Способ получения антибиотика
Союз Советских
Со циалистииесюа
Республик (11) 561 521 (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 13.08.71 (21) 1694401/15 (23) Приоритет- (32) 14 08.70
2 (51) M. Кл.С 12 О 9/00
Гасударственный квинтет
Совета Мнннотров СССР оо делам нзобретеннй н открытнй (31) 64389 (ЗЗ) США (43) Опубликовано 05.06.77. Бюллетень 1ч 21 (53) УДК 615.779.9(088.8) (45) Дата опубликования описания 09.12,77
Иностранец
Юлиус Бергер (ClilA) (72) Автор изобретения
Иностранная фирма
"Ф. Хоффманн Ля Рош и Ко. АГ (Швейцария) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ AHTH1HO1ИКА
Изобрегенне относится к способам получения антибиотиков путем культивирования гриба-продуцента на жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральных солей, в aýðîáíûõ условиях.
Известен способ получения антибиотиков с использованием в качестве продуцента гриба из рода Streptomyces.
11редлагается способ получения антибиотика путем культивирования гриба-про, уцента на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральных солей, в аэробных условиях с последующими выделением и очисткой антибиотика, при котором в качестве продуцента используют
Streptomyces Sp,Х-5108, А1СС 2! 386.
Streptomyces Sp, Х-5108 выделен из образца почвы, отобранной на Бермудских островах.
Культура это о организма получила лабораторный индекс Strep tomyces Sp. Х- 5108, подкультура 3191-2, была выставлена в Американской коллекции типов культур в Роквилле, штат Мэриленд, гце эта культура была внесена в коллекцию ATCC под регистрационным номером 21386. Виды Streptomyces, идентифицированные как Streptomyces
Х-5108, включают все штаммы Streptomyces, вырабатываюцп!е антибиотик Х-5108, котооые могут быть дифференцированы от штамма
АТСС 21386 и его подкультур.
Штамм Streptomyces Sp. Х-5108, ATCC 21386 имеет следуюпьче особенности.
Оценка степени роста.
Культура дает хорошо развитый и разветвленный мицелий на субстрате и характерный аэриальный мицелий на многих средах. В условиях погружения бактерии развиваются в виде твердых и крупных особей и в зависимости от применяемой питательной среды они могут быть бесцветными, желтыми, желтовато-коричневыми или оливковокоричневыми. Они представляют собой коричневато-черные пятна по краям зоны роста на агар-агаре с экстрактами дрожжей и солода.
Аэриальный мицелий характиризуется умеренным развитием, имеет самую различную текстуру и пигментирован в серовато. белый, светлый и умеренно-серый и желтовато-серый цвет с тонкими белыми краями на ранней стадии 1юста.
Наблюдаются концентрические кольца и образование секторов из колоний. Цветные характеристики относят культуту к ряду серых . Сравнение некоторых свойств Streptomyces Sp. Х-5108
561521 со свойствами других культур ряда "серых" приведено н табл. 1 (для всех культур поверхность спор Sm, морфология RA, цвет "серый вид "), Морфология.
Цепи спор, образующиеся иа аэриальном мицелии, разветвляются моноподиальио и симподиа lbHO с образованием прямых цепей, петель, крючков, растянутых и имеющих неправильную форму серебристых спиралей (3-4 витка), также имеющих ме гельчатое расположение. Цепочки бывают как короткими, так и длиииь<ми, но преимущественно они содержат более !О спор. !(а большинстве сред наблюдается достаточиая плотность. Споры удлиненные и имеют форму овалов и цилиндров, поверхность спор гладкая.
Физиология. Рact)3«p«мый пигмеи г.
1(3 агар - агаре с экстрактами дрожжей и с«лола образун)тся следь. коричневого пигмента.
Культура является хромогеиной (образует меланин) иа агар - агаре с пепто«ом и железом и тирозином, а также иа бульоне с три«толом и экстрактом дрожжей.
Культуральиые (период иикубации 14 дней при 28 C) и физиологические характеристики кулыур Ятгepto!))yces Sp. Х-5!08 приведены в табл. 2 и табл. 3 еоответстнеш<о.
Ор<аиические ииграты ие носезаианливаются в бульоне; крахмал актив«о г«дролизуется, а желатипа лишь очень слабо сжижается через 14 дней; хо(т()шо усваиваются L-Bp36EH<033 cl-фр) ктоза, (<-MBHHHT, L.рамиоза, ((-рафф<шоза и càõàðîçà; плохо- (1-ксилоза и (-ииозит и co<3ceb< ие ) снаи<33ется нелл кн<оза.
