Способ иммобилизации ферментов

 

1 «ci -:;. );уз;.;.-,q

О П И C А Н И Е <1ц 536192

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВНДИИЛЬСХВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 24,07.75 (21)2158908/04 с присоединением заявки № (23) Приоритет (43) Опубликовано 251176 Бюллетень № 43 (45) Дата опубликования описания 19.04,77

С 07 57/02//

jA 61 K 37/48

Государственный комитет

Совета Министров СССР оо делам изаоретений и открытий (53) УДК

577.1 5.07 (088.8) (72) Авторы изобретения

Ю. И. Крылова, Л. В. Козлов, В. К. Антонов, Б. ". Ганна, Е. Б. Датунашвили и Я. М. Павленко

Институт биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Всесоюзный научно-исследовательский институт виноградарства и виноделия "Магарач" (71) Заявители (54) СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ ФЕРМЕНТОВ

Изобретение касается получения препаратов иммобилизованных ферментов, которые могут найти широкое применение в пищевой, химической, микробиологической промышленности, а также в лабораторной и медицинской практике. Ферменты, закрепленные на с орбенте, имеющем высокую удельную массу, могут быть использованы в реакторах с "кипящим слоем". Сорбентом, подходящим для этой цели, может быть металл, если он инертен в используемых средах и разрешен к применению в соответствующих отраслях промышленности (пищевой, медицинской) .

Известно много способов иммобилизации ферментов на носителях. В частности, для иммобилизации ферментов в качестве носителя применяют порошок нержавеющей стали, активированной посредством покрытия окисью титана, образующейся при гидролизе четыреххлористого титана (1). Недостаток такого метода — непригодность данного сорбента для применения в ряде отраслей пищевой промышленности.

Предложен способ получения препаратов иммобилизованных ферментов, заключающийся в том, что в качестве носителя используют порошок металлического титана, активированного путем покрытия окисью титана. Такой носитель образует в мягких условиях комплексные соедлнения с сорбируемыми белками.

Способ получения препаратов иммобилизованных ферментов включает две последовательные стадии. На первой стадии порошкообраэный IHTBH обрабатывают дымящей азотной кислотой, что со3дает возможность для активирования носителя.

Активация носителя осуществляется посрецством

10 его обработки четыреххлористым титаном в воде.

На второй стадии осуществляют сорбцию фермента на.подготовленном таким образом носителе.

Предлагаемый способ может быть использован для иммобилизации практически всех ферментов и других белков. Особый интерес представляет иммобилизация кислых протеиназ (в том исле лепсина ), которые неустойчивы при нейтральных и щелочных значениях рИ и вследствие этого теря ст активность в условиях болыцинства методов иммобилизации. ро Пример 1. Получение активированного сорбента.

К 10 г порошка металлического титана с размером частиц 100 — 200 мкм приливают 50 мл дымящей азотной кислоты, смесь нагревают при 100оС B течение 5 час, фильтруют через стеклянный фильтр

536192 гично примеру 2. Активность полученного препарата иммобилизованной протеиназы по гемоглобину

200 ед/г.

Пример 4. Иммобилизация протеиназы из

Asperg i I lus аччап оп 78 — 2.

К 1 г активированного сорбента приливают

5,мл 1%-ного раствора протеиназы из Asperg illus

awamor1 в 0,1 M ацетатном буфере, рН 4,0. Смесь взбалтывают на механической качалке 1 час при

1у 4 С и 10 час при 20 С. Промывают препарат аналогично примеру 2. Активность полученного препарата иммобилизованной протеиназы 380 ед/г.

Пример 5. Иммобилизация пектиназы из

Aspergi l l us awamo r i.

1й К 1 г активированного сорбента приливают

5 мл 0,25%-ного раствора пектиназы из Aspergi I lus

awamori в 0,1 М ацетатном буфере, рН 5,6. Смесь взбалтывают на механической качалке 2 часа при

4 С и 12 час при 20 С. Промывают препарат анало31 гично примеру 2. Активность иммобилизованной пектиназы по пектину 4670 ед/г.

/

Г

Способ иммобилизации ферментов на носителе, о тли чаю щи и ся тем, что, с целью улучшения свойств препаратов иммобилизованных ферментов, в качестве носителя используют порошок металлиЗО ческого титана, последовательно обработанный дымящей азотной кислотой и четыреххлористым титаном в присутствии воды.

Источники информации, принятые во внимание

З5 при экспертизе:

1, Hasselberger F.Х. et al., BBRC, 1974, 57, 1054.

Составитель А. Бочаров

Редактор Т. Загребельная Техред М. дикович

Корректор В. Куприянов

Заказ 5572/291

Тираж 575 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открьпий

113035, Москва, Ж-35, Рвушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

3 и промывают на фильтре 1 н. НИ, а затем дистиллированной водой до нейтральной реакции. Подготовленный к активации порошок металлического титана переносят в круглодонную колбу, снабженную механической мешалкой, капельной воронкой и газоотводной трубкой, добавляют 50 мл дистиллированной воды, охлаждают до 5 — 10 С и к полученной суспензии прикапывают в течение 10 мин 5 мл четыреххлористого титана. Смесь перемешивают. при охлаждении 30 мин, а затем 30 мин при комнатной температуре. Порошок титана отфильтровывают, промывают на стеклянном фильтре дистиллированной водой до нейтральной реакции, высушивают на воздухе и прокаливают при 540 С в течение 3 час. Выход 9 г.

Пример 2. Иммобилизация пепсина.

К 9 г активированного сорбента приливают

50 мл 2%-ного раствора пепсина в 0,1 М ацетатном буфере, рН 4,5, смесь взбалтывают на механической качалке в течение 18 час при 4 С. Порошок титана с иммобилизованным ферментом промывают на фильтре от несвязанного фермента 1 М водным раствором NaCI до исчезновения светопоглощения при 280 нм в промывных водах и 0,1 М ацетатным буфером (рН 4,5) до отсутствия ионов хлора.

Активность полученного препарата иммобилизованного пепсина по гемоглобину составляет 1000 ед/г.

Активность препарата полностью сохраняется при лиофильном в ысушив анин, Пример 3. Иммобилизация протеиназы из

Aspergil lus oryzae, штамм 251.

К 1 r активированного сорбента приливают

5 мл 1%-ного раствора протеиназы из Aspergiilus

oryzae в 0,1 М ацетатном буфере, рН 4,6. Смесь взбалтывают на механической качалке 1 час при

4 С и 10 час при 20 С, Промывают препарат аналоФормула изобретения