Способ выделения нуклеиновых кислот из активного ила

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ пп 5486l4

Союз Советских

Социалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛбСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 17.04.75 (21) 2125986/04 с присоединением заявки №

i(23) Приоритет

Опубликовано 28.02.77. Бюллетень № 8

Дата опубликования описания 28.03.77 (51) М. Кл. С 07Н 21/00

Государственный комитет

Совета Министров СССР по делам изобретений (53) УДК 547.963.3,07 (088.8) н открытий (72) Авторы изобретения (71) Заявитель

А. С. Долобовская и А. И. Щетинин

Всесоюзный научно-исследовательский институт водоснабжения, канализации, гидротехнических сооружений и инженерной гидрогеологии «ВОДГЕО», Отдел водного хозяйства промпредприятий r. Харькова (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

ИЗ АКТИВНОГО ИЛА

Изобретение относится к области получения нуклеиновых кислот и может применяться на соответствующих производствах микробиологической промышленности.

Известны два способа выделения нуклеиновых кислот из ила сточных вод.

При осуществлении одного из них активный ил, образующийся при очистке сточных вод, обрабатывают органическим растворителем, например ацетоном, а затем осадок экстрагируют раствором, содержащим одновалентный металл, например раствором NaOH. Экстрагированные биополимеры, содержащие нуклеиновые кислоты, белки и полисахариды, осаждают двумя объемами этанола, осадок растворяют, а нуклеиновые кислоты очищают, например, депротеинизацией (1).

Недостатком данного способа является денатурация ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты) и деградация РНК (рибонуклеиновой кислоты) под действием щелочи.

Второй способ является более близким к предлагаемому способу выделения нуклеиновых кислот из активного ила. При осуществлении этого способа активный ил экстрагируют раствором комплексообразующего агента, например этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) или нитрилотриуксусной кислоты.

Рекомендуемый для экстракции водный раствор содержит 2 /о ЭДТА и имеет рН 10. Процесс ведут при температуре 0 — 4 С. Экстрагированные биополимеры, содержащие нуклеиновые кислоты, белки и полисахариды, как и в предыдущем способе, осаждают, например, двумя объемами этанола, осадок растворяют, а нуклеиновые кислоты очищают, например, депротеинизацией.

Недостатками данного способа получения

10 нуклеиновых кислот является образование сточных вод, содержащих ЭДТА, которая относится к веществам практически неразлагаемым при биологической очистке этих стоков.

Кроме того, в растворах ЭДТА затруднена де15 протеинизация, так как в этих растворах не происходит диссоциации(нуклеопротеидных комплексов на нуклеиновые кислоты и белки, что снижает выход целевого продукта.

С целью применения для экстракции нукле20 иновых кислот веществ, легко разлагаемых микроорганизмами и облегчающих депротеинизацию полученных растворов нуклеиновых кислот, предлагают проводить экстракцию активного ила раствором вещества, разрушаю25 щего водородные связи и нарушающего гидрофобные взаимодействия в биополимерах, а именно 3,0 — 8,0 М раствором мочевины.

В отличие от ЭДТА, мочевина является продуктом легко усвояемым бактериями и расте548614

Количество Д1-1К (мг(г сухого васа) в экстракте

Концентрация мочевины

Моль/л

00 в сутки

0,562

0,554

0,818

0,895

1,227

2,199

0,588

0,818

1,023

1,406

1,866

2,148

0,869

0,972

0,920

1,483

1,320

1,534

3,323

3,903

4,730

6,367

6,996

8,440

0,5

1,0

2,0

3,0

4,0

8,0

6

12

18

24

0,665

0,920

0,997

1,483

1,483

1,636

0,639

0,639

0,972

1,100

1,100

0,920 пнями. Сточные воды, образующиеся при пол чении нуклеиновых кислот из активного ила предлагаемым способом, могут быть легко очищены биологическим способом или после соответствующей обработки использованы как удобрения для сельского хозяйства.

Использование мочевины в качестве экстрагирующего раствора облегчает дальнейшую депротеинизацию раствора нуклеиновых кислот, так как многие белки в концентрированных растворах мочсвины денатурируют, а комплексы нуклеиновых кислот диссоциируют.

Пример.

Суспензию активного ила центрифугируют (3 тыс. Об/мин., в течение 2 — 3 мин), надосадочиую жидкость сливают, осадок охлаждают

Как видно из представленных данных, нуклеиновые кислоты из активного ила экстрагируются с удовлетворительным выходом раствором 3,0 — 8,0 М мочевины.

Экстрагированные нуклеиновые кислоты осаждают известным способом, например, двумя объемами этанола, осадок растворяют. например, в 0,15М хлористого натрия — 0,015М цитрате натрия (рН вЂ” 7,0) и очищают от примесей, например, встряхиванием со смесью хлороформ — изоамиловый спирт (24: 1).

Использование предлагаемого способа получения нуклеиновых кислот из активного ила по сравнению с существующим способом обеспечивает биологическую очистку сточных вод, образующихся в процессе обработки активного ила; кроме того, облегчается очистка полученных экстрактов от белков.

Пример. Суспензию активного ила центрифугируют (3 тыс. об. мин) в течение 2—

3 мин, надосадочную жидкость сливают, осадок охлаждают на льду. Охлажденный осадок заливают предварительно охлажденным на льду раствором 4 моль (24%) мочевины и суспендируют в нем.

Во избежание денатурации нуклеиновых кислот все операции проводят при 0 — 4 С.

Время экстракции 4 час.

Экстрагированные нуклеиновые кислоты осаждают двумя объемами этанола. Полученный осадок содержит 57,1% белка, 42,9% нуклеиновых кислот, из которых 14,5% РНК.

Осадок растворяют в растворе 0,15М хлористого натрия — 0,015М цитрата натрия, рН на льду. Охлажденный осадок заливают предварительно охлажденным на льду раствором

3,0 — 8,0 М мочевины и суспендируют в нем.

Во избежание денатурации, экстракцию нуклеиновых кислот проводят при температуре 0 — 4 С. Общее время экстракции зависит от концентрации мочевины в используемом растворе.

10 В таблице приведены данные по выходу

ДНК при экстракции активного ила растворами с различной концентрацией мочевины, время одной экстракции 1 час.

Влияние концентрации мочевины и количе15 ства экстракцнй на выход ДНК из активного ила.

7,0 и очищают от белка встряхиванием с равным объемом смеси хлороформ — изоамиловый спирт (24: 1) . Суспензию разделяют центрифугированием, водный слой осторожно отбирают и сохраняют для последующих операций. Промежуточный слой промывают

0,15М хлористым натрием — 0,015М цитратом натрия посредством взбалтывания с последу25 ющим центрифугированием. Промывную жидкость объединяют с ранее отобранным водным слоем, Процедуру осаждения и встряхивания со смесью хлороформ — изоамиловый спирт пов30 торяют еще один раз, После этого нуклеиновые кислоты осаждают двумя объемами этанола. Конечный выход нуклеиновых кислот составляет 8 мг/г сухого вещества ила. Содержание белка в препарате

35 составляет 1 — 10%.

Формула изобретения

Способ выделения нуклеиновых кислот из активного ила путем экстракции при темпера40 туре 0 — 4 С с последующим осаждением и очисткой, отличающийся тем, что, с целью очистки сточных вод и повышения выхода целевого продукта, экстракцию ведут

3,0 — 8,0М раствором мочевины.

45 Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1. Патент Японии № 45-13827, кл. 16F 8, 1970.

2. Патент Японии № 45-13828, кл. 161 8, 50 1970 (прототип) .