Культура Streptomyces Sp.хорошо развивается при 24 и 37 С, ио ие развивался при 42 или 50 С.
Характер усноеиия источников углерода и 330<а
Strepto Усвоение L.apa<)«H«çl i, -рали<озы, ((-ко«лозы, d-л<аииита, L-ип«зи<а, г>пок«зы, фруктозы, сахарозы, ацетата, гз«рата, мала га, Окса> 1, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 2 2, 1, 0, ", О, О, 3, 0- 1, 3, 3, 3, 3, 3, 3, О, О, О, 1, О - 1, а усноение сульфата амл<оиия, нитрата патрии, )<итрита натрия ацетамида, аспарагина, тирозииа и D, L -триптофаиа - 1, 1, 1, 1, 3, 3 и 2 соответственно (отрицательный контроль 0-1) . Для кулыивиронаиия продуцеита Streptomyces Sp. Х-5108 применяют различные способы ферментации. При фермеиг<ции в колбах порцию спор, взятую со среза культуры на агар-arape, ииокулируют в 100 мл питательной среды н конической колбе Эрленмейера емкостью 500 л<л и инкубируют при 28 С иа вращающейся качалке в течение 7 дней. Пробы бульона отбирают иа третий, пятый и седьмой день. При приготовлении бо><ьщих порций бульона пподукт ииокулиооваиия готовят в конических колбах Эрлеимейера емкостью 6 и., н пи(тек:оных бутылях ел<костью 16 л H>IH резервуарах, сиабжеи5 иых устройствами для аэрации, .отбора проб и T.ä. Для аэрации через сбраживаемую среду н бутылях и резервуарах продувают etcð«>ibíblé воздух. 11ри использовании резервуаров для Ho!Io;»I«Te;Ib«ol перемещинания используют мех<и<ические лопаст-! О ные мешалки. Лля предотнра<цеиия пеиообразования вводят аитинспецива) ели, такие, как свиной «ярд и соевое ма ло. Streptomyces Sp. Х-5108 культивируют в раз>гичиых жидких средах, предпочп3телы<о н средах, содержащих источпик ассимилируемого yi лерода, например крахмал, глюкозу, мелассу, и исто шик асс«ми.ируемого аз«13, так«и, KBK oe>EK«, I ид!)«лиза ы белков, ИО>пп<ептид! <, алиш«ки ло<ы, )ьз<дкость, иолучае мук) при обработке ку курузиых початков, аммоииеные co. IH, су:)ьфaTbi, фосфаты, хлориды 2(1 калия, чатрия, кальция, ма! иия, и примеси кобальта, меди, железа, мол«блепа, 6«ра. Актив«ость ан)ибиотика ъ-5108 «иределяют:о (>itro по диаме<ру з«иы иигибиронаиия грамположз<телы<ых бак<ерий Bacillus !. . или Bacillus н<(<т)р(сх и)ычиым ме)«лом !<иффузии н:репе arap3I3P3 с чашкой и H>!Bci«iiK«II, Прииимают )слон«О, по BKTHI)H«crb аитибиогиK3 ел M>! pacleopa соответствует диаметру зоны 30 ии! «бир«напил 0 мм. Кулыуру испытуемого I 1!е «а 2 iac до оп)ора и заполнения испытуемым pacT i30po H, соде «жа щи м BE
„l(>I«производства антибиотика целесообразно исп«льзов ать сложиые азотсодержа<цие не<лестна, иаприл<ер, растительиого (соевые бобы или х><опковая мука, овсяная мука, твердое вещество томатной пасты, растворимые вещества, образующиеся при ферментации зерна) или )ьэ<вот«ого (рыбная 50 мука, отвар из мяса с мукой, продукты п<дролиза аминокислот) происхождения и микробиальиые клетки (дрожжи "торула"). Источниками углерода служат, например, глюкоза, глицерин, декстрии и кукуруэ<ж<й крахмал. Кроме неорганических солей, обычно входящих в состав природных сред, вводят другие соли, такие, как фосфат калия, карбоиат кальция, сульфат магния, и микроэлементы. Целесообразно для производства антибиотика Х.5108 в фермеить! загружать среду, солержащую 561521 15 геле декстрана. 