Способ получения протеолитических ферментов
Воеоок знаи матен .:о-- >х : -"- @
О П И С Аа"-И"И -"Е
ИЗОБРЕТЕНИЯ (н1 467 ) ОЗ
С:1оз Советских
Социалистических
Реепублик
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 22.02.73 (21) 1885433/28-13 с присоединением заявки № (23) Приоритет
Опубликовано 15.04.75. Бюллетень № 14
Дата опубликования описания 31.07.75 (51) М. Кл. С 12d 13/10
Государственный комитет
Совета Министров СССР ло делам изобретений и открытий (53) УДК 576.15.08 (088.8) (72) Авторы изобретения
А. Ф. Гончаров, В. В. Хилимон и М. А. Гончарова (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ
ФЕРМЕНТОВ
Изобретение относится к технологии получения кормовых протеаз и может быть использовано в сельском хозяйстве.
Известен способ получения протеолитических ферментов путем культивирования микроорганизмов, относящихся к роду Bacillus, на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, с последующим выделением ферментов из культуральной жидкости.
С целью увеличения активности продуцируемых ферментов по предлагаемому способу из микроорганизмов, относящихся к роду Bacillus используют вид idosus.
Из вида Вас. idosus используют штамм
1002.
Кормовые протеазы этого штамма образуются без выделения сероводорода и аммиака.
Наращивание микробной массы штамма
Вас. idosus ¹ 1002 позволяет накапливать в жидких средах экзопротеазы с протеолитической активностью (ПА) 10000 — 12000 ед/л, а клеточная масса и ее экстракты за счет эндопротеоз увеличивают ПА более чем в 20 раз (Il0 методу водно-спиртового титрования).
ПА всей культуральной мыссы имеет прямую зависимость от количественного накопления микроорганизмов-продуцентов в среде.
Пример. Посевной материал продуцента выращивают на рыбном бульоне, на МПБ, на бульонах из отходов рыбной и мясной промышленности, на мясо-костном бульоне, на бульоне Хоттингера с суслом, на бульонах (отварах) из трупов животных, на растительных (сенных) отварах, на производственных
5 средах Намура.
Производственное наращивание культуральной массы налажено в условиях хозяйства на бульонах из трупов животных.
Можно использовать все трупы животных
10 со снятой кожей и удаленным желудочно-кишечным трактом. В зимний период трупы замораживают и используют по мере надобности.
Трупы в разрубленном виде погружают в
15 специальный котел с герметичной крышкой и манометром. Трупную массу заливают водой (1: 2 или 1: 3) и варят под давлением 0,5 атм в течение 5 — б ч.
При таком режиме трупы не только надеж20 но обезвреживаются от патогенных микроорганизмов, но и хорошо развариваются, а кости легко отделяются.
Всю бульонную массу вместе с остатками мышечных волокон в горячем виде перелива25 ют в специальные котлы, например молочные танки емкостью 0,5 т. В 3TII танки заливают (или лучше перекачивают) горячий (не ниже
80 С) бульон в количестве 100 — 300 л.
Крышку герметично закрывают, а трубку в
30 ней — стерильной ватной пробкой. Бульон ос467103
Предмет изобретения
Составитель Л. Минеева
Техред 3. Тараненко Корректор И. Позняковская
Редактор В. Блохина
Заказ 1802/!4 Изд. ¹ 1880 Тираж 529 Подписное
Е НИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий
Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Типография, пр. Сапунова, 2 тавляют для остывания на 3 — 7 ч до снижения температуры до 20 — 30 С. Посевную культуру штамма-продуцента в количестве 200—
250 г в возрасте 3 — 5 суток переливают в танк при соблюдении правил асептики.
В танке штамм инкубируют в течение 3 — 4 суток при оптимальной температуре, после чего через кран (снизу) отбирают пробу культуральной жидкости для проверки на ПА и дальнейшего использования культуральной жидкости в корм.
Дозы нативной культуры в корм животным определяют в соответствии с ПА культуральной жидкости.
В зимний период культуральну:о жидкость перед использованием можно подвергать трехкратному замораживанию — оттаиванию с целью разрушения микробных клеток н обогащения культуральной жидкости эндопротеазами, При смешивании кул туральной жидкости с кормами последние должны иметь температуру, не прев ы ш а ю щую 40 С.
Белки кормов животного и растительного происхождения подвергают воздействию экзои эндопротеаз микроба-продуцепта.
В процессе скармливания фермептированных кормов действие протеаз вырастает за счет последующего разрушения микробных клеток продуцента в желудочно-кишечном тракте животных.
Характеристика штамма.
М о р ф о л о г и я. Палочки тонкие, прямые
2 — 3 )(0,6 мкм, подвижные; споры овальные, толще диаметра материнской клетки, образуют утолщения, подобные вздутию, без строго определенного положения в клетке, хотя чаще эти вздутия образуются в центре.
Физиология и биохимические с в о и с т в а. Штамм хорошо растет на органических и синтетических средах.
На плотных средах образует суховатые колонии или сплошной налет в виде матовых наложений, плоских, с мелкими морщинами на поверхности возвышений.
На картофельной среде образует желтовато-белый, мелкоморщинистый, складчатый налет. Желатиновый столбик при посеве уколом разжижает в течение 1 — 1,5 суток.
Молоко свертывает и быстро пептонизирует, а на поверхности образует толстоватую морщинистую пленку, края которой вползают на стенку пробирки.
На мясо-пептонном бульоне (МПБ) образует серую пленку в складках. Муть на бульоне отмечается в первые сутки инкубации.
На дпе пробирки в осадке преобладают одиночные палочки.
Отношение к источнику углер од а: разлагает крахмал, образует кислоту на средах с глюкозой, сахарозой и мальтозой.
Отношение к источникам азота: усваивает белок соединительной ткани, коллаген, миозин и промежуточное вещество.
Коагулированную кровяную сыворотку животных при 56 — 60 С разжижает на вторые сутки. Сероводорода, аммиака и индола не образует. Нитраты восстанавливает.
Лучший рост штамма наблюдается на рыбном бульоне, а затем на МПБ и на бульонах из отходов рыбной и мясной промышленности, а такгке на бульоне Хотингера с суслом, на бульоне с желатиной в количестве от 5 до
15/p, на бульоне с лактозой, дрожжевой среде с кашалотовым жиром, <а растительных отварах, включая сенной отвар и сок растений, кормовых, луговых трав, сок сенажа и силосуемой массы, на производственной среде
Намура и некоторых ее модификациях.
На этих средах при оптимальной температуре и рН в теченпе 1 — 3 суток продуцирует кислые протеазы с ПА до 10000 — 12000 ед/л, а в клеточпых экстрактах, в особенности при трех и более кратных замораживаниях и оттаиваниях, ПА может возрастать более чем в
20 — 30 раз.
Увеличение ПА отмечено при добавках к среде сусла и коллагена.
Отношение к кислороду: выраженный аэрофил.
Температурный оптимум роста в пределах
20 — 25 С.
Оптимальный рН 4,5 — 6,5.
По Гр а му кр асится положительно.
1. Способ получения протеолитических ферментов путем культивирования микроорганизмов, относящихся к роду Bacillus, на питательной среде, содержащей источники углерода, азота с последующим выделением ферментов из культуральной жидкости, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью увеличения активности продуцируемых ферментов, из микроорганизмов, относящихся к роду Bacillus, используют вид idosus.
2. Способ по п. 1, отл и ч а ю щи и с я тем, что из вида Bacillus idosus используют штамм
1002.