Способ получения антибиотика
I .У.»
ОП ИКАНИЕ
Со»оэ Советских
Социвлистииеских
Респубттик (11) 561520
ИЗОБРЕТЕН Ия (61) Дополнительный к патенту (51) M. Кл С 12 Р 9/00 (22) Заявлено 08.10.64 (21) 923845/13 (33) Гасударственный комитет
Совета Министров СССР оо делам иааоретений и открытий (31} (43) Опубликовано 05.06.77. Бюллетень М 21 (45) Дата опубликования описания 09.12.77 (?2) Авторы изобретения
Иностранцы
Дениз Монси, Леон Нине и Жан Предом (Франция) Иностранная фирма
"Рона — Пуленк А. О." (Фра н ция) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА растворимый пигмент. Воздушный мицелии от светло-сероватого цвета до темно-серого. Пигмент растворимый, зеленого цвета.
Мальтозо-триптоновый агар-агар.
Степень развития хорошая. Обрап»ая сторона колоний серовато-желто- коричневая. Воздушнъш м»»цел»»й» от беловатого до серого цвета. Растворимьп» пигмент коричнево- серый, неяркий.
Агар-агар Эмерсона (W-23).
Субстратный мицелий светло-коричнево-жел тый, развит хорошо. Воздушный мицелий бело ватый. Растворимый пигмент отсутствует.
Глюкозо-пептоновый агар-агар (W-7) .
Субстратный мицелий светло-желтый, развит хорошо. Воздушный мицелий беловатый, очек» умеренный. Растворимый пигмент желтоватый.
Питательный агар-агар (W-5).
Степень развития слабая. Субстратный мицелий светло-серовато-желтый. Развитие умереш»ое. Воздушный мицелий и растворимъ»й пигмент отсутствуют.
Глюкозо-аст»арагиновый агар-агар (W-2) .
Субстратлый мицелий от светло-желтого до коричнево- желтого. Воздуигный мицелий развивается через две недели, развитие умеретпюе, цвет (23) Приоритет — (32) Изобретение касается медицины, в частности производства антибиотиков, Предлагается способ получения нового антибиотика 11.837.RR где в качестве гриба- продуцента используют штамм Streptomyces viridans 5
NRRL 3687 Штамм представлен лабораторией NRRL в Преории (США) под ссылкой "NRR1 - 3687".
Этот организм выделен из образца почвы, взятой в окрестностях Мадраса в Индии. Видовые признаки штамма соответствуют признакам описан- 10 ным для Streptomyces Viridans.
Основные характерные признаки штамма
Streptomyces viridans NRRL 3087. Вегетативный мицелий от желто-сероватого до светло-желтого цвета или коричнево-желтый. 15
Воздушный мицелий от светло-серого до темно-серого цвета, порошкообразньп», хорошо развивающийся. Длинные спорофоры, одноногие, заканчиваюшиеся цепями спор, включенных в концевые пучки, способные иметь ответвления вдоль своего 20 основного стебля. Споры цилиндрические размером (Q,7-0,9) х (1,3-1,5) мк.
Агар-агар Беннетта. Развивается хорошо. Обратная сторона серовато-желтая, окрашивается в коричнево-зеленый цвет в местах, где образуется 25 (53) УДК 615.779.9 (088.8) 561520 от беловатого до сероватого. Растворимый пигмент отсутствует в течение двух недель. Через месяц цвет эеБу охйто - серый, кпличестло неуАъчкул жсе
Гл.щерино-@спарапиовый агар-агар (Ж-З).
Субсгратный ьпгцел и коричневато-желтьй с нереллмрнымн слегшими зеленоватого цвета. Роздупйпю мжежя бело сероватьй, светло-серо" ватьй. Развитие умеренное. Растворимьй пигмент коричнево-серьй с небольшим кожкеством зеленоватого и серо-зеленого.
Агар-агар с малатом кальция Ыраинского.
Обоатная сторона колоний светло-желто-сероватая. Воздушньй мицелнй беловатый, светло-серьй. Растворимьй пигмент сероватьй или отсутствует.
Агар-агар с тирозином.
Обратная сторона колоний желто-коричневая, Воздушньй мицелий желтоватьй, умеренно развитьй, Раство1л1мьй шггмент желто-кори иевый.
Агар-агар с крахмалом (К вЂ” 11).
Обратная сторона колоний от зеленовато-серой до темно-зелено-коричневого нгзета, Воздушный мицелий беловатьй и серьй, умеренно развитый.
Растворимьй пигмент беловато-зеленьй, зеленовато- серый.