50 1% обезжиренной муки из семян хлопка (" Профло"),0,5% концентрата жидкости, получаемой при выщелачивании кукурузы, 1% кукурузного крахмала, 0,1% гидрофосфата кальция Кэ НР04, 0,1% карбоната кальция CACO> . В табл. 4 показано влияние состава питательной среды на выход антибиотика Streptomyces Sp. Х-5108 при проведении опыта во встряхиваемых колбах (период инкубации 5 дней). Все среды содержат 1% декстрина, 0,1% К НРО4, 0,1% СаСОз и 1% источника азота. В каждые 100 мл среды для инокулирования вносят 1 мл суспензии спор Streptomyces Sp. Х- 5108. Результаты, полученные при выращивании Streptomyces Sp. во встряхиваемых колбах в течение 4 дней на средах, содержащих 0,1% КэНРО4,0,1% СаСОа и компоненты, указанные в табл. 5 (по 1% каждого), приведены в табл. 5. Для инокулирования 100 мл каждой среды употребляют 1 мл суспензии спор Streptomyces Sp. Х-5108. Влияние состава питательной среды на выход антибиотика Streptomyces Sp. Х-5108 во встряхиваемых колбах и в аэрированных резервуарах отражено в табл. 6. При ферментации в различных аппаратах получают результаты, сведенные в табл,. 7. Каждая среда содержит 0,5% СаСО и 0,1% КтНРО4. Для определения активности антибиотика используют Baci! lus simplex. Продуцент Streptomyces Sp. Х-5108 растет также на некоторых химических синтетических средах, содержащих аммониевые соли, нитраты или аминокислоты (глутамат, аргинин, глицин), служащие источниками азота, глюкозу, декстрин, крахмал, цитрат, ацетат и т.п., служащие источниками углерода, с добавкой солей, таких, как фосфат калия, карбонат кальция и сульфат магния, и микроэлементов, включающих двухвалентные ионы железа, меди, марганца, кобальта и цинка. Результаты ферментации Streptomyces Sp Х-5108 на различных синтетических средах показаны в табл. 8. Выход антиоиотика Х-5108 увеличивается при хорошей аэрации среды. Антибиотик Х-5108 можно получать при любой температуре, обусловливающей удовлетворительный рост микроорганизма. Так, налример, при выращивании Streptomyces Sp. Х-5108 в колбах при 24, 28,30 и 32 С(анализ на выход антибиотика через 3,4,5 и 6 дней) выход антибиотика достигает максимума через 5-6, 4, 3-4 и 3-4 дня соответственно. Во время ферментации среда остается почти нейтральной или становится слабо кислой. Конечная величина рН зависит от наличия буферных веществ и от первоначальной величины рН среды (среда должна быть нейтральной до стерилизации) . Для выделения и очистки антибиотика Х-5108 используют различные способы, например, экстракцию растворителем (периодическая или непрерывная противоточная экстракция), проводимую в экстракционных колоннах, и хроматографию, основанную на проникновении в гель сырого антибиотика, выделенно о из кулыуральной среды. Из культуральной среды антибиотик Х-5108 вьщеляют путем отделения мицелия фильтрованием или центрифугнрованием с последующей экстракцией фильтрата или фугата несмешивающимся с водой сложным эфиром, например этилацетатом, амилацетатом, бутилацета том, предпочтительно, бутилацетатом, при рН 3-7,5. Для противоточной распределительной экстракции используют смесь этилацетата, изопропанола и 0,1 н. водного раствора Na-. НРО4. Для окончательной очистки антибиотика X-5108 применяют метод хроматографии, основанный на проникновенш1 в гель предварительно очищенного экстракш1ей препарата, на геле декстрана с поперечными связями илн на полимеризованном Для хроматографии берут "сефадекс LH-20" н элюируют спиртом. После отделения антибиотика фильтрованием или центрифугированием культуральной среды его анализируют методом тон кослойной или бумажной хроматографии при проявлении пятен методом флуоресценции и биоавтографии. Для хроматографии лучше использовать стеклянные пластины, покрытые силикагелем. Для тонкослойной хроматографии используют смесь хлороформа, метанола и гидроокиси аммония. После очистки антибиотик Х-5108 представляет собой аморфное желтое вещество. Найдено, %: