Способ определения чнсла аминокислотных остатков в молекулах белков

 

ОПИСАН ИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

3035б9

Союз Советских

Социалистических

Республик

Зависимое от авт. си1детельства №

Заявлено 12.1V.1968 (№ 1232164/23-4) с присоединением заявки №

Приоритет

Опубликовано 1ЗХ.1971. Бюллетень № 16

Дата опубликования описания 14Х11.1971

МПК G 0ln 21/16

G 01п 27/28

Комитет по делам изобретений и открытий при Совете Министров

СССР

УДК 543.865(088.8) Лвторы изобретения

В. В. Демченко и А. H. Никитин

Заявитель

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧИСЛА АМИНОКИСЛОТНЫХ

ОСТАТКОВ В МОЛЕКУЛАХ БЕЛКО — K(T)t 1п 1—

Г ЬХ() 1 ь),, J

Изобретение относится к физико-химическим способам исследования биологических объектов и может, в частности, применяться для определения молекулярного веса белка и наблюдения за изменениями конформации белка.

Известен способ определения числа аминокислотных остатков в молекулах белков, заключающийся в том, что белки гидролизуют растворами минеральных кислот в течение

12 — 120 час с последующим хроматографированием полученных гидромезатов. Известный способ длителен и трудоемок.

С целью упрощения анализа, предлагается способ, заключающийся в том, что денатурируют белок мочевиной, измеряют зависимости смещения максимума его спектра люминесценции от времени при разных температурах, по найденным из этих измерений константам скорости, измерив степень спиральности, вычисляют энтальпию активации денатурации и, зная энтальпию, определяют искомое число.

Определение числа аминокислотных остатков в молекуле белка проводят следующим образом: белок химотрипсин помещают в образцовую кювету в обычной схеме наблюдения люминесценции с фотоэлектрической регистрацией и действуют на него денатурирующим агентом — 6М раствором мочевины, разрывающим внутримолекулярные водородные связи в структурированнои, спирализованной части молекулы и приводящими к образоваНИХ Ъ1ЕЖМОЛЕ1Л ЛЯРНЫХ ВНЕШНИХ СВЯЗЕЙ С этим агентом. Затем измеряют смещение максимума спектра люминесценции белка во времени при нескольких фиксированных температурах. Денатурация — конформационный переход, соответствующий реакции первого

10 порядка, поэтому смещение ЛХ(/) максимума спектра люминесценции пропорционально концентрации денатурированного белка, т. е.

Р (/) Ц . (/Š— тчт11) (1) 15 где К(Т) — константа скорости; t — время.

Из уравнения (1) в координатах находят константу скорости

Здесь Л1, /1 — число Лвогадро и постоянная Планка; R — газовая постоянная, АН, Л5 — энтальпия и энтропия активации денатурации, Ж.o — разность между максимум люминесценции денатурированного и натив1 ного белка. В координатах InR(T) — — оп30 Т

303569

5 Для химотрипсина ккал .

ЛН моль

K(T) (2) 36,1

117,3

576

1041

129

53,7

Предмет изобретения

n= — +1

2л (3) Составитель Бердник

Редактор В. Ф. Смирягина Техред А. А. Камышникова Корректоры: H. В. Воробьева и Е. В. Исакова заказ 1750/1 Изд. № 728 Тираж 473 Подписное

ЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР

Москва, jK-35, Раушская наб., д. 475

Типография, пр. Сапунова, 2 ределяют тангенс угла наклона прямой, равный ХН, которая в случае химотрипсина

AH»RT (Зная среднюю энтальпию Лд разрыва внутримолекулярной водородной связи, например, в глобулярных белках (Лд= 1,4 ккалтиоль находят число разорванных связей

Определяют степень спирального белка т1, которая, по данным оптического вращения, для химотрипсина составляет 157о, и, учитывая, что HB каждый аминокислотный остаток приходятся две водородные связи, находят число аминокислотных остатков 11

Единица в формуле (3) появляется за счет несвязанного концевого остатка.

Определив число аминокислотных остатков и зная их средний молекулярный вес, находят средний вес М химотрипсина. Найденное таким образом число аминокислотных остатков в точности совпадает с действительным числом их в химотрипсине, определенным известными методами, а молекулярный вес, по данным разных авторов, 15000 — 25000; 21000—

25000; 22500 †230.

298

301,5

303,5

306

Способ определения числа аминокислотных остатков в молекулах белков, отличающийся тем, что с целью упрощения анализа, белковый раствор обрабатывают мочевиной, с помощью люминисцентного метода определяют количество денатурированного белка, измеряют степень спиральности нативного белка, 25 и по полученным данным судят о числе аминокислотных остатков в молекуле исследуемого белка.