Агар-агар с крахмалом Придам.
"Обратная сторона колоний серовато-желтая.
Воздушный мицелий светло- серый, достаточно хорошо развитый. Раствооимьй пигмент отсутствует. Гидролиз крахмала средний.
Синтетический агар-агар Чапека с глицерином.
Обратная сторона колоний светло-серая и желтокоричневая, Окрашивается в зелечовато-коричневьй цвет в процессе образования растворимого пигмента зеленого цвета. Воздупньй мидер беловатый и серый. Растворимый и;мент светло-желтый, коричневый. При добавлении к среде земли пигмент по мере старения становится серовато-коричневым и темно-зелено-коричневым, почти черным.
Среда на картофеле (W-27).
Субстратньй мицелий зеленовато-коричнево-желтого и темно-зеленого цвета, по мере сгарения культуры - черно-коричневого цвета. Воздушный мицелий от беловатого до светло-серого, развитие умеренное. Образование растворимого пигмента запоздалое, обильное, черно-зеленого цвета с переходом в зеленоватый, распространяется по всей поверхности картофеля.
12 0. ный чистый желатин.
Воздушный мицелий от беловатого до сероватогоцвета, развитие умеренное. Растворимый шп мент образуется через две недели. Через месяцжелтовато-серого цвета.
Питательная среда с иитратом.
Беловатое кольцо на поверхности- среды. Воздушнъй мицелий беловатый, развитие очень медленное. Раствориьп и пигмент отсутствует.
Глюкоза-нитратная среда.
На поверхности среды легкое кольцо и пленка от серовато. белого до светло-желтого цвета, развитие умеренное. Воэдушньй мицелий отсутствует или беловатого пвета (следы), Раствориыяй пигмент бледю-желгьй.
Синтетическая среда Чапека с целлюлозой.
Воздушный мицелий серый, хорошо развитый по всей поверхности бумаги, погруженной в среду
Снятое молоко.
10 a) при температуре26 С - хорошо развитое кольцо бледно-желтоватого цвета. Воэдушньй мицелий отсутствует либо наблюдаются следы беловатого цвета; б) при теьшературе 37 С - среднеразвитое коль15 цо от светло-желтого до светло-желто-коричневогс цвета. Воздушньй мицелий отсутствует, либо следы беловатого цзета.
Желатин умеренно превращает в жидкое состояние °
Молоко медленно пептонизируется с небольшой коагуляцией при 37 С.
Крахмал быстро гидролизуется.
Реакция нитратов положительная.
Сероводород не образует.
Тирозин и малат кальция растворяет хорошо, Оптимальная температура роста штамма 25-28 С.
Способ получения антибиотика осуществляют следующим образом.
Культуру Streptomyces vieidans NRRL 3687 выращивают и глубинных условиях в, ферментационном аэробном процессе на питательной среде, содержащей источи ки углерода и азота, минеральные соли и стимуляторы роста.
В качестве источника углерода можно использовать глюкозу, сахароэу, лактозу, декстрины, крахмал, сахарную патоку нли органические кислоты: молочную, лимонную, винную.
В качестве источш ка азота могут быть лри4О менены нитраты, минеральные и органические .-,оли аммония, мочевины, аминокислот, а также казеин, молочньй альбумин, соевая мука, мясной экстракт, дрожжи, растворимые дистилляты и другие.
Иэ неорганических солей питательная среда
45 может содержать щелочные или щелочноземельные фосфаты, карбонаты кальция или магния, а также активаторы роста - соли цинка, кобальта, железа, меди, марганца.
Ферментацию проводят при температуре 25-28 С, рН среды 6,5-7,5 и скорость аэрагпщ 0,3-2 л/л мин. Максимальный выход продукта через 4-7 дней культивирования.
Антибиотик иэ культуральной жидкости вьщеляют известными способами с учетом его химических, физических и биологических свойств.
Активность антибиотика определяют методом диффузии, используя ВасИ Ьа в качестве тест-оргашззя, Антибиотик 11.837, R. R. является сильной кислотой нейтральньй эквивалент которой 600 (рКа =4,1).
561520
Элементарный анализ,%: С 46,9; Н 7,9; О 39,2;
1ч 3,9; Р2,25.
Молекулярный вес выше 5000.
Физические свойства. . Аморфнйй белый порошок разлагается при температуре 16О С. Инфракрасный спектр антийютика в бромистом калии представлен на чертеже, на котором íà ocR абсцисс (нижняя шкала) нанесена с одной стороны длина волн, выраженная в ьаысронах, я с другой стороны (верхняя шкала)ласло волн в сантиметрах,, а на оси ординатпередача r, процентах.