С 63,63; Н 7,81; N 3,48; О 25,08 (по разности). Антибиотик Х-5108 растворим в спиртах, например метаноле, этаноле, 1 и 2 -пропаноле, . трет-бутаноле; в несмешивающихся с водой сложных эфирах, например в этилацетате, амилацетате, бутилацетате, и в хлороформе. Антибиотик не растворим в воде. ИК- спектр, см : 3400 (широкая), 1660 (сильная), 1580 (широкая), 1580, 1380,1250, 1100, 1040 и 995 (отчеттптвые1. УФ вЂ” спектр (0,1 н. соляная кислота), Лмакс (Е ) ммк: 334 (403),233 (610) и 206 (500) . УФ-спектр (буфер изопропанол - К,НРО4 рН 7) Лмакс (Е ), ммк: 327 (423), 231 (660). УФ-спектр (0,1 н. едкий кали), Лмакс(t ) ммк: 327 (416), 231 (647). ЯМР-спектр (дейтерохлороформ, внутренний стацдарт тетраметилсилан): отчетливые сигналы при 0,92, 1,66-2,03, 3,16 и 3,43 8 и в области сигналов олефинов. Микробищщную активность антибиотика Х-5108 определяют методом с чацкой и пластиной, с диффузией в среде агар-агара. 561521 Антибиотик Х-5108 обладает низкой токсичпостыл цри оральном и парэнтеральном введении, значительной активностью против, стрептококков при систематическом (орал ьном) и местном (подкожном) введении, активностью против пневмококов и кишечного кокцидиоза. При опытах на мышах установлено, что антибиотик практически не токсичен flp« оральном и подкожном введении (LD; е не более 2000 и 1320 мг/кг соответственно) . Антибиотик активен при орапьном (LDg p 52 мг/кг) и подкожном (СЛ, е 44 мг/кг) введении против Streptococcus pyognes, активен против Diplococcus pneumoniae (С 4е 807 и 283 мг/кг прн оральном и подкожном введении соответственно) и против грамотрпцательных бак терий. Антибиотик Х-5108 при введени«в корм домашней l> ">««bl ct«Myfl«pye r pocT >Iocfle1«teH. Обычно ант«бпотик Х-5108 добавляют к сбапансированным в Отношении питательности ко1эмам для дол>ашней птицы (на 100 вес.ч. корма -0,0001-0,01 вес.ч. антибиотика) . Дальней>цее увеличение конце«.:рации антибиотика не приводит к у результатов. Пример 1. Суспензией спор Streptomyces Sp. Х-5108 из пробирки с питательной агар-атаровой средой и«окупируют содержимое резервуара из пирекса емкостью 16 л, снабженного пр«ы>особлением для аэрац«и, в который загружено 15 л среды, содержа>.аей (в %): 1 соевой муки, 1 желтого сахара,0,2:i твердого вещества, получаемого при переработке кукурузных початков, 0,1 К, НРО4, 0,1 Са(O и 0,05 свиного жира la«тивспепиватепь) . Период ипкубац«и 4 дня при 28 С в условиях аэрации. Вь>1>ос пий волокшшгый материал переносят и фермен гер емкостью 378 п, изготовленный из нержавеющей лали, который содержит 192 и среды из 1 Л обезжиренной муки из семян хлопчатника, 1Я кукурузного крахмала, 0,25Я: твердого вещества, попу гаемого при переработке кукурузных початков,0,1 ;с (а(О 0,11 К,НРО., и 0,5% свиного жира. рН среды до иноку.>и1эования 5,8. Фе1>ментер аэрируют и через 5 дней вь«ружаюг содержимое, фипьгруюг с иэпо«ьзовапием диагомитовой земли, подкисляют фипьтрат до рН 3,5 эклра> ируют его вдвое меньшим объемом бутипацетата, осветпенпый экстракт концентрируют в вакууме при температуре ниже 40 С до образова«ия коричневого сиропа, после р стирания коэорого с петролейным эфиром выдепян>г твердый порошок антибиотика Х-5108 с актив«остья> против Bacillus Е. 120 ед/мг. Пример 2. Антибиотик Х-5!08 очищают путем периоцич ской экстракции растворителем. Партии куртуральной среды после ферме«та«ни (11340 л), котоэые при испытаниях in vitro показывают активность м 130 ед/мл против Bacillus simplex, фильтруют, экстрагируют фильтрат бутипаце татом при рН 7,5, промывают экстракт водой, концентрируют методом и> нове«ного испарения при температуре ниже 50" С, прибавляют малонат диэтилнатрия до рН 9,0, образовавшийся же l. тый осадок отфильтровывают промываюг бутипаплa том, обрабатывают смесью вода-бутипаил а > и .