В одном из вариантов осуществления выделение APC и/или предшественников APC можно осуществлять посредством преинкубации фиколловой цельной крови или подвергнутой аферезу периферической крови с одним или более типами родственных или несоединенных с антителом парамагнитных частиц (приблизительно 1 флакон частиц или 4×10⁹ частиц на одну партию клеток (как правило, от приблизительно 5×10⁸ до приблизительно 2×10¹⁰ клеток) в течение приблизительно от 30 минут до 2 часов при 22-37°C с последующим магнитным удалением клеток, прикрепленных или захваченных парамагнитными частицами. Такое разделение можно осуществлять стандартными способами, доступными в этой области. Например, можно использовать любой способ магнитного разделения, включая различные коммерчески доступные способы (например, концентратор магнитных частиц DYNAL® (DYNAL MPC®)). Прохождение выделения можно подвергать мониторингу различными способами, известными специалистам в этой области, включая проточный цитометрический анализ клеток до и после указанного выделения.

[0275] APC можно культивировать для получения первичной культуры в подходящем контейнере или сосуде для культивирования в подходящей среде для культивирования. В некоторых вариантах осуществления среду для культивирования можно дополнять одним или более цитокинами. Подходящий контейнер или сосуд для культивирования может являться любым контейнером с поверхностью, совместимой с культурой ткани. Примеры включают различные мешки, флаконы, роллерные флаконы, чашки Петри и многолуночные планшеты для использования в культивировании тканей. Также можно использовать поверхности, обработанные веществом, например, коллагеном или поли-L-лизином, или антителами, специфическими для конкретного типа клеток, для стимуляции адгезии клеток, при условии, что они делают возможным дифференциальное прикрепление клеток, как описано ниже. Поверхности также можно химически обрабатывать, например, посредством ионизации. Клетки можно высевать при исходной плотности клеток приблизительно от 10⁵ до 10⁷ клеток/см². В одном из аспектов клетки можно высевать при плотности 10⁶ клеток/см².

[0276] В одном из вариантов осуществления первичные культуры из выбранного тканевого источника можно инкубировать при приблизительно 37°C в стандартных условиях культивирования тканей в отношении влажности, CO₂ и pH до адгезии популяции клеток к субстрату в достаточной степени, чтобы сделать возможным разделение неадгезивных клеток. Некоторые незрелые APC в крови исходно не прикрепляются к пластику, в частности, незрелые DC, в отличие от моноцитов, таким образом, предшественники можно разделять после культивирования в течение ночи. Моноциты и фибробласты могут включать основную часть адгезивных клеток и, как правило, прикрепляются к субстрату в течение от приблизительно 30 минут до приблизительно 24 часов. В некоторых аспектах неадгезивные клетки можно отделять от адгезивных клеток за приблизительно от 1 до 16 часов. Неадгезивные клетки можно разделять за приблизительно от 1 до 2 часов. Для отделения адгезивных от неадгезивных клеток можно использовать любой способ, с помощью которого не удаляют значительные количества адгезивных клеток. В некоторых аспектах клетки можно удалять посредством простого встряхивания или пипетирования. В некоторых аспектах пипетирование может являться наиболее предпочтительным.

[0277] Адгезивные клетки, содержащие предшественники APC (например, моноциты), выделенные способами по изобретению, можно инкубировать при приблизительно 37°C в стандартных условиях культивирования ткани в отношении влажности, CO₂ и pH до достижения популяции клеток стадии незрелых APC. В некоторых аспектах настоящего изобретения адгезивные клетки можно инкубировать в течение периода от 4 часов до 7 дней. Однако специалисту в этой области будет понятно, что можно варьировать время и условия инкубации. Незрелые APC могут являться CD14⁻ или CD14⁺ в зависимости от происхождения клеток-предшественников. Незрелые APC также могут экспрессировать CD1a, CD40, CD86, CD54 и промежуточные уровни MHC класса II (уровни экспрессии маркера на клетках в образце можно сравнивать посредством проточного цитометрического анализа с уровнями экспрессии на отрицательных по MHC класса II клетках и клетках, о которых известно, что они экспрессируют высокие уровни MHC класса II). Незрелые APC, как правило, не экспрессируют CCR7.

[0278] В некоторых аспектах настоящего изобретения не обязательно отделять T-клетки от APC. Например, в одном из вариантов осуществления PBMC, содержащие APC и T-клетки, можно подвергать воздействию антигена, как представлено в настоящем описании, и дополнительно выращивать получаемые антигенспецифические T-клетки, как представлено в настоящем описании.

[0279] В некоторых аспектах настоящего изобретения не обязательно получать APC или T-клетки, представленные в настоящем описании, из аутологичного источника. Таким образом, APC и T-клетки можно получать из совпадающего или несовпадающего донора или из линии клеток, линии T-клеток или других клеток, выращенных in vitro. В этой области известны способы сопоставления гаплотипов. Кроме того, APC и T-клетки или их супернатант можно получать из ксеногенного источника, например, можно использовать клетки мыши, крысы, не являющегося человеком примата и свиньи.

[0280] Подходящие препараты APC включают, например, дендритные клетки и моноциты. В других вариантах осуществления APC могут являться активированными непрезентирующими псевдоантиген APC, такими как, например, B-клетки, клетки или эпителиальные или эндотелиальные клетки. APC могут являться незрелыми или зрелыми. APC и T-клетки, как правило, сокультивируют в течение от приблизительно 6 до приблизительно 48 часов, хотя в объем настоящего изобретения входит больший и меньший период. Сокультивирование, как правило, можно осуществлять в течение периода времени, достаточного, чтобы сделать возможной активацию T-клеток, но меньшего, чем время, необходимое для дифференцировки и/или созревания значительного количества незрелых APC или предшественников APC.

[0281] В некоторых вариантах осуществления моноцитарные предшественники дендритных клеток можно выделять, например, посредством приведения обогащенных лейкоцитов или моноцитов в контакт с субстратом для адгезии моноцитарных предшественников дендритных клеток. В кратком изложении, если популяцию обогащенных лейкоцитов или моноцитов приводят в контакт с субстратом, моноцитарные предшественники дендритных клеток или моноциты в популяции клеток могут прикрепляться к субстрату. Другие лейкоциты могут демонстрировать сниженную аффинность связывания с субстратом, таким образом, делая возможным предпочтительное обогащение моноцитарных предшественников дендритных клеток на поверхности субстрата. Подходящие субстраты включают субстраты из твердых частиц, такие как, например, стеклянные частицы, пластиковые частицы, покрытые стеклом пластиковые частицы, покрытые стеклом полистироловые частицы, микрокапиллярные трубки и микроворсинчатая мембрана. Поверхность субстрата, необязательно, можно обрабатывать для повышения адгезии моноцитарных предшественников дендритных клеток к субстрату. Поверхность субстрата можно покрывать, например, белками, цитокинами, плазмой и/или связывающими моноциты белками. После приведения обогащенной лейкоцитами или моноцитами популяции клеток в контакт с субстратом для адгезии моноцитарных предшественников дендритных клеток, моноцитарные предшественники дендритных клеток прикрепляются к субстрату с образованием комплексов, содержащих моноцитарные предшественники дендритных клеток на субстрате. Связывание моноцитарных предшественников дендритных клеток можно подвергать мониторингу, например, посредством детекции с использованием антител против поверхностных клеточных маркеров, таких как, например, антитела против CD14, посредством анализа FACS прямого и бокового светорассеяния и т.п. В некоторых вариантах осуществления популяцию лейкоцитов можно приводить в контакт с субстратом в течение от приблизительно 5 до приблизительно 300 минут, более типично - от приблизительно 30 до приблизительно 120 минут. Комплексы моноцитарных предшественников дендритных клеток, необязательно, можно промывать подходящим промывочным буфером для удаления неспецифически связавшихся лейкоцитов. Подходящие промывочные буферы включают среды для культивирования тканей, фосфатно-солевой буфер, фосфатно-солевой буфер Дульбекко и т.п. Среды можно дополнять аминокислотами, витаминами и/или гормонами для стимуляции жизнеспособности и/или пролиферации моноцитарных предшественников дендритных клеток. Эффективность промывки можно подвергать мониторингу посредством анализа FACS прямого и бокового светорассеяния промывочного буфера, посредством окрашивания элюированных клеток на поверхностные клеточные маркеры и т.п. Как правило, комплексы можно промывать несколько раз для удаления неспецифически связавшихся лейкоцитов. Адгезивные моноцитарные предшественники дендритных клеток можно элюировать из субстрата. Например, предшественники можно элюировать из субстрата посредством обработки фосфатно-солевым буфером, содержащим 0,4% ЭДТА или другое нетоксичное хелатирующее средство. Моноцитарные предшественники дендритных клеток, как правило, можно элюировать из субстрата без использования трипсина или других протеаз.

[0282] В других вариантах осуществления дендритные клетки можно выделять другими способами, известными специалистам в этой области (например, O’Doherty et al., J. Exp. Med. 178:1067-76 (1993); Young and Steinman, J. Exp. Med. 171:1315-32 (1990); Freudenthal and Steinman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:7698-702 (1990); Macatonia, et al., Immunol.67:285-89 (1989); Markowicz and Engleman, J. Clin. Invest. 85:955-61 (1990); патенты США №№ 5994126 и 5851756). Способы иммуноселекции дендритных клеток включают, например, использование антител против поверхностных клеточных маркеров, ассоциированных с предшественниками дендритных клеток, таких как антитела против CD34 и/или против CD14, соединенные с субстратом (например, Bernhard et al., Cancer Res. 55:1099-104 (1995); Caux at al., Nature 360:258-61 (1992)), или ассоциированных с полностью дифференцированными дендритными клетками, таких как CD11c, CD54, CD83, CD80 и CD86.

[0283] В других вариантах осуществления APC могут являться непрезентирующими псевдоантиген APC в воспалительных или иначе активированных условиях. Например, непрезентирующими псевдоантиген APCs могут включать эпителиальные клетки, стимулированные интерфероном-гамма, T-клетки, B-клетки и/или моноциты, активированные факторами или условиями, индуцирующими активность APC. Такие непрезентирующими псевдоантиген APC можно получать известными в этой области способами.

[0284] APC можно культивировать, выращивать, подвергать дифференцировке и/или созреванию, при желании, в соответствии с типом APC. APC можно культивировать в любом подходящем сосуде для культивирования, таком как, например, планшеты для культивирования, флаконы, культуральные мешки и биореакторы.

[0285] В некоторых вариантах осуществления APC можно культивировать в подходящей среде для культивирования или выращивания для поддержания и/или экспансии APC в препарате. Среды для культивирования можно выбирать в соответствии с типом выделенных APC. Например, зрелые APC, такие как зрелые дендритные клетки, можно культивировать в средах для выращивания, подходящих для их поддержания и экспансии. Среду для культивирования можно дополнять аминокислотами, витаминами, антибиотиками, двухвалентными катионами и т.п. Кроме того, в среды для выращивания можно включать цитокины, факторы роста и/или гормоны. Например, для поддержания и/или экспансии зрелых дендритных клеток можно добавлять цитокины, такие как гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) и/или интерлейкин 4 (ИЛ-4). В других вариантах осуществления незрелые APC можно культивировать и/или выращивать. Незрелые дендритные клетки могут сохранять способность захватывать мРНК-мишень и процессировать новый антиген. В некоторых вариантах осуществления незрелые дендритные клетки можно культивировать в средах, подходящих для их поддержания и культивирования. Среду для культивирования можно дополнять аминокислотами, витаминами, антибиотиками, двухвалентными катионами и т.п. Кроме того, в среды для выращивания можно включать цитокины, факторы роста и/или гормоны.

[0286] Другие незрелые APC можно культивировать или выращивать аналогичным образом. Препараты незрелых APC можно подвергать созреванию с образованием зрелых APC. Созревание APC может происходить во время или после воздействия антигенных пептидов. В некоторых вариантах осуществления препараты незрелых дендритных клеток можно подвергать созреванию. Подходящие факторы созревания включают, например, цитокины ФНОα, бактериальные продукты (например, BCG) и т.п. В другом аспекте выделенные предшественники APC можно использовать для получения препаратов незрелых APC. Предшественники APC можно культивировать, подвергать дифференцировке и/или созреванию. В некоторых вариантах осуществления моноцитарные предшественники дендритных клеток можно культивировать в присутствии подходящих сред для культивирования, дополненных аминокислотами, витаминами, цитокинами и/или двухвалентными катионами, для стимуляции дифференцировки моноцитарных предшественников дендритных клеток в незрелые дендритные клетки. В некоторых вариантах осуществления предшественников APC выделяют из PBMC. PBMC можно получать от донора, например, человека-донора, и можно использовать свежеполученными или замораживать для последующего использования. В некоторых вариантах осуществления APC получают из одного или более препаратов APC. В некоторых вариантах осуществления APC включает APC, нагруженные одним или более антигенными пептидами, содержащими одну или более из по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена. В некоторых вариантах осуществления APC является аутологичной APC, аллогенной APC или искусственной APC.

[0287] В некоторых вариантах осуществления предшественники APC являются моноцитами. В некоторых вариантах осуществления моноциты являются CD14⁺ моноцитами. В некоторых вариантах осуществления моноциты выделяют с помощью антител против CD14.В некоторых вариантах осуществления выделенные моноциты высевают в количестве от 10⁵ до 10⁷ клеток/лунку в 2 мл среды. В некоторых вариантах осуществления выделенные моноциты высевают в количестве приблизительно 3×10⁶ клеток/лунку в 2 мл среды. В некоторых вариантах осуществления выделенные моноциты культивируют в средах, содержащих цитокин или фактор роста. В некоторых вариантах осуществления выделенные моноциты культивируют в средах, содержащих ГМ-КСФ, ИЛ-4, FLT3L, ФНОα, ИЛ-1β, PGE1, ИЛ-6, ИЛ-7, ИФНα, R848, LPS, ss-rna40, поли-I:C или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления выделенные моноциты культивируют в течение по меньшей мере 2 дней, по меньшей мере 3 дней, по меньшей мере 4 дней, по меньшей мере 5 дней или по меньшей мере 6 дней перед подверганием созревания. В некоторых вариантах осуществления моноциты подвергают дифференцировке до дендритных клетках ex vivo в средах для культивирования. В некоторых вариантах осуществления полученные дендритные клетки дополнительно подвергают созреванию ex vivo и нагружают антигенными пептидами. В некоторых вариантах осуществления полученные дендритные клетки культивируют в среде, содержащей один или более антигенных пептидов. В некоторых вариантах осуществления антигенные пептиды являются неоантигенными пептидами. Неограничивающие примеры неоантигенных пептидов включают короткий пептид ВИЧ, длинные пептиды ВИЧ, короткие пептиды ранее идентифицированных неоантигенов (PIN) и длинные пептиды PIN. В некоторых вариантах осуществления полученные дендритные клетки культивируют в среде, содержащей один или более неоантигенных пептидов, в течение по меньшей мере 30 минут, по меньшей мере 50 минут, по меньшей мере 1 часа или, по меньшей мере 2 часов. В некоторых вариантах осуществления полученные дендритные клетки дополнительно инкубируют с одним или более цитокинами после инкубации с антигенными пептидами. В некоторых вариантах осуществления один или более цитокинов включают ГМ-КСФ, ИЛ-4, FLT3L, ФНОα, ИЛ-1β, PGE1, ИЛ-6, ИЛ-7, ИФНα, R848, LPS, ss-rna40, поли-I:C или их комбинацию.

[0288] В некоторых вариантах осуществления целые PBMC используют для получения APC, которые затем можно использовать для стимуляции T-клеток. В некоторых вариантах осуществления PBMC культивируют в среде, содержащей лиганд FMS-подобной тирозинкиназы 3 (FLT3L). В некоторых вариантах осуществления PBMC истощают в отношении T-регуляторных клеток (T_reg-клеток), а затем культивируют в среде, содержащей FLT3L. В некоторых вариантах осуществления PBMC истощают в отношении CD14⁺ клеток, а затем культивируют в среде, содержащей FLT3L. В некоторых вариантах осуществления PBMC истощают в отношении CD25⁺ клеток, а затем культивируют в среде, содержащей FLT3L. В некоторых вариантах осуществления PBMC истощают в отношении CD25⁺ и CD14⁺ клеток, а затем культивируют в среде, содержащей FLT3L. В некоторых вариантах осуществления PBMC истощают в отношении CD25⁺ клеток, CD14⁺ клеток и CD19⁺ клеток, а затем культивируют в среде, содержащей FLT3L. В некоторых вариантах осуществления PBMC культивируют в среде, содержащей FLT3L, а затем истощают в отношении CD14⁺ клеток. В некоторых вариантах осуществления PBMC культивируют в среде, содержащей FLT3L, а затем истощают в отношении CD25⁺ клеток. В некоторых вариантах осуществления PBMC культивируют в среде, содержащей FLT3L, а затем истощают в отношении CD14⁺ клеток и CD25⁺ клеток. В некоторых вариантах осуществления выделенные CD14⁺ моноциты культивируют в среде, содержащей FLT3L. В некоторых вариантах осуществления после культивирования в среде, содержащей FLT3L, PBMC (целые, CD14⁺-истощенные, CD25⁺-истощенные, CD25⁺/CD14⁺-истощенные или CD25⁺/CD14⁺/CD19⁺-истощенные) или выделенные CD14⁺ моноциты культивируют в среде, содержащей один или более антигенов. В некоторых вариантах осуществления PBMC или выделенные CD14⁺ моноциты культивируют в среде, содержащей один или более созревание цитокинов. Неограничивающие примеры цитокинов для созревания включают ГМ-КСФ, ИЛ-4, FLT3L, ФНОα, ИЛ-1β, PGE1, ИЛ-6, ИЛ-7, ИФНα, R848, LPS, ss-rna40, поли-I:C или их комбинацию. Цитокин для созревания можно добавлять в культуру клеток или среду в различных концентрациях. В некоторых вариантах осуществления цитокин для созревания добавляют в культуру клеток или среду в конечной концентрации по меньшей мере 0,05 нг/мл, 0,1 нг/мл, 0,2 нг/мл, 0,3 нг/мл, 0,4 нг/мл, 0,5 нг/мл, 0,8 нг/мл, 1 нг/мл, 2 нг/мл, 3 нг/мл, 4 нг/мл, 5 нг/мл, 6 нг/мл, 7 нг/мл, 8 нг/мл, 9 нг/мл, 10 нг/мл, 12 нг/мл, 15 нг/мл, 18 нг/мл или 20 нг/мл. В некоторых вариантах осуществления цитокин для созревания добавляют в культуру клеток или среду в конечной концентрации по меньшей мере 0,05 мкг/мл, 0,1 мкг/мл, 0,2 мкг/мл, 0,3 мкг/мл, 0,4 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 0,8 мкг/мл, 1 мкг/мл, 2 мкг/мл, 3 мкг/мл, 4 мкг/мл, 5 мкг/мл, 6 мкг/мл, 7 мкг/мл, 8 мкг/мл, 9 мкг/мл или 10 мкг/мл. В некоторых вариантах осуществления цитокин для созревания добавляют в культуру клеток или среду в конечной концентрации по меньшей мере 10 ед./мл, 20ед./мл, 30 ед./мл, 40 ед./мл, 50 ед./мл, 80 ед./мл, 100 ед./мл, 200 ед./мл, 500 ед./мл, 800 ед./мл, 1000 ед./мл, 1500 ед./мл, 2000 ед./мл или 2500 ед./мл (в рамках изобретения единицы ферментов вычисляют по инструкциям производителя). В некоторых вариантах осуществления культуру PBMC (целых PBMC или PBMC, истощенных в отношении некоторых клеток), используемую для получения препарата APC, подвергают дополнительной инкубации или обработке цитокинами для индуцирования или стимуляции T-клеток. В этом случае получение APC (например, созревание и нагрузку пептидом) и индуцирование или стимуляцию T-клеток осуществляют с использованием одной и той же культуры клеток. В некоторых других случаях препарат APC является отдельной популяцией клеток из популяции PBMC, используемой для стимуляции T-клеток.

[0289] В некоторых вариантах осуществления способ включает инкубацию одной или более APC или одного или более препаратов APC с пептидом и, таким образом, получения образца нагруженных пептидом APC. Например, способ может включать инкубацию одной или более APC или одного или более препаратов APC с одним или более из пептидов в концентрации 0,001-100 мкМ и, таким образом, получения образца нагруженных пептидом APC. Например, способ может включать инкубацию одной или более APC или одного или более препаратов APC с одним или более из пептидов в концентрации по меньшей мере приблизительно 0,001 мкМ, 0,005 мкМ, 0,01 мкМ, 0,02 мкМ, 0,03 мкМ, 0,04 мкМ, 0,05 мкМ, 0,08 мкМ, 0,09 мкМ, 0,1 мкМ, 0,2 мкМ, 0,3 мкМ, 0,4 мкМ, 0,5 мкМ, 0,6 мкМ, 0,7 мкМ, 0,8 мкМ, 0,9 мкМ, 1 мкМ, 2 мкМ, 3 мкМ, 4 мкМ, 5 мкМ, 6 мкМ, 7 мкМ, 8 мкМ, 9 мкМ, 10 мкМ, 20 мкМ, 30 мкМ, 40 мкМ, 50 мкМ, 60 мкМ, 70 мкМ, 80 мкМ, 90 мкМ или 100 мкМ. Например, способ может включать инкубацию одной или более APC или одного или более препаратов APC с одним или более из пептидов в концентрации не более приблизительно 0,001 мкМ, 0,005 мкМ, 0,01 мкМ, 0,02 мкМ, 0,03 мкМ, 0,04 мкМ, 0,05 мкМ, 0,08 мкМ, 0,09 мкМ, 0,1 мкМ, 0,2 мкМ, 0,3 мкМ, 0,4 мкМ, 0,5 мкМ, 0,6 мкМ, 0,7 мкМ, 0,8 мкМ, 0,9 мкМ, 1 мкМ, 2 мкМ, 3 мкМ, 4 мкМ, 5 мкМ, 6 мкМ, 7 мкМ, 8 мкМ, 9 мкМ, 10 мкМ, 20 мкМ, 30 мкМ, 40 мкМ, 50 мкМ, 60 мкМ, 70 мкМ, 80 мкМ, 90 мкМ или 100 мкМ. Например, способ может включать инкубацию одной или более APC или одного или более препаратов APC с одним или более из пептидов в концентрации приблизительно 0,001 мкМ, 0,005 мкМ, 0,01 мкМ, 0,02 мкМ, 0,03 мкМ, 0,04 мкМ, 0,05 мкМ, 0,08 мкМ, 0,09 мкМ, 0,1 мкМ, 0,2 мкМ, 0,3 мкМ, 0,4 мкМ, 0,5 мкМ, 0,6 мкМ, 0,7 мкМ, 0,8 мкМ, 0,9 мкМ, 1 мкМ, 2 мкМ, 3 мкМ, 4 мкМ, 5 мкМ, 6 мкМ, 7 мкМ, 8 мкМ, 9 мкМ, 10 мкМ, 20 мкМ, 30 мкМ, 40 мкМ, 50 мкМ, 60 мкМ, 70 мкМ, 80 мкМ, 90 мкМ или 100 мкМ. Например, способ может включать инкубацию одной или более APC или одного или более препаратов APC с 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 или более пептидами в концентрации по меньшей мере приблизительно 0,001 мкМ, 0,005 мкМ, 0,01 мкМ, 0,02 мкМ, 0,03 мкМ, 0,04 мкМ, 0,05 мкМ, 0,08 мкМ, 0,09 мкМ, 0,1 мкМ, 0,2 мкМ, 0,3 мкМ, 0,4 мкМ, 0,5 мкМ, 0,6 мкМ, 0,7 мкМ, 0,8 мкМ, 0,9 мкМ, 1 мкМ, 2 мкМ, 3 мкМ, 4 мкМ, 5 мкМ, 6 мкМ, 7 мкМ, 8 мкМ, 9 мкМ, 10 мкМ, 20 мкМ, 30 мкМ, 40 мкМ, 50 мкМ, 60 мкМ, 70 мкМ, 80 мкМ, 90 мкМ или 100 мкМ. Например, способ может включать инкубацию одной или более APC или одного или более препаратов APC с 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 или более пептидами в концентрации не более приблизительно 0,001 мкМ, 0,005 мкМ, 0,01 мкМ, 0,02 мкМ, 0,03 мкМ, 0,04 мкМ, 0,05 мкМ, 0,08 мкМ, 0,09 мкМ, 0,1 мкМ, 0,2 мкМ, 0,3 мкМ, 0,4 мкМ, 0,5 мкМ, 0,6 мкМ, 0,7 мкМ, 0,8 мкМ, 0,9 мкМ, 1 мкМ, 2 мкМ, 3 мкМ, 4 мкМ, 5 мкМ, 6 мкМ, 7 мкМ, 8 мкМ, 9 мкМ, 10 мкМ, 20 мкМ, 30 мкМ, 40 мкМ, 50 мкМ, 60 мкМ, 70 мкМ, 80 мкМ, 90 мкМ или 100 мкМ. Например, способ может включать инкубацию одной или более APC или одного или более препаратов APC с 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 или более пептидами в концентрации приблизительно 0,001 мкМ, 0,005 мкМ, 0,01 мкМ, 0,02 мкМ, 0,03 мкМ, 0,04 мкМ, 0,05 мкМ, 0,08 мкМ, 0,09 мкМ, 0,1 мкМ, 0,2 мкМ, 0,3 мкМ, 0,4 мкМ, 0,5 мкМ, 0,6 мкМ, 0,7 мкМ, 0,8 мкМ, 0,9 мкМ, 1 мкМ, 2 мкМ, 3 мкМ, 4 мкМ, 5 мкМ, 6 мкМ, 7 мкМ, 8 мкМ, 9 мкМ, 10 мкМ, 20 мкМ, 30 мкМ, 40 мкМ, 50 мкМ, 60 мкМ, 70 мкМ, 80 мкМ, 90 мкМ или 100 мкМ.

T-клетки

[0290] T-клетки принадлежат к группе лейкоцитов, известной как лимфоциты, и играют центральную роль в клеточном иммунитете. T-клетки включают CD4⁺ T-клетки (хелперные T-клетки) и CD8⁺ T-клетки (цитотоксические T-клетки). CD4⁺ T-клетки могут помогать другим лейкоцитам в иммунологических процессах, включая созревание B-клеток и активацию цитотоксических T-клеток и макрофагов. CD4⁺ T-клетки активируются при презентировании пептидных антигенов молекулами MHC класса II, экспрессируемыми на поверхности антигенпрезентирующих клеток (APC). После активации T-клетки могут быстро делиться и секретировать цитокины, регулирующие активный иммунный ответ. CD8⁺ T-клетки могут разрушать инфицированные вирусами клетки и опухолевые клетки и также могут участвовать в отторжении трансплантата. CD8⁺ T-клетки могут распознавать свои мишени посредством связывания с антигеном, связанным с MHC класса I, присутствующими на поверхности практически каждой клетки организма. Большинство T-клеток имеют T-клеточный рецептор (TCR). Способность T-клеток распознавать антигены, ассоциированные с различными злокачественными образованиями или возбудителями инфекций, придается им их TCR, состоящим из альфа-цепи (α) и бета-цепи (β) или гамма-цепи (γ) и дельта-цепи (δ). Белки, составляющие эти цепи, кодируются ДНК, использующей уникальный механизм для достижения разнообразия TCR. Этот многосубъединичный иммунный рецептор распознавания может соединяться с комплексом CD3 и связываться с пептидами, презентируемыми белками MHC класса I и II на поверхности антигенпрезентирующих клеток (APC). Первый сигнал при активации T-клеток может обеспечиваться связыванием T-клеточного рецептора с коротким пептидом, презентируемым MHC на другой клетке. Это обеспечивает активацию только T-клетки с TCR, специфическим для этого пептида. Клетка-партнер, как правило, является антигенпрезентирующей клеткой, такой как профессиональная антигенпрезентирующая клетка, как правило, дендритная клетка в случае наивных ответов, хотя B-клетки и макрофаги могут являться важными APC. Связывание TCR с антигенным пептидом на APC может являться центральным событием при активации T-клеток, происходящим в иммунологическом синапсе в области контакта между T-клеткой и APC.

[0291] Каждый TCR содержит вариабельные определяющие комплементарность области (CDR), а также каркасные области (FR) и константную область. Аминокислотная последовательность петель третьей определяющей комплементарность области (CDR3) вариабельных доменов α- и β-цепей в значительной степени определяет разнообразие αβ-T-клеток, возникающее в результате рекомбинации между сегментами генов Vβ, Dβ и Jβ в локусе β-цепи и между аналогичными сегментами генов Vα и Jα в локусе α-цепи, соответственно. Существование множества таких сегментов генов в локусах α- и β-цепей TCR делает возможным кодирование большого количества отличающихся последовательностей CDR3. Независимое добавление и делеция нуклеотидов в областях соединения Vβ-Dβ, Dβ-Jβ и Vα-Jα во время процесса перестановки генов TCR дополнительно повышает разнообразие последовательностей CDR3. В связи с этим, иммунокомпетентность отражается в разнообразии TCR. TCR γδ отличается от TCR αβ тем, что он является рецептором, тесно взаимодействующим с врожденной иммунной системой. TCR γδ экспрессируется на ранних стадиях развития, имеет специализированное анатомическое распределение, уникальную специфичность в отношении патогенов и небольших молекул и широкий спектр врожденных и адаптивных клеточных взаимодействий. На ранних стадиях онтогенеза, когда рестриктированные субпопуляции TCRγδ-клеток заселяют различные ткани пренатально, устанавливается смещенный профиль экспрессии сегментов V и J TCRγ.

[0292] T-клетки можно получать известными в этой области способами. T-клетки могут представлять собой обогащенный препарат T-клеток, APC-истощенный препарат клеток или в значительной степени очищенный препарат T-клеток. T-клетки могут являться смешанной популяцией T-клеток или очищенной субпопуляцией T-клеток. T-клетки могут являться обогащенным препаратом T-клеток, содержащим количество или процентную долю T-клеток, повышенную относительно выделенной популяции T-клеток.

[0293] T-клетки или субпопуляцию T-клеток можно получать из различных лимфоидных тканей. T-клетки можно получать из ряда источников, включая мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), костный мозг, тимус, биоптат ткани, опухоль, ткань лимфоузла, лимфоидную ткань кишечника, лимфоидную ткань слизистых оболочек, ткань селезенки, лимфоидную ткань и опухоли. В рамках изобретения термин "лимфоциты периферической крови" (PBL) и его грамматические эквиваленты могут относиться к лимфоцитам, циркулирующим в крови (например, периферической крови). Термин "лимфоциты периферической крови" может относиться к лимфоцитам, не локализованным в органах. Лимфоциты периферической крови могут включать T-клетки, NK-клетки, B-клетки или любые их комбинации.

[0294] Способ может включать выделение T-клеток из индивидуума. Способ может включать получение T-клеток, выделенных из индивидуума. T-клетки можно получать из линий T-клеток. T-клетки можно получать из аутологичных источников. T-клетки можно получать из аллогенных источников. T-клетки также можно получать из ксеногенного источника, например, мыши, крысы, не являющегося человеком примата и свиньи.

[0295] T-клетки могут представлять собой APC-истощенный препарат клеток. T-клетки могут, по существу, не содержать APC. Например, T-клетки могут включать T-клетки, отделенные от более чем 75% APC. В некоторых вариантах осуществления мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) можно получать из крови, например, в гепаринизированных сосудах. PBMC можно отделять от эритроцитов посредством центрифугирования и выделять PBMC с поверхности раздела. Выделенные PBMC, необязательно, можно промывать (например, PBS).

[0296] Очистки T-клеток можно достигать, например, посредством положительной или отрицательной селекции, включая, в качестве неограничивающих примеров, использование антител против CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD14, CD16, CD19 и/или CD25. Конкретную субпопуляцию T-клеток, такую как CD28⁺, CD4⁺, CD8⁺, CD45RA⁺ и/или CD45RO⁺ T-клетки, можно выделять способами положительной или отрицательной селекции. Например, способами положительной или отрицательной селекции можно выделять CD45RO⁺, CD14^- и/или CD25^- T-клетки. Например, способами положительной или отрицательной селекции можно выделять CD45RA⁺, CD14^- и/или CD25^- T-клетки. Например, способами положительной или отрицательной селекции можно выделять CD3⁺, CD14^- и/или CD25^- T-клетки. Например, способами положительной или отрицательной селекции можно выделять CD28⁺, CD14^- и/или CD25^-T-клетки. Например, способами положительной или отрицательной селекции можно выделять CD4⁺, CD14^- и/или CD25^- T-клетки. Например, способами положительной или отрицательной селекции можно выделять CD8⁺, CD14^- и/или CD25^- T-клетки. Например, способами отрицательной селекции можно выделять CD14^- и /или CD25^- T-клетки. Например, способами отрицательной селекции можно выделять CD19^- T-клетки. Например, способами отрицательной селекции можно выделять CD16^- T-клетки. Например, CD3⁺ и CD28⁺ T-клетки можно подвергать положительной селекции с использованием магнитных бус, конъюгированных с CD3/CD28. В одном из аспектов настоящего изобретения обогащение популяции T-клеток посредством отрицательной селекции можно осуществлять с использованием комбинации антител против поверхностных маркеров, уникальных для клеток, подвергаемых отрицательной селекции. Например, обогащение популяции T-клеток можно осуществлять посредством отрицательной селекции с использованием антител против CD19, CD16, CD14, CD25 или любой их комбинации. Например, обогащение популяции T-клеток можно осуществлять посредством отрицательной селекции с использованием комбинации антител против CD19, CD16, CD25 и/или CD14.

