Способ получения дезоксирибомононуклеотидов

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (11) 534236 (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено04.05.75 (21) 2130061/13 с присоединением заявки № (23) Приоритет (43) Опубликовано 05.11.76,Бюллетень №41 (45) Дата опубликования описания 12,01.77 (51) М. Кл.

А 61 К 37/10

Государственный комитет

Совета Министров СССР по делам изооретений и отирытий (53) УДК 6 15,7 39.6 (088.8) (72) Авторы изобретения Г, Д, Бердышев, Н. А. Луценко и Т. Б. Дьячковская (71) Заявитель Киевский ордена Ленина государственный университет им, Т,Г. Шевченко (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДЕЗОКСИРИБОМОНОНУКЛЕОТИДОВ

Изобретение относится к получению биологически активных веществ, которые могут найти применение в медицине в качестве физиологически активных средств.

Известен способ получения мононуклеотидов ферментативным путем, например, при обработке РНК культуральной жидкостью штаммы StaplllfQcoCcus ОаГЕОа в условиях пониженной активности, содержащейся в среде фосфотазы, Известен также способ получения 5-мононуклеотидов, заключающийся в том, что в качестве сырья используют полимерные нуклеиновые кислоты, которые расщепляют на мононуклеотиды 5-фосфодиэстераза активными экстрактами растительного происхождения с последующим выделением целевого продукта известными приемами.

Однако известные способы не обеспечивают высокого выхода целевого продукта.

С целью расширения сырьевой базы и повышения выхода целевого продукта в предлагаемом способе в качестве исходного сырья используют отходы производ2 ства протаминсульфата из молок рыб, экстракцию осуществляют кислотой, а ферментативный гидролиз проводят нуклеазами из печени промысловых рыб.

Для получения дезоксирибомононуклеотидов предлагаемым способом применяют ферментные препараты, которые получают из печени морских промысловых рыб, таких как камбала, горбуша и другйе. Получают

1О их следующим образом.

Печень камбалы гомогенизируют в дистиллированной воде, подкисленной Н 6О до рН 3,0 в гомогенизаторе Уоринга, затем гомогенат экстрагируют в течение

l5 3 суток, освобождают от.верхнего слоя жира, после чего центрифугируют при 4оС и 2500 об/мин в течение 40 мин. Затем надосадочную жидкость сливают и доводят добавлением сухого сернокислого аммония

20 до 25% насыщения. Осадок отделяют центрифугированием, а надосадочную жидкость доводят до 90% насыщения. Осадок со бирают фильтрованием и растворяют в минимальном объеме дистиллированной воды.

25 Полученный раствор снова доводят до на50

60 сыщения 40%-ным сернокислым аммонием, затем осадок отделяют центрифугированием и отбрасывают. Надосадочную жидкость доводят до 90% насыщения сернокислым аммонием, затем выпавший в осадок соби- Ь

pBIoT фильтрованием под Вакуумомф Полу ченный осадок растворяют в минимальном количестве 0,01М фосфатного буфера, рН

8,0 и в таком .виде полученный препарат

10 хранят в течение полугода при 20оС без потери активности.

Дальнейшую очистку ферментного препарата осуществляют с помошью гельфильтпации на колонке с сефадексом 6-100.

После очисткиферментного препарата проводят фракционирование на колонке с ДЕАЕ— целлюлозой и собирают объединенные фракции фосфодиэстеразы, дезоксирибонуклеазы

I иЦ °

Дезоксирибомононуклеотиды из отходов производства протаминсульфата из молок рыб получают следующим образом.

Пример. Отходы производства протаминсульфата из молок рыб растирают

25 до порошкообразного состояния в фарфорс вых ступках. Затем полученную порошко»образную массу (250 г) перемешивают в

5 л 7%-ной трихлоруксусной кислоты (ТХУ), полученный раствор раапивают по 1 л.в колбы и встряхивают на универсальном аппарате для встряхивания жидкости до

40 мин, затем центрифугируют 20 мин при 5000 об/мин, удаляют осадок, а надосадочную жидкость сливаЬт в стеклянную емкость. Таким образом извлекают кислотор астворимые продукты — алиг онукле отиды, мононуклеотиды, азотистые основания.

