Способ получения протеинов для изготовления диагностических биопрепаратов

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик

Зависимое от авт. свидетельства №вЂ”

Заявлено 21 VII.1970 (№ 1464358/30-15),Ч. Кл. А 61k 23/00 с присоединением заявки №

Приоритет

Комитет по делам изобретений H открытий при Совете Министров

СССР

Опубликовано 28.Xll.1972. Бюллетень № 5 за 1973

Дата опубликования описания 20.III.1973

УДК 619:576.8.097.34 (088.8) Авторы изобретения

А. Г. Малахов, Г, И. Устинова и 3. С. Газарх

Всесоюзный институт экспериментальной ветеринарии Всесоюзной ордена Ленина академии сельскохозяйственных наук имени

В. И. Ленина

Заявитель

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕИНОВ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ

ДИАГНОСТИЧ ЕСКИХ БИОПРЕПАРАТОВ

Изобретение относится к области ветеринарной диагностики.

Известеп способ получения протеинов, включающий выращивание культуры, стерилизацию, получение фильтрата, осаждение активного протеина, растворение осадка, стерилизующую фильтрацию и лиофильное высушнвание. Однако он имеет ряд недостатков, например нестандартность, обусловленную различиями. в смещении концентрации водородных ионов (рН) в культурах микобактерий в процессе их выращивания. Кроме того, этим способом протеины из микобактерий экстрагируются непосредственно в питательную среду, в которой наряду с компонентами ее химического состава содержатся также продукты обмена и аутолиза микобактерий, от которых протеины освобождают, путем их многократного отмывания растворами кислот, солей фосфатов, этанолом, эфиром или ацетоном.

Для получения протеинов в стандартных условиях непосредственно из бакмассы культуры по предлагаемому способу стерилизацию культур производят автоклавированием после добавления раствора соляной кислоты, предпочтительно 2 н., экстракцию протеинов из отмытой от питательной среды бакмассы осуществляют дистиллированной водой с рН 10,0, осаждение протеинов из этих экстрактов проводят последовательным добавлением соляной н трнхлор уксусной кислотой, а растворение осадка осуществляют дистиллированной водой с рН 7,0 — 7,2.

Способ получения протеинов пз культур

5 всех известных мпкобактернй туберкулеза, паратуберкулеза и кислотоустойчнвых сапрофнтов для изготовления диагностических t)HQHpeпаратов осущсствляется следующим ооразом.

Посев и выращивание культур мнкобакте10 рий на жидких илн гвердых питательных средах производят общепринятымн способами.

По окончании выращивания на каждый литр культуры микобактерпй плп смыва культур вливают 20 лл 2 и. раствора соляной кислоты, 15 автоклавируют прп 120 в течение 30 .яин и охлаждают до комнатной температуры.

Охлажденные культуры фильтруют через капроновое полотно, фильтрат отбрасывают, бакмассу промывают QT остатков питатеlb20 ной среды и соляной кислоты дистиллированной водой, подщелоченной 0,1 и. раствором едкого патра до рН 10,0. Отмывание бакмассы проводят до тех пор, пока в промывной воде не будет изменяться исходный pII 10,0. Отмы25 тую бакмассу суспенднруют в дистиллированной воде с рН 10,0 в ооъеме, равном >!;, объема исходной культуры, автоклавпруют при

120" в течение 30 пшн, охлаждают до комнатной температуры п фильтруют последователь30 но вначале через капроновое полотно, а затем

364321

Предмет изобретения

Составитель В. Фогельман

Редактор В. Фельдман Техред 3. Тараненко Корректоры: А. Николаева

Л. Корогод

Заказ 497/4 Изд. № 151 Тираж 467 Подписное

ЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР

Москва, )K-35, Раугиская наб.,,>. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2 о через фильтр Зейтца с пластинами «Ф» и IH

«К». По окончании фильтрации бакмассу отбрасывают, а па каждый литр фильтрата для осаждения протеинов добавляют 40 л1л 1 н. раствора соляной кислоты, перемешивают, добавляют 40 л1л 40% раствора трихлоруксусной кислоты, вновь перемешивают и смесь оставляют стоять 12 — 18 час при температуре 4—

7 С.

Осаждение можно производить и только 1 н. раствором соляной кислоты, но для этого 41еобходимо предварительно определить оптимальное количество этого раствора, потребное для полного осаждения протеинов. Для этого берут 10 пробирок. В каждую пробирку вливают по 10 лчл фильтрата экстракта микобактерий и добавляют в первую 0,1 лл, во вторую — 0,2 11л, в третью — 0,3 11л и так далее до 1,0 л1л 1 н. раствора соляной кислоты, перемешивают и через 30 л1ин определяют в какой пробирке образовался наибольший осадок. Производят соответствующие пересчеты и полученное количество кислоты вливают для осаждения протеинов из всего объема фильтрата экстракта микобактерий, после чего смесь также оставляют стоять 12 — 18 час при температуре 4 — 7 С.

1В обоих случаях по окончании отстаивания надосадочную жидкость отделяют сифоном и оторасывают, а осадок растворяют в дистиллиро ванной воде, подщелаченной 0,1 н. раствором едкого натра до рН 7,0 — 7,2. Раствор осадка цонтрифугируют 30 иин при 3000 оборотах в 1 лин и в нем определяют количество белка. Его содержание должно быть равно

5 10 »1г в 1 лчл раствора. Затем раствор фильтруют через фильтр Зейтца с пластинами

«СФ» н.1и «ЕК», разливают по ампулам и сушат до замороженного состояния общепринятым способом.

Способ получения протеинов для изготовления диагностических биопрепаратов, вкгно15 чающий выращивание культуры, стерилизацию, получение фильтрата, осаждение активного протеина, растворение осадка, стери1изующую фильтрацию и лиофильное высушивание, отлича1ощийся тем, что, с целью получения

20 протеинов в стандартных условиях непосредственно из бакмассы культуры, стерилизацию культур производят автоклавированнем после добавления раствора соляной кислоты, предпочтительно 2iI»., экстракцию протеинов нз

25 отмытой от питательной среды бакмассы осуществляют дистиллированной водой с рН 10,0, осаждение протеинов из этих экстрактов проводят последовательным добавлением соляной

H f P H x 1 0 Р 1. K chic I I 0 Й KH c I 0 T hl и л H 0+110 É с 0 л Я I I 0 Й

30 кислотой, а растворение осадка осуществляют дистиллированной водой с рН 7,0 — 7,2.