[0297] Например, образец T-клеток может содержать клетки из циркулирующей крови индивидуума, и его можно получать посредством афереза или лейкофереза. Образец T-клеток может содержать лимфоциты, включая T-клетки, моноциты, гранулоциты, B-клетки, другие ядросодержащие лейкоциты, эритроциты и/или тромбоциты. Можно удалять нежелательные компоненты образца T-клеток и суспендировать остальные T-клетки в средах для культивирования. Например, клетки можно промывать для удаления фракции плазмы. Например, T-клетки можно выделять из лимфоцитов периферической крови посредством лизирования эритроцитов и центрифугирования в градиенте PERCOLL™.

[0298] В различных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям и способам, включающим T-клетки. В некоторых вариантах осуществления T-клетка содержит TCR, содержащий цепи TCR альфа и TCR бета. В некоторых вариантах осуществления T-клетка содержит TCR, содержащий цепи TCR гамма и TCR дельта. В некоторых вариантах осуществления T-клетка содержит T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена. В некоторых вариантах осуществления антигенспецифическая T-клетка включает по меньшей мере одну CD4⁺ T-клетку. В некоторых вариантах осуществления антигенспецифическая T-клетка включает по меньшей мере одну CD8⁺ T-клетку. В некоторых вариантах осуществления антигенспецифическая T-клетка включает по меньшей мере одну CD4-обогащенную T-клетку. В некоторых вариантах осуществления антигенспецифическая T-клетка включает по меньшей мере одну CD8-обогащенную T-клетку. В некоторых вариантах осуществления антигенспецифическая T-клетка включает T-клетку памяти. В некоторых вариантах осуществления антигенспецифическая T-клетка включает наивную T-клетку. В некоторых вариантах осуществления антигенспецифическая T-клетка включает CD4⁺ T-клетку памяти. В некоторых вариантах осуществления антигенспецифическая T-клетка включает наивную CD4⁺ T-клетку. В некоторых вариантах осуществления антигенспецифическая T-клетка включает CD8⁺ T-клетку памяти. В некоторых вариантах осуществления антигенспецифическая T-клетка включает наивную CD8⁺ T-клетку. В некоторых вариантах осуществления пептидная последовательность антигена содержит мутацию, выбранную из (A) точечной мутации, (B) мутации участка сплайсинга, (C) мутации со сдвигом рамки считывания, (D) мутации сквозного прочитывания терминатора, (E) мутации со слиянием генов и их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления пептидная последовательность антигена связывается с белком HLA индивидуума с большей аффинностью, чем соответствующий пептид дикого типа. В некоторых вариантах осуществления пептидная последовательность антигена связывается с белком HLA индивидуума с K_D или IC₅₀ менее 500 нМ, 250 нМ, 150 нМ, 100 нМ, 50 нМ, 25 нМ или 10 нМ. В некоторых вариантах осуществления каждая пептидная последовательность связывается с белком, кодируемым с аллелем HLA, экспрессируемым индивидуумом. В некоторых вариантах осуществления TCR T-клетки из композиции, представленной в настоящем описании, связывается с комплексом пептид-HLA с K_D или IC₅₀ менее 500 нМ, 250 нМ, 150 нМ, 100 нМ, 50 нМ, 25 нМ или 10 нМ.

[0299] В некоторых вариантах осуществления T-клетки культивируют в среде, содержащей цитокин. Примеры цитокинов включают ИЛ-7 и ИЛ-15. В некоторых вариантах осуществления цитокин в культуре T-клеток или среде имеет конечную концентрацию по меньшей мере 0,05 нг/мл, 0,1 нг/мл, 0,2 нг/мл, 0,3 нг/мл, 0,4 нг/мл, 0,5 нг/мл, 0,8 нг/мл, 1 нг/мл, 2 нг/мл, 3 нг/мл, 4 нг/мл, 5 нг/мл, 6 нг/мл, 7 нг/мл, 8 нг/мл, 9 нг/мл, 10 нг/мл, 12 нг/мл, 15 нг/мл, 18 нг/мл или 20 нг/мл. В некоторых вариантах осуществления ИЛ-7 в культуре T-клеток или среде имеет конечную концентрацию по меньшей мере 0,05 нг/мл, 0,1 нг/мл, 0,2 нг/мл, 0,3 нг/мл, 0,4 нг/мл, 0,5 нг/мл, 0,8 нг/мл, 1 нг/мл, 2 нг/мл, 3 нг/мл, 4 нг/мл, 5 нг/мл, 6 нг/мл, 7 нг/мл, 8 нг/мл, 9 нг/мл, 10 нг/мл, 12 нг/мл, 15 нг/мл, 18 нг/мл или 20 нг/мл. В некоторых вариантах осуществления ИЛ-15 в культуре T-клеток или среде имеет конечную концентрацию по меньшей мере 0,05 нг/мл, 0,1 нг/мл, 0,2 нг/мл, 0,3 нг/мл, 0,4 нг/мл, 0,5 нг/мл, 0,8 нг/мл, 1 нг/мл, 2 нг/мл, 3 нг/мл, 4 нг/мл, 5 нг/мл, 6 нг/мл, 7 нг/мл, 8 нг/мл, 9 нг/мл, 10 нг/мл, 12 нг/мл, 15 нг/мл, 18 нг/мл или 20 нг/мл. В некоторых вариантах осуществления T-клетки культивируют в среде, дополнительно содержащей FLT3L. В некоторых вариантах осуществления FLT3L в культуре T-клеток или среде имеет конечную концентрацию по меньшей мере 1 нг/мл, 2 нг/мл, 3 нг/мл, 4 нг/мл, 5 нг/мл, 6 нг/мл, 7 нг/мл, 8 нг/мл, 9 нг/мл, 10 нг/мл, 12 нг/мл, 15 нг/мл, 18 нг/мл, 20 нг/мл, 30 нг/мл, 40 нг/мл, 50 нг/мл, 60 нг/мл, 70 нг/мл, 80 нг/мл, 90 нг/мл, 100 нг/мл или 200 нг/мл. В некоторых вариантах осуществления T-клетки инкубируют, индуцируют или стимулируют в среде, содержащей FLT3L, в течение первого периода времени. В некоторых вариантах осуществления T-клетки инкубируют, индуцируют или стимулируют в среде, содержащей дополнительно добавленный FLT3L, в течение второго периода времени. В некоторых вариантах осуществления T-клетки инкубируют, индуцируют или стимулируют в среде, содержащей дополнительно добавленный FLT3L, в течение третьего периода времени. В некоторых вариантах осуществления T-клетки инкубируют, индуцируют или стимулируют в среде, содержащей дополнительно добавленный FLT3L, в течение четвертого, пятого или шестого периода времени при добавлении FLT3L в каждый период времени.

Антигены

[0300] Настоящее изобретение относится к способам производства T-клеток, специфических в отношении иммуногенных антигенов. Настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим антигенспецифические T-клетки, стимулированные с помощью APC. В некоторых вариантах осуществления один или более антигенных пептидов нагружают на APC, где нагруженные пептидом APC затем используют для стимуляции T-клеток для получения антигенспецифических T-клеток. В некоторых вариантах осуществления антигены являются неоантигенами. В некоторых вариантах осуществления APC, используемые для нагрузки пептидом, являются дендритными клетками.

[0301] В некоторых вариантах осуществления пептидная последовательность содержит мутацию, отсутствующую в незлокачественных клетках индивидуума. В некоторых вариантах осуществления пептид кодируется геном или экспрессируемым геном злокачественных клеток индивидуума. В некоторых вариантах осуществления пептидная последовательность имеет длину по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 4000, 5000, 7500 или 10000 или более природных аминокислот. В некоторых вариантах осуществления пептидная последовательность связывается с белком, кодируемым аллелем HLA класса I, и имеет длину 8-12 природных аминокислот. В некоторых вариантах осуществления пептидная последовательность связывается с белком, кодируемым аллелем HLA класса II, и имеет длину 16-25 природных аминокислот. В некоторых вариантах осуществления пептидная последовательность включает множество пептидных последовательностей антигена. В некоторых вариантах осуществления множество пептидных последовательностей антигена включает по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 или 500 пептидных последовательностей антигена.

[0302] В некоторых вариантах осуществления антигены, представленные в настоящем описании, являются неоантигенами. Предполагаемые иммуногенные последовательности неоантигена можно идентифицировать любым подходящим известным в этой области способом. Способы по настоящему изобретению можно использовать, например, для получения терапевтических средств, специфических в отношении заболевания индивидуума, или для получения вакцин против заболевания. Предполагаемые иммуногенные неоантигены могут являться ранее идентифицированными неоантигенами. В некоторых вариантах осуществления предполагаемые иммуногенные неоантигены могут не являться ранее идентифицированными. Предполагаемые иммуногенные неоантигены для использования в способах и композициях, представленных в настоящем описании, могут являться специфическими в отношении индивидуума. В некоторых вариантах осуществления предполагаемые неоантигены для использования в способах и композициях, представленных в настоящем описании, могут являться специфическими в отношении множества индивидуумов.

[0303] У животных и людей мутантные эпитопы потенциально могут являться эффективными в индуцировании иммунного ответа или активации T-клеток. В одном из вариантов осуществления можно определять у индивидуума потенциально иммуногенные эпитопы возбудителя инфекции, такого как вирус. В одном из вариантов осуществления можно определять потенциально иммуногенные мутантные эпитопы у индивидуума с заболеванием, таким как злокачественное новообразование. В некоторых вариантах осуществления потенциально иммуногенный антиген или неоантиген для использования в способах, представленных в настоящем описании, может являться антигеном дифференцировки, экспрессирующимся в опухоли и клетках типа ткани, из которой она образуется. В некоторых вариантах осуществления потенциально иммуногенный антиген или неоантиген для использования в способах, представленных в настоящем описании, может являться антигеном злокачественного новообразования/зародышевой линии, не экспрессирующимся в другой дифференцированной ткани. В некоторых вариантах осуществления потенциально иммуногенный антиген или неоантиген для использования в способах, представленных в настоящем описании, может являться мутантным антигеном. Например, предполагаемый иммуногенный антигенный или неоантигенный пептид для использования в способах, представленных в настоящем описании, может содержать точечную миссенс-мутацию или являться антигеном или неоантигеном слитого белка, образовавшегося при опухолеспецифической транслокации сегмента гена. В некоторых вариантах осуществления потенциально иммуногенный антиген или неоантиген для использования в способах, представленных в настоящем описании, может являться гиперэкспрессированным антигеном. В некоторых вариантах осуществления потенциально иммуногенный антиген или неоантиген можно обнаружить в опухолях. Например, потенциально иммуногенный антиген или неоантиген для использования в способах, представленных в настоящем описании, может включать белок, экспрессия которого строго регулируется в клетках дифференцированной нормальной ткани.

[0304] Потенциально иммуногенные мутантные эпитопы можно определять посредством геномного или экзомного секвенирования ткани опухоли и здоровой ткани из пациента со злокачественным новообразованием с использованием технологий секвенирования нового поколения. Например, гены, выбранные с учетом частот мутаций в них и способности действовать в качестве антигена или неоантигена, можно секвенировать с использованием технологий секвенирования нового поколения. В одном из вариантов осуществления данные секвенирования можно анализировать для идентификации потенциально иммуногенных мутантных пептидов, которые могут связываться с молекулами HLA индивидуума. В одном из вариантов осуществления данные можно анализировать с использованием компьютера. В другом варианте осуществления данные о последовательностях можно анализировать на наличие антигенных или неоантигенных пептидов. В одном из вариантов осуществления потенциально иммуногенные антигенные или неоантигенные пептиды можно определять по их аффинности к молекулам MHC.

[0305] Потенциально иммуногенные антигенные или неоантигенные пептиды можно определять посредством прямого секвенирования белков. Например, для идентификации потенциально иммуногенных антигенных или неоантигенных пептидов для использования в способах, представленных в настоящем описании, можно использовать секвенирование ферментативно расщепленных белков с использованием многомерных способов масс-спектрометрии (например, тандемной масс-спектрометрии (MS/MS)).

[0306] Для идентификации потенциально иммуногенных антигенных или неоантигенных пептидов можно использовать высокопроизводительные способы секвенирования de novo неизвестных белков. Например, высокопроизводительные способы секвенирования de novo неизвестных белков, такие как метасеквенирование белков способом дробовика, можно использовать для анализа протеома опухоли индивидуума для идентификации потенциально иммуногенных экспрессируемых неоантигенов.

[0307] Потенциально иммуногенные антигенные или неоантигенные пептиды также можно идентифицировать с использованием мультимеров MHC для идентификации ответов антигенспецифических T-клеток. Например, высокопроизводительный анализ ответов антигенспецифических T-клеток в образцах пациента можно осуществлять с использованием способов скрининга на основе тетрамеров MHC. Способы скрининга на основе тетрамеров можно использовать для начальной идентификации потенциально иммуногенных опухолеспецифических антигенов или, альтернативно, в качестве способа вторичного скрининга для оценки того, воздействию каких потенциально иммуногенных антигенов пациент мог уже подвергаться, чтобы, таким образом, облегчить выбор потенциально иммуногенных антигенов для использования в способах, представленных в настоящем описании.

[0308] В некоторых вариантах осуществления можно анализировать или охарактеризовывать иммунные клетки. Например, можно анализировать или охарактеризовывать иммунные клетки из композиции, представленной в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления способ может включать определение экспрессии одного или более клеточных маркеров по меньшей мере одной иммунной клетки из образца стимулированных иммунных клеток и определение связывания по меньшей мере одной иммунной клетки из образца стимулированных иммунных клеток с комплексом пептид-MHC; где определение экспрессии и определение связывания осуществляют одновременно. В некоторых вариантах осуществления образец стимулированных иммунных клеток представляет собой популяцию иммунных клеток, стимулированных с помощью APC, содержащих комплекс пептид-MHC. В некоторых вариантах осуществления популяцию иммунных клеток получают из биологического образца. В некоторых вариантах осуществления способ может включать инкубацию популяции иммунных клеток из биологического образца с APC, содержащими комплекс пептид-MHC, и, таким образом, получение образца стимулированных иммунных клеток; определение экспрессии одного или более клеточных маркеров по меньшей мере одной иммунной клетки из образца стимулированных иммунных клеток; и определение связывания по меньшей мере одной иммунной клетки из образца стимулированных иммунных клеток с комплексом пептид-MHC; где определение экспрессии и определение связывания осуществляют одновременно. В некоторых вариантах осуществления один или более клеточных маркеров включают ФНОα, ИФНγ, LAMP-1, 4-1BB, ИЛ-2, ИЛ-17A, гранзим B, PD-1, CD25, CD69, TIM3, LAG3, CTLA-4, CD62L, CD45RA, CD45RO, FoxP3 или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления один или более клеточных маркеров включают цитокин. В некоторых вариантах осуществления один или более клеточных маркеров включают маркер дегрануляции. В некоторых вариантах осуществления один или более клеточных маркеров включают поверхностный клеточный маркер. В некоторых вариантах осуществления один или более клеточных маркеров включают белок. В некоторых вариантах осуществления определение связывания по меньшей мере одной иммунной клетки из образца стимулированных иммунных клеток с комплексом пептид-MHC включает определение связывания по меньшей мере одной иммунной клетки из образца стимулированных иммунных клеток с тетрамером MHC, содержащих пептид и MHC из комплекса пептид-MHC. В некоторых вариантах осуществления MHC является MHC класса I или MHC класса II. В некоторых вариантах осуществления комплекс пептид-MHC содержит одну или более меток. В некоторых вариантах осуществления популяция иммунных клеток из биологического образца содержит два или более образца, каждый из которых содержит популяцию иммунных клеток из одного или более биологических образцов. В некоторых вариантах осуществления два или более образца метят двумя или более метками образцов. В некоторых вариантах осуществления определение экспрессии и определение связывания включает активируемую флуоресценцией сортировку клеток (FACS). В некоторых вариантах осуществления определение экспрессии и определение связывания включает анализ отдельных клеток. В некоторых вариантах осуществления определение экспрессии и определение связывания включает определение процентной доли иммунных клеток, экспрессирующих один или более клеточных маркеров и связывающихся с комплексом пептид-MHC. В некоторых вариантах осуществления метки содержат флуорофор. В некоторых вариантах осуществления популяция иммунных клеток содержит популяцию иммунных клеток, типичную для популяции иммунных клеток из композиции, представленной в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления можно анализировать или охарактеризовывать популяции иммунных клеток, экспрессирующих ФНОα, ИФНγ, LAMP-1, 4-1BB, ИЛ-2, ИЛ-17A, гранзим B, PD-1, CD25, CD69, TIM3, LAG3, CTLA-4, CD62L, CD45RA, CD45RO, FoxP3, CD3, CD28, CD4, CD8 или любую их комбинацию и/или неэкспрессирующих CD14, CD19,CD16, CD25 или любую их комбинацию. Например, способ может включать анализ или характеризацию специфической субпопуляции T-клеток, такой как субпопуляция T-клеток, экспрессирующих ФНОα, ИФНγ, LAMP-1, 4-1BB, ИЛ-2, ИЛ-17A, Гранзим B, PD-1, CD25, CD69, TIM3, LAG3, CTLA-4, CD62L, CD45RA, CD45RO, FoxP3, CD3, CD28, CD4, CD8 или любую комбинацию и/или неэкспрессирующих CD14, CD19,CD16, CD25 или любую их комбинацию. Например, способ может включать анализ или характеризацию популяции иммунных клеток, не экспрессирующих CD14, CD25, CD19, CD16 или любую их комбинацию.

[0309] В некоторых вариантах осуществления можно определять экспрессию одного или более клеточных маркеров в популяции иммунных клеток. Например, способ может включать определение экспрессии ФНОα, ИФНγ, LAMP-1, 4-1BB, ИЛ-2, ИЛ-17A, гранзима B, PD-1, CD25, CD69, TIM3, LAG3, CTLA-4, CD62L, CD45RA, CD45RO, FoxP3, CD14, CD25, CD19, CD16 или любой их комбинации. Например, способ может включать инкубацию популяции иммунных клеток из биологического образца с APC, содержащими комплекс пептид-MHC, и, таким образом, получение образца стимулированных иммунных клеток; определение экспрессии ФНОα, ИФНγ, LAMP-1, 4-1BB, ИЛ-2, ИЛ-17A, гранзима B, PD-1, CD25, CD69, TIM3, LAG3, CTLA-4, CD62L, CD45RA, CD45RO, FoxP3, CD14, CD25, CD19, CD16 или любой их комбинации из по меньшей мере одной иммунной клетки из образца стимулированных иммунных клеток; и определение связывания по меньшей мере одной иммунной клетки из образца стимулированных иммунных клеток с комплексом пептид-MHC; где определение экспрессии и определение связывания осуществляют одновременно.

[0310] Потенциально иммуногенные антигенные или неоантигенные пептиды для использования в способах, представленных в настоящем описании, могут являться известными последовательностями антигена или неоантигена. Например, потенциально иммуногенные антигенные или неоантигенные пептиды для использования в способах, представленных в настоящем описании, можно получать из базы данных последовательностей антигена или неоантигена.

[0311] В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к пептидам или полинуклеотидам, кодирующим пептиды, идентифицированные способами, представленными в настоящем описании (например, пептиду с опухолеспецифической мутации, вирусному пептиду или пептиду, ассоциированному с незлокачественным заболеванием).

[0312] В некоторых вариантах осуществления для селекции или идентификации иммуногенных антигенов используют оптический способ. В некоторых вариантах осуществления для селекции или идентификации иммуногенных антигенов используют штрихкод-зонд. В некоторых вариантах осуществления для селекции или идентификации иммуногенных антигенов используют штрихкод-зонд, содержащий мишене-специфическую область и область-штрихкод. В некоторых вариантах осуществления мишене-специфическая область содержит последовательность нуклеиновой кислоты, гибридизующуюся или имеющую по меньшей мере приблизительно 90%, 95% или 100% комплементарности последовательности по отношению к последовательности нуклеиновой кислоты полинуклеотида-мишени.

[0313] В некоторых вариантах осуществления для идентификации иммуногенных антигенов используют способ секвенирования. В рамках изобретения можно использовать любой подходящий способ секвенирования, например, технологии секвенирования нового поколения (NGS). В будущем технологию NGS можно будет заменить секвенированием третьего поколения для ускорения стадии секвенирования способа. Для уточнения, термины "секвенирование нового поколения" или "NGS" в контексте настоящего изобретению могут означать все высокопроизводительные технологии секвенирования, с помощью которых, в отличие от "общепринятого" способа секвенирования, известного как способ Сэнгера, считывают матрицы нуклеиновой кислоты случайным образом параллельно по всему геному посредством разбиения всего генома на небольшие фрагменты. С помощью таких технологий NGS (также известных как технологии массивного параллельного секвенирования) можно получать информацию о последовательности нуклеиновой кислоты всего генома, экзома, транскриптома (всех транскрибированных последовательностей генома) или метилома (всех метилированных последовательностей генома) за очень короткие периоды времени, например, в пределах 1-2 недель, например, в пределах 1-7 дней или в пределах менее 24 часов, и, в принципе, осуществлять подходы секвенирования отдельных клеток. В контексте изобретения можно использовать множество платформ NGS, коммерчески доступных или описанных в литературе, например, подробно описанных в WO 2012/159643.

[0314] В некоторых вариантах осуществления антигенный или неоантигенный пептид или его эпитоп может содержать, в качестве неограничивающих примеров, приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14, приблизительно 15, приблизительно 16, приблизительно 17, приблизительно 18, приблизительно 19, приблизительно 20, приблизительно 21, приблизительно 22, приблизительно 23, приблизительно 24, приблизительно 25, приблизительно 26, приблизительно 27, приблизительно 28, приблизительно 29, приблизительно 30, приблизительно 31, приблизительно 32, приблизительно 33, приблизительно 34, приблизительно 35, приблизительно 36, приблизительно 37, приблизительно 38, приблизительно 39, приблизительно 40, приблизительно 41, приблизительно 42, приблизительно 43, приблизительно 44, приблизительно 45, приблизительно 46, приблизительно 47, приблизительно 48, приблизительно 49, приблизительно 50, приблизительно 60, приблизительно 70, приблизительно 80, приблизительно 90, приблизительно 100, приблизительно 110, приблизительно 120 или более аминокислотных остатков, включая любой диапазон между ними. В конкретных вариантах осуществления длина иммуногенного антигена или его эпитопа составляет 100 аминокислот или менее.

[0315] В некоторых вариантах осуществления антигенный или неоантигенный пептид или его эпитоп для MHC класса I имеет длину 13 остатков или менее и, как правило, состоит из от приблизительно 8 до приблизительно 11 остатков, в частности, 9 или 10 остатков. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный антигенный или неоантигенный пептид или его эпитоп для MHC класса II имеет длину 9-24 остатков.

[0316] Более длинный иммуногенный пептид можно конструировать несколькими способами. В некоторых вариантах осуществления, если HLA-связывающие пептиды спрогнозированы или известны, более длинный иммуногенный пептид может состоять из (1) отдельных связывающих пептидов с удлинениями на 2-5 аминокислот в направлении N- и C-конца каждого соответствующего продукта гена; или (2) конкатенации некоторых или всех из связывающих пептидов с удлиненными последовательностями каждого из них. В других вариантах осуществления, если при секвенировании выявляют длинную (>10 остатков) последовательность эпитопа, например, неоэпитоп, присутствующий в опухоли (например, в результате сдвига рамки считывания, сквозного прочитывания терминатора или включения интрона, приводящих к новой пептидной последовательности), более длинный неоантигенный пептид может состоять из целого фрагмента новых опухолеспецифических аминокислот в виде единого более длинного пептида или нескольких перекрывающихся более длинных пептидов. В некоторых вариантах осуществления допускают использованием более длинного пептида, чтобы сделать возможным эндогенный процессинг клетками пациента, и это может приводить к более эффективному презентированию антигена и индуцированию T-клеточных ответов. В некоторых вариантах осуществления можно использовать два или более пептидов, где пептиды перекрываются и накладываются на длинный неоантигенный пептид.

[0317] В некоторых вариантах осуществления антигенный или неоантигенный пептид связывается с белком HLA (например, HLA класса I или HLA класса II). В конкретных вариантах осуществления антигенный или неоантигенный пептид связывается с белком HLA с большей аффинностью, чем соответствующий пептид дикого типа. В конкретных вариантах осуществления антигенный или неоантигенный пептид имеет IC₅₀ или K_D по меньшей мере менее 5000 нМ, по меньшей мере менее 500 нМ, по меньшей мере менее 100 нМ, по меньшей мере 50 нМ или менее.

[0318] В некоторых вариантах осуществления антигенный или неоантигенный пептид может иметь длину от приблизительно 8 до приблизительно 50 аминокислотных остатков, или от приблизительно 8 до приблизительно 30, от приблизительно 8 до приблизительно 20, от приблизительно 8 до приблизительно 18, от приблизительно 8 до приблизительно 15 или от приблизительно 8 до приблизительно 12 аминокислотных остатков. В некоторых вариантах осуществления антигенный или неоантигенный пептид может иметь длину от приблизительно 8 до приблизительно 500 аминокислотных остатков или от приблизительно 8 до приблизительно 450, от приблизительно 8 до приблизительно 400, от приблизительно 8 до приблизительно 350, от приблизительно 8 до приблизительно 300, от приблизительно 8 до приблизительно 250, от приблизительно 8 до приблизительно 200, от приблизительно 8 до приблизительно 150, от приблизительно 8 до приблизительно 100, от приблизительно 8 до приблизительно 50 или от приблизительно 8 до приблизительно 30 аминокислотных остатков.

[0319] В некоторых вариантах осуществления антигенный или неоантигенный пептид может иметь длину по меньшей мере,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 или более аминокислотных остатков. В некоторых вариантах осуществления неоантигенные пептиды могут иметь длину по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 или более аминокислотных остатков. В некоторых вариантах осуществления антигенный или неоантигенный пептид может иметь длину не более 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 или менее аминокислотных остатков. В некоторых вариантах осуществления антигенный или неоантигенный пептид может иметь длину не более 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 или менее аминокислотных остатков.

[0320] В некоторых вариантах осуществления антигенный или неоантигенный пептид имеет общую длину по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23, по меньшей мере 24, по меньшей мере 25, по меньшей мере 26, по меньшей мере 27, по меньшей мере 28, по меньшей мере 29, по меньшей мере 30, по меньшей мере 40, по меньшей мере 50, по меньшей мере 60, по меньшей мере 70, по меньшей мере 80, по меньшей мере 90, по меньшей мере 100, по меньшей мере 150, по меньшей мере 200, по меньшей мере 250, по меньшей мере 300, по меньшей мере 350, по меньшей мере 400, по меньшей мере 450 или по меньшей мере 500 аминокислот.

[0321] В некоторых вариантах осуществления антигенный или неоантигенный пептид имеет общую длину не более 8, не более 9, не более 10, не более 11, не более 12, не более 13, не более 14, не более 15, не более 16, не более 17, не более 18, не более 19, не более 20, не более 21, не более 22, не более 23, не более 24, не более 25, не более 26, не более 27, не более 28, не более 29, не более 30, не более 40, не более 50, не более 60, не более 70, не более 80, не более 90, не более 100, не более 150, не более 200, не более 250, не более 300, не более 350, не более 400, не более 450 или не более 500 аминокислот.

[0322] В некоторых вариантах осуществления неоантигенные пептиды могут иметь значение pI от приблизительно 0,5 до приблизительно 12, от приблизительно 2 до приблизительно 10 или от приблизительно 4 до приблизительно 8. В некоторых вариантах осуществления неоантигенные пептиды могут иметь значение pI по меньшей мере 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5 или более. В некоторых вариантах осуществления неоантигенные пептиды могут иметь значение pI не более 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5 или менее.

[0323] В некоторых вариантах осуществления антигенный или неоантигенный пептид может иметь аффинность связывания с HLA от приблизительно 1 пМ до приблизительно 1 мМ, от приблизительно 100 пМ до приблизительно 500 мкМ, от приблизительно 500 пМ до приблизительно 10 мкМ, от приблизительно 1 нМ до приблизительно 1 мкМ или от приблизительно 10 нМ до приблизительно 1 мкМ. В некоторых вариантах осуществления антигенный или неоантигенный пептид может иметь аффинность связывания с HLA по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900 мкМ или более. В некоторых вариантах осуществления антигенный или неоантигенный пептид могут иметь аффинность связывания с HLA не более 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900 мкМ.

[0324] В некоторых вариантах осуществления антигенный или неоантигенный пептид, представленный в настоящем описании, может содержать носители, например, хорошо известные в этой области, например, тиреоглобулин, альбумины, такие как сывороточный альбумин человека, столбнячный анатоксин, полиаминокислотные остатки, такие как поли-L-лизин, поли-L-глутаминовая кислота, белки вируса гриппа, коровый белок вируса гепатита B и т.п.

[0325] В некоторых вариантах осуществления антигенный или неоантигенный пептид, представленный в настоящем описании, можно модифицировать посредством ацилирования концевого -NH₂, например, посредством ацетилирования алканоилом (C₁-C₂₀) или тиогликолилом, амидирования карбоксильного конца, например, аммиаком, метиламином и т.д. В некоторых вариантах осуществления с помощью этих модификаций можно получать участки для связывания с подложкой или другой молекулой.

[0326] В некоторых вариантах осуществления антигенный или неоантигенный пептид, представленный в настоящем описании, может содержать модификации, такие как, в качестве неограничивающих примеров, гликозилирование, окисление боковой цепи, биотинилирование, фосфорилирование, добавление поверхностно-активного материала, например, липида, или его можно химически модифицировать, например, ацетилировать и т.д. Кроме того, связи в пептиде могут быть иными, чем пептидные связи, например, ковалентные связи, сложноэфирные или эфирные связи, дисульфидные связи, водородные связи, ионные связи и т.д.

[0327] В некоторых вариантах осуществления антигенный или неоантигенный пептид, представленный в настоящем описании, может содержать замены для модификации физического свойства (например, стабильности или растворимости) получаемого пептида. Например, антигенный или неоантигенный пептид можно модифицировать посредством замены цистеина (C) α-аминомасляной кислотой ("B"). Из-за своей химической природы, цистеин имеет склонность к образованию дисульфидных мостиков и в достаточной степени изменяет пептид структурно так, что снижает способность к связыванию. Замена α-аминомасляной кислоты на C не только уменьшает эту проблему, но фактически в некоторых случаях улучшает способность к связыванию и перекрестному связыванию. Замену цистеина α-аминомасляной кислотой можно осуществлять в любом остатке антигенного или неоантигенного пептида, например, в любом якорном или неякорном положении эпитопа или аналога в пептиде или в других положениях пептида.

[0328] В некоторых вариантах осуществления антигенный пептид или неоантигенный пептид, представленный в настоящем описании, может содержать миметики аминокислот или неприродные аминокислотные остатки, например D- или L-нафтилаланин; D- или L-фенилглицин; D- или L-2-тиенилаланин; D- или L- 1-, 2-, 3- или 4-пиренилаланин; D- или L-3-тиенилаланин; D- или L-(2-пиридинил)-аланин; D- или L-(3-пиридинил)-аланин; D- или L-(2-пиразинил)-аланин; D- или L-(4-изопропил)-фенилглицин; D-(трифторметил)-фенилглицин; D-(трифтор-метил)-фенилаланин; D-ρ-фторфенилаланин; D- или L-ρ-бифенил-фенилаланин; D- или L-ρ-метоксибифенилфенилаланин; D- или L-2-индол(аллил)аланины; и D- или L-алкилаланины, где алкильная группа может представлять собой замещенный или незамещенный метил, этил, пропил, гексил, бутил, пентил, изопропил, изо-бутил, втор-изотил, изо-пентил или некислые аминокислотные остатки. Ароматические кольца неприродной аминокислоты включают, например, тиазолильное, тиофенильное, пиразолильное, бензимидазолильное, нафтильное, фуранильное, пирролильное и пиридильное ароматические кольца. Модифицированные пептиды, содержащие различные миметики аминокислот или неприродные аминокислотные остатки, являются особенно подходящими, т.к. они склонны проявлять повышенную стабильность in vivo. Такие пептиды также могут иметь улучшенный срок годности или производственные свойства.

[0329] Стабильность пептидов можно оценивать рядом способов. Например, для тестирования стабильности используют пептидазы и различные биологические среды, такие как плазма и сыворотка человека. См., например, Verhoef, et al., Eur. J. Drug Metab. Pharmacokinetics 11:291 (1986). Время полужизни пептидов, представленных в настоящем описании, общепринято определяют с использованием анализа 25% сыворотки человека (об./об.). Способ является следующим: смешанную сыворотку человека (тип AB, не инактивированную термически) перед использованием разрушают посредством центрифугирования. Затем сыворотку разводят до 25% с помощью RPMI-1640 или другой подходящей среды для культивирования ткани. Через заранее определенные временные интервалы небольшое количество реакционного раствора удаляют и добавляют в 6% водный раствор трихлоруксусной кислоты (TCA) или этанол. Мутный образец охлаждают (4°C) в течение 15 минут, а затем центрифугируют для осаждения преципитировавших белков сыворотки. Затем наличие пептидов определяют посредством обращенно-фазовой ВЭЖХ с использованием специфических для анализа стабильности условий хроматографии.

[0330] В некоторых вариантах осуществления антигенный или неоантигенный пептид, представленный в настоящем описании, может находиться в растворе, лиофилизированной или кристаллической форме.