взводя э рН до 4. Органическую фазу отделяют, оораоагывают, как указано выше, но малонат диэтилнатрия прибавляют до установления рН -8,5. Полученный осадок подкисляют, экстрагируют свежим бутипацетатом, обрабатывают экстракт "дарко G-60" и натриевую соль антибиотика Х-5108 осаждают прибавлением малоната диэтилнатрия до рН 8,0. Образовавшуюся желтую натриевую соль анти биотика промывают и сушат. При испытаниях in vitro активность соли 430 ед/мг против Bacillus simplex. Технологическая схема выделения ан гибиотика Х-5108. Стадия 1. 11340 л бульона в цепом (cGop через 5-6 дней) фильтруют. 2à Стадия 2, К 9804 л профильтрованно> о бульона (рН7,5) при необходимости добавпяюэ Н,РО4 и экстрагируют 2268 л бутипацетата. Стадия 3. 2192 л экстракта промывают 2 х 94 л воды и концентрируют методом мгновенного испарения. Стадия 4. К 302 л концентрата прибавляют малонат диэтипнатрия до рН 9 (1-1,5 и 1,7 н. раствора мапоната), Осадок отфильтровывают и промывают 3,7 и бугилацетата. зо Стадия 5. Попучешгый осадок растворяют в 94 л воды, добавляюг 15Я-ную Н, РО> до рН -4 и экстрагируют двумя порциял>и бутилацетата (75 + 37,8 л) . Стадия 6. 106 л экстракта промывают 2 х 7,5 л воды и концентрируют методом мгновенного З5 испарения. Стадия 7. К 15 л концентрата прибавляют малонат диэтилнатрия до рН 8,5, отфильтровывают осалок и п)юмывают 3,7 л бутипацетата. Стадия 8. Вь>делен«>пй осадок растворяют в 75 и щ воды, доводят рН до 5 с помощью 15/c.-íîé Н РО и 3 4 экстрагирунэг двумя порциями бутипацетата (56,7 + 28.,3 и) . Стадия 9. 78 л экстракта промывают 2 х 7,5 л воды и концентрируют методом мгновенного испарения. Стадия 10. 5 л концентрата переме>пиванэт с 50 г )> дарко G-50 в течение 1 час при >.Омнатной температуре, фильтруют и концентрируют методом м> новеflflol испарения. 50 (.тадия 11. К 7,5 л концентрата прибавляют мапонаг диэтипнатрия до рН 3,0, отфильтровывают осадок, промывают 3,7 л бутилацетата, затем 3,7 л петролейпого эфира (т. кин. 3(160 ), сушат .о при 56 С/11,5 мм в течение 36 час и получают натри. 55 евую соль антибиотика Х-5108 в виде желтого аморфного вещества. Пример 3. Очистка антибиотика Х-5108 противоточной распределительной экстракцией при числе труб?00, объеме верхней и нижней фаз 40 мл (каждая) . 561521 5 r антибиотика Х-5108, выделенного экстракцией из сырого бульона после ферментации, растворяют в 40 мл верхней фазы и используют систему эгипацетат - изопропанол 0,1 М Na HPO4 (12:9:20 по объему) Число переносов 200, пик для труб после 200 переносов 159, коэффициент распределения 3,88. Фракции 150-170 собирают, к экстракту антибиотика в органической фазе прибавляли 1-бутанол, водную фазу отбрасывают, органическую промывают четырьмя порциями воды, воду оттоняют в виде азеотропа, прибавляют петролейный эфир и выделяют 3 г антибиотика, активность которого в 2 раза больше активности исходного материала. П р и и е р 4. Для очистки антибиотика Х-5108 хроматографией на сефадексе LH-20 к этанольному раствору 300 мг пробы антибиотика, предварительно очищенного противоточной распределительной экстракцией, добавляют раствор метилата натрия (влажная индикаторная бумажка) до рН 8-9, вносят в колонку с сефадексом LH-20 (290 х 41 мм), уравновешенную спиртом 3А. Колонку проявляют спиртом ЗА и антибиотик удаляют из колонки в виде раствора объемом 950- 1200мл (активные фракции) . Последующие фракции содержат ряд окрашенных зон с незначительной биологической активностью. Активные фракции сливают, выпаривают до небольшого объема, прибавляют к остатку эфир и петролейный эфир и осаждают антибиотик в виде желтой натриевой соли, дающей только одно желтое пятно при тонкослойной хроматографии (силикагель F-254, обнаружение в УФ- свете) с Rg 0,29 (силикагель/кизельгур, биоавтография). II р и м е р 5. 