Патент ссср 385436

 

О ll И С А Н И Е 385436

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик

К IlkftHTV

Зависимый от патента №вЂ”

М. Кл. С 07с 101/00

Заявлено 03.11.1971 (№ 1619741/23-4)

Приоритет 07.II.1970, № P 2005658,0, ФРГ

Опубликовано 29Х.,1973. Бюллетень № 25

Дата опубликования описания 16.Х.1973

Гооударстеенный комитет

Совета Мкнистров СССР по делам изобретений и открытий

УДК 547.965.07 (088.8) Автор изобретения

Иностранец

Рольф Гайгер (Федеративная Республика Германии) Иностранная фирма

«Фарбверке Хехст АГ» (Федеративная Республика Германии) Заявитель

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДЕЗФЕНИЛАЛАНИН В -ИНСУЛИНА

Изобретение относится к способу получения дезфенилаланин В -инсулина, применяе.мого,в медицине.

Известный способ получения инсулина расщеплением по Эдману с прюгенением соответствующего изотиоцианата сопровождается образованием смеси продуктов, трудно разделяемых хроматегра фически.

Этот способ используется для получения небольших количеств указанных продуктов и прежде всего для аналитических целей.

Предлагаемый способ получения дезфенилаланин В -,инсулина заключается в том, что инсулин в смеси, состоящей из амида Х, диалкилкар боновой кислоты и водного буферного раствора с рН 8,0 — 9,0, обрабатывают изоыт<оег трет-.бутилоксикарбонилазида с последующей обработкой полученного продукта фенилизотиоцианатом и затем сильной кислотой, например трифторуксусной.

В качестве исходного продукта может быть использован инсулин .различных видов, преимущественно инсулин крупного рогатого скота, инсулин свиньи или смесь этих инсулинов в любом соотношении.

Для проведения реакции, например, суспендируют или растворяют 1 лглоль инсулина в 30 — 70-кратном весовом количестве амида N, N -диалкилкарбоновой кислоты, который может содержать до -25% воды. Затем добавляют 20 — 75 ллоль трет-бутилоксикарбонилазида и 2,5 — 4-кратное количество (по отношению к весу введенного инсулина) буферного раствора,и перемешивают 3 — 6 час

5 угри 35 — 40 С. При комнатной те мпературе реакция протекает значительно медленнее ч требует больше времени.

Ди-трет-бутилоксикарбонилинсулин осаждают эфиром, сушат в вакууме над Р20:, 1о растворяют в 20 — 50чкратном,количестве 60-95% -ного водного,пиридина, добавляют 1,5-—

4 ллоль фенилгорчичного масла, которое может содержать заместители, и перемешивают

3 — 20 LQc при комнатной температуре. Реак15 цию обычно заканчивают при появлении м ти. Продукт реакции осаждают эфиром, выдерживают 1 — 2 час в 10-кратном весовом количестве трифторуксусной кислоты, вновь осаждают эфиром и,кристаллизуют:явест20 ным способом при рН 5,0 — 5,5.

Во всех примерах для характеристики ац илированных инсулинов используют электрофорез на бумаге (6 час, 200 в, уксусная кислота — муравьиная кислота, РН 2, индч25 катор бромфеноловый синий); для контроля отщепления фе нилаланина — электрофорез и анализ:с аминокислотой.

П ip и и е р 1. К раствору 1 г (0.167 л поль) инсулина свиньи в 70 игл 80%-ного диметила30 цетамида добавляют 1,45 г (10 .илоль) трет385436 течение 1 час при 40 С получ" þò 725 мг дезфенилаланин В -инсулина (свиньи).

5 Пример 5. Из 1 г смеси инсулина крупного рогатого скота и инсулина свиньи, как в приомере 1, но при использовании 0,3 ммоль

4-нитрофенилизотиоцианата и проведении реакции в течение 2 час при комнатной темпе10 ратуре получают 780 мг дезфенилаланин B инсулина.

П.р и м е р 6. Как в примере 1, из 1 г инсулина крупного рогатого скота при использовании 0,4 ммоль 4-хлорфенилизотиоцианата

15 и проведении реакции в течение 3 час при ком натной температуре получают 765 мг дезфенилаланин В -инсулина (крупного рогатого скота).

Пример 7. Аналагично пргамеру 1 из

20 1 г инсулина свиньи при ис пользовании 0,3 ммоль 3-трифторметилфенилизотиоциапата и проведении реакции в течение 2 час при комнатной температуре получают 770 иг дезфенилаланин В -,инсулина (свипьи).

Спосоо получения дезфенилаланин В -.инсулина, отличаюгиайся тем, что инсулин в смеси, состоящей из амида N, N äèàëêèëêàðIooíîâîé кислоты и водного буферного раствора с рН 8,0-9,0, оора батывают избыткогм трет- бут11локсикарбонилазида с последующей последовательной обработкой полученного продукта фенилизотиоцианатом и сильной кислотой, например трифторуисусной.

Составитель И. Гудкова

Текрсд Е. Борисова

Корректоры Е. Хмелева н Л. Орлова

Редактор Т. Шарганова

Заказ 508/1554 Лзд. ¹ 661 г1НИИПИ Государственного комитета по делам изобретений и

Москва, %-35, Раушская

Тнп. Харьк. фнл. пред. «Патент» бутилоксикарбонилазида и 3,3 мл (3,3 гммоль)

l,н. бикарбоната натрия, перемешивают 5 час при 35 С, упаривают,в ва кууме,при 50 С,,растирают остаток с эфиром и;получают

1,275 г солесодержащего продукта, который после обработки 20 мл 2% -ной уксусной кислоты, дает 945 мг N (Al) — NE (В29) - дитрет- бутилоксикарбонилинсулина (свиньи) .

Полученное соединение растворяют в 4 мл

95% -ного пиридина, добавляют 0,0365 мл фенилизотиоцианата, перемешивают 4 час при комнатной температуре, упаривают,в вакууме при температуре максимум 50 С до небольпгого объема, осаждают эфиром и выделяют

820 мг N" (А!) N (В29) -ди-трет-бутилоксдкарбоннл-N" (Bl) - фснилтиокарбамоилинсулина (свиньи), которые выдерживают 1 час в 8,5 мл трифторуксусной кислоты при комнатной температуре, добавляют 100 мл эфира и осаждают 720 мг дезфенилалани:.i В "-инсулина (свиньи), кри сталлизующегося при рН

5,0 — 5,5. Обработку трифторуксуспой кислотой можно проводить в течение 10 дигн при

50 С илч в тегение 5 мик с флегмой.

/П р и м е,р 2. Аналогично примеру 1 из 1 г инсулина крупного рогатого скота получают

710 лг дезфенилаланин В -инсулина (крупного рогатого с|кота).,П р и м е,р 3. Как в примере l,,из 1 г инсулина крупного рогатого скота, проводя процесс в течение 50 час .при 5 С в 85% -ном пиридине, получают 695 мг дезфенилаланин

В -инсулина (крупного рогатого скота).

IH р и м е,р 4, Аналогично примеру 1 из 1 г ,инсулина свиньи при проведении реакции в

Предмет изобретения

Т:I p а ttt Подписное

Совета .Министров СССР открытий наб., д. 4/5