[0331] В некоторых вариантах осуществления антигенный или неоантигенный пептид, представленный в настоящем описании, можно получать синтетически с помощью технологии рекомбинантных ДНК или химического синтеза или его можно выделять из природных источников, таких как нативные опухоли или патогенные организмы. Эпитопы можно синтезировать по отдельности или соединенными прямо или косвенно в пептид. Хотя антигенный или неоантигенный пептид, представленный в настоящем описании, по существу, не будет содержать другие белки природной клетки-хозяина и их фрагменты, в некоторых вариантах осуществления пептид можно синтетически конъюгировать так, чтобы соединять нативные фрагменты или частицы.

[0332] В некоторых вариантах осуществления пептиды можно синтезировать в растворе или на твердой подложке общепринятыми способами. Коммерчески доступны различные автоматические синтезаторы, и их можно использовать известными способами (см., например, Stewart & Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2d. Ed., Pierce Chemical Co., 1984). Кроме того, отдельные пептиды можно соединять с использованием химического лигирования для получения более крупных пептидов, все равно попадающих в объем изобретения.

[0333] Альтернативно, можно использовать технологию рекомбинантных ДНК, где нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид, встраивают в экспрессирующий вектор, с помощью нее трансформируют или трансфицируют подходящую клетку-хозяина и культивируют ее в условиях, подходящих для экспрессии. Эти способы, как правило, известны в этой области, как описано, в целом, в Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). Таким образом, рекомбинантные пептиды, содержащие или состоящие из одного или более эпитопов, представленных в настоящем описании, можно использовать для презентирования соответствующего T-клеточного эпитопа.

[0334] В одном из аспектов, настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим один, по меньшей мере два или более двух антигенных пептидов или неоантигенных пептидов. В некоторых вариантах осуществления композиция, представленная в настоящем описании, содержит по меньшей мере два разных пептида. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере два разных пептида получают из одного и того же полипептида. Термин "разные полипептиды" означает, что пептид может иметь разную длину, аминокислотную последовательность или и то, и другое. Пептиды получают из любого полипептида, как известно или как обнаружено, содержащего опухолеспецифическую мутацию. В некоторых вариантах осуществления выделенный антигенный или неоантигенный пептид кодируется геном с точечной мутацией, приводящей к замене аминокислоты нативного пептида.

Фармацевтические композиции

[0335] Фармацевтические композиции можно составлять с использованием одного или более физиологически приемлемых носителей, включая эксципиенты и вспомогательные средства, облегчающие переработку активных средств в препараты, которые можно использовать фармацевтически. Соответствующий состав будет зависеть от выбранного пути введения. Любые из хорошо известных способов, носителей и эксципиентов можно использовать, как общепринято в этой области.

[0336] В некоторых случаях фармацевтическую композицию составляют в виде терапевтического средства на основе клеток, например, T-клеточного терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция включает терапевтическое средство на основе пептида, терапевтическое средство на основе нуклеиновой кислоты, терапевтическое средство на основе антитела и/или терапевтическое средство на основе клеток. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция включает терапевтическое средство на основе пептида или терапевтическое средство на основе нуклеиновой кислоты, в котором нуклеиновая кислота кодирует полипептиды. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция включает терапевтическое средство на основе антитела. Композиция может содержать T-клетки, специфические в отношении двух или более иммуногенных антигенных или неоантигенных пептидов.

[0337] В дополнение к активному ингредиенту, фармацевтические композиции могут включать фармацевтически приемлемый эксципиент, носитель, буфер, стабилизатор или другие материалы, хорошо известные специалистам в этой области. Такие материалы должны быть нетоксичными и не должны мешать эффективности активного ингредиента. Конкретная природа носителя или другого материала будет зависеть от пути введения.

[0338] Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы являются носителями, эксципиентами или стабилизаторами, нетоксичными для реципиентов в используемых дозах и концентрациях, и включают буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония, хлорид бензетония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пантенол и m-крезол); низкомолекулярные (менее приблизительно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие средства, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексные соединения с металлами (например, комплексы Zn-белок); и/или неионные поверхностно-активные средства, такие как TWEEN®, PLURONIC® или полиэтиленгликоль (PEG).

[0339] Приемлемые носители являются физиологически приемлемыми для пациента, которому их вводят, и сохраняют терапевтические свойства соединений, с которыми/в которых их вводят. Приемлемые носители и их составы, в целом, описаны, например, в Remington’ Pharmaceutical Sciences (18th ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA 1990). Одним из примеров носителей является физиологический раствор. Фармацевтически приемлемый носитель является фармацевтически приемлемым материалом, композицией или носителем, таким как жидкий или твердый наполнитель, дилюент, эксципиент, растворитель или инкапсулирующий материал, участвующие в транспорте конкретных соединений из места введения в одном органе или части организма в другой орган или часть организма или в системе анализа in vitro. Приемлемые носители совместимы с другими ингредиентами состава и не вредят индивидууму, которому их вводят. Приемлемый носитель не должен изменять специфическую активность неоантигенов.

[0340] В одном из аспектов настоящее изобретение относится к фармацевтически приемлемым или физиологически приемлемым композициям, включающим растворители (водные или неводные), растворы, эмульсии, дисперсионные среды, покрытия, изотонические и способствующие или замедляющие абсорбцию средства, совместимые с фармацевтическим введением. Таким образом, термины "фармацевтические композиции" или "фармацевтические составы" относятся к композиции, подходящей для фармацевтического использования для индивидуума. Композиции можно составлять совместимыми с конкретным путем введения (т.е. системным или локальным). Таким образом, композиции включают носители, дилюенты или эксципиенты, подходящие для введения различными путями.

[0341] В некоторых вариантах осуществления композиция может дополнительно содержать приемлемую добавку для улучшения стабильности иммунных клеток в композиции. Приемлемые добавки могут не изменять специфическую активность иммунных клеток. Неограничивающие примеры приемлемых добавок включают сахар, такой как маннит, сорбит, глюкоза, ксилит, трегалоза, сорбоза, сахароза, галактоза, декстран, декстроза, фруктоза, лактоза и их смеси. Приемлемые добавки можно комбинировать с приемлемыми носителями и/или эксципиентами, такими как декстроза. Альтернативно, неограничивающие примеры приемлемых добавок включают поверхностно-активное вещество, такое как полисорбат 20 или полисорбат 80, для повышения стабильности пептида и снижения желирования растворов. Поверхностно-активное вещество можно добавлять в композицию в количестве от 0,01% до 5% раствора. Добавление таких приемлемых добавок повышает стабильность и время полужизни композиции при хранении.

[0342] Фармацевтическую композицию можно вводить, например, посредством инъекции. Композиции для инъекции включают водные растворы (если являются водорастворимыми) или дисперсии и стерильные порошки для экстемпорального получения стерильных инъецируемых растворов или дисперсии. В случае внутривенного введения подходящие носители включают физиологический раствор, бактериостатическую воду или фосфатно-солевой буфер (PBS). Носитель может являться растворителем или дисперсионной средой, содержащей, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси. Текучесть можно поддерживать, например, с использованием покрытия, такого как лецитин, посредством поддержания необходимого размера частиц в случае дисперсии и с использованием поверхностно-активных веществ. Антибактериальные и противогрибковые средства включают, например, парабены, хлорбутанол, фенол, аскорбиновую кислоту и тиомерсал. В композиции можно включать изотонические средства, например, сахара, полиспирты, такие как маннит, сорбит, и хлорид натрия. Полученные растворы можно упаковывать для использования в исходном виде или лиофилизированными; лиофилизированный препарат позднее можно комбинировать со стерильным раствором перед введением. В случае внутривенной инъекции или инъекции в очаге повреждения, активный ингредиент будет находиться в форме парентерально приемлемого водного раствора, не содержащего пирогены и имеющего подходящий pH, изотоничность и стабильность. Специалисты в этой области могут получать подходящие растворы с использованием, например, изотонических носителей, таких как хлорид натрия для инъекций, раствор Рингера для инъекций, лактат Рингера для инъекций. При необходимости, можно включать консерванты, стабилизаторы, буферы, антиоксиданты и/или другие добавки. Стерильные инъецируемые растворы можно получать посредством включения активного ингредиента в необходимом количестве в подходящем растворителе с одним ингредиентом или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, при необходимости, с последующей стерилизацией фильтрацией. Как правило, дисперсии получают посредством включения активного ингредиента в стерильный носитель, содержащий основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для получения стерильных инъецируемых растворов предпочтительными способами получения могут являться вакуумная сушка и лиофилизация, посредством которых получают порошок активного ингредиента и любого дополнительного желаемого ингредиента из ранее его стерилизованного фильтрацией раствора.

[0343] Композиции общепринято можно вводить внутривенно, например, посредством инъекции однократной дозы. В случае инъекции, активный ингредиент может находиться в форме парентерально приемлемого водного раствора, по существу, несодержащего пирогены и имеющего подходящий pH, изотоничность и стабильность. Можно получать подходящие растворы с использованием, например, изотонических носителей, таких как хлорид натрия для инъекций, раствор Рингера для инъекций, лактат Рингера для инъекций. При необходимости, можно включать консерванты, стабилизаторы, буферы, антиоксиданты и/или другие добавки. Кроме того, композиции можно вводить посредством аэрозолизации.

[0344] Если композиции рассматривают для использования в лекарственных средствах или для любых из способов, представленных в настоящем описании, предполагают, что композиция может, по существу, не содержать пирогены таким образом, что композиция не будет вызывать воспалительную реакцию или опасную аллергическую реакцию при введении пациенту-человеку. Тестирование композиций на пирогены и получение композиций, по существу, несодержащих пирогены, хорошо известны специалисту в этой области, и их можно осуществлять с использованием коммерчески доступных наборов.

[0345] Приемлемые носители могут включать соединение, стабилизирующее, повышающее или замедляющее абсорбцию или повышающее или замедляющее клиренс. Такие соединения включают, например, углеводы, такие как глюкоза, сахароза или декстраны; низкомолекулярные белки; композиции, снижающие клиренс или гидролиз пептидов; или эксципиенты или другие стабилизаторы и/или буферы. Средства, замедляющие абсорбцию, включают, например, моностеарат алюминия и желатин. Детергенты также можно использовать для стабилизации или повышения или снижения абсорбции фармацевтической композиции, включая липосомные носители. Для защиты от расщепления соединение можно комплексировать с композицией, чтобы сделать ее резистентной к кислотному или ферментативному гидролизу, или соединение можно комплексировать в соответствующим образом резистентном носителе, таком как липосома. Способы защиты соединений от расщепления известны в этой области (например, Fix (1996) Pharm Res. 13:1760 1764; Samanen (1996) J. Pharm. Pharmacol. 48:119 135; и патент США № 5391377).

[0346] Композиции можно вводить способом, совместимым с лекарственным составом, и в терапевтически эффективном количестве. Вводимое количество зависит от индивидуума, подвергаемого лечению, способности иммунной системы индивидуума утилизировать активный ингредиент и желаемой степени связывания. Точное количество активного ингредиента, необходимое для введения, зависит от решения практикующего врача и является характерным для каждого индивидуума. Также доступны подходящие схемы начального введения и бустерного введения, но их характеризуют по начальному введению с последующими повторными дозами с интервалами один или более часов посредством последующей инъекции или другого введения. Альтернативно, предусмотрены непрерывные внутривенные инфузии, достаточные для поддержания концентраций в крови.

[0347] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к иммуногенной композиции, например, фармацевтической композиции, которая может вызывать неоантиген-специфический ответ (например, гуморальный или клеточно-опосредованный иммунный ответ). В некоторых вариантах осуществления иммуногенная композиция содержит неоантигенные терапевтические средства (например, пептиды, полинуклеотиды, TCR, CAR, клетки, содержащие TCR или CAR, дендритную клетку, содержащую полипептид, дендритную клетку, содержащую полинуклеотид, антитело, и т.д.), представленные в настоящем описании, соответствующие опухолеспецифическому антигену или неоантигену.

[0348] В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция, представленная в настоящем описании, может вызывать ответ специфических цитотоксических T-клеток, ответ специфических хелперных T-клеток или B-клеточный ответ.

[0349] В некоторых вариантах осуществления антигенные полипептиды или полинуклеотиды можно предоставлять в виде антигенпрезентирующих клеток (например, дендритных клеток), содержащих такие полипептиды или полинуклеотиды. В других вариантах осуществления такие антигенпрезентирующие клетки используют для стимуляции T-клеток для использования на пациентах. В некоторых вариантах осуществления антигенпрезентирующие клетки являются дендритными клетками. В родственных вариантах осуществления дендритные клетки являются аутологичными дендритными клетками, в которые вводили неоантигенный пептид или нуклеиновую кислоту. Неоантигенный пептид может являться любым подходящим пептидом, вызывающим соответствующий T-клеточный ответ. В некоторых вариантах осуществления T-клетка является CTL. В некоторых вариантах осуществления T-клетка является HTL. Таким образом, одним из вариантов осуществления настоящего изобретения является иммуногенная композиция, содержащая по меньшей мере одну антигенпрезентирующую клетку (например, дендритную клетку), в которую вводили или которую нагружали одним или более неоантигенными полипептидами или полинуклеотидами, представленными в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления такие APC являются аутологичными (например, аутологичными дендритными клетками). Альтернативно, мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), выделенные из пациента, можно нагружать неоантигенными пептидами или полинуклеотидами ex vivo. В родственных вариантах осуществления такие APC или PBMC инъецируют обратно пациенту. Полинуклеотид может являться любым подходящим полинуклеотидом, с помощью которого можно трансдуцировать дендритную клетку, таким образом, достигая презентирования неоантигенного пептида и индуцирования иммунитета. В некоторых вариантах осуществления такие антигенпрезентирующие клетки (APC) (например, дендритные клетки) или мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) используют для стимуляции T-клетки (например, аутологичной T-клетки). В родственных вариантах осуществления T-клетка является CTL. В других родственных вариантах осуществления T-клетка является HTL. В некоторых вариантах осуществления T-клетки являются CD8⁺ T-клетками. В некоторых вариантах осуществления T-клетки являются CD4⁺ T-клетками. Затем такие T-клетки инъецируют пациенту. В некоторых вариантах осуществления CTL инъецируют пациенту. В некоторых вариантах осуществления HTL инъецируют пациенту. В некоторых вариантах осуществления и CTL, и HTL инъецируют пациенту. Введение другого терапевтического средства можно осуществлять одновременно или последовательно и в любом порядке.

[0350] В некоторых вариантах осуществления фармацевтическую композицию (например, иммуногенные композиции), представленные в настоящем описании, для терапевтического лечения можно составлять для парентерального, местного, назального или перорального введения. В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции по настоящему изобретению вводят парентерально, например, внутривенно, подкожно, интрадермально или внутримышечно. В некоторых вариантах осуществления композицию можно вводить внутриопухолево. Композиции можно вводить в место хирургического вмешательства для индуцирования локального иммунного ответа в опухоли. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям для парентерального введения, содержащим раствор неоантигенных пептидов, и иммуногенные композиции растворяют или суспендируют в приемлемом носителе, например, водном носителе. Можно использовать различные водные носители, например, воду, забуференную воду, 0,9% физиологический раствор, 0,3% глицин, гиалуроновую кислоту и т.п. Эти композиции можно стерилизовать общепринятыми, хорошо известными способами стерилизации или можно стерилизовать фильтрацией. Получаемые водные растворы можно упаковывать для использования в исходном виде или лиофилизированными, при этом лиофилизированный препарат комбинируют со стерильным раствором перед введением. Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные средства, при необходимости, для приближения к физиологическим условиям, такие как корректирующие pH и буферные средства, средства для регуляции тоничности, увлажнители и т.п., например, ацетат натрия, лактат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция, сорбитанмонолаурат, триэтаноламин олеат и т.д.

[0351] Способность адъюванта повышать иммунный ответ на антиген, как правило, проявляется в значительном повышении иммуноопосредованной реакции или уменьшении симптомов заболевания. Например, повышение гуморального иммунитета проявляется в значительном повышении титра антител, индуцированных против антигена, и повышение активности T-клеток может проявляться в повышении пролиферации клеток, или клеточной цитотоксичности, или секреции цитокинов. Адъювант также может изменять иммунный ответ, например, посредством изменения, главным образом, гуморального ответа или ответа T-хелперов 2 в, главным образом, клеточный ответ или ответ T-хелперов 1.

[0352] Подходящие адъюванты известны в этой области (см., WO 2015/095811) и включают, в качестве неограничивающих примеров, поли(I:C), поли-ICLC, агонист STING, 1018 ISS, соли алюминия, Amplivax, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, ГМ-КСФ, IC30, IC31, имиквимод, ImuFact IMP321, пластырь IS, ISS, ISCOMATRIX, JuvImmune, LipoVac, MF59, монофосфориллипид A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, векторную систему PepTel®, микрочастицы PLG, резиквимод, SRL172, виросомы и другие вирусоподобные частицы, YF-17D, VEGF-ловушку, R848, β-глюкан, Pam3Cys, Pam3CSK4, Stimulon QS21 от Aquila (Aquila Biotech, Worcester, Mass., USA), полученный из сапонина, экстракты микобактерий, синтетические миметики стенок бактериальных клеток и другие патентованные адъюванты, такие как Detox от Ribi, Quil или Superfos. Описано несколько иммунологических адъювантов (например, MF59), специфических для дендритных клеток, и их получение (Dupuis M, et al., Cell Immunol. 1998; 186(1):18-27; Allison A C; Dev Biol Stand. 1998; 92:3-11, Mosca et al. Frontiers in Bioscience, 2007; 12:4050-4060, Gamvrellis et al. Immunol & Cell Biol. 2004; 82: 506-516). Также можно использовать цитокины. Несколько цитокинов напрямую связывают с влиянием на миграцию дендритных клеток в лимфоидные ткани (например, ФНОα), ускорением созревания дендритных клеток в эффективные антигенпрезентирующие клетки в случае T-лимфоцитов (например, ГМ-КСФ, PGE1, PGE2, ИЛ-1, ИЛ-1β, ИЛ-4, ИЛ-6 и CD40L) (патент США № 5849589, включенный в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме) и действием в качестве иммуноадъювантов (например, ИЛ-12) (Gabrilovich D I, et al., J Immunother Emphasis Tumor Immunol. 1996 (6):414-418).

[0353] Также сообщают, что иммунологические олигонуклеотиды CpG усиливают эффекты адъювантов в терапевтических условиях. Не желая быть связанными какой-либо теорией, полагают, что олигонуклеотиды CpG действуют, активируя врожденную (неадаптивную) иммунную систему через Toll-подобные рецепторы (TLR), в основном, TLR9. Запущенная CpG активация TLR9 усиливает антигенспецифические гуморальные и клеточные ответы на широкий спектр антигенов, включая пептидные или белковые антигены, живые или инактивированные вирусы, иммуногенные фармацевтические композиции дендритных клеток, аутологичные клеточные иммуногенные фармацевтические композиции и конъюгаты полисахаридов в профилактических и терапевтических иммуногенных фармацевтических композициях. Важно, что она повышает созревание и дифференцировку дендритных клеток, что приводит к повышенной активации TH1-клеток и генерации сильных цитотоксических T-лимфоцитов (CTL) даже в отсутствие помощи со стороны CD4⁺ T-клеток. Сдвиг в сторону TH1, индуцируемый стимуляцией TLR9, сохраняется даже в присутствии адъювантов, таких как квасцы или неполный адъювант Фрейнда (IFA), в норме способствующих сдвигу в сторону TH2. Олигонуклеотиды CpG демонстрируют даже большую адъювантную активность при составлении или совместном введении с другими адъювантами или в составах, таких как микрочастицы, наночастицы, липидные эмульсии или схожие составы, особенно полезные для индуцирования сильного ответа, когда антиген является относительно слабым. Они также могут ускорять иммунный ответ и позволять снижать дозу антигена со сравнимыми гуморальными ответами на полную дозу иммуногенной фармацевтической композиции без CpG в некоторых экспериментах (Arthur M. Krieg, Nature Reviews, Drug Discovery, 5, June 2006, 471-484). В патенте США № 6406705 описывают комбинированное использование олигонуклеотидов CpG, адъювантов не на основе нуклеиновых кислот и антигена для индуцирования антигенспецифического иммунного ответа. Коммерчески доступным антагонистом TLR9 CpG является dSLIM (иммуномодулятор на основе двойной шпильки) от Mologen (Berlin, DE), являющийся компонентом фармацевтической композиции, представленной в настоящем описании. Также можно использовать другие TLR-связывающие молекулы, такие как РНК, связывающая TLR7, TLR8 и/или TLR9.

[0354] Другие примеры адъюванты, которые можно использовать, включают, в качестве неограничивающих примеров, химически модифицированные CpG (например, CpR, Idera), поли(I:C)(например, полиI:CI2U), не-CpG бактериальную ДНК или РНК, ssRNA40 для TLR8, а также иммуноактивные низкомолекулярные соединения и антитела, такие как циклофосфамид, сунитиниб, бевацизумаб, целебрекс, NCX-4016, силденафил, тадалафил, варденафил, сорафениб, XL-999, CP-547632, пазопаниб, ZD2171, AZD2171, ипилимумаб, тремелимумаб и SC58175, которые могут действовать терапевтически и/или в качестве адъюванта. Специалисты в этой области легко могут определять количества и концентрации адъювантов и добавок, которые можно использовать в контексте настоящего изобретению, без излишнего экспериментирования. Дополнительные адъюванты включают колониестимулирующие факторы, такой как гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ, сарграмостим).

[0355] В некоторых вариантах осуществления иммуногенная композиция по настоящему изобретению может содержать несколько разных адъювантов. Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей любой адъювант, включая любые из указанных выше адъювантов или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления иммуногенная композиция содержит неоантигенные терапевтические средства (например, пептиды, полинуклеотиды, TCR, CAR, клетки, содержащие TCR или CAR, дендритную клетку, содержащую полипептид, дендритную клетку, содержащую полинуклеотид, антитело и т.д.), и адъювант можно вводить отдельно в любой подходящей последовательности.

[0356] Липидирование можно классифицировать на несколько разных типов, таких как N-миристоилирование, пальмитоилирование, добавление GPI-якоря, пренилирование и несколько дополнительных типов модификаций. N-миристоилирование представляет собой ковалентное присоединение миристата, C₁₄-насыщенной кислоты, к остатку глицина. Пальмитоилирование представляет собой тиоэфирное связывание длинноцепочечных жирных кислот (C₁₆) с остатками цистеина. Добавление GPI-якоря представляет собой связывание гликозил-фосфатидилинозитол (GPI) через амидную связь. Пренилирование представляет собой тиоэфирное связывание изопреноидного липида (например, фарнезила (C-15), геранилгеранила (C-20)) с остатками цистеина. Дополнительные типы модификаций могут включать присоединение S-диацилглицерина к атому серы цистеинов, конъюгацию O-октаноила через остатки серина или треонина, конъюгацию S-археола с остатками цистеина и присоединение холестерина.

[0357] Жирные кислоты для получения липидированных пептидов могут включать C₂-C₃₀-насыщенные, мононенасыщенные или полиненасыщенные жирные ацильные группы. Примеры жирных кислот могут включать пальмитоильные, миристоильные, стеароильные и деканоильные группы. В некоторых случаях липидный остаток, имеющий адъювантное свойство, присоединяют к интересующему полипептиду для вызывания или повышения иммуногенности в отсутствие внешнего адъюванта. Липидированный пептид или липопептид можно обозначать как самоадъювантный липопептид. Любые из жирных кислот, описанных выше и где-либо в настоящем описании, могут вызывать или повышать иммуногенность интересующего полипептида. Жирная кислота, которая может вызывать или повышать иммуногенность, могут включать пальмитоильную, миристоильную, стеароильную, лауроильную, октаноильную и деканоильную группы.

[0358] Полипептиды, такие как "голые" пептиды или липидированные пептиды, можно включать в липосому. В некоторых случаях липидированные пептиды можно включать в липосому. Например, липидная часть липидированного пептида может спонтанно интегрироваться в липидный бислой липосомы. Таким образом, липопептид можно презентировать на "поверхности" липосомы. Неограничивающие примеры липосом, подходящих для включения в составы, включают мультиламеллярные везикулы (MLV), олиголамеллярные везикулы (OLV), моноламеллярные везикулы (UV), небольшие моноламеллярные везикулы (SUV), моноламеллярные везикулы среднего размера (MUV), крупные моноламеллярные везикулы (LUV), гигантские моноламеллярные везикулы (GUV), мультивезикулярные везикулы (MVV), моно- или олиголамеллярные везикулы, полученные способом обращенно-фазового выпаривания (REV), мультиламеллярные везикулы, полученные способом обращенно-фазового выпаривания (MLV-REV), стабильные плюриламеллярные везикулы (SPLV), замороженные и размороженные MLV (FATMLV), везикулы, полученные способами экструзии (VET), везикулы, полученные с помощью френч-пресса (FPV), везикулы, полученные слиянием (FUV), везикулы, полученные дегидратацией-регидратацией (DRV) и пузырьковые липосомы (BSV).

[0359] В зависимости от способа получения, липосомы могут являться моноламеллярными или мультиламеллярными, и их размер может варьироваться при диаметрах в диапазоне от приблизительно 0,02 мкм до более чем приблизительно 10 мкм. Липосомы могут адсорбировать многие типы клеток, а затем высвобождать заключенное средство (например, пептид, представленный в настоящем описании). В некоторых случаях липосомы сливаются с клеткой-мишенью, при этом содержимое липосомы может высвобождаться в клетку-мишень. Липосома может подвергаться эндоцитозу клетками, являющимися фагоцитирующими. После эндоцитоза может происходить интрализосомальная деградация липосомных липидов и высвобождение инкапсулированных средств.

[0360] Липосомы, представленные в настоящем описании, также могут содержать липиды-носители. В некоторых вариантах осуществления носитель липиды являются фосфолипидами. Липиды-носители, которые могут образовывать липосомы, включают, в качестве неограничивающих примеров, дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC), фосфатидилхолин (PC; лецитин), фосфатидную кислоту (PA), фосфатидилглицерин (ПГ), фосфатидилэтаноламин (PE), фосфатидилсерин (PS). Другие подходящие фосфолипиды дополнительно включают дистеароилфосфатидилхолин (DSPC), димиристоилфосфатидилхолин (DMPC), дипальмитоилфосфатидилглицерин (DPPG), дистеароилфосфатидилглицерин (DSPG), димиристоилфосфатидилглицерин (DMPG), дипальмитоилфосфатидную кислоту (DPPA); димиристоилфосфатидную кислоту (DMPA), дистеароилфосфатидную кислоту (DSPA), дипальмитоилфосфатидилсерин (DPPS), димиристоилфосфатидилсерин (DMPS), дистеароилфосфатидилсерин (DSPS), дипальмитоилфосфатидилэтаноламин (DPPE), димиристоилфосфатидилэтаноламин (DMPE), дистеароилфосфатидилэтаноламин (DSPE) и т.п. или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления липосомы дополнительно содержат стерин (например, холестерин), модулирующий образование липосом. Липиды-носители могут являться любыми известными нефосфатными полярными липидами.

[0361] Фармацевтическую композицию можно инкапсулировать в липосомы с использованием хорошо известной технологии. В качестве носителей для фармацевтических композиций по настоящему изобретению также можно использовать биодеградируемые микросферы.

[0362] Фармацевтическую композицию можно вводить в липосомах или микросферах (или микрочастицах). Способы получения липосом и микросфер для введения пациенту хорошо известны специалистам в этой области. В основном, материал растворяют в водном растворе, добавляют соответствующие фосфолипиды и липиды, при необходимости, вместе с поверхностно-активными веществами и материал, при необходимости, подвергают диализу или обработке ультразвуком.

[0363] Микросферы, образованные из полимеров или белков, хорошо известны специалистам в этой области, и их можно адаптировать для прохождения через желудочно-кишечный тракт напрямую в кровоток. Альтернативно, можно включать в них соединение и микросферы или составные микросферы можно имплантировать для медленного высвобождения в течение периода времени в диапазоне от дней до месяцев.

[0364] Индивидууму также можно вводить иммуногенные фармацевтические композиции на основе клеток. Например, иммуногенную фармацевтическую композицию на основе антигенпрезентирующих клеток (APC) можно составлять с использованием любых из хорошо известных способов, носителей и эксципиентов, как принято в этой области. APC включают моноциты, клетки моноцитарного происхождения, макрофаги и дендритные клетки. В некоторых случаях иммуногенная фармацевтическая композиция на основе APC может являться иммуногенной фармацевтической композицией на основе дендритных клеток.

[0365] Иммуногенную фармацевтическую композицию на основе дендритных клеток можно получать любыми способами, хорошо известными в этой области. В некоторых случаях иммуногенные фармацевтические композиции на основе дендритных клеток можно получать способом ex vivo или in vivo. Способ ex vivo может включать использование аутологичных DC, в которые ex vivo вводили полипептиды, представленные в настоящем описании, для активации или нагрузки DC перед введением пациенту. Способ in vivo может включать таргетинг специфических рецепторов DC с использованием антител, соединенных с полипептидами, представленными в настоящем описании. Иммуногенная фармацевтическая композиция на основе DC может дополнительно содержат активаторы DC, такие как агонисты TLR3, TLR-7-8 и CD40. Иммуногенная фармацевтическая композиция на основе DC может дополнительно содержат адъюванты и фармацевтически приемлемый носитель.

[0366] Адъювант можно использовать для усиления иммунного ответа (гуморального и/или клеточного), вызванного у пациента, которому вводят иммуногенную фармацевтическую композицию. В некоторых случаях адъюванты могут вызывать ответ Th1-типа. В других случаях адъюванты могут вызывать ответ Th2-типа. Ответ Th1-типа может отличаться продукцией таких цитокинов, как ИФНγ, в противоположность ответу Th2-типа, который может отличаться продукцией таких цитокинов, как ИЛ-4, ИЛ-5 и ИЛ-10.

[0367] В некоторых аспектах липидные адъюванты, такие как MPLA и MDP, можно использовать с иммуногенными фармацевтическими композициями, представленными в настоящем описании. Например, монофосфориллипид A (MPLA) является адъювантом, вызывающим повышенное презентирование липосомального антигена специфическим T-лимфоцитам. Кроме того, мурамилдипептид (MDP) также можно использовать в качестве подходящего адъюванта в комбинации с иммуногенными фармацевтическими составами, представленными в настоящем описании.

[0368] Адъювант также может содержать стимуляторные молекулы, такие как цитокины. Неограничивающие примеры цитокинов включают: CCL20, α-интерферон (ИФНα), β-интерферон (ИФНβ), γ-интерферон (ИФНγ), фактор роста тромбоцитов (PDGF), ФНОα, ГМ-КСФ, эпидермальный фактор роста (EGF), хемокин, привлекающий кожные Т-лимфоциты (CTACK), эпителиальный, экспрессирующийся в тимусе хемокин (TECK), эпителиальный хемокин, ассоциированный со слизистыми оболочками (MEC), ИЛ-12, ИЛ-15, ИЛ-28, MHC, CD80, CD86, ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-18, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, ИЛ-8, L-селектин, P-селектин, E-селектин, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50,95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, М-КСФ, Г-КСФ, мутантные формы ИЛ-18, CD40, CD40L, фактор роста сосудов, фактор роста фибробластов, ИЛ-7, фактор роста нервов, фактор роста эндотелия сосудов, Fas, рецептор ФНО, Fit, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DRS, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, каспазу ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IκB, неактивный NIK, SAP K, SAP-I, JNK, интерферон-чувствительные гены, NFκB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, лиганд RANK, Ox40, лиганд Ox40, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAPI и TAP2.

[0369] Дополнительные адъюванты включают: MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, ИЛ-8, RANTES, L-селектин, P-селектин, E-селектин, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50,95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, М-КСФ, Г-КСФ, ИЛ-4, мутантные формы ИЛ-18, CD40, CD40L, фактор роста сосудов, фактор роста фибробластов, ИЛ-7, ИЛ-22, фактор роста нервов, фактор роста эндотелия сосудов, Fas, рецептор ФНО, Fit, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, каспазу ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IκB, неактивный NIK, SAP K, SAP-1, JNK, интерферон-чувствительные гены, NFκB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, лиганд RANK, Ox40, лиганд Ox40, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2 и их функциональные фрагменты.

[0370] В некоторых аспектах адъювант может являться модулятором Toll-подобного рецептора. Примеры модуляторов Toll-подобных рецепторов включают агонисты TLR9 и не ограничены низкомолекулярными модуляторами Toll-подобных рецепторов, такими как имиквимод. В некоторых случаях адъювант выбирают из бактериальных анатоксинов, блок-сополимеров полиоксипропилен-полиоксиэтилен, солей алюминия, липосом, полимеров CpG, эмульсий "масло-в-воде" или их комбинаций. В некоторых случаях адъювант является эмульсией "масло-в-воде". Эмульсия "масло-в-воде" может включать по меньшей мере одно масло и по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество, при этом масла и поверхностно-активные вещества являются биодеградируемыми (метаболизируемыми) и биосовместимыми. Капли масел в эмульсии могут иметь диаметр менее 5 мкм и даже могут иметь субмикронный диаметр, при этом этих небольших размеров достигают с помощью микрофлюидайзера для получения стабильных эмульсий. Капли с размером менее 220 нм можно подвергать стерилизации фильтрацией.