0,464 r натриевой соли антибиотика Х-5108, полученной хроматографией на сефадексе LH-20, растворяют в 4,6 мл ледяной воды, прибавляют 10 мл этилаце га ra, переносят в делительную воронку и прибавляют 1 мл раствора Л1аНз РО (50 r NaH PO4 H,,О в 100 мл воды). Образовавшийся вначале осацок растворяется при встряхивании. Органическую фазу промывают четырьмя порц1гями ледяной воды (по 1 обьему), отгоняла от нее азеотроп, разбавляют концентрат (2 мл) 2 ,объемами этилацетата, прибавляют диэтиловый эфир ио каплям до помутнения и вводят 30 мл 10 10 петролейного эфира. Полученный осадок антибиотика Х-5108 отфильтровывают н сушат при комнатной телшера гуре. Пример 6. Основной рацион готовят иэ следующих ингредиентов (вес.%): Измельченное желтое 56,075 зерно кукурузы Мясо и костная мука (507" белков) 4,000 Рыбная мука (60% белков) 4,000 Соевая мука (50% белков) Дегидра гирова иная мука из альфа-альфы 1.000 Животный ьэар 4,000 Метионин О,"00 Ми не раль ный ф осфа т 0,250 Карбонат кальция 1,200 Иодированная соль 0,250 Витамины 1,000 Минеральные компоненты 0,025 К этому рациону прибавляют антибиотик Х-5108 в норме 50 г антибиотика на 1 кг рациона. Проводят опыт путем непринудительного кормления домашней птицы (однодневные цыплята) рационом с добавкой антибиотика Х-5108 в течение 15 дней. Затем цыплят взвешивают, учитывая количество съеденного корма, и эффективность кормления определяют путем сравнения с контрольными группами. Средний дополнительный привес цля каждой опытной группы делят на средний привес контрольной группы и частное умножали на 100. Привес за 2 нецели (среднее значение для 40 цыплят) для контрольной и испытуемой (50 r антибиотика на 1 кг рациона) группы составляет 154 + 8 и 185 t l2 г (с учетом среднеквадратичной погрешности для среднего значения), или 100 и 120% соответственно, Эффективность кормления 1,55 и 1,39, улучшение эффективности кормления + 12 . 28,000 При введении в рацион различных количеств антибиотика Х-5108 получены результаты, указанные в табл. 9. 45 Из данных табл. 9 видно, что цыплята, получавшие рацион с добавкс и 50 мг антибиотика Х-5108 на 1 кг рациона, растут быстрее, чем в контрольной группе. 561521 Таблица1 Свойство Образование меланина Образование антибиотика Стрептолин Источник углерода Глюкоза d- Ксилоза L- Араби коза 1 - Рамноза L-Инознт Не испытывали Галактоза Таблица .2 Агар. агар Чапека с сахарозой Слабо- коСветложелтый ричневатый Хороший % М То же Аспарагиндекстроза0,25% Отсутст. вует От оранжевого до канареечно-желтого d-Фруктоза d- Раффиноза d-Маннит Х-5108 Олеан- Хлор- Гризе- Антидоми- тетра- олуте- трихоцин циклин ин монас Аэриальный мицелий беловатый; спорообразование хорошее; споры белые Аэрнальный мицелий от сходного с пушинками до порошкообразного, белый, становится и ри спорообразовании дымчато- серым 561521 14 Продолжение табл. 2 То же Оранжевотемножелтыи Агар-агар с крахмалом Оранжево келтый Лимонножелтый серыми Агар- агар "микофил" (BB I) Слаботемный Отсутствие спорообразования Светложелтый ° Ъ Питательный Темный То же агар-агар с экстрактом дрожжей Агар-агар с глицерином От удовлетворительного Влажный, кремоватого