Б акте риостатическую активность антибиотика11.8.37.П.В. определяют методом разжижении, Результаты различных определений представлены в таблице, где минимальные бактериостатические концентрации выражены в микрограммах субстанции на 1 см испытуемой среды. Антибиотик обладает большой продолжительностьдействия и слабой токсичностью.
Пример 1. Ферментер емкостью 170» разгружают средой следующего состава (в кг):
Замочснное зерно 4,8
Водная глюкоза 2,4
Хлористый натрий 0,6
Сульфат магния 0,12
Вода, л до 100
После установления рН среды 7,15 575 см концентрированного натрия (д - 1,33) добавляют 0,6 кг карбоната кальция.
Питательную среду стерилизуют паром при температуре 122 С в течение 40 мин. После охлаждения объем среды составляет 120 л, а ðÍ7,15. Среду засевают 200 мл культуры 81гертопзусез viridans
NRRL 3687 и инкубируют при температуре 26 С в течение 28 ч при непрерывном перемешивании и аэрации стерильным воздухом.
Фсрментацпю осуществляют в ферментере объемом 350 л на ферментационной среде следующего состава (в кг):
Соевая мука 8,0
Растворимые дистилляты 1,0
Крахмал 3,0
Карбонат кальция 2,0
Хлорисгый натрий 2,0
Хлористый водный кобальт (6Н О) 4,0
Соевое масло, л 3,0
Вода, л 180 рН среды 7,05. Среду стерилизуют паром при температуре 122 С в течение 40 мии.-После охлаждения объем среды 200 л, рН 7,15.
Ферментационную среду засевают 20 л, подго. товленного описанным выше образом инокулята.
Юерментацию ведут при температуре 26-27 С в течение 138 ч при перемешивании и аэрации стерильным воздухом, рН среды 7,9, объем ферментационной массы 180 л.
Концентрация антибиотика в ферментационной массе 4515 л/смз.
Пример 2. Ферментацию осуществляют в фермеитере емкостью350 л на ферментационной среде следующего состава:
Намоченное зерно, кг 6
Крахмал, кг 2
Соевое масло, л 3
Хлористый водный кобальт (6Н О), г 4
Вода, л 175 рН среды устанавливают 5,9 380 см кон ð центрированного натрия (d-1,33) и добавляют 1 кг карбоната кальция. Среду стерилизуют паром при температуре 122 С в течение 40 мин. После охлаждения к среде добавляют стерильные 0,4 кг сульфата аммои я и 5 л воды. рН среды 6,8, объем
15 200 л.
Далее среду засевают 20 л инокулята, подго топленного, как описано в примере 1.
Ферменташпо осуществляют при температуре 26-27 С в течение 144 ч при перемешивании и
2р азрашм стерильным воздухом, рН ферментационной массы 8,4, концентрация антибиотика
3eqn /
Пример 3. В 200 л ферментационной среды с рН8,4, имеющей титр 2855 л/см устанавливают
25 рН 3 SN раствором соляной кислоты в резервуаре, снабженном неремешивающим устройством, Затем добавляют 12 кг вспомогательного средства фильтрации. Смесь фильтруют через фильтр-пресс, а остаток фильтрации промывают 60 л водопроводчр ной водьь Фильтрат и промывную воду выбрасы вают как отходы. Остаток фильтрации взбалтывают в 150 л смеси бутанола и метанола (2: 1); рН смеси доводят до 6 И н, раствором натрия. Перемешивание ведут в течение 30 ла н, затем смесь фильтру35 ют через фильтр-пресс. Фильтрат собирают, а остаток промывают 30 л смеси бутанола и метанола.
185 л промывочной воды и филь|рата имеет титр 2075 л/см . Спиртовьп1 филырат концентрируют под давлением 20 мм рт.ст при температу4Р ре 35 С до объема 2 л.
Выпавший в осадок антибиотик отделяют фильтрованием, промывают ацетоном и высушивают в сушильном шкафу под вакуумом (5 мм рт.ст. ) .
45 Получают 254 r зелено-серого вещества, имеющего титр 1025 л/мг.