[0371] В некоторых случаях иммуногенная фармацевтическая композиция может включать носители и эксципиенты (включая, в качестве неограничивающих примеров, буферы, углеводы, маннит, белки, полипептиды или аминокислоты, такие как глицин, антиоксиданты, бактериостатические средства, хелатирующие средства, суспендирующие средства, загустители и/или консерванты), воду, масла, включая масла из нефтепродуктов, масла животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, сезамовое масло и т.п., физиологический раствор, водные растворы декстрозы и глицерина, ароматизаторы, красители, уменьшающие липкость средства и другие приемлемые добавки, адъюванты, или связывающие средства, другие фармацевтически приемлемые вспомогательные средства, необходимые для приближения к физиологическим условиям, таким как pH-буферные средства, средства для регуляции тоничности, эмульгаторы, увлажнители и т.п. Примеры эксципиентов включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, глицерин моностеарат, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропилен, гликоль, воду, этанол и т.п. В других случаях фармацевтический препарат, по существу, не содержит консерванты. В других случаях фармацевтический препарат может содержать по меньшей мере один консервант. Следует понимать, что, хотя для введения фармацевтических композиций, представленных в настоящем описании, можно использовать любой подходящий носитель, известный специалистам в этой области, тип носителя будет варьироваться в зависимости от способа введения.

[0372] Иммуногенная фармацевтическая композиция может включать консерванты, такие как тиомерсал или 2-феноксиэтанол. В некоторых случаях иммуногенная фармацевтическая композиция, по существу, не содержит (например, <10 мкг/мл) ртутный материал, например, не содержит тиомерсал. В качестве альтернативы соединениям меркурия можно использовать сукцинат α-токоферола.

[0373] Для контроля тоничности в иммуногенную фармацевтическую композицию можно включать физиологическую соль, такую как натриевая соль. Другие соли могут включать хлорид калия, дигидроортофосфат калия, дифосфат натрия и/или хлорид магния или т.п.

[0374] Иммуногенная фармацевтическая композиция может иметь осмоляльность от 200 мОсм/кг до 400 мОсм/кг, 240-360 мОсм/кг или в диапазоне 290-310 мОсм/кг.

[0375] Иммуногенная фармацевтическая композиция может содержать один или более буферов, таких как буфер Трис, боратный буфер, сукцинатный буфер, гистидиновый буфер (в частности, с адъювантом гидроксидом алюминия) или цитратный буфер. В некоторых случаях буферы включают в диапазоне 5-20 или 10-50 мМ.

[0376] pH иммуногенной фармацевтической композиции может составлять от приблизительно 5,0 до приблизительно 8,5, от приблизительно 6,0 до приблизительно 8,0, от приблизительно 6,5 до приблизительно 7,5 или от приблизительно 7,0 до приблизительно 7,8.

[0377] Иммуногенная фармацевтическая композиция может являться стерильной. Иммуногенная фармацевтическая композиция может являться непирогенной, например, содержащей <1 ЕЭ (единицы эндотоксина, стандартная мера) на дозу, и может содержать <0,1 ЕЭ на дозу. Композиция может не содержать глютен.

[0378] Иммуногенная фармацевтическая композиция может включать детергент, например, поверхностно-активное вещество сложный эфир полиоксиэтилена и сорбитана (известное как "Tween") или октоксинол (такой как октоксинол-9 (Triton X-100) или t-октилфеноксиполиэтоксиэтанол). Детергент может присутствовать лишь в незначительных количествах. Иммуногенная фармацевтическая композиция может включать менее 1 мг/мл каждого из октоксинола-10 и полисорбата 80. Другими остаточными компонентами в незначительных количествах могут являться антибиотики (например, неомицин, канамицин, полимиксин B).

[0379] Иммуногенную фармацевтическую композицию можно составлять в виде стерильного раствора или суспензии в подходящих носителях, хорошо известных в этой области. Фармацевтические композиции можно стерилизовать общепринятыми, хорошо известными способами стерилизации или можно стерилизовать фильтрацией. Получаемые водные растворы можно упаковывать для использования в исходном виде или лиофилизированными, при этом лиофилизированный препарат комбинируют со стерильным раствором перед введением.

[0380] Фармацевтические композиции, содержащие, например, активное средство, такое как иммунные клетки, представленные в настоящем описании, в комбинации с одним или более адъювантами, можно составлять так, чтобы они имели некоторые молярные соотношения. Например, можно использовать молярные соотношения от приблизительно 99:1 до приблизительно 1:99 активного средства, такого как иммунная клетка, представленная в настоящем описании, в комбинации с одним или более адъювантами. В некоторых случаях можно выбирать диапазон молярным соотношений активного средства, такого как иммунная клетка, представленная в настоящем описании, в комбинации с одним или более адъювантами от приблизительно 80:20 до приблизительно 20:80; от приблизительно 75:25 до приблизительно 25:75, от приблизительно 70:30 до приблизительно 30:70, от приблизительно 66:33 до приблизительно 33:66, от приблизительно 60:40 до приблизительно 40:60; приблизительно 50:50; и от приблизительно 90:10 до приблизительно 10:90. Молярное соотношение активного средства, такого как иммунная клетка, представленная в настоящем описании, в комбинации с одним или более адъювантами может составлять приблизительно 1:9, и в некоторых случаях может составлять приблизительно 1:1. Активное средство, такое как иммунная клетка, представленная в настоящем описании, в комбинации с одним или более адъювантами можно составлять вместе, в одной единице дозирования, например, в одном флаконе, суппозитории, таблетке, капсуле, аэрозоле; или каждое средство, форму и/или соединение можно составлять в отдельных единицах, например, двух флаконах, суппозиториях, таблетках, двух капсулах, таблетке и флаконе, аэрозоле и т.п.

[0381] В некоторых случаях иммуногенную фармацевтическую композицию можно вводить с дополнительным средством. Выбор дополнительного средства может зависеть по меньшей мере частично от состояния, подвергаемого лечению. Дополнительное средство может включать, например, ингибитор контрольных точек, такой как средство против PD1, против CTLA4, против PD-L1, против CD40 или против TIM3 (например, антитело против PD1, против CTLA4, против PD-L1, против CD40 или против TIM3); или любые средства, имеющие терапевтический эффект в отношении патогенной инфекции (например вирусной инфекции), включая, например, лекарственные средства, используемые для лечения воспалительных состояний, такие как НПВС, например, ибупрофен, напроксен, ацетаминофен, кетопрофен или аспирин. Например, ингибитор контрольных точек может являться антагонистом PD-1/PD-L1, выбранным из группы, состоящей из: ниволумаба (ONO-4538/BMS-936558, MDX1 106, OPDIVO), пембролизумаба (MK-3475, KEYTRUDA), пидилизумаба (CT-011), и MPDL328OA (ROCHE). В качестве другого примера, составы могут дополнительно содержать одну или более добавок, такие как витамин C, E или другие антиоксиданты.

[0382] Фармацевтическую композицию, содержащую активное средство, такое как иммунная клетка, представленная в настоящем описании, в комбинации с одним или более адъювантами, можно составлять общепринятым способом с использованием одного или более физиологически приемлемых носителей, включающих эксципиенты, дилюенты и/или вспомогательные средства, например, облегчающие переработку активных средств в препараты, которые можно вводить. Правильный состав может зависеть по меньшей мере частично от выбранного пути введения. Средства, представленные в настоящем описании, можно вводить пациенту с использованием ряда путей или способов введения, включая пероральный, буккальный, местный, ректальный, трансдермальный, чрезслизистый, подкожный, внутривенный и внутримышечный путь, а также посредством ингаляции.

[0383] Активные средства можно составлять для парентерального введения (например, посредством инъекции, например, болюсной инъекции или непрерывной инфузии) и в стандартной лекарственной форме в ампулах, предварительно наполненных шприцах, инфузии небольшого объема или многодозовых контейнерах с добавленным консервантом. Композиции могут иметь такую форму, как суспензии, растворы или эмульсии в масляных или водных носителях, например, растворах в водном полиэтиленгликоле.

[0384] В случае инъецируемых составов носитель можно выбирать из носителей, которые, как известно в этой области, являются подходящими, включая водные растворы, или масляные суспензии, или эмульсии с сезамовым маслом, кукурузным маслом, хлопковым маслом или арахисовым маслом, а также эликсиры, маннита, декстрозы или стерильный водный раствор и схожие фармацевтические носители. Состав также может содержать полимерные композиции, являющиеся биосовместимыми, биодеградируемыми, такими как полимер молочной и гликолевой кислот. Из этих материалов можно получать микросферы или наносферы, нагруженные лекарственным средством и дополнительно покрытые или дериватизированные для обеспечения лучших свойств замедленного высвобождения. Носители, подходящие для окологлазной или внутриглазной инъекции, включают, например, суспензии терапевтического средства в воде для инъекций, липосомы и носители, подходящие для липофильных веществ. Другие носители для окологлазной или внутриглазной инъекции хорошо известны в этой области.

[0385] В некоторых случаях фармацевтическую композицию составляют общепринятыми способами в виде фармацевтической композиции, адаптированной для внутривенного введения людям. Как правило, композиции для внутривенного введения представляют собой растворы в стерильном изотоническом водном буфере. При необходимости, композиция также может включать солюбилизатор и местный анестетик, такой как лидокаин, для облегчения боли в месте инъекции. Как правило, ингредиенты добавляют раздельно или смешивают в стандартной лекарственной форме, например, в виде сухого лиофилизированного порошка или безводного концентрата в герметически запаянном контейнере, таком как ампула или саше, на которых указано количество активного средства. Если композиция предназначена для введения посредством инфузии, ее можно распределять с помощью инфузионного флакона, содержащего стерильную воду фармацевтической категории или физиологический раствор. Если композиция предназначена для введения посредством инъекции, можно предоставлять ампулу стерильной воды для инъекций или физиологического раствора таким образом, что ингредиенты можно смешивать перед введением.

[0386] Если введение осуществляют посредством инъекции, активное средство можно составлять в водных растворах, в частности, в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Хенкса, раствор Рингера или забуференный физиологический раствор. Раствор может содержать вспомогательные средства, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие средства. В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция не содержит адъювант или любое другое вещество, добавляемое для усиления иммунного ответа, стимулированного с помощью пептида.

[0387] В дополнение к описанным выше составам, активные средства также можно составлять в виде препарата-депо. Такие составы длительного действия можно вводить посредством имплантации или чрескожного введения (например, подкожного или внутримышечного), внутримышечной инъекции или с использованием трансдермального пластыря. Таким образом, например, средства можно составлять с подходящими полимерными или гидрофобными материалами (например, в виде эмульсии в приемлемом масле) или ионообменными смолами или в виде умеренно растворимых производных, например, умеренно растворимой соли.

[0388] В некоторых случаях фармацевтические композиции, содержащие одно или более средств, вызывают локальные и местные эффекты при местном введении или инъецировании в конкретные очаги инфекции или вблизи них. Прямое местное нанесение, например, вязкой жидкости, раствора, суспензии, растворов на основе диметилсульфоксида (DMSO), липосомальных составов, геля, желе, крема, лосьона, мази, суппозитория, пены или аэрозоля, можно использовать для местного введения для достижения, например, локальных и/или местных эффектов. Фармацевтически приемлемые носители для такого состава включают, например, низшие алифатические спирты, полигликоли (например, глицерин или полиэтиленгликоль), сложные эфиры жирных кислот, масла, жиры, силиконы и т.п. Такие препараты также могут включать консерванты (например, сложные эфиры p-гидроксибензойной кислоты) и/или антиоксиданты (например, аскорбиновую кислоту и токоферол). Также см. Dermatological Formulations: Percutaneous absorption, Barry (Ed.), Marcel Dekker Incl, 1983. В другом варианте осуществления местные составы, содержащие транспортер, носитель или ингибитор ионных каналов, используют для лечения вирусных инфекций эпидермиса или слизистых оболочек.

[0389] Фармацевтические композиции могут содержать вспомогательные вещества, такие как гидрофильные или липофильные желирующие средства, гидрофильные или липофильные активные средства, консерванты, антиоксиданты, растворители, ароматизаторы, наполнители, солнцезащитные средства, поглотители запахов и красители. Количества этих различных вспомогательных веществ являются количествами, общепринято используемыми в это области, и, например, составляют от приблизительно 0,01% до приблизительно 20% от общей массы композиции. В зависимости от своей природы, эти вспомогательные вещества можно включать в жировую фазу, водную фазу и/или липидные везикулы.

Способы лечения

[0390] Настоящее изобретение относится также к способам лечения индивидуума с заболеванием, нарушением или состоянием. Способ лечения может включать введение композиции или фармацевтической композиции, представленной в настоящем описании, индивидууму с заболеванием, нарушением или состоянием.

[0391] Настоящее изобретение относится к способам лечения, включающим иммуногенную терапию. Настоящее изобретение относится к способам лечения заболевания (такого как злокачественное новообразование или вирусная инфекция). Способ может включать введение индивидууму эффективного количества композиции, содержащей иммуногенные антигенспецифические T-клетки, способами, представленными в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления антиген включает вирусный антиген. В некоторых вариантах осуществления антиген включает опухолевый антиген.

[0392] Неограничивающие примеры терапевтических средств, которые можно получать, включают терапевтическое средство на основе пептида, терапевтическое средство на основе нуклеиновой кислоты, терапевтическое средство на основе антитела, терапевтическое средство на основе T-клеток и терапевтическое средство на основе антигенпрезентирующих клеток.

[0393] В некоторых других аспектах настоящее изобретение относится к применению композиции или фармацевтической композиции для производства лекарственного средства для применения в терапии. В некоторых вариантах осуществления способ лечения включает введение индивидууму эффективного количества T-клеток, специфически распознающих иммуногенный неоантигенный пептид. В некоторых вариантах осуществления способ лечения включает введение индивидууму эффективного количества TCR, специфически распознающего иммуногенный неоантигенный пептид, такого как TCR, экспрессирующийся в T-клетке.

[0394] В некоторых вариантах осуществления злокачественное новообразование выбрано из группы, состоящей из карциномы, лимфомы, бластомы, саркомы, лейкоза, плоскоклеточного рака, рака легких (включая, мелкоклеточный рак легких, немелкоклеточный рак легких, аденокарциному легких и плоскоклеточную карциному легких), рака брюшины, печеночно-клеточного рака, рака желудка (включая злокачественное новообразование желудочно-кишечного тракта), рака поджелудочной железы, глиобластомы, рака шейки матки, рака яичников, рака печени, рака мочевого пузыря, гепатомы, рака молочной железы, рака толстого кишечника, меланомы, карциномы эндометрия или матки, карциномы слюнной железы, рака почки, рака печени, рака предстательной железы, рака женских наружных половых органов, рака щитовидной железы, печеночной карциномы, рака головы и шеи, колоректального рака, рака прямой кишки, саркомы мягких тканей, саркомы Капоши, B-клеточной лимфомы (включая низкодифференцированную/фолликулярную неходжкинскую лимфому (NHL), мелкоклеточную лимфоцитарную (SL) NHL, NHL промежуточной степени злокачественности/фолликулярную NHL, диффузную NHL промежуточной степени злокачественности, иммунобластную NHL высокой степени злокачественности, лимфобластную NHL высокой степени злокачественности, мелкоклеточную NHL с нерассеченными ядрами высокой степени злокачественности, NHL с массивным поражением лимфатических узлов, лимфому из клеток мантийной зоны, СПИД-ассоциированную лимфому и макроглобулинемию Вальденстрема), хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL), острого лимфобластного лейкоза (ALL), миеломы, волосатоклеточного лейкоза, хронического миелобластного лейкоза и посттрансплантационного лимфопролиферативного синдрома (PTLD), аномальной пролиферации сосудов, ассоциированной с факоматозом, отека, синдрома Мейгса и их комбинаций.

[0395] Способы, представленные в настоящем описании, особенно полезны в контексте персонализированной медицины, когда иммуногенные неоантигенные пептиды, идентифицированные способами, представленными в настоящем описании, используют для разработки терапевтических средств (таких как вакцины или терапевтических антител) для того же индивидуума. Таким образом, способ лечения заболевания у индивидуума может включать идентификацию иммуногенного неоантигенного пептида у индивидуума способами, представленными в настоящем описании, и синтез пептида (или его предшественника), и производство T-клеток, специфических для идентифицированных неоантигенов, и введение неоантиген-специфических T-клеток индивидууму.

[0396] Средства и композиции, представленные в настоящем описании, можно использовать в отдельности или в комбинации с общепринятыми схемами лечения, такими как хирургическое вмешательство, лучевая терапия, химиотерапия и/или трансплантация костного мозга (аутологичного, сингенного, аллогенного или неродственного). Набор опухолевых антигенов можно идентифицировать способами, представленными в настоящем описании, и можно использовать их, например, для значительной части пациентов со злокачественными новообразованиями.

[0397] В некоторых вариантах осуществления, в дополнение к композиции, содержащей иммуногенное терапевтическое средство можно вводить по меньшей мере одно или более химиотерапевтических средств. В некоторых вариантах осуществления одно или более химиотерапевтических средств могут принадлежать к разным классам химиотерапевтических средств.

[0398] В практическом осуществлении способов лечения или применения, представленных в настоящем описании, терапевтически эффективные количества терапевтических средств можно вводить индивидууму, имеющему заболевание или состояние. Терапевтически эффективное количество может варьироваться в широких пределах в зависимости от тяжести заболевания, возраста и относительного состояния здоровья индивидуума, активности используемых соединений и других факторов.

[0399] Индивидуумами могут являться, например, млекопитающее, люди, беременные женщины, пожилые люди, взрослые люди, подростки, предподростки, дети, дети младшего возраста, младенцы или новорожденные. Индивидуум может являться пациентом. В некоторых случаях индивидуум может являться человеком. В некоторых случая индивидуум может являться ребенком (т.е. молодым человеком, недостигшим возраста полового созревания). В некоторых случаях индивидуум может являться младенцем. В некоторых случаях индивидуум может являться младенцем на искусственном вскармливании. В некоторых случаях индивидуум может являться индивидуумом, включенным в клиническое исследование. В некоторых случаях индивидуум может являться лабораторным животным, например, млекопитающим, или грызуном. В некоторых случаях индивидуум может являться мышью. В некоторых случаях, индивидуум может страдать ожирением или иметь лишний вес.

[0400] В некоторых вариантах осуществления индивидуума раньше лечили с использованием одного или более разных способов лечения злокачественных новообразований. В некоторых вариантах осуществления индивидуума ранее лечили с использованием одного или более из лучевой терапии, химиотерапии или иммунотерапии. В некоторых вариантах осуществления индивидуума лечили с использованием одной, двух, трех, четырех или пяти линий предшествующей терапии. В некоторых вариантах осуществления предшествующая терапия является цитотоксической терапией.

[0401] В некоторых вариантах осуществления заболевание или состояние, которое можно подвергать лечению способами, представленными в настоящем описании, является злокачественным новообразованием. Злокачественное новообразование представляет собой аномальный рост клеток, имеющих склонность к пролиферации неконтролируемым образом и, в некоторых случаях, к метастазированию (распространению). Опухоль может являться злокачественной или доброкачественной. Термин "доброкачественная опухоль" означает, что опухоль может расти, но не распространяется. Термин "злокачественная опухоль" означает, что опухоль может расти и распространяться в другие части организма. Если злокачественное новообразование распространяется (метастазирует), новая опухоль имеет тоже название, что и исходная (первичная) опухоль.

[0402] Способы по настоящему изобретению можно использовать для лечения любого типа злокачественного новообразования, известного в этой области. Неограничивающие примеры злокачественных новообразований, которые можно лечить способами по настоящему изобретению, могут включать меланому (например, метастазирующую злокачественную меланому), рак почки (например, светлоклеточную карциному), рак предстательной железы (например, гормонально-рефрактерную аденокарциному предстательной железы), аденокарциному поджелудочной железы, рак молочной железы, рак толстого кишечника, рак легких (например, немелкоклеточный рак легких), рак пищевода, плоскоклеточную карциному головы и шеи, рак печени, рак яичников, рак шейки матки, рак щитовидной железы, глиобластому, глиому, лейкоз, лимфому и другие злокачественные новообразования.

[0403] Кроме того, заболевание или состояние, представленное в настоящем описании, включает рефрактерные или рецидивирующие злокачественные новообразования, рост которых можно ингибировать способами лечения по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления злокачественное новообразование, которое можно лечить способами лечения по настоящему изобретению, выбрано из группы, состоящей из карциномы, плоскоклеточной карциномы, аденокарциномы, саркомы, рака эндометрия, рака молочной железы, рака яичников, рака шейки матки, рака фаллопиевых труб, первичного рака брюшины, рака толстого кишечника, колоректального рака, плоскоклеточной карциномы аногенитальной области, меланомы, почечноклеточной карциномы, рака легких, немелкоклеточного рака легких, плоскоклеточной карциномы легких, рака желудка, рака мочевого пузыря, рака желчного пузыря, рака печени, рака щитовидной железы, рака гортани, рака слюнных желез, рака пищевода, рака головы и шеи, глиобластомы, глиомы, плоскоклеточной карциномы головы и шеи, рака предстательной железы, рака поджелудочной железы, мезотелиомы, саркомы, гемобластоза, лейкоза, лимфомы, невромы и их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления злокачественное новообразование, которое можно лечить способами по настоящему изобретению, включают, например, карциному, плоскоклеточную карциному (например, канала шейки матки, века, конъюнктивы, влагалища, легких, ротовой полости, кожи, мочевого пузыря, языка, гортани и глотки) и аденокарциному (например, предстательной железы, тонкого кишечника, эндометрия, канала шейки матки, толстого кишечника, легких, поджелудочной железы, глотки, прямой кишки, матки, желудка, молочной железы и яичника). В некоторых вариантах осуществления злокачественное новообразование, которое можно лечить способами по настоящему изобретению, дополнительно включает саркому (например, миогенную саркому), лейкоз, неврому, меланому и лимфому. В некоторых вариантах осуществления злокачественное новообразование, которое можно лечить способами по настоящему изобретению, является раком молочной железы. В некоторых вариантах осуществления злокачественное новообразование, которое можно лечить способами лечения по настоящему изобретению, является трижды негативным раком молочной железы (TNBC). В некоторых вариантах осуществления злокачественное новообразование, которое можно лечить способами лечения по настоящему изобретению, является раком яичников. В некоторых вариантах осуществления злокачественное новообразование, которое можно лечить способами лечения по настоящему изобретению, является колоректальным раком.

[0404] В некоторых вариантах осуществления пациент или популяция пациентов, которых можно лечить с помощью фармацевтической композиции по настоящему изобретению, имеют солидную опухоль. В некоторых вариантах осуществления солидная опухоль является меланомой, почечноклеточной карциномой, раком легких, раком мочевого пузыря, раком молочной железы, раком шейки матки, раком толстого кишечника, раком желчного пузыря, раком гортани, раком печени, раком щитовидной железы, раком желудка, раком слюнных желез, раком предстательной железы, раком поджелудочной железы или карциномой клеток Меркеля. В некоторых вариантах осуществления пациент или популяция пациентов, которых можно лечить с помощью фармацевтической композиции по настоящему изобретению, имеют гемобластоз. В некоторых вариантах осуществления пациент имеет гемобластоз, такой как диффузная крупноклеточная B-клеточная лимфома ("DLBCL"), лимфома Ходжкина ("HL"), неходжкинская лимфома ("NHL"), фолликулярная лимфома ("FL"), острый миелолейкоз ("AML") или множественная миелома ("MM"). В некоторых вариантах осуществления пациент или популяция пациентов, которых можно лечить, имеют злокачественное новообразование, выбранное из группы, состоящей из рака яичников, рака легких и меланомы.

[0405] Конкретные неограничивающие примеры злокачественных новообразований, которые можно подвергать профилактике и/или лечению по настоящему изобретению, включают следующие: рак почки, рак почки, мультиформную глиобластому, метастазирующий рак молочной железы; карциному молочной железы; саркому молочной железы; нейрофиброму; нейрофиброматоз; опухоли детского возраста; нейробластому; злокачественную меланому; карциномы эпидермиса; лейкозы, такие как, в качестве неограничивающих примеров, острый лейкоз, острый лимфоцитарный лейкоз, острые миелоцитарные лейкозы, такие как миелобластный, промиелоцитарный, миеломоноцитарный, моноцитарный лейкоз, эритролейкоз и миелодиспластический синдром, хронические лейкозы, такие как, в качестве неограничивающих примеров, хронический миелоцитарный (гранулоцитарный) лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, волосатоклеточный лейкоз; истинную полицитемию; лимфомы, такие как, в качестве неограничивающих примеров, лимфома Ходжкина, неходжкинская лимфома; множественные миеломы, такие как, в качестве неограничивающих примеров, вялотекущая множественная миелома, несекреторная миелома, остеосклеротическая миелома, плазмоцитарный лейкоз, солитарная плазмоцитома и экстрамедуллярная плазмоцитома; макроглобулинемию Вальденстрема; моноклональную гаммапатию неясного генеза; доброкачественную моноклональную гаммапатию; болезнь тяжелых цепей; злокачественное новообразование костной ткани и саркомы соединительной ткани, такие как, в качестве неограничивающих примеров, саркома костей, миеломная болезнь костей, множественная миелома, вызванная холестеатомой остеосаркома костей, болезнь Педжета, остеосаркома, хондросаркома, саркома Юинга, злокачественная гигантоклеточная опухоль, фибросаркома костей, хордома, саркома надкостницы, саркомы мягких тканей, ангиосаркома (гемангиосаркома), фибросаркома, саркома Капоши, лейомиосаркома, липосаркома, лимфангиосаркома, неврилеммома, рабдомиосаркома и синовиальная саркома; опухоли головного мозга, такие как, в качестве неограничивающих примеров, глиома, астроцитома, глиома ствола мозга, эпендимома, олигодендроглиома, неглиальная опухоль, невринома слухового нерва, краниофарингиома, медуллобластома, менингиома, пинеоцитома, пинеобластома и первичная лимфома головного мозга; рак молочной железы, включая, в качестве неограничивающих примеров, аденокарциному, дольковую (мелкоклеточную) карциному, внутрипротоковую карциному, медуллярный рак молочной железы, слизистый рак молочной железы, тубулярный рак молочной железы, папиллярный рак молочной железы, болезнь Педжета (включая ювенильную болезнь Педжета) и воспалительный рак молочной железы; рак надпочечника, такой как, в качестве неограничивающих примеров, феохромоцитома и карцинома надпочечника; рак щитовидной железы, такой как, в качестве неограничивающих примеров, папиллярный или фолликулярный рак щитовидной железы, медуллярный рак щитовидной железы и анапластический рак щитовидной железы; рак поджелудочной железы, такой как, в качестве неограничивающих примеров, инсулома, гастринома, глюкагонома, ВИПома, соматостатин-секретирующая опухоль и карциноид или опухоль островков поджелудочной железы; злокачественные новообразования гипофиза, такие как, в качестве неограничивающих примеров, болезнь Кушинга, пролактин-секретирующая опухоль, акромегалия и несахарный диабет; злокачественные новообразования глаза, такие как, в качестве неограничивающих примеров, меланома глаза, такая как меланома радужной оболочки, хороидальная меланома, меланома ресничного тела и ретинобластома; злокачественные новообразования влагалища, такие как плоскоклеточная карцинома, аденокарцинома и меланома; рак женских наружных половых органов, такой как плоскоклеточная карцинома, меланома, аденокарцинома, базально-клеточная карцинома, саркома и болезнь Педжета; рак шейки матки, такой как, в качестве неограничивающих примеров, плоскоклеточная карцинома и аденокарцинома; рак матки, такой как, в качестве неограничивающих примеров, карцинома эндометрия и саркома матки; рак яичников, такой как, в качестве неограничивающих примеров, эпителиальная карцинома яичника, пограничная опухоль, герминома и стромальная опухоль; карциному шейки матки; рак пищевода, такой как, в качестве неограничивающих примеров, плоскоклеточный рак, аденокарцинома, аденокистозная карцинома, мукоэпидермоидная карцинома, железисто-плоскоклеточная карцинома, саркома, меланома, плазмоцитома, бородавчатая карцинома и овсяноклеточная (мелкоклеточная) карцинома; рак желудка, такой как, в качестве неограничивающих примеров, аденокарцинома, грибовидный рост (полипоид), изъязвление, поверхностное распространение, диффузное распространение, злокачественную лимфому, липосаркому, фибросаркому и карциносаркому; рак толстого кишечника; колоректальный рак, KRAS-мутантный колоректальный рак; карциному толстого кишечника; рак прямой кишки; рак печени, такой как, в качестве неограничивающих примеров, печеночноклеточная карцинома и гепатобластома, рак желчного пузыря, такой как аденокарцинома; холангиокарциному, такую как, в качестве неограничивающих примеров, папиллярная, нодулярная и диффузная холангиокарцинома; рак легких, такой как KRAS-мутантный немелкоклеточный рак легких, немелкоклеточный рак легких, плоскоклеточная карцинома (эпидермоидная карцинома), аденокарцинома, крупноклеточная карцинома и мелкоклеточный рак легких; карциному легких; рак яичка, такой как, в качестве неограничивающих примеров, герминома, семинома, анапластическая, классическая (типичная), сперматоцитарная семинома, несеминомная опухоль, эмбриональная карцинома, тератома, хориокарцинома (опухоль желточного мешка), рак предстательной железы, такой как, в качестве неограничивающих примеров, андрогеннезависимый рак предстательной железы, андрогензависимый рак предстательной железы, аденокарцинома, лейомиосаркома и рабдомиосаркома; рак полового члена; рак ротовой полости, такой как, в качестве неограничивающих примеров, плоскоклеточная карцинома; базальноклеточный рак; рак слюнных желез, такой как, в качестве неограничивающих примеров, аденокарцинома, мукоэпидермоидная карцинома и железисто-кистозная карцинома; рак глотки, такой как, в качестве неограничивающих примеров, плоскоклеточный рак и веррукозная карцинома; рак кожи, такой как, в качестве неограничивающих примеров, базальноклеточная карцинома, плоскоклеточная карцинома и меланома, поверхностная распространяющаяся меланома, нодулярная меланома, лентиго-меланома, акральная лентигинозная меланома; рак почки, такой как, в качестве неограничивающих примеров, почечноклеточный рак, аденокарцинома, гипернефрома, фибросаркома, переходноклеточный рак (почечной лоханки и/или мочеточника); карциному почки; опухоль Вильмса; рак мочевого пузыря, такой как, в качестве неограничивающих примеров, переходноклеточная карцинома, плоскоклеточный рак, аденокарцинома, карциносаркома. Кроме того, злокачественные новообразования включают миксосаркому, остеогенную саркому, эндотелиосаркому, лимфангиоэндотелиосаркому, мезотелиому, синовиому, гемангиобластому, эпителиальную карциному, цистаденокарциному, бронхогенную карциному, карциному потовых желез, карциному сальных желез, папиллярную карциному и папиллярные аденокарциномы.

Наборы

[0406] Способы и композиции, представленные в настоящем описании, можно предоставлять в форме набора вместе с инструкциями по введению. Как правило, набор может включать желаемые неоантигенные терапевтические композиции в контейнере, в стандартной лекарственной форме и инструкции по введению. В набор можно включать дополнительные терапевтические средства, например, цитокины, лимфокины, ингибиторы контрольных точек, антитела. Другие компоненты набора, которые также могут являться желательными, включают, например, стерильный шприц, бустерные дозы и другие желаемые эксципиенты.

[0407] Настоящее изобретение также относится к наборам и изделиям для применения с одним или более способами, представленными в настоящем описании. Наборы могут содержать один или более типов иммунных клеток. Наборы также могут содержать реагенты, пептиды и/или клетки, которые можно использовать для получения антигенспецифических иммунных клеток (например, неоантиген-специфических T-клеток), как представлено в настоящем описании. Наборы могут дополнительно содержать адъюванты, реагенты и буферы, необходимые для получения и введения антигенспецифических иммунных клеток.

[0408] Наборы также могут включать носитель, упаковку или контейнер, компартментализованный для включения одного или более контейнеров, таких как флаконы, пробирки и т.п., при этом каждый из контейнеров содержит один из отдельных элементов, таких как полипептиды и адъюванты, предназначенные для использования в способе, представленном в настоящем описании. Подходящие контейнеры включают, например, бутыли, флаконы, шприцы и пробирки. Контейнеры можно получать из различных материалов, таких как стекло или пластик.

[0409] Изделия, представленные в настоящем описании, содержат упаковочные материалы. Неограничивающие примеры фармацевтических упаковочных материалов включают блистерные упаковки, бутыли, пробирки, пакеты, контейнеры, бутыли и упаковочный материал, подходящий для выбранного состава и предполагаемого способа введения и лечения. Как правило, набор включает ярлыки, на которых указано содержимое и/или инструкции по использованию, и вкладыш в упаковку с инструкциями по использованию. Также можно включать набор инструкций.

Варианты осуществления

[1] Фармацевтическая композиция, содержащая: (a) популяцию иммунных клеток из биологического образца, содержащую по меньшей мере одну антигенспецифическую T-клетку, содержащую T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, и (b) фармацевтически приемлемый эксципиент; где количество иммунных клеток, экспрессирующих CD14 и/или CD25, в популяции пропорционально отличается от количества иммунных клеток, экспрессирующих CD14 и/или CD25, в биологическом образце.

[2] Композиция, содержащая популяцию иммунных клеток из биологического образца, где количество иммунных клеток, экспрессирующих CD14 и CD25, в популяции пропорционально меньше количества иммунных клеток, экспрессирующих CD14 и CD25, в биологическом образце.

[3] Фармацевтическая композиция, содержащая (a) популяцию иммунных клеток, содержащую T-клетки из биологического образца, где T-клетки включают по меньшей мере одну антигенспецифическую T-клетку, являющуюся APC-стимулированной T-клеткой и содержащую T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, где APC является FLT3L-стимулированной APC; и (b) фармацевтически приемлемый эксципиент.

