Способ получения ферментного препарата эластазы

 

282247

ОП ИСАЙ ИЕ

ИЗОБРЕТ ЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советоиии

Социалиотичеоили

Ревпублии

Зависимое от авт. свидетельства №вЂ”

Заявлено 29.1/.1968 (Xo 1244222/28-13) с присоединением заявки №вЂ”

Приоритет

Опубликовано 02Л1.1972. Бюллетень № 6

Дата опубликования описания 21.III.1972

М. Кл. С 12d 13/10

С 126 9/00

Комитет по делам изобретений и открытий при Совете Миииотоое

СССР

УДК 577.159(088.8) Авторы изобретения

1О. A. Рассулин, В, П. Богданов и Г. С. Еркомаишвили

Институт органической химии им. Н. Д. Зелинского

Заявитель

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА ЭЛАСТАЗЪ|

Изобретение относится к области получения ферментного препарата эластазы — фермента, способного гидролизовать белок эластин, вызывая при соответствующих условиях полное его растворение в .водных средах, Известен способ получения эластазы путем выращивания ее продуцентов на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и неорганические соли, с последующим отделением мицелия и выделением ферментов из культуральной жидкости. Однако применение этого способа ограничено в промышленности из-за его высокой стоимости, длительности процесса и недостаточной активности препаратаа.

Цель изобретения — повышение чистоты и активности ферментного препарата. Для этого в качестве продуцента используют микроорганизм Actinomyces rimosus, являющийся одновременно продуцентом окситетрациклина, который накапливается, главным образом, в мицелии. Актиномицент Actinomyces rimosus продуцирует в культуральную среду активные ферменты с эластазными свойствами. Подобное свойство Actinomyces rimosus характерно в основном для двух штаммов ЛСТ-гибрид и

ЛСТ-416. Выделение эластазы из культуральной жидкости осуществляют при помощи ионообменной смолы КБ-51-2 — сильнонабухающем катионите на основе салициловой кислоты и фенола.

Сущность предлагаемого способа заключается в следующем.

Для посева используют посевной материал первой генерации. Длительность выращивания посевного материала составляет двое суток.

Ферментацию проводят при температуре 26—

28 C в первые сутки, затем при температуре

lo 30 — 32 С, рН среды не регулируется, изменяясь в процессе ферментации от % до 7,3 в начале с последующим падением до рН 6,0—

6,5, Продолжительность ферментации составляет 5 — 6 суток. Необходимым условием выра1S щивания является активное аэрирование культуры стерильным воздухом, Весь процесс культивирования ведется в стерильных условиях. Для выращивания Actinomyces rimosus может быть использована среда, например, 20 следующего состава, %:

Крахмал 6

Мука соевая 2

Сульфат аммония 0,45

Кукурузный экстракт 1,5

Кальций углекислый 0,8

Через колонку с ионообменной смолой

КБ-51-2 пропускают культуральную жидкость

Actinomyces rimosus. Мицелий предварительзо но удаляют фильтрованием или центрифугиро282247

Полищук

Корректоры: E. Усова и Т, Бабакина

Составитель Г.

Редактор Н. Воликова Техред Л. Евдонов

Заказ 535/3 Изд. № 199 Тираж 448 Подписное

ЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР

Москва, K-35, Раушская наб., д. 4/5 пр. Сапунова, 2

Типография, ванием. Вместе с мицелием удаляется основное количество окситетрациклина, который в дальнейшем извлекается известным путем.

В исходной жидкости после отделения мицелия остается неочищенная эластаза и часть окситетрациклина, который перешел в раствор ,в процессе ферментации. Остаточная концентрация его составляет 600 — 1000 ед/мл.

При пропускании культуральной жидкости через колонку одновременно происходит сорбция антибиотика и эластазы. Часть неактивных белков проходит не сорбируясь на смоле.

Колонку после окончания сорбции промывают слабым аммиачным буфером рН 9,2 м для удаления пигментных веществ. После промывки эластазу элюируют с колонки концентрированным раствором аммиачного буфера, содержащего хлористый натрий, хлористый аммоний и аммиак рН 9,2 — 9 3. При этом весь окситетрациклин из культуральной жидкости и большая часть балластных белков остается на смоле, а эластаза переходит в раствор элюата в очищенном виде. После такой обработки чистота эластазы возрастает,в 10—

15 раз.

Таким образом, на смоле в одну стадию производится концентрирование эластазы и очистка ее от антибиотика, большей части пигментов и балластного белка.

Из элюата, представляющего собой концентрированный раствор солей и ферментов, эластазу выделяют осаждением тремя объемами изопропилового или этилового спирта при температуре 0 С. Выпавший осадок фермента центрифугируют или фильтруют, растворяют в небольшом количестве воды и лиофильно высушивают.

Пример получения эластазы из культуральной жидкости Actinomyces rimosus. Через колонку размером 3)(25 см, уравновешенную /д м фосфатным буфером рН 6,3, пропускают при 4 С 6000 м г культуральной жидкости Actinomyces rimosus, содержащей 88 г белка по

Лоури и 5,4 г окситетрациклина. Сорбируется

96% протеолитической активности и 94 /о эластазной активности от исходной, а также

56 г,белка по Лоури и 5,0 г окситетрациклина, Колонку промывают 700 мл аммиачного буфера рН 9,2 состава 0,005 NH

Эластазу элюируют 600 мл концентрированного буфера состава 1 м NaCl — О,ЗМ NH

ХНз, рН 9,2 — 9,3 со скоростью около 50мл/час, Выход 6,7 г белка по Лоури (7,6 ).

Практически весь окситетрациклин остается на колонке. Элюат охлаждают до 0 — (— 5 С) и при перемешивании добавляют 1800 лл охлажденного до — 10 С изопропанола или этанола. Осадок центрифугируют через час при 3000 об/мин, растворяют в 60 мл охлажденной дистиллированной воды и лио фильно высушивают. Выход сухого препарата эластазы составляет около 2,0 — 2,5 г, Выход активности — около 40 — 45 /о.

Характеристика эластазы Actinomyces rimosus.

Внешний вид — порошок светло-кремового цвета.

Активность 1 мг эластазы полностью растворяет (видимое растворение) 150 мг эластина на 1 час при температуре 40 С.

Оптимум рН эластазной активности. Максимальное действие на эластин проявляется при рН 8,8, а также при рН 6,4 в 0,03 — 0,05М трисовом или глициновым буфере.

Устойчивость при различных рН..Препарат эластазы устойчив в пределах рН 5,5 — 8,5 при нагревании в течение часа при 40 С в буфере соответствующего рН.

Протеолитическая активность, Препарат эластазы обладает заметной способностью гидролизовать другие белки, например казеин.

его протеолитическая активность по казенну соответствует 25 — 30)(10- мэкв. ти розин а, освобождаемого за 1 мин гидролиза казеина при 40 С в расчете на 1 мг фермента. Максимальное действие на казеин наблюдается при рН 7,1.

Растворимость. Препарат полностью растворим в воде и солевых растворах.

Предмет изобретения

1. Способ получения ферментного препарата эластазы путем выращивания ее продуцентов на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и неорганические соли, с последующим отделением полученных клеток продуцентов и выделением ферментов из культуральной жидкости, отличающийся тем, что, с целью повышения активности и чистоты ферментного препарата, в качестве продуцентов используют Actinomyces rimosus, являющийся одновременно продуцентом антибиотика окситетрациклина, а выделение эластазы из культуральной жидкости осуществляют при помощи ионообменных смол.

2. Способ по,п. 1, отличающийся тем, что в качестве ионообменной смолы используют катионит КБ-51-2.