Пример 4. 375 л ферментационной массы с рН 7„9 пропускают через сито для удаления круп50 ных частиц, рН доводят до 7,5 н, раствором соляной кислоты при пере мешивании. Затем добавляют 22,5 л смолы J3QWEX 1х2 в хлористом цикле, перемешивают 2 ч, после чего смесь пропускают через
55 вибросито. Смола задерживается на сите, а среду выбрасывают. Затем смолу загружают в колонну и последовательно промывают 50 л 5Я.-ного водного раствора хлористого натрия и 10 л воды. Промытую смолу обезвоживают, пропуская 20 л метанола. Адсорбированное вещество извлекают раствором метанола с 20% воды и 2,8% хлористого аммония.
561520
8 воды, затем 2,5 л смеси метанол-вод (80:20 по объему).
Антибиотик элюируют 10 л смеси метанол-вода, содержащей 7,5 г/л хлористого калия. Элюат концентрируют до 400 см под давлением 20 мм рт,ст. при температуре ниже 40 С. Концентрат диалнзируют против дистиллированной воды в течение 24 ч посредством целлюлозной пленки для удаления минеральных солей и органических примесей, 1О 650 см диалнзированного раствора концентрируют под.давлением 20 мм рт. ст. до объема 125 см
Антибиотик осаждают путем дбоавле ия LU, объемов смеси эфир-ацетон-изопропанол (10: 10:
10). После фильтрации, промывки в ацетоне и
I о
15 высушивания в течение ночи при температуре 35 С под давлением 2 мм рт.ст. получают 8,25 г светло-серого порошка с титром 24-600 и/мг.
Вид бактерий
Staphylococcus aureus, souche 209P-АТСС 6538 Р
0,15 — — — — — — souche 133 (inctitut Pasteur) 0,15
0,35
150
Sarcina Lutea — АТСС 9341
0,6 — "—" —" — pyogenes hemolyticus (souche Dig 7, Ьат!тот Pasteur) 0 005
Nei sser i a gonorrhaeae (А50 — inst i tut Pasteur)
Diplococcus pneumoniae (souche Til, Institut Pasteur) 1,25
0,03
0,03
35 — — — — para-smegmatis (А75 — Lausanne) 65
Shigella dysenteriae — Shiga L (Institut Pasteur)
Salmonella paratyphi А (Lacasse, inst itut Pasteur) — " — " — асЬоттвив11ег! (рагат1тттФн Щ Fougenc (Institut Pasteur) 7
Элюаты концентрируют под давлением 20 мм рт.ст. до объема 3 л, Концентрированный раствор с титром 92.950 л/см и удельпмм весом 1 057 диализнруют в течение 48 ч против дистиллированной воды при помощи пленки типа целлофан.
Объем раствора 4,7 л, удельный вес 1,025. Раствор концентрируют aog давлением з мм рт. ст. до1
300 см, затем лиофилизнрчют. Получают 48 r неочи1ценного вещества с титром 6530 л/мг.
Пример 5. 250 r неочищенного антибиотика, полученного по примеру 3, растворяют в 4 л воды при рН 8, Водный раствор фильтруют, пропускают через колонну, содержащую 2,7 л нонообменной смолы до 1а/ ЕХ1х2 в хлористом цикле; обработанн ло воду удаляют. Смолу промывают 2.5 л — — — — — — souche Smith
Streptococcus fszcalis — АТСС 9790 —" — "— "— viridans — (Institut Pasteur) Bacillus subtiIis — АТСС 6633
cereus J — АТСС 6630
Mycobacterium species — АТСС 607
EscherIchIa coIi — АТСС 9637
Минимальные бактериостатические концентрации, мг/см
56152О
10 цродолжение таблицы
Pseudomonas aeruginosa (souche Bass — l stitut Pasteur>
Brucella bronchi septica (CN — 387 — ФеИсоае
lnstitut) — abortus bovis 8 19
Pasteurella multocida (А 125, lnstitut Pasteur) 1,5
Tr6ponhme de Reiter
20 питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли и микроэлементы, с последующим выделением и очисткой целевого продуктаизвестными приемами.
Формула изобретения
Способ получения антибиотика, о тл и ч а ющи и с я тем, что культуру Streptomyces viridans
gRRl» 3687 выращивают в аэробных условиях на
Составитеш. Г. Смирн эва
Техред В. Куприянов
Редактор Л. Ушакова
Корректор А. Власенко
Тираж 541 Подписное
ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-З5, Раушская наб., д. 4/5
Заказ 1694/161
Филиал ППП "Паавит".г. Ужгород, ул. Проектная, 4
УО
70 бО
О
4о
РО ,О
0 с
Proteus vulgar is — А 244 а:Ыза! ella pneumoniae — АТСС 10 031.
1д 17 Ю 17 1S- 1Х вж,