[4] Композиция по п.[1], где по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка включает по меньшей мере одну APC-стимулированную T-клетку.

[5] Композиция по любому из пп.[1], [3] и [4], где количество иммунных клеток, экспрессирующих CD14 и/или CD25, в популяции пропорционально меньше количества иммунных клеток, экспрессирующих CD14 и/или CD25, в биологическом образце.

[6] Композиция по любому из пп.[1], [3] и [4], где количество иммунных клеток, экспрессирующих CD14 и/или CD25, в популяции пропорционально больше количества иммунных клеток, экспрессирующих CD14 и/или CD25, в биологическом образце.

[7] Композиция по любому из пп.[1]-[6], где биологический образец получают из индивидуума.

[8] Композиция по п.[7], где индивидуум является человеком.

[9] Композиция по п.[7] или [8], где индивидуум имеет заболевание или нарушение.

[10] Композиция по п.[9], где заболевание или нарушение является злокачественным новообразованием.

[11] Композиция по п.[10], где злокачественное новообразование выбрано из группы, состоящей из рака яичников, рака легких и меланомы.

[12] Композиция по любому из пп.[1]-[11], где по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка включает по меньшей мере одну CD4⁺ T-клетку.

[13] Композиция по любому из пп.[1]-[12], где по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка включает по меньшей мере одну CD8⁺ T-клетку.

[14] Композиция по любому из пп.[1]-[13], где по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка включает по меньшей мере одну CD4-обогащенную T-клетку.

[15] Композиция по любому из пп.[1]-[14], где по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка включает по меньшей мере одну CD8-обогащенную T-клетку.

[16] Композиция по любому из пп.[1]-[15], где по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка включает T-клетку памяти.

[17] Композиция по любому из пп.[1]-[16], где по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка включает наивную T-клетку.

[18] Композиция по любому из пп.[1]-[17], где по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка включает CD4⁺ T-клетку памяти.

[19] Композиция по любому из пп.[1]-[18], где по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка включает наивную CD4⁺ T-клетку.

[20] Композиция по любому из пп.[1]-[19], где по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка включает CD8⁺ T-клетку памяти.

[21] Композиция по любому из пп.[1]-[20], где по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка включает наивную CD8⁺ T-клетку.

[22] Композиция по любому из пп.[1]-[21], где по меньшей мере одна пептидная последовательность антигена содержит мутацию, выбранную из (A) точечной мутации, (B) мутации участка сплайсинга, (C) мутации со сдвигом рамки считывания, (D) мутации сквозного прочитывания терминатора, (E) мутации со слиянием генов и их комбинаций.

[23] Композиция по любому из пп.[1]-[22], где по меньшей мере одна пептидная последовательность антигена связывается с белком HLA индивидуума с большей аффинностью, чем соответствующий пептид дикого типа.

[24] Композиция по любому из пп.[1]-[23], где по меньшей мере одна пептидная последовательность антигена связывается с белком HLA индивидуума с K_D или IC₅₀ менее 500 нМ, 250 нМ, 150 нМ, 100 нМ, 50 нМ, 25 нМ или 10 нМ.

[25] Композиция по любому из пп.[1]-[24], где каждая из по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена связывается с белком, кодируемым аллелем HLA, экспрессируемым индивидуумом.

[26] Композиция по любому из пп.[1]-[25], где TCR связывается с комплексом пептид-HLA с K_D или IC₅₀ менее 500 нМ, 250 нМ, 150 нМ, 100 нМ, 50 нМ, 25 нМ или 10 нМ.

[27] Композиция по любому из пп.[1]-[26], где каждая из по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена содержит мутацию, отсутствующую в незлокачественных клетках индивидуума.

[28] Композиция по любому из пп.[1]-[27], где каждая из по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена кодируется геном или экспрессируемым геном злокачественных клеток индивидуума.

[29] Композиция по любому из пп.[1]-[28], где одна или более из по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена имеет длину по меньшей мере, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 4000, 5000, 7500 или 10000 природных аминокислот.

[30] Композиция по любому из пп.[1]-[29], где одна или более из по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена связывается с белком, кодируемым аллелем HLA класса I и имеет длину 8-12 природных аминокислот.

[31] Композиция по любому из пп.[1]-[30], где одна или более из по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена связывается с белком, кодируемым аллелем HLA класса II и имеет длину 16-25 природных аминокислот.

[32] Композиция по любому из пп.[1]-[31], где по меньшей мере одна пептидная последовательность антигена включает множество пептидных последовательностей антигена.

[33] Композиция по п.[32], где множество пептидных последовательностей антигена включает по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 или 500 пептидных последовательностей антигена.

[34] Композиция по п.[3]-[33], где APC представляет собой один или более препаратов APC.

[35] Композиция по любому из пп.[3]-[34], где APC является зрелой APC.

[36] Композиция по любому из пп.[3]-[35], где APC включает APC, нагруженные одним или более антигенными пептидами, содержащими одну или более из по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена.

[37] Композиция по любому из пп.[3]-[36], где APC является аутологичной APC, аллогенной APC или искусственной APC.

[38] Композиция по любому из пп.[3]-[37], где APC включает дендритную клетку (DC).

[39] Композиция по любому из пп.[4]-[38], где APC получают из CD14⁺ моноцита, или она является CD14-обогащенной APC или CD141-обогащенной APC.

[40] Композиция по п.[39], где CD14⁺ моноцит обогащают из биологического образца индивидуума, содержащего мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC).

[41] Композиция по п.[39] или [40], где CD14⁺ моноцит стимулируют одним или более цитокинами или факторами роста.

[42] Композиция по п.[41], где один или более цитокинов или факторов роста включают ГМ-КСФ, ИЛ-4, FLT3L, ФНОα, ИЛ-1β, PGE1, ИЛ-6, ИЛ-7, ИФНα, R848, LPS, ss-rna40, поли-I:C или их комбинацию.

[43] Композиция по любому из пп.[39]-[42], где CD14⁺ моноцит получают из второго биологического образца, содержащего PBMC.

[44] Композиция по п.[43], где второй биологический образец получают из того же индивидуума.

[45] Композиция по любому из пп.[1]-[44], где биологический образец содержит мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC).

[46] Композиция по любому из пп.[1] и [3]-[45], где по меньшей мере одну антигенспецифическую T-клетку стимулируют в среде, содержащей ИЛ-7, ИЛ-15, ингибитор индоламин-2,3-диоксигеназы-1 (IDO), антитело против PD-1, ИЛ-12 или их комбинацию.

[47] Композиция по п.[46], где ингибитор IDO является эпакадостатом, навоксимодом, 1-метилтриптофаном или их комбинацией.

[48] Композиция по любому из пп.[1]-[47], где процентная доля по меньшей мере одной антигенспецифической T-клетки в композиции составляет по меньшей мере приблизительно 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% всех T-клеток или всех иммунных клеток.

[49] Композиция по любому из пп.[1]-[48], где процентная доля по меньшей мере одной антигенспецифической CD8⁺ T-клетки в композиции составляет по меньшей мере приблизительно 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% всех CD4⁺ T-клеток, всех CD8⁺ T-клеток, всех T-клеток или всех иммунных клеток.

[50] Композиция по любому из пп.[1]-[49], где процентная доля по меньшей мере одной антигенспецифической CD4⁺ T-клетки в композиции составляет по меньшей мере приблизительно 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% всех CD4⁺ T-клеток, всех CD8⁺ T-клеток, всех T-клеток или всех иммунных клеток.

[51] Композиция по любому из пп.[1]-[50], где процентная доля по меньшей мере одной антигенспецифической T-клетки в биологическом образце составляет не более приблизительно 0,00001%, 0,00005%, 0,0001%, 0,0005%, 0,001%, 0,005%, 0,01%, 0,05%, 0,1% или 0,5% всех CD4⁺ T-клеток, всех CD8⁺ T-клеток, всех T-клеток или всех иммунных клеток.

[52] Композиция по любому из пп.[1]-[51], где процентная доля по меньшей мере одной антигенспецифической CD8⁺ T-клетки в биологическом образце составляет не более приблизительно 0,00001%, 0,00005%, 0,0001%, 0,0005%, 0,001%, 0,005%, 0,01%, 0,05%, 0,1% или 0,5% всех CD4⁺ T-клеток, всех CD8⁺ T-клеток, всех T-клеток или всех иммунных клеток.

[53] Композиция по любому из пп.[1]-[52], где процентная доля по меньшей мере одной антигенспецифической CD4⁺ T-клетки в биологическом образце составляет не более приблизительно 0,00001%, 0,00005%, 0,0001%, 0,0005%, 0,001%, 0,005%, 0,01%, 0,05%, 0,1% или 0,5% всех CD4⁺ T-клеток, всех CD8⁺ T-клеток, всех T-клеток или всех иммунных клеток.

[54] Композиция по любому из пп.[1]-[53], где антиген является неоантигеном, опухолеассоциированным антигеном, гиперэкспрессированным антигеном, вирусным антигеном, минорным антигеном гистосовместимости или их комбинацией.

[55] Композиция по любому из пп.[1]-[54], где количество по меньшей мере одной антигенспецифической CD8⁺ T-клетки в композиции составляет по меньшей мере приблизительно 1×10⁶, 2×10⁶, 5×10⁶, 1×10⁷, 2×10⁷, 5×10⁷, 1×10⁸, 2×10⁸ или 5×10⁸ антигенспецифических CD8⁺ T-клеток.

[56] Композиция по любому из пп.[1]-[54], где количество по меньшей мере одной антигенспецифической CD4⁺ T-клетки в композиции составляет по меньшей мере приблизительно 1×10⁶, 2×10⁶, 5×10⁶, 1×10⁷, 2×10⁷, 5×10⁷, 1×10⁸, 2×10⁸ или 5×10⁸ антигенспецифических CD4⁺ T-клеток.

[57] Композиция по любому из пп.[1]-[56], где по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка включает множество антигенспецифических T-клеток.

[58] Композиция по любому из пп.[1]-[57], где количество иммунных клеток, экспрессирующих CD19 и/или CD16, в популяции меньше количества иммунных клеток, экспрессирующих CD19 и/или CD16, в биологическом образце.

[59] Способ лечения, включающий введение композиции по любому из пп.[1] или [3]-[58] индивидууму с заболеванием или нарушением.

[60] Применение композиции по любому из пп.[1] или [3]-[58] для производства лекарственного средства для применения в терапии.

[61] Способ получения по меньшей мере одной антигенспецифической T-клетки, содержащей T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, включающий инкубацию APC с популяцией иммунных клеток из биологического образца, истощенного в отношении клеток, экспрессирующих CD14 и/или CD25.

[62] Способ получения по меньшей мере одной антигенспецифической T-клетки, содержащей T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, включающий инкубацию стимулированных лигандом FMS-подобной тирозинкиназы 3 (FLT3L) APC с популяцией иммунных клеток из биологического образца.

[63] Способ получения фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одну антигенспецифическую T-клетку, содержащую T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, включающий: (a) инкубацию лиганда FMS-подобной тирозинкиназы 3 (FLT3L) с популяцией иммунных клеток из биологического образца в течение первого периода времени; и (b) затем инкубацию по меньшей мере одной T-клетки из биологического образца с APC.

[64] Способ получения по меньшей мере одной антигенспецифической T-клетки, содержащей T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, включающий инкубацию популяции иммунных клеток из биологического образца с одним или более препаратами APC в течение одного или более отдельных периодов времени менее 28 дней после инкубации популяции иммунных клеток с первым препаратом APC из одного или более препаратов APC, где выращивают по меньшей мере одну антигенспецифическую T-клетку памяти или индуцируют по меньшей мере одну антигенспецифическую наивную T-клетку.

[65] Способ получения по меньшей мере одной антигенспецифической T-клетки, содержащей T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, включающий инкубацию популяции иммунных клеток из биологического образца с 3 или менее препаратами APC в течение 3 или менее отдельных периодов времени, где выращивают по меньшей мере одну антигенспецифическую T-клетку памяти или индуцируют по меньшей мере одну антигенспецифическую наивную T-клетку.

[66] Способ по любому из пп.[62]-[65], где популяцию иммунных клеток получают из биологического образца, истощенного в отношении CD14- и/или CD25-экспрессирующих клеток.

[67] Способ по п.[61] или [66], где биологический образец дополнительно истощают в отношении CD19-экспрессирующих клеток.

[68] Способ по п.[61] или [63], где APC является FLT3L-стимулированной APC.

[69] Способ по любому из пп.[64]-[67], где инкубацию популяции иммунных клеток осуществляют в среде, содержащей ИЛ-7, ИЛ-15 или их комбинацию.

[70] Способ по п.[69], где среда дополнительно содержит ингибитор индоламин-2,3-диоксигеназы-1 (IDO), антитело против PD-1, ИЛ-12 или их комбинацию.

[71] Способ по п.[70], где IDO ингибитор является эпакадостатом, навоксимодом, 1-метилтриптофаном или их комбинацией.

[72] Способ по любому из пп.[64]-[71], где по меньшей мере один из препаратов APC содержит FLT3L-стимулированные APC.

[73] Способ по любому из пп.[64]-[71], где по меньшей мере два из препаратов APC содержат FLT3L-стимулированные APC.

[74] Способ по любому из пп.[64]-[71], где по меньшей мере три из препаратов APC содержат FLT3L-стимулированные APC.

[75] Способ по любому из пп.[64]-[71], где каждый из препаратов APC содержит FLT3L-стимулированные APC.

[76] Способ по любому из пп.[61]-[63], где APC включает один или более препаратов APC.

[77] Способ по любому из пп.[61]-[76], где один или более препаратов APC включают 3 или менее препаратов APC.

[78] Способ по любому из пп.[64]-[77], где один или более препаратов APC инкубируют с иммунными клетками последовательно в течение одного или более отдельных периодов времени.

[79] Способ по любому из пп.[61]-[78], где по меньшей мере один из одного или более препаратов APC представляют собой APC из биологического образца.

[80] Способ по любому из пп.[61]-[79], где популяция иммунных клеток включает APC или по меньшей мере один из одного или более препаратов APC.

[81] Способ по любому из пп.[61]-[79], где популяция иммунных клеток не содержит APC, популяция иммунных клеток не содержит один из одного или более препаратов APC.

[82] Способ по любому из пп.[61]-[81], где способ включает инкубацию FLT3L и по меньшей мере одного пептида с популяцией иммунных клеток из биологического образца, где FLT3L инкубируют с популяцией иммунных клеток в течение первого периода времени, и где по меньшей мере один пептид инкубируют с популяцией иммунных клеток в течение первого периода стимуляции пептидом, и, таким образом, получение первого образца стимулированных T-клеток, где популяция иммунных клеток включает по меньшей мере одну T-клетку и по меньшей мере одну APC.

[83] Способ по п.[82], где способ включает инкубацию FLT3L и по меньшей мере одного пептида с по меньшей мере одной APC, где FLT3L инкубируют с по меньшей мере одной APC в течение второго периода времени, и где по меньшей мере один пептид инкубируют с по меньшей мере одной APC в течение второго периода стимуляции пептидом, и, таким образом, получение первого образца зрелых APC, нагруженных пептидом; и инкубацию первого образца зрелых APC, нагруженных пептидом, с первым образцом стимулированных T-клеток и, таким образом, получение второго образца стимулированных T-клеток.

[84] Способ по п.[83], где способ включает инкубацию FLT3L и по меньшей мере одного пептида с по меньшей мере одной APC, где FLT3L инкубируют с по меньшей мере одной APC в течение третьего периода времени, и где по меньшей мере один пептид инкубируют с по меньшей мере одной APC в течение третьего периода стимуляции пептидом, и, таким образом, получение второго образца зрелых APC, нагруженных пептидом; и инкубацию второго образца зрелых APC, нагруженных пептидом, со вторым образцом стимулированных T-клеток, и, таким образом, получение третьего образца стимулированных T-клеток.

[85] Способ по любому из пп.[61]-[84], где биологический образец получают из индивидуума.

[86] Способ по п.[85], где индивидуум является человеком.

[87] Способ по п.[85] или [86], где индивидуум имеет заболевание или нарушение.

[88] Способ по п.[87], где заболевание или нарушение является злокачественным новообразованием.

[89] Способ по п.[88], где злокачественное новообразование выбрано из группы, состоящей из рака яичников, рака легких и меланомы.

[90] Способ по любому из пп.[61]-[89], где по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка включает по меньшей мере одну CD4⁺ T-клетку.

[91] Способ по любому из пп.[61]-[90], где по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка включает по меньшей мере одну CD8⁺ T-клетку.

[92] Способ по любому из пп.[61]-[91], где по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка содержит по меньшей мере одну CD4-обогащенную T-клетку.

[93] Способ по любому из пп.[61]-[92], где по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка содержит по меньшей мере одну CD8-обогащенную T-клетку.

[94] Способ по любому из пп.[61]-[93], где по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка включает по меньшей мере одну T-клетку памяти.

[95] Способ по любому из пп.[61]-[94], где по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка включает по меньшей мере одну наивную T-клетку.

[96] Способ по любому из пп.[61]-[95], где по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка включает по меньшей мере одну CD4⁺ T-клетку памяти.

[97] Способ по любому из пп.[61]-[96], где по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка включает по меньшей мере одну наивную CD4⁺ T-клетку.

[98] Способ по любому из пп.[61]-[97], где по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка включает по меньшей мере одну CD8⁺ T-клетку памяти.

[99] Способ по любому из пп.[61]-[98], где по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка включает по меньшей мере одну наивную CD8⁺ T-клетку.

[100] Способ по любому из пп.[61]-[99], где по меньшей мере одна пептидная последовательность антигена содержит мутацию, выбранную из (A) точечной мутации, (B) мутации участка сплайсинга, (C) мутации со сдвигом рамки считывания, (D) мутации сквозного прочитывания терминатора, (E) мутации со слиянием генов и их комбинации.

[101] Способ по любому из пп.[61]-[100], где по меньшей мере одна пептидная последовательность антигена содержит точечную мутацию и связывается с белком HLA индивидуума с большей аффинностью, чем соответствующий пептид дикого типа.

[102] Способ по любому из пп.[61]-[101], где по меньшей мере одна пептидная последовательность антигена связывается с белком HLA индивидуума с IC₅₀ менее 500 нМ, 250 нМ, 150 нМ, 100 нМ, 50 нМ, 25 нМ или 10 нМ.

[103] Способ по любому из пп.[61]-[102], где каждая из по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена связывается с белком, кодируемым аллелем HLA, экспрессируемым индивидуумом.

[104] Способ по любому из пп.[61]-[103], где TCR связывается с комплексом пептид-HLA с K_D менее 500 нМ, 250 нМ, 150 нМ, 100 нМ, 50 нМ, 25 нМ или 10 нМ.

[105] Способ по любому из пп.[61]-[104], где каждая из по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена содержит мутацию, отсутствующую в незлокачественных клетках индивидуума.

[106] Способ по любому из пп.[61]-[105], где каждая из по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена кодируется геном или экспрессируемым геном злокачественных клеток индивидуума.

[107] Способ по любому из пп.[61]-[106], где одна или более из по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена имеет длину по меньшей мере, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 4000, 5000, 7500 или 10000 природных аминокислот.

[108] Способ по любому из пп.[61]-[107], где одна или более из по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена связывается с белком, кодируемым аллелем HLA класса I и имеет длину 8-12 природных аминокислот.

[109] Способ по любому из пп.[61]-[108], где одна или более из по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена связывается с белком, кодируемым аллелем HLA класса II и имеет длину 16-25 природных аминокислот.

[110] Способ по любому из пп.[61]-[109], где по меньшей мере одна пептидная последовательность антигена включает множество пептидных последовательностей антигена.

[111] Способ по п.[110], где множество пептидных последовательностей антигена включает по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 или 500 пептидных последовательностей антигена.

[112] Способ по любому из пп.[61]-[111], где APC или APC из препаратов APC включают APC, нагруженные одним или более антигенными пептидами, содержащими одну или более из по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена.

[113] Способ по любому из пп.[61]-[112], где APC или APC из препаратов APC являются аутологичными APC или аллогенными APC.

[114] Способ по любому из пп.[61]-[113], где APC или APC из препаратов APC включает дендритную клетку (DC).

[115] Способ по п.[114], где DC является CD141⁺ DC.

[116] Способ по любому из пп.[61]-[114], где способ включает истощение клеток, экспрессирующих CD14 и/или CD25, в биологическом образце.

[117] Способ по п.[116], где способ дополнительно включает истощение клеток, экспрессирующих CD19, в биологическом образце.

[118] Способ по п.[116] или [116], где истощение клеток, экспрессирующих CD14, или CD25, или CD19, включает связывание CD14-, или CD25-, или CD19-связывающего средства с APC или APC из препаратов APC.

[119] Способ по п.[118], где CD14-, или CD25-, или CD19-связывающее средство является биотинилированным.

[120] Способ по п.[118] или [119], где истощение клеток, экспрессирующих CD14, или CD25, или CD19, дополнительно включает связывание реагента против биотина на твердой подложке с CD14-, или CD25-, или CD19-связывающим средством.

[121] способ по любому из пп.[118]-[120], где CD14-, или CD25-, или CD19-связывающее средство присоединяют к твердой подложке.

[122] Способ по любому из пп.[61]-[121], где APC по любому из пп.[61]-[63] или [66]-[121] или APC из препаратов APC по любому из пп.[64]-[121] получают из CD14⁺ моноцита, или они являются CD14-обогащенными APC или CD141-обогащенными APC.

[123] Способ по любому из пп.[61]-[122], где APC по любому из пп.[61]-[63] или [66]-[122] или APC из препаратов APC по любому из пп.[64]-[122] обогащают из биологического образца.

[124] Способ по любому из пп.[61]-[123], где APC по любому из пп.[61]-[63] или [66]-[123] или APC из препаратов APC по любому из пп.[64]-[123] стимулируют одним или более цитокинами или факторами роста.

[125] Способ по п.[124], где один или более цитокинов или факторов роста включают ГМ-КСФ, ИЛ-4, FLT3L, ФНОα, ИЛ-1β, PGE1, ИЛ-6, ИЛ-7, ИФНα, R848, LPS, ss-rna40, поли-I:C или их комбинацию.

[126] Способ по любому из пп.[61]-[125], где APC по любому из пп.[61]-[63] или [66]-[125] или APC из препаратов APC по любому из пп.[64]-[125] получают из второго биологического образца.

[127] Способ по п.[126], где второй биологический образец получают из того же индивидуума.

[128] Способ по любому из пп.[61]-[127], где биологический образец содержит мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC).

[129] Способ по любому из пп.[61]-[128], где процентная доля по меньшей мере одной антигенспецифической T-клетки составляет по меньшей мере приблизительно 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% всех CD4⁺ T-клеток, всех CD8⁺ T-клеток, всех T-клеток или всех иммунных клеток.

[130] Способ по любому из пп.[61]-[129], где процентная доля по меньшей мере одной антигенспецифической CD8⁺ T-клетки составляет по меньшей мере приблизительно 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% всех CD4⁺ T-клеток, всех CD8⁺ T-клеток, всех T-клеток или всех иммунных клеток.

[131] Способ по любому из пп.[61]-[130], где процентная доля по меньшей мере одной антигенспецифической CD4⁺ T-клетки составляет по меньшей мере приблизительно 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% всех CD4⁺ T-клеток, всех CD8⁺ T-клеток, всех T-клеток или всех иммунных клеток.

[132] Способ по любому из пп.[61]-[131], где процентная доля по меньшей мере одной антигенспецифической T-клетки в биологическом образце составляет не более приблизительно 0,00001%, 0,00005%, 0,0001%, 0,0005%, 0,001%, 0,005%, 0,01%, 0,05%, 0,1% или 0,5% всех CD4⁺ T-клеток, всех CD8⁺ T-клеток, всех T-клеток или всех иммунных клеток.

[133] Способ по любому из пп.[61]-[132], где процентная доля по меньшей мере одной антигенспецифической CD8⁺ T-клетки в биологическом образце составляет не более приблизительно 0,00001%, 0,00005%, 0,0001%, 0,0005%, 0,001%, 0,005%, 0,01%, 0,05%, 0,1% или 0,5% всех CD4⁺ T-клеток, всех CD8⁺ T-клеток, всех T-клеток или всех иммунных клеток.

[134] Способ по любому из пп.[61]-[133], где процентная доля по меньшей мере одной антигенспецифической CD4⁺ T-клетки в биологическом образце составляет не более приблизительно 0,00001%, 0,00005%, 0,0001%, 0,0005%, 0,001%, 0,005%, 0,01%, 0,05%, 0,1% или 0,5% всех CD4⁺ T-клеток, всех CD8⁺ T-клеток, всех T-клеток или всех иммунных клеток.

[135] Способ по любому из пп.[61]-[134], где способ дополнительно включает введение индивидууму одной или более из по меньшей мере одной антигенспецифической T-клетки.

[136] Способ по любому из пп.[61]-[135], где общий период времени из отдельных периодов времени составляет менее 28 дней.

[137] Способ по любому из пп.[61]-[136], где инкубация включает инкубацию первого препарата APC из препаратов APC с T-клетками в течение более чем 7 дней.

[138] Способ по любому из пп.[61]-[137], где инкубация включает инкубацию первого препарата APC из препаратов APC с T-клетками в течение более чем 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 дней.

[139] Способ по любому из пп.[61]-[138], где биологический образец свежеполучен из индивидуума или является замороженным образцом.

[140] Способ по любому из пп.[61]-[139], где способ включает инкубацию APC или одного или более из препаратов APC с первой средой, содержащей по меньшей мере один цитокин или фактор роста, в течение первого периода времени.

[141] Способ по п.[140], где по меньшей мере один цитокин или фактор роста включает ГМ-КСФ, ИЛ-4, FLT3L, ФНОα, ИЛ-1β, PGE1, ИЛ-6, ИЛ-7, ИФНα, R848, LPS, ss-rna40, поли-I:C или любую их комбинацию.

[142] Способ по п.[140] или [141], где способ включает инкубацию одного или более из препаратов APC с по меньшей мере одним пептидом в течение второго периода времени.

[143] Способ по любому из пп.[140]-[142], где способ включает инкубацию APC по любому из пп.[61]-[63] или [66]-[142], или одного или более из препаратов APC по любому из пп.[64]-[142] со второй средой, содержащей один или более цитокинов или факторов роста, в течение третьего периода времени и, таким образом, получение зрелых APC.

[144] Способ по п.[143], где один или более цитокинов или факторов роста включает ГМ-КСФ, ИЛ-4, FLT3L, ФНОα, ИЛ-1β, PGE1, ИЛ-6, ИЛ-7, ИФНα, R848, LPS, ss-rna40, поли-I:C или их комбинацию.

[145] Способ по п.[143] или [144], где способ дополнительно включает удаление одного или более цитокинов или факторов роста из второй среды после третьего периода времени и перед началом четвертого периода времени.

[146] Способ по любому из пп.[61]-[145], где APC из препаратов APC стимулируют одним или более цитокинами или факторами роста.

[147] Способ по любому из пп.[61]-[146], где антиген является неоантигеном, опухолеассоциированным антигеном, вирусным антигеном, минорным антигеном гистосовместимости или их комбинацией.

[148] Способ по любому из пп.[61]-[147], где способ осуществляют ex vivo.

[149] Способ по любому из пп.[61]-[148], где по меньшей мере одна антигенспецифическая T-клетка включает множество антигенспецифических T-клеток.

[150] Способ по любому из пп.[61]-[149], где способ включает получение биологического образца, содержащего по меньшей мере одну APC и по меньшей мере одну PBMC, из индивидуума или по меньшей мере одну T-клетку.

[151] Способ по любому из пп.[61]-[150], где способ включает истощение клеток, экспрессирующих CD14, и/или CD25, и/или CD19, в биологическом образце и, таким образом, получение образца, истощенного в отношении CD14⁺, и/или CD25⁺, и/или CD19⁺ клеток.

[152] Способ по любому из пп.[61]-[151], где способ включает инкубацию образца, истощенного в отношении CD14⁺, и/или CD25⁺, и/или CD19⁺ клеток, с FLT3L в течение первого периода времени.

[153] Способ по любому из пп.[61]-[152], где способ включает инкубацию по меньшей мере одного пептида с образцом, истощенным в отношении CD14⁺, и/или CD25⁺, и/или CD19⁺ клеток, в течение второго периода времени и, таким образом, получение первого образца зрелых APC, нагруженных пептидом.

[154] Способ по любому из пп.[61]-[153], где способ включает инкубацию первого образца APC, нагруженных пептидом, с по меньшей мере одной T-клеткой в течение третьего периода времени и, таким образом, получение первого образца стимулированных T-клеток.

[155] Способ по п.[154], где инкубацию первого образца APC, нагруженных пептидом, с по меньшей мере одной T-клеткой осуществляют в присутствии ИЛ-7, ИЛ-15 или их комбинации.

[156] Способ по п.[155], где инкубацию первого образца APC, нагруженных пептидом, с по меньшей мере одной T-клеткой осуществляют в присутствии ингибитора индоламин-2,3-диоксигеназы-1 (IDO), антитела против PD-1, ИЛ-12 или их комбинации.

[157] Способ по п.[156], где ингибитор IDO является эпакадостатом, навоксимодом, 1-метилтриптофаном или их комбинацией.

[158] Способ по любому из пп.[61]-[157], где способ включает инкубацию T-клетки из первого образца стимулированных T-клеток с FLT3L-стимулированными APC из образца зрелых APC в течение четвертого периода времени и, таким образом, получение второго образца стимулированных T-клеток.

[159] Способ по любому из пп.[61]-[157], где способ включает инкубацию T-клетки из первого образца стимулированных T-клеток с FLT3L и вторым образцом APC, нагруженных пептидом, из образца зрелых APC в течение четвертого периода времени и, таким образом, получение второго образца стимулированных T-клеток.

[160] Способ по любому из пп.[61]-[157], где способ включает инкубацию T-клетки из первого образца стимулированных T-клеток с FLT3L и FLT3L-стимулированными APC из образца зрелых APC в течение четвертого периода времени и, таким образом, получение второго образца стимулированных T-клеток.

[161] Способ по любому из пп.[158]-[160], где инкубацию T-клетки из первого образца стимулированных T-клеток осуществляют в присутствии ИЛ-7, ИЛ-15 или их комбинации.

[162] Способ по п.[161], где инкубацию T-клетки из первого образца стимулированных T-клеток осуществляют в присутствии ингибитора индоламин-2,3-диоксигеназы-1 (IDO), антитела против PD-1, ИЛ-12 или их комбинации.

[163] Способ по п.[162], где ингибитор IDO является эпакадостатом, навоксимодом, 1-метилтриптофаном или их комбинацией.

[164] Способ по любому из пп.[61]-[163], где способ включает инкубацию T-клетки из второго образца стимулированных T-клеток с FLT3L-стимулированными APC из образца зрелых APC в течение пятого периода времени и, таким образом, получение третьего образца стимулированных T-клеток.

[165] Способ по любому из пп.[61]-[163], где способ включает инкубацию T-клетки из второго образца стимулированных T-клеток с FLT3L и третьим образцом APC, нагруженных пептидом, из образца зрелых APC в течение пятого периода времени и, таким образом, получение третьего образца стимулированных T-клеток

[166] Способ по любому из пп.[61]-[163], где способ включает инкубацию T-клетки из второго образца стимулированных T-клеток с FLT3L и FLT3L-стимулированными APC из образца зрелых APC в течение пятого периода времени и, таким образом, получение третьего образца стимулированных T-клеток.

[167] Способ по любому из пп.[164]-[166], где инкубацию T-клетки из второго образца стимулированных T-клеток осуществляют в присутствии ИЛ-7, ИЛ-15 или их комбинации.

[168] Способ по п.[167], где инкубацию T-клетки из второго образца стимулированных T-клеток осуществляют в присутствии ингибитора индоламин-2,3-диоксигеназы-1 (IDO), антитела против PD-1, ИЛ-12 или их комбинации.

[169] Способ по п.[168], где ингибитор IDO является эпакадостатом, навоксимодом, 1-метилтриптофаном или их комбинацией.

[170] Способ по любому из пп.[61]-[169], где один или более отдельных периодов времени, 3 или менее отдельных периодов времени, первый период времени, второй период времени, третий период времени, четвертый период времени или пятый период времени составляет по меньшей мере 1 час, по меньшей мере 2 часа, по меньшей мере 3 часа, по меньшей мере 4 часа, по меньшей мере 5 часов, по меньшей мере 6 часов, по меньшей мере 7 часов, по меньшей мере 8 часов, по меньшей мере 9 часов, по меньшей мере 10 часов, по меньшей мере 11 часов, по меньшей мере 12 часов, по меньшей мере 13 часов, по меньшей мере 14 часов, по меньшей мере 15 часов, по меньшей мере 16 часов, по меньшей мере 17 часов, по меньшей мере 18 часов, по меньшей мере 19 часов, по меньшей мере 20 часов, по меньшей мере 21 час, по меньшей мере 22 часа, по меньшей мере 23 часа, по меньшей мере 24 часа, по меньшей мере 25 часов, по меньшей мере 26 часов, по меньшей мере 27 часов, по меньшей мере 28 часов, по меньшей мере 29 часов, по меньшей мере 30 часов, по меньшей мере 31 час, по меньшей мере 32 часа, по меньшей мере 33 часа, по меньшей мере 34 часа, по меньшей мере 35 часов, по меньшей мере 36 часов, по меньшей мере 37 часов, по меньшей мере 38 часов, по меньшей мере 39 часов или по меньшей мере 40 часов.

