Способ получения ферментного препарата из поджелудочной железы убойных животных

 

СПОСОБ ПОЛУЧШгИЯ ФНРМЕИГ-НОГО IffEIIAPATA ИЗ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕШ ЖШОТКЫХ, предусматргаающий экеграквзао «зметлетюго сырья ацетапшм буфером jtff 4,6-4,7, разделение экстракта и жмыха и вьзделение из последнего фермента коллагенаэного действия экстракцией 0,75 М раствором NaCI, фракционированным осаждением белков сульфатом аммония , отделением осадка фермента и диализом , отличающийся тем, что, с целью безотходного использования сырья и дополнительного извлечения из него фермента эластазного действия, в отделенном от жмыха экстракте осаждают баплжяные белки сульфатом аммония при стеHeiffl насыщеюм 0,16-0,17, осадок отбрасывают , а из фильтрата сульфатом аммония при степею насыщения 0,45-0,46 осаждают фермент зластазиого действия, после чего ферментный осадок растворяют в карбонатном буфере ври рЯ 9,1-9,2 н подвергают диализу с последующим объединением диализатов н фильтрацией.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

О Ц ВОЮ

РЕСПУБЛИК

09) (11) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

И A870PCH0INY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОЦИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTHPHTMA (21) 3465f34/28-13 (22) 06.07.82 (46) 15.0184. Бюл. IF 2 (72) Л. Б. Полонская, Л. Л. Борткевич, Т. И. Козловская, Л. К. Барткова, В. И. Цыгаикова, М. А. Борисова, Е. Ю. Куликова, В. М. Царенков, Я. М. Гинзбург, Т. Н. Бируль чик и Е. М. Липницкий, (71) Всесоюэиий научно-исследовательский институт мясной;иромьинлениости (53) 577Л5.07 (088.8)

: (56) 1. Авторское свидетельство СССР

У 603389, кл. А 61 К 37/38, 1976. (54) (57) СПОСОБ ИОЛУ ИНИЯ ФЕРМЕНГНОГО ПРЕПАРАТА ИЗ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ

ЖВЛЕЗЦ УБОЯННХ ЖИВОТНЫХ, предусматривающий экстраит1ив измельченного сырья ацетатиым буфером рН 4,6-4,7, разделение (д) С 12 и 9/64; С 12 N 9/66; А 61 К 37/48 экстракта и жмыха и вьщеленне из последнего фермента коллагеназного действия экстракдией 0,75 М раствором NaCt, фракционнрованным осаждением белков сульфатом ам- мония, отделением осадка фермента н диализом, отличающийся тем, что, с целью безотходного использования сырья и дополнительного извлечения иэ него фермента эластазного действия, в отделенном от жмыха экстракте осаждают балластные белки сульфатом аммония при степени насыщения О,!6 — 0,12, осадок отбрасывают, а иэ фильтрата сульфатом аммония при степени насыщения 0,45-0,46 осаждают фермент эластазного действия, после чего ферментный осадок растворяют в карбонатном буфере нри рН 9,1 — 9,2 и подвергают диализу с последующим объединением диализатов и фильтрацией.

Изобретение относится к способам получения полиферментных препаратов лечебного действия и может быть использовано на предприятиях мясной промышленности.

Известен способ получения ферментного препарата коллагенаэного действия из поджелудочной железы убойных животных, включающий экстракцию измельченного сырья ацетатным буфером рН 4,6 — 4,7, отделение экстракта от жмыха и вьщеление пелевого про. 10 дукта экстракцией жмыха 0,75 М раствором

NaCI, фракционированным осаждением белков сульфатом аммония (обычно при степени насьпцения 0,25 — 0„35 и 045 — 0,6) с последующим отделением осадка фермента и диализом (1) .

При изготовлении препарата коллагеназного действия после экстракции ацетатным буфером экстракт, содержащий фермент зластазного действия, сифонируют, что приводит к по-. терям ценного вещества.

Целью изобретения является безотходное ис пользование сырья и дополнительное извлечение из него фермента эластазного действия.

Указанная цель достигается тем, что соглас-Z5 но способу получения ферментного препарата из поджелудочной железы убойных животных, предусматривающему экстракцию измельченного сырья ацетатным буфером рН 4,6 — 4,7, разделение экстракта н жмыха и выделение фермента коллагенаэного действия экстракцией 0,75 М раствором йаО, фракционнрованным осаждением белков сульфатом аммония, отделение осадка фермента и диализом, в отделенном от жмыха экстракте осаждают балластные белки сульфатом аммония прн степени насыщения 0,16 — 0,17, осадок отбрасывают, а из фильтрата сульфатом аммония при степени насыщения 0,45 — 0,46 осаждают фермент эластазного действия, после чего

40 ментный осадок растворяют в карбонатном буфере при рН 9,1 — 9,2 н подвергают дналиэу с последующим обьедннением диализатов и фильтрацией.

Способ позволяет комцлексно исцользовать животное сырье, утилизировать отходы и получить полиферментный препарат. . П р. и м е р 1. 1 кг обезвоженной и измельченной поджелудочной железы свиней экстрагируют 6 обьемами 0,1 М ацетатного буфера рН 4,6.

Экстракция длится 8 ч. Первые,2 ч зкстрагнрование производится прн непрерывном перемешиванни, последующие 6 ч перемешивают каждый час по 10 мин..