цвета Отсутствует до хорошего (10. дней) Отсутствие спорооб раз ования То же,Мерный Хороший То же А Хороший рост на всех перечисленных жидких средах, бульоне с триптоном (темный пигмент, отрицательная реакция на индол через 3 дня); питательном бульоне ГДА, бульоне Чапека с сахароэой, бульоне Краинского с глюкозой и бульоне с глицерином и цитратом кальция. Хороший рост в течение 8 дней при 24, 28, 32 и 37, но не при 42 С. Агар-агар с пел тоном и томатной пастой Агар-агар Краннского с крахмалом, глюкозой Тампон иэ картофеля Тампон нэ моркови Аэриальный мицелий от белого до светло- серого> спорооб разование хорошее; споры серые Спорообраэование хорошее, споры становятся дымчаго-серыми с белыми краями Аэриальный мицелий белый; спорообраэование хорошее; споры становятся дымчатоОт сероватого до желтовато- коричневого Светложелтый 561521 То же 12 14 дается 10 Бульон с органическим нитратом 8 Желатина (15%) при 18 С Агар-агар с пептоном и железом (Клиг лер) Лакмусовое молоко Яичный агар. Дорсета Умеренный, без спор Хороший, темный пигмент Удовлетворительный, темный растворимый пигмент От удовлетворительного до хорошего; коричневато- черный пигмент, отсутствие спор Хороший, слабое спорообразование Удовлетворительньt и поверхностный рост Удовлетворительный поверхностный рост; отсутствие спорообразования Хороший; слабое образование белых спор Очень хороший рост; в основном хорошее образование светлосерых спор 16 Таблица 3 Восстановления нитрата не наблюдается, газов не образуется Сжижения желаткны не наблюдается Слабое сжнжение Хромогенная - образуется меланин Цвет лакмуса не меняется; помутнения или осветления не наблюСветло- коричневатый цвет; отсутствие помутнения или осветления Небольшое коли чество темного пигмента Таблица 4 Активность антибиотика е мл Источник азота Отвар иэ мяса с мукой ВУ вЂ” 100 ("Коммершиал Солвентс Корпорейшен" ) 45 "Профло" ("Тредерс Ойл Милл Компани" ) Овсяная мука ("Кускер Отс Компани" ) 23 "Сойалоз" (обезжиренная мука соевых бобов) Белковая мука из арахиса Белковая мука из кокосовых орехов Твердое вещество томатной пасты Мука с льняным маслом 57 Кукурузная мука Высушенный экстракт из зерна кукурузы вместе с растворимыми веществами (X. Уоркер) 74 "Солудри" ("Шинли Дистиллерс") Рыбная мука (Гортон) Рыбные отходы (Уилкинсон) 51 16 Смесь молочного сахара с аль бумином Высушенные дрожжи "торула" Автолизат дрожжей "нейшенел" Гидролизат сои, образовавшийся под действием энзимов 12 Гомогенизироваиная отжатая рыба Протопептон Н 366 (" Уилсон Лаборато риз") 18 Твердое вещество кукурузных початков Период инкубацни о дней. " Концентрация источника азота 2 %. Гидролизат белков пшеницы, образовавшийся нри кислотном гидролизе ("Турок Миллз") 561521 20 грабли ца 5 Отвар из мяса с мукой и декстрин Остаток после ферментации зерна (BY — 100) и декстрин "Профло и декстрин 52 Рыбные отходы 138 "Профло" и декстрин "Профло" и декстрин " " Профло и декстрии 34 Профло и декстрин еюео Профло и глюкоза Профло и крахмал Профло" и Глицерин "Профло" и желтый сахар "Профло" и мальтоза "Профло" и лактоза "Профло" и маниит 21" 21 14 26 Период инкубации 6 дней, Без СаСОЗ Без СаСОз или КтнрО . еаео концентрация Профло 0,25%. евера 1 оицентрация "Профло" 2,щ Высушенный экстракт из зерна кукурузы вместе с растворимыми веществами (Х. Уокер) и декстрин" 561521 Таблица 6 то ытывали дня) крахмала Таблица 7 Ферменте р Состав среды, 1 К lэ 1 высушенного ра.гворимого вещества после экстракции зерен кукурузы, 1 декстрина, 0,1 К, НР04 и 0)1 СаС03 К 13" 1 (.