[171] Способ по любому из пп.[61]-[170], где один или более отдельных периодов времени, 3 или менее отдельных периодов времени, первый период времени, второй период времени, третий период времени, четвертый период времени или пятый период времени составляет от 1 до 4 часов, от 1 до 3 часов, от 1 до 2 часов, от 4 до 40 часов, от 7 до 40 часов, от 4 до 35 часов, от 4 до 32 часов, от 7 до 35 часов или от 7 до 32 часов.

[172] Способ по любому из пп.[61]-[171], где способ включает введение по меньшей мере одной T-клетки из первого, или второго, или третьего образца стимулированных T-клеток нуждающемуся в этом индивидууму.

[173] Способ, включающий: (a) получение биологического образца, содержащего по меньшей мере одну антигенпрезентирующую клетку (APC), из индивидуума; (b) обогащение клеток, экспрессирующих CD14, из биологического образца и, таким образом получение образца, обогащенного CD14⁺ клетками; (c) инкубацию образца, обогащенного CD14⁺ клетками, с по меньшей мере одним цитокином или фактором роста в течение первого периода времени; (d) инкубацию по меньшей мере одного пептида с образцом, обогащенным CD14⁺ клетками (c), в течение второго периода времени и, таким образом, получение образца APC, нагруженных пептидом; (e) инкубацию образца APC, нагруженных пептидом, с одним или более цитокинами или факторами роста в течение третьего периода времени и, таким образом, получение образца зрелых APC; (f) инкубацию APC из образца зрелых APC с CD14-, и/или CD25-, и/или CD19-истощенным образцом, содержащим T-клетки, в течение четвертого периода времени; (g) инкубацию T-клеток с APC из образца зрелых APC в течение пятого периода времени; (h) инкубацию T-клеток с APC из образца зрелых APC в течение шестого периода времени; и (i) введение по меньшей мере одной T-клетки из T-клеток нуждающемуся в этом индивидууму.

[174] Способ, включающий: (a) получение биологического образца, содержащего по меньшей мере одну APC и по меньшей мере одну T-клетку, из индивидуума; (b) истощение клеток, экспрессирующих CD14, и/или CD25, и/или CD19, в биологическом образце и, таким образом, получение образца, истощенного в отношении CD14⁺, и/или CD25⁺, и/или CD19⁺, клеток; (c) инкубацию образца, истощенного в отношении CD14⁺, и/или CD25⁺, и/или CD19⁺ клеток, с FLT3L в течение первого периода времени; (d) инкубацию по меньшей мере одного пептида с образцом, истощенным в отношении CD14⁺, и/или CD25⁺, и/или CD19⁺, клеток (c), в течение второго периода времени и, таким образом, получение образца APC, нагруженных пептидом; (e) инкубацию образца APC, нагруженных пептидом, с по меньшей мере одной T-клеткой в течение третьего периода времени и, таким образом, получение первого образца стимулированных T-клеток; (f) инкубацию T-клетки из первого образца стимулированных T-клеток с APC из образца зрелых APC в течение четвертого периода времени и, таким образом, получение второго образца стимулированных T-клеток; (g) необязательно, инкубацию T-клетки из второго образца стимулированных T-клеток с APC из образца зрелых APC в течение пятого периода времени и, таким образом, получение третьего образца стимулированных T-клеток; (h) введение по меньшей мере одной T-клетки из первого, второго или третьего образца стимулированных T-клеток нуждающемуся в этом индивидууму.

[175] Способ, включающий: (a) получение биологического образца, содержащего по меньшей мере одну APC и по меньшей мере одну T-клетку, из индивидуума; (b) истощение клеток, экспрессирующих CD14, и/или CD25, и/или CD19, в биологическом образце и, таким образом, получение образца, истощенного в отношении CD14⁺, и/или CD25⁺, и/или CD19⁺ клеток; (c)инкубацию образца, истощенного в отношении CD14⁺, и/или CD25⁺, и/или CD19⁺ клеток, с FLT3L в течение первого периода времени; (d) инкубацию по меньшей мере одного пептида с образцом, истощенным в отношении CD14⁺, и/или CD25⁺, и/или CD19⁺ клеток (c), в течение второго периода времени и, таким образом, получение образца APC, нагруженных пептидом; (e) инкубацию образца APC, нагруженных пептидом, с по меньшей мере одной T-клеткой в течение третьего периода времени и, таким образом, получение первого образца стимулированных T-клеток; (f) необязательно, инкубацию T-клетки из первого образца стимулированных T-клеток с FLT3L-стимулированными APC из образца зрелых APC в течение четвертого периода времени и, таким образом, получение второго образца стимулированных T-клеток; (g) необязательно, инкубацию T-клетки из второго образца стимулированных T-клеток с FLT3L-стимулированными APC из образца зрелых APC в течение пятого периода времени и, таким образом, получение третьего образца стимулированных T-клеток; (h) введение по меньшей мере одной T-клетки из первого, второго или третьего образца стимулированных T-клеток нуждающемуся в этом индивидууму.

[176] Способ, включающий: (a) получение биологического образца, содержащего по меньшей мере одну APC и по меньшей мере одну T-клетку, из индивидуума; (b) истощение клеток, экспрессирующих CD14, и/или CD25, и/или CD19, в биологическом образце и, таким образом, получение образца, истощенного в отношении CD14⁺, и/или CD25⁺, и/или CD19⁺ клеток; (c) инкубацию образца, истощенного в отношении CD14⁺, и/или CD25⁺, и/или CD19⁺ клеток, с FLT3L в течение первого периода времени; (d) инкубацию по меньшей мере одного пептида с образцом, истощенным в отношении CD14⁺, и/или CD25⁺, и/или CD19⁺ клеток (c), в течение второго периода времени и, таким образом, получение первого образца APC, нагруженных пептидом; (e) инкубацию первого образца APC, нагруженных пептидом, с по меньшей мере одной T-клеткой в течение третьего периода времени и, таким образом, получение первого образца стимулированных T-клеток; (f) необязательно, инкубацию T-клетки из первого образца стимулированных T-клеток с FLT3L и вторым образцом APC, нагруженных пептидом, из образца зрелых APC в течение четвертого периода времени и, таким образом, получение второго образца стимулированных T-клеток; (g) необязательно, инкубацию T-клетки из второго образца стимулированных T-клеток с FLT3L и третьим образцом APC, нагруженных пептидом, из образца зрелых APC в течение пятого периода времени и, таким образом, получение третьего образца стимулированных T-клеток; (h) введение по меньшей мере одной T-клетки из первого, второго или третьего образца стимулированных T-клеток нуждающемуся в этом индивидууму.

[177] Способ, включающий: (a) получение биологического образца, содержащего по меньшей мере одну APC и по меньшей мере одну T-клетку, из индивидуума; (b) истощение клеток, экспрессирующих CD14, и/или CD25, и/или CD19, в биологическом образце и, таким образом, получение образца, истощенного в отношении CD14⁺, и/или CD25⁺, и/или CD19⁺ клеток; (c) инкубацию образца, истощенного в отношении CD14⁺, и/или CD25⁺, и/или CD19⁺ клеток, с FLT3L в течение первого периода времени; (d) инкубацию по меньшей мере одного пептида с образцом, истощенным в отношении CD14⁺, и/или CD25⁺, и/или CD19⁺ клеток (c), в течение второго периода времени и, таким образом, получение первого образца APC, нагруженных пептидом;(e) инкубацию первого образца APC, нагруженных пептидом, с по меньшей мере одной T-клеткой в течение третьего периода времени и, таким образом, получение первого образца стимулированных T-клеток; (f) необязательно, инкубацию T-клетки из первого образца стимулированных T-клеток с FLT3L и FLT3L-стимулированными APC из образца зрелых APC в течение четвертого периода времени и, таким образом, получение второго образца стимулированных T-клеток; (g) необязательно, инкубацию T-клетки из второго образца стимулированных T-клеток с FLT3L и FLT3L-стимулированными APC из образца зрелых APC в течение пятого периода времени и, таким образом, получение третьего образца стимулированных T-клеток; (h) введение по меньшей мере одной T-клетки из первого, второго или третьего образца стимулированных T-клеток нуждающемуся в этом индивидууму.

[178] Способ, включающий (a) инкубацию FLT3L и по меньшей мере одного пептида с популяцией иммунных клеток из биологического образца, где FLT3L инкубируют с популяцией иммунных клеток в течение первого периода времени, и где по меньшей мере один пептид инкубируют с популяцией иммунных клеток в течение первого периода стимуляции пептидом, и, таким образом, получение первого образца стимулированных T-клеток, где популяция иммунных клеток содержит по меньшей мере одну T-клетку и по меньшей мере одну APC; (b) необязательно, инкубацию FLT3L и по меньшей мере одного пептида с по меньшей мере одной APC, где FLT3L инкубируют с по меньшей мере одной APC в течение второго периода времени, и где по меньшей мере один пептид инкубируют с по меньшей мере одной APC в течение второго периода стимуляции пептидов, и, таким образом, получение первого образца зрелых APC, нагруженных пептидом; и инкубацию первого образца зрелых APC, нагруженных пептидом, с первым образцом стимулированных T-клеток и, таким образом, получение второго образца стимулированных T-клеток; (c) необязательно, инкубацию FLT3L и по меньшей мере одного пептида с по меньшей мере одной APC, где FLT3L инкубируют с по меньшей мере одной APC в течение третьего периода времени, и где по меньшей мере один пептид инкубируют с по меньшей мере одной APC в течение третьего периода стимуляции пептидом и, таким образом, получение второго образца зрелых APC, нагруженных пептидом; и инкубацию второго образца зрелых APC, нагруженных пептидом, со вторым образцом стимулированных T-клеток и, таким образом, получение третьего образца стимулированных T-клеток; и (d) введение по меньшей мере одной T-клетки из первого образца стимулированных T-клеток, второго образца стимулированных T-клеток или третьего образца стимулированных T-клеток нуждающемуся в этом индивидууму.

[179] Способ, включающий (a) определение экспрессии одного или более клеточных маркеров по меньшей мере одной иммунной клетки из образца стимулированных иммунных клеток и (b) определение связывания по меньшей мере одной иммунной клетки из образца стимулированных иммунных клеток с комплексом пептид-MHC; где определение экспрессии и определение связывания осуществляют одновременно.

[180] Способ по п.[179], где образец стимулированных иммунных клеток содержит популяцию иммунных клеток, стимулированных с помощью APC, содержащих комплекс пептид-MHC.

[181] Способ по п.[179] или [180], где популяцию иммунных клеток получают из биологического образца.

[182] Способ, включающий: (a) инкубацию популяции иммунных клеток из биологического образца с APC, содержащими комплекс пептид-MHC, и, таким образом, получение образца стимулированных иммунных клеток; (b) определение экспрессии одного или более клеточных маркеров по меньшей мере одной иммунной клетки из образца стимулированных иммунных клеток; и (c) определение связывания по меньшей мере одной иммунной клетки из образца стимулированных иммунных клеток с комплексом пептид-MHC; где определение экспрессии и определение связывания осуществляют одновременно.

[183] Способ по любому из пп.[179]-[182], где один или более клеточных маркеров включают ФНОα, ИФНγ, LAMP-1, 4-1BB, ИЛ-2, ИЛ-17A, гранзим B, PD-1, CD25, CD69, TIM3, LAG3, CTLA-4, CD62L, CD45RA, CD45RO, FoxP3 или любую их комбинацию.

[184] Способ по любому из пп.[179]-[183], где определение связывания по меньшей мере одной иммунной клетки из образца стимулированных иммунных клеток с комплексом пептид-MHC включает определение связывания по меньшей мере одной иммунной клетки из образца стимулированных иммунных клеток с тетрамером MHC, содержащим пептид и MHC из комплекса пептид-MHC.

[185] Способ по любому из пп.[179]-[184], где MHC является MHC класса I или MHC класса II.

[186] Способ по любому из пп.[179]-[185], где комплекс пептид-MHC содержит одну или более меток.

[187] Способ по любому из пп.[179]-[186], где популяция иммунных клеток из биологического образца содержит два или более образцов, каждый из которых содержит популяцию иммунных клеток из одного или более биологических образцов.

[188] Способ по п.[187], где два или более образца метят двумя или более метками для образцов.

[189] Способ по любому из пп.[179]-[188], где определение экспрессии и определение связывания включает активируемую флуоресценцией сортировку клеток (FACS).

[190] Способ по любому из пп.[179]-[189], где определение экспрессии и определение связывания включает анализ отдельных клеток.

[191] Способ по любому из пп.[179]-[190], где определение экспрессии и определение связывания включает определение процентной доли иммунных клеток, экспрессирующих один или более клеточных маркеров и связывающихся с комплексом пептид-MHC.

[192] Способ по п.[186] или [187], где метки содержат флуорофор.

[193] Способ по любому из пп.[179]-[192], где популяция иммунных клеток содержит популяцию иммунных клеток, типичную для популяции иммунных клеток из композиции по любому из пп.[1]-[58].

ПРИМЕРЫ

[0410] Настоящее изобретение будет более подробно описано с помощью следующих конкретных примеров. Следующие примеры представлены в иллюстративных целях и не предназначены для ограничения изобретения каким-либо образом. Специалистам в этой области будут понятны различные некритические параметры, которые можно изменять или модифицировать для получения альтернативных вариантов осуществления изобретения. Все патенты, патентные заявки и печатные публикации, указанные в настоящем описании, включены в него в качестве ссылки в полном объеме.

Сущность примеров:

[0411] Примеры 1 и 2 ниже являются примерами способов производства T-клеток (способ 1 и способ 2). Схемы примеров способов показаны на фиг. 1A и фиг. 1B. В примерах 21-23 показаны стадии получения APC и этих двух способов. В примерах 12 и 14-16 и таблицах 2-5 представлены результаты, полученные в случае способов 1 и 2. В примере 13 описаны параметры способов, которые будут подвергать тестированию.

[0412] Примеры 3-7 и 20 являются примерами результатов экспансии CD4⁺ T-клеток памяти и индуцирования CD8⁺ наивных T-клеток с использованием способа 1 и способа 2. Результаты проточного цитометрического анализа показаны на фиг. 2B, фиг. 5A и B, фиг. 7, фиг. 10 и фиг. 12-23.

[0413] Примеры 8-11 и 16-19 являются примерами результатов анализов для оценки специфичности, фенотипа и/или функции T-клеток, выращенных или индуцированных способами, представленными в настоящем описании. На фиг. 25 показан общий обзор способа производства T-клеток и использования этих анализов для оценки специфичности, фенотипа и/или функции T-клеток.

Пример 1 - Способ производства T-клеток 1

[0414] В этом примере представлен пример способа производства T-клеток 1, как показано на фиг. 1.

[0415] Материалы:

Среда для DC (Cellgenix)

Микрочастицы CD14, человека, Miltenyi #130-050-201

Цитокины и/или факторы роста

Среды для T-клеток (AIM V+RPMI 1640 с GlutaMAX+сыворотка+ПенСтреп)

Стоковые растворы пептидов - 1 мМ на пептид (ВИЧ A02-5-10 пептидов, ВИЧ B07-5-10 пептидов, DOM - 4-8 пептидов, PIN - 6-12 пептидов)

[0416] Стадия 1: Выделение моноцитов для получения DC

1. Вычисляют приблизительное количество PBMC для размораживания с учетом ожидаемого выхода DC для каждого донора.

2. Размораживают PBMC и ресуспендируют в количестве ~1×10⁶-1×10⁸ клеток/мл в средах для DC.

3. Добавляют бензоназу (разведение 1:1000) и помещают в инкубатор с ослабленной крышкой.

4. Осуществляют обогащение CD14⁺ моноцитов по инструкциям производителя.

5. Высевают обогащенные клетки в 6-луночные планшеты в количестве 1×10⁵-1×10⁷ на лунку в средах для DC с одним или более цитокинами и/или факторами роста, выбранными из ГМ-КСФ, ИЛ-4, FLT3L, ФНОα, ИЛ-1β, PGE1, ИЛ-6, ИЛ-7, ИФНα, R848, LPS, ss-rna40 и полиI:C.

[0417] Стадия 2: Нагрузка пептидами и созревание

1. Подсчитывают DC и разделяют клетки в пробирки 15 мл в зависимости от экспериментальных условий; 0,01-1 миллион клеток на условие.

2. Центрифугируют при 1200 об./мин. в течение 5 мин и ресуспендируют в 50-400 мкл среды для DC. Добавляют пептиды и помещают в инкубатор с ослабленной крышкой на 0,5-3 часа. Вычисляли объемы для совокупностей пептидов при концентрация 1 мМ на пептид. Добавляют объем каждой отдельной совокупности A02 (5 пептидов) и B07 (5 пептидов) на лунку до конечной концентрации 0,001-100 мкМ на пептид.

3. Через 0,5-3 часа добавляют от 200 мкл до 1,5 мл сред для DC, содержащих смесь для созревания, и переносят клетки в 24-луночный планшет.

Смесь для созревания содержит один или более цитокинов, выбранных из ГМ-КСФ, ИЛ-4, FLT3L, ФНОα, ИЛ-1β, PGE1, ИЛ-6, ИЛ-7, ИФНα, R848, LPS, ss-rna40 и полиI:C.

[0418] Стадия 3: Проведение эксперимента по длительной стимуляции (LTS)

1. Из лунок планшетов с DC осторожно удаляют все среды, перенося содержимое каждой лунки в отдельную лунку в 24-луночный планшет с глубокими лунками.

2. Промывают каждую лунку 0,5-3 мл среды для T-клеток и объединяют со средами для DC в планшете с глубокими лунками.

3. В каждую лунку добавляют от 100 мкл до 2 мл среды для T-клеток.

4. DC центрифугируют при 1200 об./мин. в течение 5 мин.

5. Удаляют весь супернатант, ресуспендируют DC в от 100 мкл до 2 мл среды для T-клеток и переносят обратно в соответствующие лунки.

6. Размораживают PBMC в средах для T-клеток и ресуспендируют в количестве 0,5×10⁶-4×10⁶ клеток/мл в средах для T-клеток с ИЛ-7 и ИЛ-15.

7. Добавляют 0,5-3 мл полученных PBMC в каждую лунку.

[0419] Стадия 4: LTS с подпиткой

С помощью глюкометра проверяют, являются ли среды желтыми. Если уровень глюкозы остается высоким, в культуру добавляют ИЛ-7 и ИЛ-15 в каждую лунку. Если уровень глюкозы является низким, клетки переносят в 6-луночный планшет (4 мл/лунку) и дополняют ИЛ-15 и ИЛ-7. Если уровень глюкозы является очень низким, увеличивают объем до 6 мл/лунку в 6-луночном планшете.

[0420] Стадия 5: LTS с подпиткой

Культуру подпитывают каждые 1-4 дней, добавляя свежие ИЛ-15/ИЛ-7 и увеличивая объем культуры, по мере необходимости, когда концентрация глюкозы становится низкой.

[0421] Стадия 6: Повторная стимуляция

Подсчитывают T-клетки и повторяют со стадии 3 на новой партии нагруженных пептидом DC. Оставшиеся клетки замораживают для анализа.

[0422] Стадия 7: LTS с подпиткой

Культуры подпитывают каждые 1-5 дней.

[0423] Стадия 8: Повторная стимуляция

[0424] Стадия 9: LTS с подпиткой

Культуры подпитывают каждые 1-5 дней.

[0425] Стадия 10

Подсчитывают T-клетки и замораживают для анализа.

Пример 2 - Способ производства T-клеток 2

[0426] Этот способ является альтернативой способу, описанному в примере 1.

[0427] В примере 2 представлен пример способа производства T-клеток (способ 2), как показано на фиг. 1.

[0428] Материалы:

Среда AIM V (Invitrogen)

Среда 1(RPMI 1640 с GlutaMAX+сыворотка+ПенСтреп)

Среда 2 (AIM V+RPMI 1640 с GlutaMAX+сыворотка+ПенСтреп)

[0429] Способ:

[0430] Стадия 1: Высевают 4 миллиона PBMC в каждой лунке 24-луночного планшета с одним или более цитокинами в среде 2. Один или более цитокинов выбраны из ГМ-КСФ, ИЛ-4, FLT3L, ФНОα, ИЛ-1β, PGE1, ИЛ-6, ИЛ-7, ИФНα, R848, LPS, ss-rna40 и полиI:C.

[0431] Стадия 2: Нагрузка пептидами и созревание в среде 2

1. Получают стоковый раствор интересующей совокупности пептидов (за исключением условий без пептидов) при конечной концентрации 0,001-100 мкМ для коротких фрагментов и 0,001-100 мкМ для длинных фрагментов в соответствующих лунках и смешивают.

2. Инкубируют в течение 0,5-3 ч.

3. Получают стоковую смесь для созревания, добавляют в каждую лунку после инкубации и смешивают. Смесь для созревания содержит один или более цитокинов, выбранных из ГМ-КСФ, ИЛ-4, FLT3L, ФНОα, ИЛ-1β, PGE1, ИЛ-6, ИЛ-7, ИФНα, R848, LPS, ss-rna40 и полиI:C.

[0432] Стадия 3: В каждую лунку добавляют сыворотку человека в конечной концентрации 2,5-20% об. и смешивают.

[0433] Стадия 4: Осторожно заменяют 50-90% среды свежей средой 1, дополненной ИЛ-7 и ИЛ-15 до конечной концентрации 0,005-500 нг/мл каждого.

[0434] Стадия 5: Осторожно заменяют 50-90% среды свежей средой 1, дополненной ИЛ-7 и ИЛ-15 до конечной концентрации 0,005-500 нг/мл каждого, каждые 1-5 дней.

[0435] В случае, если лунки становятся оранжевыми или желтыми в дни без подпитки (считывание глюкозы в случае прозрачной среды), заменяют 25-75% имеющейся среды свежей средой 1 и ИЛ-7/ИЛ-15.

[0436] Стадия 6: Подсчитывают и замораживают (или переходят к следующим стадиям для осуществления стимуляции T-клеток - к стадии 8 и/или стадии 10 способа 1).

[0437] На стадиях культивирования от стадии 1 до стадии 6 нагруженные пептидом DC можно получать параллельно в соответствии со "стадией 1" и "стадией 2" способа 1.

[0438] Подсчитывают T-клетки и стимулируют T-клетки новой партией нагруженных пептидом DC. Замораживают оставшиеся клетки для анализа. Стимуляцию T-клеток можно осуществлять способами "стадии 3" способа 1.

[0439] Стадия 7: Подсчитывают T-клетки и повторяют стимуляцию T-клеток способами "стадии 3" способа 1 на новой партии нагруженных пептидом DC. Замораживают оставшиеся клетки для анализа.

[0440] Стадия 8: Подсчитывают T-клетки и замораживают для анализа.

Пример 3 - Индуцирование CD8⁺ T-клеток

[0441] Образцы PBMC человека-донора использовали для осуществления индуцирования антигенспецифических T-клеток способом 1 или способом 2. Индуцирование CD8⁺ T-клеток памяти и наивных T-клеток анализировали после производства T-клеток с использованием разных способов. Образцы клеток можно отбирать для анализа в разные моменты времени. Мультимеры pMHC использовали для мониторинга фракции антигенспецифических CD8⁺ T-клеток в индукционных культурах и для детекции множественных T-клеточных ответов параллельно с использованием комбинаторного кодирования. На фиг. 2 представлен пример результатов, где показана фракция антигенспецифических CD8⁺ T-клеток памяти, индуцированных длинными пептидами или короткими пептидами с использованием способа 1 и способа 2. Термин "совокупность" означает, что образец, содержащий T-клетки, используемые для индуцирования, представляет собой целые PBMC. Термин "T_reg-" означает, что образец, содержащий T-клетки, используемые для индуцирования, представляет собой PBMC, истощенные в отношении CD25-экспрессирующих клеток. На фиг. 3 представлен пример результатов анализа T-клеточных ответов, где показана фракция антигенспецифических CD8⁺наивных T-клеток, отвечающих на пептид GAS7, анализируемая посредством проточной цитометрии после кратковременной стимуляции или индуцирования (длительность культивирования в этом примере вычисляют от начала стимуляции). Можно наблюдать повышение фракции антигенспецифических T-клеток памяти и наивных PIN-специфических T-клеток после кратковременной стимуляции.

Пример 4 - Индуцирование CD8⁺ T-клеток

[0442] Индуцирование CD8⁺ T-клеток анализировали после производства T-клеток с использованием разных способов. Индуцированные T-клетки инкубировали с разными антигенными пептидами в тестовых лунках и фракцию T-клеток, отвечающих на пептиды, анализировали посредством проточной цитометрии. Мультимеры pMHC использовали для мониторинга фракции антигенспецифических CD8⁺ T-клеток в индукционных культурах и для детекции множественных T-клеточных ответов параллельно с использованием комбинаторного кодирования. Коэффициент совпадений можно использовать для демонстрации того, насколько T-клетки отвечают на антигенные пептиды. Коэффициент совпадений определяют как количество тестовых лунок с положительными ответами, разделенное на общее количество тестовых лунок. Эксперимент проводили в двух повторениях, и коэффициент совпадений подтверждали в двух параллельных лунках. На фиг. 4 представлен пример результатов, где показана фракция CD8⁺ T-клеток, индуцированных короткими пептидами ВИЧ, короткими пептидами ранее идентифицированных неоантигенов (PIN) или длинными пептидами PIN после индуцирования способом 1 и способом 2. Термин "целые PBMC" означает, что образец, содержащий T-клетки, используемые для индуцирования, представляет собой целые PBMC. Термин "CD25^- PBMC" означает, что образец, содержащий T-клетки, используемые для индуцирования, представляет собой клетки, истощенные в отношении CD25⁺ клеток. Показано кратковременное и длительное индуцирование. На фиг. 6 показан представлен пример результатов, где показана фракция длительно индуцированных CD8⁺ T-клеток при использовании образцов PBMC от двух людей-доноров.

Пример 5 - Ответы CD4⁺ T-клеток

[0443] Ответы CD4⁺ T-клеток на ранее идентифицированные неоантигены (PIN) можно индуцировать с использованием способа индуцирования ex vivo. В этом примере ответы CD4⁺ T-клеток идентифицировали посредством мониторинга продукции ИФНγ антигенспецифическим образом. На фиг. 10 показаны типичные примеры такого проточного цитометрического анализа. И наконец, специфичность ответов CD4⁺ T-клеток в случае мутантного пептида, а не пептида дикого типа, показана посредством стимуляции индуцированных популяций T-клеток с использованием мутантного пептида или пептида дикого типа (фиг. 11).

Пример 6 - Индуцирование наивных CD8⁺ T-клеток

[0444] Индуцирование наивных CD8⁺ T-клеток анализировали посредством проточной цитометрии после производства T-клеток способом 1 или способом 2. Образцы PBMC получали от человека-донора 1 или человека-донора 2, и они являлись целыми PBMC или CD25-истощенными PBMC. Образцы клеток анализировали после кратковременного или длительного индуцирования способами, показанными на фиг. 1. Анализировали ответы наивных CD8⁺ T-клеток из индуцированных CD8⁺ T-клеток на разные пептиды, и их графики показаны на фиг. 12-23.

Пример 7 - Ответы CD8⁺ наивных T-клеток

[0445] Способы производства T-клеток в примере 1 успешно можно использовать для индуцирования ответов CD8⁺ T-клеток из наивного компартмента. На фиг. 7 показаны типичные диаграммы проточной цитометрии двух ответов CD8⁺ T-клеток на мутантные эпитопы у здорового донора после двух раундов стимуляции. Кроме того, ответы CD8⁺ T-клеток из компартмента памяти могут достигать высоких значений. В типичном примере, показанном на фиг. 8A, после до трех раундов стимуляции приблизительно 50% всех CD8⁺ T-клеток являлись специфическими в отношении иммунодоминантных эпитопов, pp65 CMV, YVL EBV, BMLF1 EBV и Mart-1. Индуцированные ответы CD8⁺ T-клеток памяти свидетельствуют о полифункциональности в анализе вторичного иммунного ответа на пептид (дегрануляция и высвобождение цитокинов, фиг. 8B).

Пример 8 - Проточный цитометрический анализ T-клеток

[0446] На фиг. 5A показан пример проточного цитометрического анализа ответа CD8⁺ наивных T-клеток на ME-1, индуцированного в условиях, указанных на фигуре, с использованием способа 2. На фиг. 5B показан пример проточного цитометрического анализа ответа CD8⁺ наивных T-клеток на ME-1, индуцированного в условиях, указанных на фигуре. Определяли, что 12,6% CD8⁺ T-клеток являлись специфическими в отношении ME-1 после длительного индуцирования.

Пример 9 - Анализ цитотоксичности индуцированных T-клеток

[0447] Анализ цитотоксичности использовали для оценки того, могут ли культуры индуцированных T-клеток уничтожать экспрессирующие антиген линии опухолевых клеток. В этом примере измеряли экспрессию активной каспазы 3 на живых и погибших опухолевых клетках для количественного анализа ранней гибели клеток и погибших опухолевых клеток. На фиг. 9 индуцированные ответы CD8⁺ T-клеток памяти могут уничтожать экспрессирующие антиген опухолевые мишени.

Пример 10 - Фенотипический анализ полученных CD8⁺ T-клеток

Линии CD8⁺ T-клеток, полученные в примере 1, можно охарактеризовывать по фенотипической экспрессии, цитокиновому профилю и специфической цитотоксической активности в отношении аутологичных клеток-мишеней. Для анализа фенотипической экспрессии 1×10⁴-1×10⁶ T-клеток из каждой культуры можно промывать PBS, содержащим 0,1-10% FBS и 0,1% азида натрия (FBS-PBS), и ресуспендировать в FBS-PBS, содержащем разведение 1:100 меченого флуорохромом антитела (против CD45RA и CD62L). После инкубации на льду клетки промывали и фиксировали для проточного цитометрического анализа. Если выбранные культуры CD8⁺ T-клеток экспрессируют CD62L, но не CD45RA, независимо от их реактивности в отношении различных пептидов, это может свидетельствовать о том, что выбранные культуры T-клеток принадлежат к субпопуляции CD8⁺ T-клеток памяти.

Пример 11 - Продукция цитокинов CD8⁺ T-клетками

[0448] Можно анализировать цитокиновый профиль культур CD8+ T-клеток. Культуры T-клеток сначала будут стимулировать аутологичными APC, в которые вводили антигенные пептиды. Цитокиновый профиль будут определять количественно с использованием наборов для ELISA (PharMingen, San Diego, Calif.). Планшеты для микротитрования (96-луночные, NUNC Maxisorp) будут покрывать в течение ночи при 4°C 0,2-4 мкг/лунку очищенного захватывающего моноклонального антитела мыши против цитокина человека (ИЛ-4, ИЛ-10, ФНОα, ИФНγ) (PharMingen). Будут промывать планшеты и будут насыщать неспецифические участки связывания 10% (масс./об.) эмбриональной телячьей сывороткой (FBS) в течение 0,5-3 часов, а затем промывать. Супернатанты и стандарты цитокинов будут разводить PBS и добавлять в параллельные лунки. Планшеты будут инкубировать при 37°C в течение 1-3 часов, а затем промывать PBS-T. В каждую лунку будут добавлять совпадающее биотинилированное детекторное антитело и инкубировать при комнатной температуре в течение 1-3 часов. После промывки будут добавлять конъюгированную с авидином пероксидазу хрена и инкубировать в течение 0,5-3 часов. В качестве субстрата для проявки цвета будут использовать 3,3’,5,5’-тетраметилбензидин (TMB, Sigma). Оптическую плотность будут измерять при 450 нм с использованием ридера для ELISA (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.) и концентрации цитокинов будут количественно определять с помощью программного обеспечения Microplate (Bio-Rad) с использованием двойной стандартной кривой с восьмью точками.