Экстракт отстаивается 20 ч при темпера- 55 туре не выше 5 Ñ. Отстоявшуюся жидкость сифонируют, а жмых подвергают вторичному зкстрагированию.

1 1067040 2

Балластные белки высаливают из экстракта добавлением небольшими порциями, при перемешивании, кристаллического сульфата аммония до степени насыщения 0,16-0,17. Осадок отделяют фильтрацией на путч-фильтре или специальном фнльтрующем устройстве при температуре не выше 5 С.

Из фильтрата медленно высаливают фермент добавлением кристаллического сульфата аммония до степени насыщения 0,45—

0,46, с поверхности снимают пену и оставляют при температуре не выше 5 С.

Осадок выдерживают 16 ч при температуре не выше 5 С. Затем надосадочную жидкость снфонируют, а осадок отделяют фильтрацией на путч-фильтре.

Осадок растворяют в 3-х объемах 0,1 М карбонатного буфера, рН 9,1 н разливают в целлофановые мешки по 100-150 мл. Диализ проводят 48 ч при температуре не вы0 ше 5 С против дистиллированной воды.

Жмых суспензируют в 0,75 М растворе хлористого натрия (7,5 объемов к массе ис. ходного сырья) н экстрагируют 3,5 ч при непрерывном перемешивании к температуре не выше 5 С. После 3 часового отстаивания экстракт отделяют снфонированием, фильтрацией на нутч-фильтре нли прессованнем иа гидравлическом прессе.

Балластные белки из экстракта выеаливают добавлением небольшими порциями, нри перемешиваиии кристаллического сульфата аммония. до степени насьпцения 0,26 — 0,27.

Осадок отделяют фильтрацией на нутч-фильтре или на специальном фильтрующем устройстве при температуре не выше 5 С.

Из фильтрата высаливают фермент добавлением набольшими порциями при перемешиванни кристаллического сульфата аммония до степени насьпцения 0,6 — 0,7 прн температуре не выше 5 С„

Осадок выдерживавн 16 ч при температуре не выше 5 С. Затем надосадочную жидкость. снфонируют, а осадок отделяют на путч-фильтре.

Осадок растворяют в 3-х объемах дистиллированной воды и разливают в целлофановые мешки по 100-150 мл. Диализ проводят 48 ч нри. температуре не выше 5 С про. тив дистиллированной воды со сменой воды каждые -6 ч. l u ll осадки и диаллизаты объединяют и фильтруют на нутч-фильтре.

Осадок растворяют в 2.х объемах 0,1 М карбонатного буфера, рН 9,1. Раствор фильтруют на нутч-фильтре через кизельгур.

Раствор стерилиэуют и разливают во флаконы, Выход лиофилизированного препарата

S-10 г .

1067040

По сравнению с известным способом предлагаемый обладает более широким спектром ферментного действия, имея не только ак20 тивность коллагенаэного действия, но и элас- тазного действия.

Сопоставительный анализ показателей пред- лагаемого способа rr прототипа приведен в таблице.

Показатели

Способ щенной и измельченной железы проводится как и в первом примере, но при рН 4,7.

Перемешивание каждый час осуществляется в течение 15 мин. Далее все операции проводят как в примере 1, но после высаливания фер- 30 мента при первой экстракции осадок выдерживается 18 ч при температуре не выше 5 С.

После сифонирования надосадочной жидкости

;и отделения осадка на путч-фильтре, осадок растворяптт в 3-х объемах 0,1 М карбонатно- 35 го буфера при рН 9,2.

0,150

0,300

Предлагаемый

0,150

Известный, Составитель О. Скородумова

Техред Л.Пилипенко Корректор O. Тигор

Редактор Т. Веселова

Заказ 11154/29 Тираж 52S Подписное

ВНИИПИ Гдсударственного комитета СССР по делам изобретений и открьпий

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб„д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Пример 2. Первая экстракция высушенной и измельченной железы проводится, как и в первом примере, но при

) РН 465. Перемешивание каждый час осуществляется в течение 12 мин. Далее все проводится как и в первом примере, но после высаливания фермента при первой зкстрак. цин осадок выдерживается 17 ч при температуре не выше 5 С. После сифонирования шдосадочной жидкости и отдельния осадка иа путч-фильтре осадок растворяют в 3-х обьемах 0,1 М карбонатного буфера при рН 9,15. !! экстракция жьыха осуществляется как в примере 1, но экстракт отстаивается 3,5 ч

Отделение балластных белков и осаждение фермента после П экстракции проводится как в примере 1, но осадок фермента выдерживается в течение 17 ч при температуре ие выше 5 С. Далее все операции проводят как s примере 1, но после объединения и

II осадков и диалиэатов получившийся осадок растворяют в 2-х o6r eûax 0,1 М карбонатного буфера прн РН 9,15.

Пример 3. Первая экстракция высуII экстракция жмыха осуществляется как в примере 1, но экстракт отстаивается 4 ч.

Отделение балластных белков и осаждение фермента после II экстракции проводится как в примере 1, но осадок. фермента вьщерживается в течение 18 ч при температуре не выше 5 С. Далее операции проводят как в примере 1, но после объединения и II осадков и диализатов получившийся осадок раство. ряют в 2-х объемах 0,1 М карбонатиого буфера при рН 9,2.

Изобретение позволяет получить полиферментный препарат для применения в хирургической практике.