-глyтамaта натрия 1 цекстрина, 0,1 твердого вещества кукурузных початков, 0.,15 К2 НРО и 0,0э М9$0д К 1! 1 твердого вещества томатной пасты, 1 высутцениого растворимого вещества после экстракции зерен кукуру- ы, кукурузного крахмала, 0,5 глюкозы, 0,5 СаСО> и 0,1 К2 11Р04 0,5 "Профло", 0,5 высушенного расгворимого вещества после эксг) акпии зерен кукурузы, 0,5 твер;ци о вещес|ва томатной пасты, 0,5 паствы из мясного экстракта (прогопепгои )(" 366), 1 крахмала, 0,1 Са 03 и 0,1 К, НРО„ K 16 ) ()ðîôío", 0,5 жидкости, получаемой при обработке кукурузных початков,!,О кукуруэно о крахмала О, l СаСОз и 0,) К, НР04 Ферментер объемом 454 л (загрузка 295 л среды), изготовленный из нержавеющеи стали. " Ферментер объемом 19000 л (загрузка ) 4500 л среды), изготовленный из углеродистой стали. "" Ферментер объемом 3400 л (загруэка 2220 л среды), изготовленный из углеродистой стали. 2 О 1 1 "Профло" О 1 ) 1,0 1,0 1,0 1,5 О О 0,1 СаСОз 0,5 0,5 0,5 1,5 0,1 К НР044 91 54 100, 71, 86, 150, ) э5 Не исп 97 (4 46 119 ) 14 l26 561521 Таблица 8 1,0 глутамата натрия, 1 декстрина> 0,1 К, НРО > 0>05 Mg SO< > 1,0 смеси аминокислот и 1 декстрина, 7,6 0,1 Кт НРО4, 0,1 солей VSPN 1, ВВ1, бульон Чапека-Докса 11,5 4,4 1,0 аргинина, О,1 декстрина, 01 К, НРО4, 0,1 СаСО, и 0>05 MgSO4 0,8 1,0 Д,L-аспарагиновой кислоты, 1,0 декстрина, 0,1 К НРО4, 0,1 СаСОЗ и 0,05% MgSOä 0,1 глутамата натрия,0,6 (NH4),НРО4 1 глюкозы, 1 декстрина, 0,1 К, НР04, 0,1 CaCOз, 0,1 КС1 и 0,05 MgSO4 0,8 6,6 0,33 (NH4) g SO4 > 1,5 глюкозы, 0,1 цитрата натрия, 0,05 ацетата натрия, 0,5 хлорида натрия, 0,025 MgSO4 ° 7Н О, 0,01 К НРО4, 0,01 КН, PO,О,З СаСО,, 0,001 MnSO4 4Нт О, 0,004 ZnSO4 7НтО> 1,6 10 К СгтО 7 20 3 l сах розы,0,3",нитрата натрия,0,1% K>HP04,0,05% Мц$0,0,05% хлорида калия, 0,001% сульфата двухвалентного железа. 561521 26 Таблица 9 1,54 149 (100) 48 Контроль Антибиотик Х-5108 50 1,37 + 12 175 (117) 152 (100) 24 1,47 Контроль Антибиотик Х вЂ” 5108 1,38 + 7 173 (114) 146 (100) 18 1,59 Контроль Антибиотик Х вЂ” 5108 1,37 + 16 180 (123) 149 (100) 18 1,51 Контроль Антибиотик Х вЂ” 5108 1,39 + 9 183 (123) 149 (100) 18 1,54 Контроль Антибиотик Х- 5108 1,41 + 13 185 (124) 149 (100) 18 1,54 Контроль Антибиотик Х вЂ” 5108 1,33 + 14 182 (122) 18 p aKTep T.Øâðãàíîâà Техред М.Левицкая Корректор С. Ямалова Тираж 538 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Сове а Министров СССР по делам изобретения и открытия! 13035, Москва, Ж- 35, Раушская наб.. д. 4/5 1694/161 Филиал ППП "Патент", г. Увпород, ул. Проектная, 4 Формула изобретения 1. Способ получения антибиотика путем культивирования гриба-продуцента на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральных солей, в аэробных условиях с последуюшими выделением и очисткой антибиотика, о т л ича ю щи и с я тем, что, с целью получения антибиотика, используемого для стимулирования роста домашней птицы, в качестве продуцента испольэунп Streptomyces Sp. Х-5108, АТСС 21386. 2. Способ поп. 1,отличающийся,тем,что антибиотик вьщеляют путем фильтрования кульСоставитель туральной среды, экстракции филь|рата растворителем, не смешивающимся с водой, и последующего извлечения антибиотика из экстракта. 3. Способ поп.2,отличающийся тем,что в качестве растворителя дчя экстракции используют бутилаце тат. 4. Способ по п. 1, отличающийся,тем, что сырой антибиотик, выделенный иэ культуральной среды, очищают противоточным распределением. 5. Способ поп. 1,отличающийся,тем,что антибиотик очищают методом хроматографии, основанной на проникновении в гель сырого антибиотика. ныделеннстго нз культуральной среды. р. Màõíþê