Пример 12 - Способ 1 и способ 2: Общие выводы

Таблица 1. Общие результаты способов 1 и 2

	Способ 1	Способ 2
	CD14-истощенные/CD25-истощенные	CD25-истощенные	CD14-истощенные/CD25-истощенные	FLT3L 3 раза
	LTS 37	LTS 38	LTS 37	LTS 38	LTS 38	LTS 38
CD8 памяти	Кратная экспансия в совокупности	30-1200	20-5000	20-100	5-100	5-100	5-100
CD8 памяти	Абсолютное количество	1-50×10⁶	20-1000×10⁶	0,1-1×10⁶	2-10×10⁶	2-20×10⁶	0,5-10×10⁶
Функциональность	Снижается при стимуляции 3	Снижается при стимуляции 3	Сохраняется при стимуляции 3	Сохраняется при стимуляции 3	Сохраняется при стимуляции 3	Сохраняется при стимуляции 3
Наивные CD8	Коэффициент совпадений на лунку	20-40%	0-40%	20-30%	0-20%	10%	0-10%
	Коэффициент совпадений на пептид	1-3 из 11	0-4 из 11	2 из 11	1 из 11	1-3 из 11	1-2 из 11
	Абсолютное количество	0,1-1×10⁶	-	0,01-0,5×10⁶	-	-	-
Функциональность	TBD*	TBD	TBD	TBD	TBD	TBD
Наивные CD4	Коэффициент совпадений на лунку	78-100%	56%	10-100%	50%	70%	TBD
	Коэффициент совпадений на пептид	TBD	TBD	TBD	TBD	TBD	TBD
	Абсолютное количество	TBD	TBD	TBD	TBD	TBD	TBD
Функциональность	Хорошая	Хорошая	Хорошая	TBD	TBD	TBD

TBD* = Не определено

Пример 13 - Тестирование параметров способов 1 и 2

[0449] Примером эксперимента для тестирования параметров способов может являться тестирование способа 1 на образцах пациентов в малом масштабе. Другим примером эксперимента для тестирования параметров способов может являться характеризация T-клеточных продуктов, полученных в предыдущих партиях, включающая тестирование функциональности CD4⁺ T-клеток и CD8⁺ T-клеток, сортировку антигенспецифических клеток и характеризацию посредством секвенирования РНК отдельных клеток. Другим примером эксперимента для тестирования параметров способов может являться тестирование добавления поли-ICLC/aCD40L во время получения DC и количественного анализа обогащения T-клеток. Другим примером эксперимента для тестирования параметров способов может являться тестирование функциональности индуцированных ответов CD8⁺ наивных T-клеток, включающее оценку антигенспецифической цитотоксичности в анализе цитолиза, осуществление анализа вторичного иммунного ответа на пептид с более широкой панелью для проточной цитометрии для измерения дифференцировки и истощения, определение чувствительности (титрование пептида) и специфичности (WT против мутантных форм, деконволюция совокупности) для подгруппы совпадений и обогащение CD8⁺ для устранения возможности побочных эффектов антигенспецифических CD4⁺ T-клеток. Другим примером эксперимента для тестирования параметров способов может являться исследование функциональности, определение чувствительности (титрование пептида) и специфичности (WT против мутантных форм, деконволюция совокупности) для подгруппы совпадений, осуществление анализа вторичного иммунного ответа с использованием панели для проточной цитометрии для анализа дифференцировки и истощения для лучшего понимания фенотипа. Другим примером эксперимента для тестирования параметров способов может являться сортировка антигенспецифических T-клеток (CD8⁺ T-клеток памяти, CD8⁺ наивных T-клеток, CD4⁺ наивных T-клеток) и профилирование посредством секвенирования РНК отдельных клеток, включая сравнение фенотипа при разном индуцировании, сравнение фенотипа при индуцировании из разных компартментов, исследование кинетики.

Пример 14 - Добавление T-клеток, истощенных в отношении CD14- и/или CD25-экспрессирующих клеток, улучшает индуцирование CD4⁺ и CD8⁺ наивных T-клеток

[0450] В таблице 2 ниже показаны результаты способа получения T-клеток 1, свидетельствующие о том, что истощение в отношении CD14⁺/CD25⁺ клеток может повышать коэффициент совпадений CD8⁺ наивных T-клеток и поддерживает постоянный коэффициент совпадений CD4⁺ T-клеток.

Таблица 2. Результаты истощения в отношении CD14⁺/CD25⁺ клеток

LTS#33		CD14^-	CD25^-	CD14^-/CD25^-
% коэффициента совпадений CD8⁺ наивных T-клеток	HD34	20	30	50
% коэффициента совпадений CD8⁺ наивных T-клеток	HD35	0	0	10
Среднее	10	15	30
% коэффициента совпадений CD4⁺ наивных T-клеток	HD34	100	80	90
% коэффициента совпадений CD4⁺ наивных T-клеток	HD35	100	100	100
Среднее	100	90	95

Пример 15 - Индуцирование CD8⁺ наивных T-клеток значительно улучшали с использованием способа 1 и способа 2

[0451] В таблицах 3A и 3B ниже показаны результаты для способа получения T-клеток 1 и способа получения T-клеток 2, представленных в настоящем описании. У двух тестируемых людей-доноров значительно улучшали индуцирование CD8⁺ наивных T-клеток при использовании истощения CD25-экспрессирующих клеток или истощения CD25- и CD14-экспрессирующих клеток по сравнению с использованием истощения CD14-экспрессирующих клеток. Индуцирование CD8⁺ наивных T-клеток также значительно улучшали с использованием стимуляции FLT3L.

Таблица 3A. Результаты индуцирования CD8⁺ наивных T-клеток в случае HD35

HD35

Способ 1 (истощение CD25)
1/13 подтвержденных
Доля успешных результатов 7,5%

Способ 2 (совокупность)
3/13 подтвержденных
Доля успешных результатов 23%

Способ 2 (истощение CD25)
5/13 подтвержденных
Доля успешных результатов 39%

День 19

День 26

День 19

День 26

День 19

День 26

Исходно

Подтверждение

Исходно

Подтверждение

Исходно

Подтверждение

Исходно

Подтверждение

Исходно

Подтверждение

Исходно

Подтверждение

Индуцирование короткими пептидами

ВИЧ, параллель 1

ВИЧ, параллель 2

ВИЧ, параллель 3

ВИЧ, параллель 4

ВИЧ-3
0,226%

ВИЧ-3
0,0203%

ВИЧ, параллель 5

ВИЧ-5*
0,0327%

ВИЧ-5*
0,0691%

ВИЧ-5

ВИЧ-3
0,496%

ВИЧ-3
0,215%

ВИЧ-3
0,33%

ВИЧ-3
0,0722%

PIN, параллель 1

PIN, параллель 2

CSNK1A1
0,135%

CSNK1A1
0,0747%

CSNK1A1
0,219%

CSNK1A1
0,193%

PIN, параллель 3

PIN, параллель 4

ME-1
4,15%

ME-1
0,927%

ME-1
12,6%

ME-1
2,34%

GAS7/ACTN4
0,012/0,284%

GAS7/ACTN4
0,076/0,156%

GAS7/ACTN4
0,241/0,376%

GAS7/ACTN4
0,669/0,095%

PIN, параллель 5

ACTN4
0,101%

ACTN4
0,032%

Длинные пептиды

Длинные пептиды PIN, параллель 1

CSNK1A1
0,0342%

CSNK1A1
0,0482%

CSNK1A1
0,0156%

CSNK1A1
0,0265%

Длинные пептиды PIN, параллель 2

Длинные пептиды PIN, параллель 3

Таблица 3B. Результаты индуцирования CD8⁺ наивных T-клеток в случае HD34

HD34

Способ 1
0/13 подтвержденных
Доля успешных результатов 0%

Способ 2, добавление совокупности
2/13 подтвержденных
Доля успешных результатов 15%

Способ 2, добавление CD25-истощенных клеток
2/13 подтвержденных
Доля успешных результатов 15%

День 19

День 26

День 19

День 26

День 19

День 26

Исходно

Подтверждение

Исходно

Подтверждение

Исходно

Подтверждение

Исходно

Подтверждение

Исходно

Подтверждение

Исходно

Подтверждение

Индуцирование короткими пептидами

ВИЧ, параллель 1

ВИЧ-5
0,358%

ВИЧ-5
0,789%

ВИЧ-5
1,93%

ВИЧ-5
3,61%

ВИЧ, параллель 2

ВИЧ-3 И ВИЧ-5
0,017/0,098%

ВИЧ-3 И ВИЧ-5
0,013/0,279%

ВИЧ-5
0,056%

ВИЧ-5
0,173%

ВИЧ, параллель 3

ВИЧ, параллель 4

ВИЧ, параллель 5

PIN, параллель 1

PRDX5
0,33%

PRDX5
0,119%

PRDX5
1,58%

PRDX5
0,549%

PIN, параллель 2

PIN, параллель 3

PIN, параллель 4

PIN, параллель 5

Пример 16 - Анализ УФ-опосредованного обмена пептидов

[0452] УФ-опосредованное расщепление условного лиганда может зависеть от времени. При использовании описанных выше условий, расщепление пептидов можно определять через 1 мин, и оно может являться, по существу, полным после приблизительно 15 мин. Для обеспечения оптимального обмена условного лиганда интересующим пептидом, как правило, можно использовать время инкубации от 30 до 60 мин. Концентрация белка может влиять на скорость УФ-опосредованного расщепления, т.к. нитрофенильный остаток и продукт реакции поглощают длинноволновый ультрафиолетовый свет. Кроме того, длина пути может влиять на скорость реакции. Свободный пептид, восприимчивый к молекулам MHC, образованным после воздействия УФ, можно выделять посредством осуществления УФ-опосредованного расщепления в присутствии интересующего лиганда MHC. В большинстве экспериментов используют 100-кратный молярный избыток пептида относительно MHC. УФ-индуцированный обмен пептидов, как правило, осуществляют с использованием 25 мкг/мл УФ-чувствительных комплексов MHC класса I. Однако реакции обмена пептидов можно осуществлять с использованием концентраций MHC класса I до 100-200 мкг/мл.

[0453] Материалы:

96-луночные планшеты (кат. № 651201, полипропиленовый 96-луночный микропланшет с V-образным дном, Greiner Bio-one)

УФ-лампа 366 нм CAMAG UV Cabinet 3 (кат. №: 022.9070, CAMAG), оборудованная УФ-лампой с длинноволновым УФ, 366 нм, 2×8 W (кат. № 022.9115, CAMAG) или световой трубкой Uvitec с 2×15W, лампа черного света 365 нм (модель - LI215BLB с размерами L×W×H 505×140×117 мм)

Центрифуга с ротором для планшетов для микротитрования.

[0454] Способ:

[0455] 1. В каждую лунку 96-луночного планшета добавляют следующие реагенты:

Реагент	Количество	Конечная концентрация
PBS	100 мкл	Не применимо
10-кратный пептид для обмена (500 мкМ в PBS)	12,5 мкл	50 мкМ
10-кратные УФ-чувствительные молекулы MHC класса I (250 мкг/мл; ~5 мкМ)	12,5 мкл	25 мкг/мл (приблизительно 0,5 мкМ)

[0456] 2. Помещают 96-луночный планшет под УФ-лампу (366 нм) на 1 ч. с расстоянием между УФ-лампой и образцом приблизительно 5 см.

[0457] 3. Центрифугируют планшет при 3300×g в течение 5 минут. Переносят 100 мкл супернатанта (держа планшет под углом во избежание переноса какого-либо осадка) в новый 96-луночный планшет для последующего использования.

Пример 17 - Сборка конъюгированных с флуорохромом мультимерами pMHC

[0458] Комплексы MHC класса I можно комплексировать с меченым флуорофором стрептавидином для образования тетрамеров MHC класса I для анализа T-клеток. Общеупотребительные флуорофоры включают аллофикоцианин и фикоэритрин, и образование мультимеров MHC с этими конъюгатами описано ниже. Однако для получения мультимеров MHC для детекции T-клеток также можно использовать покрытые стрептавидином квантовые точки.

[0459] Материалы:

Раствор PE-стрептавидина 1 мг/мл (кат. № S866, Molecular Probes) или раствор APC-стрептавидин 1 мг/мл (кат. № S868, Molecular Probes)

Планшеты для микротитрования с замененными комплексами MHC класса I, содержащие 25 мкг/мл pMHC в 100 мкл/лунку. Это соответствует 2,5 мкг или 0,05 нмоль MHC класса I на лунку.

[0460] Способ:

[0461] 1. Получают разведения 27 мкг/мл стрептавидина-PE в PBS или 14,6 мкг/мл стрептавидина-APC в PBS, получая 100 мкл MHC класса I на каждую лунку.

[0462] 2. Добавляют стрептавидин-PE или -APC к MHC класса I посредством четырех последовательных добавлений 25 мкл с 10-минутными интервалами.

Пример 18 - Комбинаторное кодирование мультимеров MHC

[0463] UV-опосредованный обмен пептидов MHC

[0464] 1. Размораживают стоковый раствор биотинилированных комплексов p*MHC на льду.

[0465] 2. Разбавляют интересующие биотинилированные комплексы p*MHC в PBS до 200 мкг/мл. Необходим объем 60 мкл на реакцию обмена. Для конъюгации комплексов pMHC с Qdot585 необходимо 80 мкл на реакцию обмена.

[0466] 3. Разбавляют стоковые растворы пептида до 400 мкМ в PBS. Получают минимум 70 мкл на пептид; для пептидов, используемых для конъюгации комплексов pMHC с Qdot585, получают минимум 90 мкл на пептид.

[0467] 4. В 96-луночном полипропиленовом микропланшете с V-образным дном смешивают 60 мкл 200 мкг/мл p*MHC выбранного аллеля и 60 мкл раствора пептида 400 мкМ на лунку (конечные концентрации: 100 мкг/мл p*MHC и 200 мкМ пептид). Для конъюгации комплексов pMHC с Qdot585 смешивают 80 мкл 200 мкг/мл p*MHC и 80 мкл раствора пептида 400 мкМ.

[0468] 5. 96-луночный микропланшет подвергают воздействию УФ-света (~366 нм) в течение 1 ч. при RT. Расстояние до УФ-лампы должно составлять 2-5 см.

[0469] 6. Центрифугируют планшет при 3300×g в течение 5 мин при RT.

[0470] 7. При включении точки паузы повторяют стадию 6 и переносят 2×50 мкл супернатанта в два новых 96-луночных полипропиленовых микропланшета с V-образным дном и держат их на льду. Для конъюгации комплексов pMHC с Qdot585 переносят 2×70 мкл. Необходимо быть осторожными, чтобы не перенести осадок на дне (зачастую невидимый), т.к. перенос агрегатов потенциально будет повышать фон конечного окрашивания мультимеров MHC.

[0471] 8. Мультимеризуют мономеры pMHC посредством конъюгации с конъюгатами флуорохром-стрептавидин. Дифференциальная конъюгация описана ниже: вариант A для конъюгации с Qdot605-, 625-, 655- или 705-стрептавидином; вариант B для конъюгации с Qdot585-стрептавидином; и вариант C для конъюгации с PE-, APC- или PE-Cy7-стрептавидином.

[0472] (A) Конъюгация с Qdot605-, 625-, 655- или 705-стрептавидином: (i) Добавляют 3,5 мкл конъюгата Qdot-стрептавидин (стоковая концентрация 1 мкМ) на 50 мкл мономера pMHC (до конечной концентрации 66 нМ).

[0473] (B) Конъюгация с Qdot585-стрептавидином: (i) Добавляют 4,9 мкл конъюгата Qdot585-стрептавидин (стоковая концентрация 1 мкМ) на 70 мкл мономера pMHC (до конечной концентрации 66 нМ).

[0474] (C) Конъюгация с PE -, APC- или PE-Cy7-стрептавидином: (i) Добавляют 4,6 мкл конъюгата PE-, APC- или PE-Cy7-стрептавидин (стоковая концентрация 200 мкг/мл) на 50 мкл мономера pMHC (до конечной концентрации 16,8 мкг/мл).

[0475] 9. Хорошо перемешивают и оставляют конъюгироваться в течение 30 мин на льду.

[0476] 10. Добавляют D-биотин и NaN₃ до конечной концентрации 25 мкМ D-биотина и 0,02% (масс./об.) NaN₃. Это осуществляют посредством добавления 2,5 мкл 20-кратного стокового раствора (500 мкМ D-биотина с 0,4% (масс./об.) NaN₃) в каждую лунку; для конъюгации мультимеров MHC с Qdot585 в каждую лунку добавляют 3,5 мкл. Хорошо перемешивают и инкубируют на льду в течение 20 мин.

[0477] 11. Добавляют 50 мкл PBS, содержащего 25 мкМ D-биотина и 0,02% (масс./об.) NaN₃, к мультимерам MHC, конъюгированным с PE, APC или PE-Cy7 (двукратное разведение).

[0478] 12. Смешивают разные комплексы. При смешивании используют соотношение 2:1 с Qdot585 к любому другому цветному комплексу. Все остальные цветные комплексы смешивают в соотношении 1:1.

Окрашивание T-клеток с использованием мультимеров MHC

[0479] 13. Смешивают мультимеры MHC для всех 27 цветных комбинаций для получения одного готового к использованию образца, центрифугируют его при 3300×g в течение 5 мин при 4°C и переносят супернатант. Всего потребуется 54 мкл супернатанта для каждого окрашивания T-клеток (т.е. 2 мкл для каждого отдельного комплекса pMHC, присутствующего в смеси).

[0480] 14. Размораживают образцы PBMC (или другие соответствующие образцы T-клеток) и дважды промывают их RPMI. Рекомендовано обрабатывать ДНКазой после размораживания для снижения слипания клеток (например, посредством размораживания клеток в среде, содержащей 0,025 мг/мл Pulmozyme и 2,5 мМ MgCl₂).

[0481] 15. Ресуспендируют клетки в PBS с 2% (об./об.) FBS (буфера для FACS) и распределяют их по 96-луночному полистироловому микропланшету с U-образным дном в количестве до 3×10⁶ клеток на лунку в 200 мкл буфера для FACS.

[0482] 16. Центрифугируют планшет при 490×g в течение 5 мин при RT.

[0483] 17. Удаляют буфер, встряхивая планшет вверх дном - клетки остаются в виде осадка на дне лунки.

[0484] 18. Добавляют 54 мкл мультимеров MHC со стадии 13 и хорошо перемешивают.

[0485] 19. Инкубируют в течение 15 мин при 37°C.

[0486] 20. Помещают планшет на лед и добавляют 20 мкл смеси антител из 5-кратного стока.

[0487] 21. Добавляют 4 мкл 40-кратного разведения красителя для погибших клеток в ближней ИК-области и тщательно перемешивают.

[0488] 22. Инкубируют в течение 30 мин на льду.

[0489] 23. Центрифугируют планшет при 490×g в течение 5 мин при 4°C.

[0490] 24. Удаляют супернатант, встряхивая планшет вверх дном.

[0491] 25. Дважды промывают 200 мкл буфера для FACS (дважды центрифугируют при 490×g в течение 5 мин при 4°C и встряхивают планшет вверх дном после каждого центрифугирования для удаления супернатанта).

[0492] 26. Ресуспендируют осадок в 50-100 мкл буфера для FACS и переносят его в пробирки для FACS 1,4 мл или 5 мл. Теперь образцы готовы к анализу с помощью проточного цитометра.

Контроли одноцветной компенсации

[0493] 27. В 11 пробирок для FACS (№№ 1-11) добавляют 100 мкл буфера для FACS и одну каплю частиц для отрицательной компенсации.

[0494] 28. Добавляют одну каплю частиц для компенсации против Ig-κ мыши в пробирки №№ 1-10 со стадии 27 и одну каплю ArC-аминореактивных частиц в новую пробирку (№ 12).

[0495] 29. В пробирки №№ 1-8 добавляют 5 мкл 1 мг/мл антител против CD8 с биотином и смешивают.

[0496] 30. Пробирки №№ 1-8 инкубируют в течение 20 мин на льду.

[0497] 31. Пробирки №№ 1-8 дважды промывают 2 мл буфера для FACS (центрифугируют при 490×g в течение 5 мин при 4°C).

[0498] 32. В пробирку № 12 (со стадии 28) добавляют 1 мкл красителя для погибших клеток в ближней ИК-области; смешивают и инкубируют в течение 30 мин при RT в темноте.

[0498] 33. Разводят конъюгаты стрептавидин-флуорохром в десять раз (за исключением Qdot585), добавляют 5 мкл каждого в пробирки №№ 1-7, добавляют 1 мкл неразведенного Qdot585-стрептавидина в пробирку № 8, а затем инкубируют в течение 20 мин на льду в темноте.

[0500] 34. В пробирки №№ 9 и 10 (со стадии 28) добавляют 5 мкл FITC-антитела (используют одно из антител против антигенов контрольного канала) или 5 мкл антитела против CD8a с Alexa 700; инкубируют в течение 20 мин на льду в темноте.

[0501] 35. Пробирки №№ 1-11 дважды промывают 2 мл буфера для FACS и дважды промывают пробирку № 12 2 мл PBS (центрифугируют при 490×g в течение 5 мин при 4°C).

[0502] 36. Ресуспендируют содержимое всех пробирок с 150 мкл буфера для FACS. В пробирку № 12 добавляют одну каплю ArC-отрицательных частиц и смешивают. Контроли компенсации готовы для анализа с помощью проточного цитометра.

Стратегия гейтирования

[0503] 37. Гейтируют сначала лимфоциты, а затем отдельные клетки (FSC-α, FSC-W), живые клетки, клетки, отрицательные по антигенам контрольного канала, и CD8⁺ клетки.

[0504] 38. Проводят раздельные гейты, определяющие положительные события в восьми разных каналов мультимеров MHC.

[0505] 39. Инвертируют восемь положительных по мультимерам MHC гейтов для получения восьми гейтов, по которым выбирают CD8⁺ и отрицательные по мультимерам MHC клетки для каждого канала мультимеров MHC.

[0506] 40. Накладывают гейты для двух положительных по мультимерам MHC популяций с инвертированными гейтами для каждой из шести других популяций с мультимерами MHC. Это комбинирование гейтов позволяет осуществлять селекцию CD8⁺ клеток, являющихся положительными в двух и только двух каналах мультимеров MHC (т.е. если клетка является положительной в одном или трех или более каналах мультимеров MHC, ее гейтируют отрицательно). Примером такого гейта являются PE⁺, и APC⁺, и PE-Cy7^-, и Qdot585^-, и Qdot605^-, и Qdot625^-, и Qdot655^-, и Qdot705^-.

[0507] 41. Получают эти наложенные гейты (описанные на стадии 40) для всех 28 возможных двухцветных комбинаций мультимеров MHC.

[0508] 42. Соединяют все 28 гейтов со стадии 41 (например, гейт 1, или гейт 2, или … или гейт 28).

[0509] 43. Накладывают восемь инвертированных гейтов со стадии 39 (PE⁻, и APC⁻, и PE-Cy7⁻, и Qdot585⁻, и Qdot605⁻, и Qdot625⁻, и Qdot655⁻, и Qdot705⁻).

[0510] 44. Соединяют два гейта со стадий 42 и 43.

[0511] 45. Получают 28 точечных диаграмм со всеми возможными двухцветными кодами, на которых показаны события, гейтированные положительно на стадии 44. На этих диаграммах показаны только CD8⁺ клетки, отрицательные по всем мультимерам MHC или положительные по двум; все фоновые события гейтируют отрицательно.

[0512] 46. Также получают 28 точечных диаграмм со всеми возможными двухцветными кодами, где показаны все CD8⁺ клетки. Эти графики хорошо отражают фоновый уровень в образце, и их также можно использовать для выявления неправильной компенсации. Рекомендовано сравнение этих "негейтированных" графиков с гейтированными графиками для получения опыта отделения ответов от фона. Это может иметь особое значение для популяций низкой интенсивности.

Пример 19 - Фосфо-специфическая проточная цитометрия с флуоресцентным мечением клеток штрихкодами

[0513] Клеточное мечение штрихкодами можно использовать для осуществления мультиплексированного фенотипического и функционального анализа посредством проточной цитометрии. Фосфо-специфическую проточную цитометрию можно осуществлять с небольшими модификациями для включения мечения FCB. После фиксации формальдегидом образцы будут ресуспендировать в 100% 20-25°C метаноле (как правило, 500 мкл на 10⁶ клеток), содержащем указанную концентрацию Alexa Fluor или сукцинимидиловых сложных эфиров Pacific Blue, при этом к каждому образцу добавляют разные концентрации флуоресцентного красителя. В некоторых случаях, образцы можно ресуспендировать в метаноле, а затем будут добавлять флуорофоры FCB, растворенные в DMSO (как правило, разведение 1:50). Это можно осуществлять, чтобы сделать возможным предшествующее получение и хранение матриц окрашивания FCB в DMSO, необходимое для экспериментов с 96-луночными планшетами. После мечения в течение 15 мин при 20-25°C клетки будут дважды промывать средой для окрашивания (фосфатно-солевой буфер (pH 7,0), содержащий 0,5% BSA и 0,02% азида натрия). Мечение при 4°C или меньшей температуре будет приводить к очень низкой интенсивности мечения, что позволяет хранить образцы при -80°C в метаноловом растворе для окрашивания без повышения уровней окрашивания FCB.

[0514] Дифференциально меченые образцы будут объединять в одной пробирке или лунке для FACS и снова осаждать, если получаемый объем превышает 100. Объединенный, меченый штрихкодами образец (как правило, 100 мкл) будут окрашивать фосфо-специфическими антителами и/или антителами против поверхностных маркеров, промывать и анализировать посредством проточной цитометрии. Проточную цитометрию можно осуществлять с помощью проточного цитометра BD LSR2, оборудованного лазерами 405 нм, 488 нм и 633 нм и стоковыми фильтрами производителя с заменой восьмиугольного полосового фильтра 405 нм Cascade Yellow полосовым фильтром 610/20 для детекции квантовой точки 605.

Пример 20 - Индуцирование CD4⁺ наивных T-клеток

[0515] Способы 1 и 2 осуществляли с использованием пептидов PIN. Анализировали антигенспецифические CD4⁺ наивные T-клетки. Результаты представлены ниже в таблице 4.

Таблица 4 - Результаты индуцирования CD4⁺ наивных T-клеток доноров 1 и 2

Считывание при длительном индуцировании		Донор 2	Донор 1
LTS#35		Способ 1 (CD25^-)	Способ 2 (целые PBMC)	Способ 2 (CD25^-)	Способ 1 (CD25^-)	Способ 2 (целые PBMC)	Способ 2 (CD25^-)
Индуцирование длинными пептидами	PIN, параллель 1	Y	Y	Y	Y	Y	Y
Индуцирование длинными пептидами	PIN, параллель 2	Y	Y	Y	Y	-	-
PIN, параллель 3	-	Y	Y	Y	Y	-
Результаты	2/3 66%	3/3 100%	3/3 100%	3/3 100%	2/3 66%	1/3 33%

Пример 21 - Способ производства: получение DC

Стадия 1	Обогащение моноцитов и культивирование DC	Аутологичные Клетки Аферезный пакет №1
Стадия 2	Обогащение моноцитов и культивирование DC	Обогащение моноцитов
Стадия 3	Культивирование DC
Стадия 4	Нагрузка пептидов и созревание DC	Сбор DC, ресуспендирование в средах для DC
Стадия 5	Нагрузка пептидов и созревание DC	Добавление специфических для пациента пептидов и инкубация
Стадия 6	Созревание DC

Пример 22 - Способ индуцирования T-клеток 1

Индуцирование T-клеток №1

Стадия 7	Аутологичные клетки Аферезный пакет №2
Стадия 8	Истощение CD25⁺ (± истощение CD14⁺)
Стадия 9	Промывка DC и ресуспендирование в средах для культивирования T-клеток
Стадия 10	Инкубация T-клеток со зрелыми DC (из "Получение DC")

Индуцирование T-клеток №2

Стадия 11	Промывка T-клеток и ресуспендирование в средах для T-клеток
Стадия 12	Инкубация T-клеток со зрелыми DC (из "Получение DC")

Индуцирование T-клеток №3

Стадия 11	Промывка T-клеток и ресуспендирование в средах для T-клеток
Стадия 12	Инкубация T-клеток со зрелыми DC (из "Получение DC")

Сбор и криоконсервация

Стадия 15		Сбор T-клеток	Тестирование высвобождения: микоплазма
Стадия 16	Лекарственное вещество (DS)	Промывка и суспендирование в конечном составе	Тестирование высвобождения: стерильность, эндотоксин, фенотип клеток, количество TNC, жизнеспособность, концентрация клеток, активность
Стадия 17	Лекарственный продукт (DP)	Наполнение и криоконсервация DS Хранение в парах жидкого азота

Пример 23 - Способ индуцирования T-клеток 2

Индуцирование T-клеток №1

Стадия 7	Аутологичные клетки Аферезный пакет №2
Стадия 8	Истощение CD25⁺ (± истощение CD14⁺)
Стадия 8a	Добавление FLT3L
Стадия 9	Добавление специфических для пациента пептидов и инкубация
Стадия 10	Инкубация истощенных PMBC с FLT3L и пептидами

Индуцирование T-клеток №2

Стадия 11	Промывка T-клеток и ресуспендирование в средах для T-клеток
Стадия 12	Инкубация T-клеток со зрелыми DC (из "Получение DC")

Индуцирование T-клеток №3

Стадия 11	Промывка T-клеток и ресуспендирование в средах для T-клеток
Стадия 12	Инкубация T-клеток со зрелыми DC (из "Получение DC")

Сбор и криоконсервация

Стадия 15		Сбор T-клеток	Тестирование высвобождения: микоплазма
Стадия 16	Лекарственное вещество (DS)	Промывка и суспендирование в конечном составе	Тестирование высвобождения: стерильность, эндотоксин, фенотип клеток, количество TNC, жизнеспособность, концентрация клеток, активность
Стадия 17	Лекарственный продукт (DP)	Наполнение и криоконсервация DS Хранение в парах жидкого азота

Пример 24 - Одновременная детекция и функциональная характеризация ответов CD4⁺ и CD8⁺ неоантиген-специфических T-клеток с использованием мультиплексированной, многопараметрической проточной цитометрии

[0524] Неоантигены, возникающие в злокачественных клетках в результате соматических мутаций, изменяющих кодирующие белок последовательности генов, представляют привлекательную мишень для иммунотерапии. Они уникальным образом экспрессируются на опухолевых клетках в противоположность здоровой ткани и могут распознаваться иммунной системой как чужеродные антигены, повышая иммуногенность. Способы производства T-клеток разрабатывали для вызывания анамнестических ответов и ответов de novo CD4⁺ и CD8⁺ T-клеток на специфические для пациента неоантигены с помощью множества раундов стимуляции T-клеток ex vivo, получая неоантиген-реактивный T-клеточный продукт для использования в адоптивной клеточной терапии. Подробную характеризацию стимулированного T-клеточного продукта можно использовать для тестирования множества потенциальных переменных, используемых в этих способах.

[0525] Для оценки функциональности и/или специфичности T-клеток разрабатывали анализ для одновременной детекции ответов антигенспецифических T-клеток и характеризации величины и функции этих ответов. В этом анализе использовали следующие стадии. Первые совместные культуры T-клеток и APC использовали для вызывания реактивности в антигенспецифических T-клетках. Необязательно, использовали мультиплексирование образцов с помощью флуоресцентного штрихкод-мечения клеток. Для идентификации антигенспецифических CD8⁺ T-клеток и исследования функциональности T-клеток изучали окрашивание мультимеров пептид-MHC и многопараметрическое внутриклеточное окрашивание и/или окрашивание поверхностных клеточных маркеров одновременно с использованием анализа FACS. Результаты этого усовершенствованного анализа показали его полезность для исследования T-клеточных ответов, индуцированных у здорового донора. У здорового донора определяли неоантиген-специфические T-клеточные ответы, индуцированные против пептидов. Также сравнивали величину, специфичность и функциональность индуцированных T-клеточных ответов. На фиг. 25 и фиг. 26 показаны примеры способов одновременного анализа профиля клеточных маркеров и окрашивания тетрамера MHC из образца T-клеток.

[0526] В кратком изложении, разные образцы T-клеток метили штрихкодами с использованием разных флуоресцентных красителей в разных концентрациях (см., например, пример 19). В каждый образец добавляли разные концентрации флуоресцентного красителя или комбинации множества красителей в разных концентрациях. Образцы ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере (PBS), а затем добавляли флуорофоры, растворенные в DMSO (как правило, в разведении 1:50), до максимальной конечной концентрации 5 мкМ. После мечения в течение 5 мин при 37°C избыток флуоресцентного красителя тушили добавлением белок-содержащей среды (например, среды RPMI, содержащей 10% смешанной сыворотки человека типа AB). Культуры уникально меченых штрихкодами T-клеток стимулировали аутологичными APC, в которые вводили антигенные пептиды, как описано выше.

[0527] Дифференциально меченые образцы объединяли в одной пробирке или лунке для FACS и снова осаждали, если получаемый объем превышал 100 мкл. Объединенный меченый штрихкодами образец (как правило, 100 мкл) окрашивали антителами против поверхностных маркеров, включая LAMP-1 (см., например, пример 11), и инкубировали с собранными, конъюгированными с флуорохромом мультимерами пептид-MHC (см., например, примеры 17 и 18 выше). После фиксации и пермеабилизации образец дополнительно окрашивали внутриклеточно с использованием антител против ФНОα и ИФНγ.

[0528] Затем профиль клеточных маркеров и окрашивание тетрамеров MHC объединенного, меченого штрихкодами образца T-клеток анализировали одновременно посредством проточной цитометрии с помощью проточного цитометра. В отличие от других способов, с помощью которых профили клеточных маркеров и окрашивание тетрамеров MHC образца T-клеток анализируют раздельно, с помощью описанного в этом примере одновременного анализа профиля клеточных маркеров и окрашивания тетрамеров MHC в образце T-клеток получают информацию о процентной доли T-клеток, являющихся антигенспецифическими и имеющими усиленное окрашивание клеточных маркеров. С помощью других способов, посредством которых анализируют профили клеточных маркеров и окрашивание тетрамеров MHC образца T-клеток, отдельно определяют процентную долю T-клеток из образца, являющихся антигенспецифическими, и отдельно определяют процентную долю T-клеток, имеющих усиленное окрашивание клеточных маркеров, что позволяет лишь определять корреляцию этих долей. Описанный в этом примере одновременный анализ профиля клеточных маркеров и окрашивание тетрамеров MHC образца T-клеток не основан на корреляции доли антигенспецифических T-клеток и доли T-клеток, имеющих усиленное окрашивание клеточных маркеров; точнее, с помощью него определяют долю T-клеток, являющихся антигенспецифическими и имеющими усиленное окрашивание клеточных маркеров. Описанный в этом примере одновременный анализ профиля клеточных маркер и окрашивание тетрамеров MHC образца T-клеток делает возможным определение на уровне отдельных клеток тех клеток, которые являются антигенспецифическими и имеют усиленное окрашивание клеточных маркеров.