Полученный кислотный экстракт нейтрализуют 4н, аммиаком до рН 7,0 до- 40 бавляют 4 г МдЫ4 7Н О, затем вносят препарат нуклеаз (400 мг), выделенный вышеописанным способом, Реакционный раствор инкубируют при

37оС в течение 24 час, рН инкубацион- 45 ной смеси периодически контролируют, После окончания процесса ферментативного гидролиза олигонуклеотидов и добавления 10 л 96о гидролизного спирта, полученный раствор фильтруют, затем упаривают до сиропообразной жидкости, которую разводят дистиллированной водой и фильтруют через активированный угопь для удаления пигментов.

Разделение смеси дезоксирибомононуклеотидов осуществляют следующим образом.

Берут 100 мп раствора смеси дезоксирибомононуклеотидов и наносят на ионообменную колонку размером 50х12 см, содержащую смапу "Дауэкс-1" в.,хлоридной форме, рН наносимого раствора предварительно доводят аммиаком до 10.

Сначала колонку промывают бидистиллированной водой для удаления аммиака, раствором 0,01М хлорида аммония 1215 л, до тех. пор, пока рН элюируюшего раствора не понизится до 7,0. В результате такой промывки удаляот.азотистые основания и нуклеозиды, после этого колонку промывают 0,01М соляной кислотой (15-20 л), при этом удаляют все нуклеотиды. Полинуклеотиды и остатки негидролизовавшейся ДНК остаются на колонке.

Так осуществляют первоначальное разделение продуктов гидрапиза ДНК, Затем фракцию дезоксирибомононуклеотидов, полученную при пропускании через колонку 0,01М раствора соляной кислоты и концентрированную повторной реабсорбцией на "Дауэкс-1", подшелачивают водным раствором аммиака и наносят на колонку меньших размеров (10х2 см), содержащую "Дауэкс-1", для выделения отдельных дезоксирибануклеотидов, осуществляя их фракционирование следующим образом.

Пропускают 0,01М раствор хлористого аммония до тех пор, пока рН раствора, вытекающего из колонки, не снизится до

6,0, затем пропускают через колонку

0,001 М раствор соляной кислоты,при этом выделяют фракцию, содержащую дезоксицитидиловую кислоту (включая 5-метилцитидиловую кислоту), затем промыванием 0,002М соляной кислотой выделяот фракцию, содержащую дезоксиадениловую кислоту, раствором 0,003М соляной кислоты выделяют фракцию, содержащую тимидиловую кислоту, раствором 0,005М соляной кислоты выделяот фракцию, содержащую дезоксигуаниловую кислоту.

Идентификацию фракции нуклеотидов, сс бранных с колонки, осуществляют при помощи спектрофотометрии.

Полученные растворы дезоксирибомоно нуклеотидов каждый в отдельности концентрируют путем реадсорбции на ионообменных колонках, промывают водой и элюируют разбавленными растворами соляной кислоты. При этом пуриновые дезоксирибома нонуклеотиды быстро нейтрализуют водным раствором аммиака с целью избежания кислотного гидролиза, Дальнейшую концентрацию каждого полученного дезоксирибомононуклеотида в растворе осуществляют упариванием в ва5 кууме раствора с последуюшим осаждением смесью этанола с эфиром или раствором солей бария с аммиаком.

Предлагаемый способ позволяет использовать в качестве исходного сырья отходы производства протаминсульфата из молок рыб, которые до настояшего времени во всем мире не находят никакого применения и выбрасываются за ненадобностью. Получение дезоксирибомононуклеотидов из предлагаемого сырья обходится в два раза дешевле по сравнению с их получением из полимерных нуклеиновых кислот.

34236

Ф ормула изобретения

Способ получения дезоксирибомононуклеотидов путем экстракции исходного сырья, ферментативного гидролиза получен5 ного экстракта с последуюшим выделением целевого продукта известными приемами, о т л и ч а ю ш и и с я тем, что, с целью расширения сырьевой базы и повышения выхода целевого продукта, в качестве исходного сырья используют отходы производства протаминсульфата из молок рыб, экстракцию осушествляют кислотой, а ферментативный гидролиз проводят нуклеазами из печени промысловых рыб. !

Составитель С. Малютина

Редактор Л, Гончарова Техред М. Ликович Корректор Н. Золотовская

Заказ 5563/215 Тираж 630 Подписное

БНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул. Проектная, 4