[0529] Для оценки успеха указанного способа индуцирования использовали анализ вторичного иммунного ответа с последующим мультиплексированным, многопараметрическим анализом панели проточной цитометрии. Образец, взятый из индукционной культуры, метили уникальным двухцветным флуоресцентным клеточным штрихкодом. Меченые клетки инкубировали на нагруженных антигеном DC или ненагруженных DC в течение ночи для стимуляции функционального ответа в антигенспецифических клетках. На следующий день уникально меченые клетки объединяли перед окрашиванием с помощью антитела и окрашиванием мультимеров в соответствии с представленной ниже таблицей.

Маркер	Флуорохром	Цель
CD19/CD16/CD14	BUV395	Исключение клеток
Живые/погибшие	Near-IR	Исключение погибших клеток
CD3	BUV805	Гейтирование по линии клеток
CD4	Alexa Fluor 700	Гейтирование по линии клеток
CD8	PerCP-Cy5,5	Гейтирование по линии клеток
Штрихкод 1	CFSE	Мультиплексирование образца
Штрихкод 2	TagIT Violet	Мультиплексирование образца
Мультимер 1	PE	Антигенспецифичность CD8⁺ клеток
Мультимер 2	BV650	Антигенспецифичность CD8⁺ клеток
ИФНγ	APC	Функциональность
ФНОα	BV711	Функциональность
CD107a	BV786	Цитотоксичность
4-1BB	PE/Dazzle 594	Активация

[0530] Определяли возможность полной деконволюции мультиплексированных образцов посредством мечения и анализа раздельно или в виде смеси (фиг. 27A). Уникально меченые образцы можно полностью разрешать с минимальной перекрестной контаминацией или без перекрестной контаминации с другими штрихкодами. Детекцию антигенспецифических CD8⁺ T-клеток посредством окрашивания мультимеров поддерживали посредством мультиплексирования образца. Образец индукционной культуры, содержащий ~20% CD8⁺ T-клеток со специфичностью к pp65 CMV, BRLF1 EBV, BMLF1 EBV и/или MART-1 разделяли, метили девятью уникальными двухцветными штрихкодами, а затем объединяли для окрашивания с помощью тетрамеров, соответствующих всем четырем специфичностям в тех же двухцветных комбинациях (бриллиантовый фиолетовый 650 [BV650] и фикоэритрин [PE]) (фиг. 27B). Все девять штрихкодов приводили к сравнимому профилю окрашивания тетрамеров, и с помощью них определяли девять тетрамер-положительных клеток.

[0531] Образцы из двух индуцированных культур, имеющих ответы de novo CD4⁺ T-клеток, также анализировали с помощью анализа вторичного иммунного ответа в отдельности без штрихкод-мечения или смешанными с неродственными образцами (фиг. 28A и фиг. 28B). Количество функций и величина вызванного ответа клеток не изменялись значимо при штрихкод-мечении образцов.

[0532] Одновременный анализ специфичности и функциональности индуцированных анамнестических ответов CD8⁺ T-клеток показал, что анамнестические ответы CD8⁺ T-клеток против эпитопов pp65 CMV, MART-1 и BRLF1 и BMLF1 EBV можно индуцировать с 0,23% CD8⁺ T-клеток в исходном материале здорового донора до >60% (фиг. 29A)

[0533] Функцию антигенспецифических T-клеток селективно исследовали посредством предварительного гейтирования по CD8⁺ мультимер⁺ клеткам (фиг. 29B). Клетки демонстрировали цитотоксическую функцию (поверхностное воздействие на CD107a) и секрецию ИФНγ после воздействия нагруженных антигеном DC.

[0534] Также показана детекция и функциональная характеризация индуцированных ответов de novo CD4⁺ T-клеток со множественными специфичностями в одной культуре. Антигенспецифическую функциональность использовали для идентификации индуцированных ответов CD4⁺ T-клеток (фиг. 30A). В представленном примере индуцирование осуществляли в четырех параллельных культурах, направленно воздействую на 10 полученных из ВИЧ эпитопов, являющихся наивными мишенями у ВИЧ-отрицательного здорового донора. Антигенспецифические ответы определяли во всех четырех параллелях. Три из определенных ответов выбирали для дополнительного последующего исследования посредством деконволюции совокупности для идентификации специфичности индуцированных ответов (фиг. 30B). Множественные ответы определяли в каждой тестируемой параллели, и те же два эпитопа (ВИЧ №5 и ВИЧ №7) индуцировали ответ с наибольшей величиной в каждом случае. Не желая быть связанными какой-либо теорией, полагают, что это может отражать более высокую иммуногенность этих эпитопов у этого донора из-за гаплотипа MHC класса II или более высокой доли предшественников T-клеток, нацеленных на эти эпитопы в наивном репертуаре. Чувствительность к антигену определяли для трех выбранных ответов посредством титрования пептида во время нагрузки DC (фиг. 30C). В случае ответов на ВИЧ №5, ВИЧ №6 и ВИЧ №4 определяли EC₅₀ 0,45 мкМ, 0,43 мкМ и 9,1 мкМ, соответственно.

Пример 25 - Способ производства T-клеток 3

[0535] Материалы:

[0536] Среда AIM V (Invitrogen)

[0537] FLT3L человека, доклинический, CellGenix #1415-050, сток 50 нг/мкл

[0538] ФНОα, доклинический, CellGenix #1406-050, сток 10 нг/мкл

[0539] ИЛ-1β, доклинический, CellGenix #1411-050, сток 10нг/мкл

[0540] PGE1 или алпростадил - Cayman (Чешская Республика), сток 0,5 мкг/мкл

[0541] Среда R10 - RPMI 1640 GlutaMax+10% сыворотка человека+1% ПенСтреп

[0542] Среда 20/80-18% AIM V+72% RPMI 1640 GlutaMax+10% сыворотка человека+1% ПенСтреп

[0543] ИЛ-7, сток 5нг/мкл

[0544] ИЛ-15, сток 5нг/мкл

[0545] Способ:

[0546] Стадия 1: Высевают 5 миллионов PBMC (или интересующих клеток) в каждую лунку 24-луночного планшета с FLT3L в 2 мл среды AIM V

[0547] Стадия 2: Нагрузка пептидом и созревание - в AIMV

[0548] 1. В соответствующих лунках смешивают интересующую совокупность пептидов (за исключением условий без пептидов) с PBMC (или интересующими клетками).

[0549] 2. Инкубируют в течение 1 ч.

[0550] 3. После инкубации в каждой лунке смешивают смесь для созревания (включая ФНОα, ИЛ-1β, PGE и ИЛ-7).

[0551] Стадия 3: В каждую лунку добавляют сыворотку человека в конечной концентрации 10% об. и смешивают.

[0552] Стадия 4: Заменяют среду свежей средой RPMI+10% HS, дополненной ИЛ-7+ИЛ-15.

[0553] Стадия 5: В течение периода инкубации каждые 1-6 дней среду заменяют свежей средой 20/80, дополненной ИЛ-7+ИЛ-15.

[0554] Стадия 6: В каждую лунку нового 6-луночного планшета с FLT3L в 2 мл среды AIM V Высевают 5 миллионов PBMC (или интересующих клеток).

[0555] Стадия 7: Нагрузка пептидом и созревание для повторной стимуляции (новые планшеты)

[0556] 1. В соответствующих лунках смешивают интересующую совокупность пептидов (за исключением условий без пептидов) с PBMC (или интересующими клетками).

[0557] 2. Инкубируют в течение 1 ч.

[0558] 3. После инкубации в каждой лунке смешивают смесь для созревания.

[0559] Стадия 8: Повторная стимуляция:

[0560] 1. После первой стимуляции FLT3L подсчитывают клетки в культурах и добавляют 5 миллионов культивируемых клеток в новые планшеты для повторной стимуляции.

[0561] 2. Доводят объем культуры до 5 мл (AIM V) и добавляют 500 мкл сыворотки человека (10% об.)

[0562] Стадия 9: Удаляют 3 мл среды и добавляют 6 мл среды RPMI+10% HS, дополненной ИЛ-7+ИЛ-15.

[0563] Стадия 10: Заменяют 75% среды свежей средой 20/80, дополненной ИЛ-7+ИЛ-15.

[0564] Стадия 11: При необходимости, повторяют повторную стимуляцию.

Пример 26 - Экспериментальные данные об использовании способа производства T-клеток 3

[0565] T-клетки получали с использованием способа производства T-клеток 3 и анализировали стимулированные T-клетки. Образцы получали из двух пациентов с меланомой. T-клетки анализировали с использованием схожих анализов, как описано в примере 24. На фиг. 34 показаны графики мультимеров pMHC, где количественно проанализированы индуцированные ответы CD8⁺ T-клеток из пациентов с меланомой. В рамках изобретения термин "стимуляция неоантигеном" относится к способу производства T-клеток. На фиг. 35 показаны данные о полифункциональном профиле анамнестического ответа и ответа de novo, индуцированных у пациента с меланомой, о чем свидетельствует комбинация 1, 2, 3 или 4 функций. Одна или более функций представляет собой продукцию одного или более факторов, выбранных из ИФНγ, ФНОα, CD107a и 4-1BB. На фиг. 36 показана специфичность анамнестического ответа и ответа de novo, индуцированных у пациента с меланомой против мутантного пептида и пептида дикого типа. На фиг. 37A, 37B и 37C показан профиль цитотоксичности анамнестического ответа и ответа de novo, индуцированных у пациента с меланомой, что количественно анализировали по доле CD8⁺CD107a⁺ T-клеток (верхние панели). На нижних панелях фиг. 37A, 37B и 37C показан цитолиз клеток-мишеней при этих T-клеточных ответах, что количественно анализировали по доле aCAS3⁺ опухолевых клеток. На фиг. 38A показана идентификация ответов неоантиген-специфических CD4⁺ T-клеток у пациента с меланомой. На фиг. 38B показана специфичность этих ответов CD4⁺ T-клеток, показанных на фиг. 38A, против мутантных пептидов и пептидов дикого типа. На фиг. 38C представлен профиль полифункциональности этих ответов CD4⁺ T-клеток, показанный с помощью комбинации 1, 2, 3 или 4 функций. Одна или более функций представляет собой продукцию одного или более факторов, выбранных из ИФНγ, ФНОα, CD107a и 4-1BB.

Пример 27 - Экспериментальные данные об использовании способа производства T-клеток 1 или 2

[0566] T-клетки получали с использованием способа производства T-клеток 1 или, альтернативно, способа 2. Стимулированные T-клетки анализировали с использованием схожих анализов, как описано в примере 24. На фиг. 39 показана функциональность анамнестических ответов, индуцированных у двух здоровых доноров (например, HD66 и HD63), при добавлении эпакадостата или без него, как показано с помощью комбинации 1, 2 или 3 функций (например, одна или более функций представляет собой продукцию одного или более факторов, выбранных из ИФНγ, ФНОα и CD107a). На фиг. 40 показан процент индуцированных ответов de novo CD8⁺ T-клеток ("коэффициент совпадений", усредненный по четырем здоровым донорам) в шести параллельных индуцированиях с добавлением эпакадостата или без него. На фиг. 41A показано абсолютное количество антигенспецифических клеток донора HD55 после индуцирования способом производства T-клеток, представленным в настоящем описании, с добавлением PD-1-блокирующего антитела или без него. На фиг. 41B показано абсолютное количество антигенспецифических клеток донора HD 67 после индуцирования способом производства T-клеток, представленного в настоящем описании, с добавлением PD-1-блокирующего антитела или без него. На фиг. 42A показана фракция pMHC⁺ CD8⁺ T-клеток в рамках ответов de novo CD8⁺ T-клеток с добавлением ИЛ-12 или без него. На фиг. 42B показана процентная доля CD8⁺ T-клеток в рамках ответов de novo CD8⁺ T-клеток с добавлением ИЛ-12 или без него.

Пример 28: Глубокая характеризация иммунных ответов, индуцированных против специфических для пациента неоантигенов с использованием

[0567] Для оценки иммуногенной способности специфические для пациента неоантигенов прогнозировали с использованием биоинформатического программного обеспечения. Синтетические длинные пептиды, охватывающие прогнозируемые неоантигены, использовали в качестве иммуногенов в способе стимуляции. Способ стимуляции включает подпитку этими кодирующими неоантиген пептидами полученных из пациента APC, которые затем сокультивируют с полученными из пациента T-клетками для примирования неоантиген-специфических T-клеток.

[0568] В способ стимуляции включено множество раундов стимуляции для примирования, активации и усиления анамнестических T-клеточных ответов и T-клеточных ответов de novo. Специфичность, фенотип и функциональность этих неоантиген-специфических T-клеток анализировали посредством характеризации этих ответов с использованием следующих анализов: анализ комбинаторного кодирования с использованием мультимеров pMHC использовали для детекции множественных ответов неоантиген-специфических CD8⁺ T-клеток. Анализ вторичного иммунного ответа с использованием мультиплексированной, многопараметрической проточной цитометрии использовали для идентификации и валидации ответов CD4⁺ T-клеток. Функциональность ответов CD8⁺ и CD4⁺ T-клеток анализировали посредством измерения продукции провоспалительных цитокинов, включая ИФНγ и ФНОα, и положительной регуляции CD107a в качестве маркера дегрануляции. Анализ цитотоксичности с помощью неоантиген-экспрессирующих линий опухолевых клеток использовали для определения способности CD8⁺ T-клеток распознавать и уничтожать клетки-мишени в ответ на природно процессированный и презентированный антиген. Цитотоксичность измеряли по положительной регуляции CD107a на поверхности T-клеток и положительной регуляции активной каспазы 3 на неоантиген-экспрессирующих опухолевых клетках. В этом исследовании образцы от пациента с меланомой (NV6 и NV10) получали по согласованию с IRB.

[0569] Способ стимуляции был успешным в отношении усиления уже существующих ответов CD8⁺ T-клеток, а также индуцирования ответов de novo CD8⁺ T-клеток (таблица 1).

Таблица 1

Пациент	Обозначение HUGO	Полное название гена	Тип
NV10	SRSF1_E>K	Богатый серином и аргинином фактор сплайсинга 1	CD8
	ARAP_Y>H	Анкириновый повтор и домен PH	CD8
	PKDREJ_G>R	Рецептор полицистинового семейства слизистой оболочки яйца
	MKRN1_S>L	Макорин RING-белок с цинковыми пальцами 1	CD4
	CREBBP_S>L	CREB-связывающий белок	CD4
TPCN1_K>E	Двухпорный кальциевый канал 1
NV6	AASDH_neoORF	Аминоадипат-полуальдегиддегидрогеназа	CD8
	ACTN4_K>N	Актинин альфа 4
	CSNK1A1_S>L	Казеинкиназа 1 альфа 1
	DHX40_neoORF	Хеликаза DEAH-бокс 40
	GLI3_P>L	Белок с цинковыми пальцами семейства GLI 3
	QARS_R>W	Глутаминил-TRNA-синтаза
	FAM178B_P>L	Член B семейства со сходством последовательностей 178
RPS26_P>L	Рибосомальный белок S26

[0570] При использовании PBMC пациента с меланомой NV10 наблюдали усиление ответа уже существующих CD8⁺ T-клеток с 4,5% CD8⁺ T-клеток до 72,1% CD8⁺ T-клеток (SRSF1_E>K). Кроме того, способ стимуляции являлся эффективным в индуцировании двух предполагаемых ответов de novo CD8⁺ T-клеток в отношении пациент-специфических неоантигенов (ARAP1_Y>H: 6,5% CD8⁺ T-клеток, и PKDREJG>R: 13,4% CD8⁺ T-клеток; клетки не являлись определимыми до стимуляции) (фиг. 34). С помощью способа стимуляции успешно индуцировали семь ответов de novo CD8⁺ T-клеток в отношении ранее описанных и новых модельных неоантигенов с использованием PBMC другого пациента с меланомой, NV6, с разными величинами (ACTN4_K>N, CSNK1A1_S>L, DHX40_neoORF 7, GLI3_P>L, QARS_R>W, FAM178B_P>Lи RPS26_P>L, диапазон: от 0,2% CD8⁺ T-клеток до 52% CD8⁺ T-клеток). Кроме того, усиливали ответ CD8⁺ T-клеток памяти на специфический для пациента неоантиген (AASDH_neoORF, до 13% CD8⁺ T-клеток после стимуляции).

[0571] Индуцированные CD8⁺ T-клетки пациента NV10 охарактеризовывали более подробно. После повторной стимуляции нагруженными мутантным пептидом DC неоантиген-специфические CD8⁺ T-клетки демонстрировали одну, две и/или все три функции (16,9% и 65,5% функциональных CD8⁺ pMHC⁺ T-клеток в случае SRSF1_E>K и ARAP1_Y>H, соответственно (фиг. 35)).

[0572] При повторной стимуляции разными концентрациями неоантигенных пептидов индуцированные CD8⁺ T-клетки отвечали в значительной степени на мутантный неоантигенный пептид, но не на пептид дикого типа (фиг. 36).

[0573] У пациента NV10 ответы CD4⁺ T-клеток определяли с помощью анализа вторичного иммунного ответа с использованием нагруженных мутантным неоантигеном DC (фиг. 38A-C). Определяли три ответа CD4⁺ T-клеток (MKRN1_S>L, CREBBP_S>L и TPCN1_K>E) с учетом реактивности в отношении DC, нагруженных мутантным неоантигенным пептидом. Эти ответы CD4⁺ T-клеток также имели полифункциональный профиль при повторной стимуляции мутантным неоантигенным пептидом. 31,3%, 34,5% и 41,9% CD4⁺ T-клеток демонстрировали одну, две и/или три функции; ответы на MKRN1_S>L, CREBBP_S>L и TPCN1_K>E, соответственно.

[0574] Также анализировали цитотоксическую способность индуцированных ответов CD8⁺ T-клеток пациента NV10 (фиг. 37A-C). В случае ответов на SRSF1_E>K и ARAP1_Y>Hнаблюдали значительную положительную регуляцию CD107a на CD8⁺ T-клетках и активной каспазы 3 на опухолевых клетках, трансдуцированных с использованием мутантной конструкции, после сокультивирования.

[0575] Используя способ стимуляции, подтверждали, что прогнозируемые специфические для пациента неоантигены, а также модельные неоантигены являлись иммуногенными при индуцировании множественных неоантиген-специфических ответов CD8⁺ и CD4⁺ T-клеток в материале пациента. Способность индуцировать полифункциональные и мутант-специфические ответы CD8⁺ и CD4⁺ T-клеток доказывали возможность прогнозирования неоантигенов высокого качества и достижения мощных T-клеточных ответов. Наличие множества обогащенных неоантиген-специфических популяций T-клеток (памяти и de novo) к концу стимуляции свидетельствует о возможности вызывать новые T-клеточные ответы и получать эффективные противоопухолевые иммунотерапевтические средства для лечения пациентов со злокачественными новообразованиями.

1. Способ получения опухолевых антигенспецифических Т-клеток ex vivo, включающий:

(a) истощение CD14+ клеток и CD25+ клеток в популяции иммунных клеток, включающих антигенпрезентирующие клетки (APC) и Т-клетки, тем самым формируя истощенную по CD14/CD25 популяцию иммунных клеток, содержащую первую популяцию APC и Т-клеток, где популяция иммунных клеток взята из биологического образца субъекта-человека, больного раком; и

(b) инкубирование истощенной по CD14/CD25 популяции иммунных клеток в течение первого периода времени в присутствии:

(i) лиганда рецептора FMS-подобной тирозинкиназы 3 (FLT3L) и

(ii) (A) полипептида, содержащего по меньшей мере две последовательности эпитопа опухолевого антигена, экспрессируемые раковыми клетками субъекта-человека, причем каждая из по меньшей мере двух последовательностей эпитопа опухолевого антигена содержит мутацию и связывается с белком MHC, экспрессируемым субъектом с более сильным сродством, чем у соответствующей последовательности эпитопа дикого типа, или (B) полинуклеотида, кодирующего полипептид; тем самым формируя популяцию стимулированных Т-клеток; и

(c) выращивание популяции стимулированных Т-клеток, тем самым формируя выращенную популяцию Т-клеток, где выращивание популяции стимулированных Т-клеток включает выращивание Т-клеток, полученных из наивных CD8+ Т-клеток и наивных CD4+ Т-клеток,

где выращенная популяция Т-клеток содержит (i) по меньшей мере 1×10⁶ общих CD8+ Т-клеток, (ii) по меньшей мере 1×10⁶ общих CD4+ Т-клеток и (iii) Т-лимфоциты, специфичные для

(A) первого комплекса, содержащего (i) первую последовательность эпитопа опухолевого антигена по меньшей мере из двух последовательностей эпитопа опухолевого антигена и (ii) белок MHC, экспрессируемый раковыми клетками или APC субъекта-человека, и

(B) второго комплекса, содержащего (i) вторую последовательность эпитопа опухолевого антигена по меньшей мере из двух последовательностей эпитопа опухолевого антигена (ii) белок MHC, экспрессируемый раковыми клетками или APC субъекта-человека; и

где по меньшей мере 0,1% CD8 + Т-клеток, которые специфичны к первому комплексу или второму комплексу в выращенной популяции Т-клеток, выделяют из наивных CD8+ Т-клеток и по меньшей мере 0,1% CD4+ Т-клеток, которые являются специфическими к первому комплексу или второму комплексу в выращенной популяции Т-клеток, выделяют из наивных CD4+ Т-клеток.

2. Способ по п. 1, где стадии (b) и (c) выполняются менее чем за 28 дней.

3. Способ по п. 1, где доля CD8+ Т-клеток, специфичных к первому комплексу или второму комплексу, от общего количества CD8+ Т-клеток в выращенной популяции Т-клеток по меньшей мере в два раза выше, чем доля CD8+ Т-клеток, которые специфичны к первому или второму комплексу из общего количества CD8+ Т-клеток в биологическом образце.

4. Способ по п. 1, где доля CD4+ Т-клеток, специфичных к первому комплексу или второму комплексу, от общего числа CD4+ Т-клеток в выращенной популяции Т-клеток по меньшей мере в два раза выше, чем доля CD4+ Т-клеток, которые специфичны для первого комплекса или второго комплекса от общего количества CD4+ Т-клеток в биологическом образце.

5. Способ по п. 1, где выращивание включает (A) контактирование популяции стимулированных Т-клеток со второй популяцией зрелых APC, где вторая популяция зрелых APC (i) инкубируется с FLT3L и (ii) презентирует по меньшей мере две последовательности эпитопа опухолевого антигена; и (B) выращивание популяции стимулированных Т-клеток в течение второго периода времени, тем самым формируя выращенную популяцию Т-клеток.

6. Способ по п. 5, где вторая популяция зрелых APC инкубируется с FLT3L в течение по меньшей мере 1 дня до контакта популяции стимулированных Т-клеток со второй популяцией зрелых APC.

7. Способ по п. 5, где выращивание дополнительно включает (C) контактирование выращенной популяции Т-клеток с третьей популяцией зрелых АРС, где третья популяции зрелых АРС (i) была инкубировала с FLT3L и (ii) презентирует по меньшей мере две последовательности эпитопа опухолевого антигена; и (D) расширение выращенной популяции Т-клеток в течение третьего периода времени, тем самым формируя выращенную популяцию Т-клеток из (c).

8. Способ по п. 7, где третью популяцию зрелых APC инкубировали с FLT3L в течение по меньшей мере 1 дня перед контактированием выращенной популяции Т-клеток с третьей популяцией зрелых APC.

9. Способ по п. 1, где биологический образец представляет собой образец периферической крови, образец лейкофереза или образец афереза.

10. Способ по п. 1, дополнительно включающий сбор выращенной популяции Т-клеток или криоконсервацию выращенной популяции Т-клеток.

11. Способ по п. 1, где инкубация включает инкубацию истощенной CD14/CD25 популяции иммунных клеток в присутствии FLT3L и РНК, кодирующей полипептид.

12. Способ по п. 1, где длина полипептида составляет от 8 до 50 аминокислот.

13. Способ по п. 1, где полипептид содержит по меньшей мере три последовательности эпитопа опухолевого антигена, каждая из которых экспрессируется раковыми клетками субъекта-человека, страдающего раком.

14. Способ по п. 1, где истощение CD14+ клеток и CD25+ клеток в популяции иммунных клеток включает контактирование популяции иммунных клеток с CD14-связывающим агентом и CD25-связывающим агентом.

15. Способ по п. 1, где истощение дополнительно включает истощение CD19+ клеток в популяции иммунных клеток.

16. Способ по п. 1, где способ дополнительно включает введение выращенной популяции клеток, содержащей опухолевые антигенспецифические Т-клетки, субъекту-человеку, больному раком.

17. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая выращенную популяцию истощенных по CD14/CD25 Т-клеток и фармацевтически приемлемый наполнитель,

где выращенная популяция истощенных по CD14/CD25 Т-клеток содержит (i) по меньшей мере 1×10⁶ общих CD8+ Т-клеток, (ii) по меньшей мере 1×10⁶ общих CD4+ Т-клеток и (iii) Т-клетки, специфичные для:

(A) первого комплекса, содержащего (i) первую последовательность эпитопа опухолевого антигена и (ii) белок MHC, экспрессируемый раковыми клетками или APC субъекта-человека, и

(B) второго комплекса, содержащего (i) вторую последовательность эпитопа опухолевого антигена и (ii) белок MHC, экспрессируемый раковыми клетками или APC субъекта-человека; и

где по меньшей мере 0,1% CD8+ Т-клеток, специфичных к первому комплексу или второму комплексу в выращенной популяции истощенных по CD14/CD25 Т-клеток, выделяют из наивных CD8+ Т-клеток и по меньшей мере 0,1% CD4+ Т-клеток, специфичных к первому комплексу или второму комплексу в выращенной популяции истощенных по CD14/CD25 Т-клеток, выделяют из наивных CD4+ Т-клеток.

18. Фармацевтическая композиция по п. 17, в которой выращенная популяция истощенных по CD14/CD25 Т-клеток представляет собой выращенную популяцию истощенных по CD14/CD25 и FLT3L-стимулированных Т-клеток.

Группа изобретений относится к композиции биочернил для листа для регенерации дермы, способу изготовления индивидуализированного листа для регенерации дермы с ее использованием. Композиция биочернил для листа для регенерации дермы включает первую жидкость, содержащую стромально-васкулярную фракцию, полученную из жировой ткани, внеклеточный матрикс и фибриноген; и вторую жидкость, содержащую тромбин, в которой содержание внеклеточного матрикса в первой жидкости составляет 20-60 мас.% и в которой концентрация тромбина во второй жидкости составляет 40-250 МЕ/мл.

Полипептиды для лечения заболеваний // 2792848

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к новым пептидам для лечения рака. Изобретение раскрывает пептид, эффективный в блокировании CXC-хемокинового рецептора 4 (CXCR4).

Способ иммобилизации нативной амниотической мембраны и одноразовое зажимное устройство для его осуществления // 2792799

Изобретение относится к клеточной биологии, тканевой инженерии и медицине, в частности, к офтальмологии, и представляет собой способ иммобилизации нативной амниотической мембраны для транспортировки, консервации и применения в качестве биотрансплантата или подложки-носителя для культивируемых клеток и устройство для его осуществления.

Способ получения линий первичных макрофагов с провоспалительными свойствами // 2792602

Изобретение относится к области биотехнологии и регенеративной медицины, а именно к способу получения линии макрофагов с провоспалительными свойствами. Способ получения линии макрофагов с провоспалительными свойствами характеризуется тем, что производят забор крови в пробирки с ЭДТА, кровь разводится раствором фосфатного буфера, содержащего ЭДТА, разведенная кровь наслаивается на раствор фикола и центрифугируется при комнатной температуре, далее отбирается лейкоцитарная пленка, промывается дважды раствором фосфатного буфера, содержащего ЭДТА, после единожды раствором фосфатного буфера, содержащего ЭДТА и бычий сывороточный альбумин БСА (1%), полученный осадок клеток инкубируется с магнитными частицами, содержащими антитела к рецептору CD14, фракция клеток проводится через магнитную колонку и смывается раствором фосфатного буфера, содержащего ЭДТА и БСА, и получают CD14++ моноциты, которые культивируются в среде RPMI с добавлением бычьей сыворотки, L-глутамина, пенициллина, стрептомицина, макрофагального колониестимулирующего фактора, клетки дифференцируются в макрофаги в течение 7 дней, после чего проводят нокдаун генов, при этом олигонуклеотиды, использованные для нокдауна, разводятся в фосфатном буфере, пары олигонуклеотидов отжигаются, далее инкубируются при комнатной температуре, для трансфекции клеток используют липофильный агент Lipofectamine 3000, после добавления липофильных комплексов к клеткам проводят инкубацию 24 часа, далее производят смену среды на RPMI с добавлением бычьей сыворотки, L-глутамина, пенициллина, стрептомицина, через 24 часа после смены среды проводят анализ фенотипа, а также анализ экспрессии провоспалительных генов и получают культуру макрофагов с провоспалительными свойствами, при определенных условиях.

Антигенные рецепторы и их применения // 2792042

Группа изобретений относится к биотехнологии. Представлены: антигенный рецептор для обеспечения иммунного ответа на клетки злокачественной опухоли, экспрессирующие опухолевый антиген, причем рецептор содержит первую пептидную цепь и вторую пептидную цепь, рекомбинантная CD8+ T-клетка-хозяин, экспрессирующая антигенный рецептор и способ её получения, нуклеиновая кислота, фармацевтическая композиция и способ лечения злокачественной опухоли.

Способ получения аутологичных регуляторных т-лимфоцитов путем культивирования ex vivo в присутствии хорионического гонадотропина // 2791738

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к области клеточной биотехнологии. Задачей изобретения является разработка композиции факторов культуральной среды, предназначенной для совершенствования технологии культивирования CD4+-лимфоцитов, приводящего к эффективной дифференцировке их в Т-регуляторные клетки (Treg), экспрессирующие транскрипционный фактор FOXP3, который свидетельствует о супрессорной функции получаемых Treg.

Способ культивирования и культуральная среда для пролиферации человеческих vγ9vδ2 t-клеток // 2791182

Настоящее изобретение относится к области клеточной биологии, в частности к способу пролиферации человеческих Vγ9Vδ2 Т-клеток и культуральной среде для их пролиферации. Для осуществления указанного способа сначала культивируют композицию, содержащую T-клетки, используя культуральную среду, способную стимулировать T-клетки, которая содержит полную культуральную среду RPMI-1640 с 10% фетальной телячьей сывороткой, интерлейкин-2 и соединение фосфоновой кислоты, а именно золедроновую кислоту.

Способ создания предполимеризационной морфогенетической матрицы // 2791073

Изобретение относится к области биоинженерии. Способ создания предполимеризационной морфогенетической матрицы включает стадии: берутся биосовместимые фотоотверждаемые термочувствительные гидрогели с регулируемой температурой фазового перехода, ковалентно включают в их химический состав солюбилизированные функционально важные гликопротеины и гликозаминогликаны избранных биологических тканей, имитирующие функции нативных органных внеклеточных матриксов, посредством аддитивной 3D-печати на нагреваемой подложке размещают микрокапли гидрогелей, используемые в качестве биочернил, в проекциях будущего месторасположения специфических элементов цитоархитектоники, создавая мозаичный мультиматериальный непрозрачный или полупрозрачный объем по заданной цифровой трехмерной модели, сформированный объем ограждают боковыми стенками, охлаждают до температуры ниже нижней критической температуры раствора.

Способы получения композиций генно-инженерных клеток и родственных композиций // 2790444

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам получения композиции клеток. Способы включают получение входной композиции клеток, приведение входной композиции клеток в контакт с агентом, включающим молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую рекомбинантный рецептор, а также стимуляцию входной композиции клеток до, во время или после указанного контакта.

Способ лечения аллергического заболевания дыхательных путей (aad)/астмы // 2790031

Изобретение относится к медицине, а именно к способу лечения у субъекта заболевания, выбранного из группы: аллергическое заболевание дыхательных путей (AAD) и астма. Способ лечения у субъекта заболевания, выбранного из группы: аллергическое заболевание дыхательных путей (AAD) и астма, включает введение мезенхимоангиобластной мезенхимальной стволовой клетки (MCA-MSC) субъекту, где MCA-MSC экспрессирует miR-145-5p, miR-181b-5p и miR-214-3p, но не miR-127-3p и miR-299-5p, где MCA-MSC имеет фенотип CD73+CD105+CD90+CD146+CD44+CD10+CD31-CD45-, где MCA-MSC в количестве от 106 MCA-MSC/кг до 2×108 MCA-MSC/кг вводят путем, выбранным из внутривенного и интраназального; и где MCA-MSC получена способом, включающим: культивирование первичной мезодермальной клетки, дифференцированной из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки (iPSC), в среде для формирования мезенхимальной колонии (M-CFM), содержащей LiCl и FGF2 (фактор роста фибробластов), но не содержащей PDGF (тромбоцитарный фактор роста), в условиях нормального содержания кислорода, в течение времени, достаточного для формирования мезенхимальной колонии; и культивирование мезенхимальной колонии в прикрепленном состоянии с получением MCA-MSC.

Конъюгат лиганд-лекарственное средство аналога экзатекана, способ его получения и его применение // 2793316

Изобретение относится к области органической химии, а именно к конъюгату лиганд-лекарственное средство или его фармацевтически приемлемой соли формулы (Pc-L-Y-Dr), где Y представляет собой -O-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-; Ra и Rb представляют собой атом водорода; R1 представляет собой C3-6 циклоалкил или C3-6 циклоалкил-C1-6 алкил; R2 представляет собой атом водорода; или R1 и R2 совместно с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют C3-6 циклоалкил; m составляет 0 или 1; n составляет от 1 до 10, которое может представлять собой целое или десятичное число; Pc представляет собой антитело; и L представляет собой линкерное звено.