Способ получения антибиотика тиенамицина
ОП ИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕН ИЯ
К ПАТЕНТУ
Союз Советских
Социалистических
Республик (1)) 5769б7 (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 24.11.7s (21) 2191704/13 (23) Приоритет (32) 25.11.74 (31) 526992 (33) СЫА (51) < <л С120 9рО
ГвсуаврстввавнВ ввнатет
6вватв Мвааатрвв СССР вв делам азавретеав а вткрьпвю (43) Опубликовано 15.10.77. Баоллетеиь ¹ 38 (53) УДК 615.779.931 (088 Я) (45) Дата опубликования описания 1?.11.77 (72) Авторы изобретения
Иностранцы
Фкин Совайер Кахан (Сй1А), Фредерик Мзрвнн Ка хан (Канада), Эдвард Олли Стетпнв, роберт Томас 1 озг зьман Д11А) н Себастьян Эрнмщес (1вспанкя)
Нностранная фирма
"Мерк еН Ко.. Ивк." (C93A) 1 етзобретевпте Относится к Области мвкробФще" тик-. к получению антибиотика, который Являетсх высоко ффектнвным ВрН инт вбивании poc a pa»J х граавпонпбнтельньгх H гремотрицателып
МИКРООРТИИЗНЮВ.
5 предложенный способ получения антибиотиса пеенамнгппта новый, в патентной н научно-техннческ ОЙ HHxepe He Onucau.
Целью нзобратвжя; является получение антибиотика тиенаьатцина.
Эта цель твзстнгается тем, что ппиам Streptc.
mycea са т1еуа ИЯЯ1 8057 культивируют в аэроб нь х глубиииьхх условиях в питательной среде: сО. дернзтцей исто ппеки углерода, азота и мижральньте соли, с последующим выцежнием и очисткой цежв ого продукта. .Антибиотик тиенамицин формулы е-СНу- Гйл- NH получают нутем выращивания микроорганизма
Streptomyces саШеуа. Этот ппамм выделен из образца почвы и обозначен как МА — 4297 в коллекции культур Мерк енд К, Инк, рейвей, Нью-джер2
- . Культура помеы ена BR постояннОе Iom в
K KL куль. "? Севержз1х регионально лабо. раторнй по и;ст двз шум, Северного атдслеынх по использованнр носледоваиий н Откоьгте,-з, слукбы сезГмжохозяйственньгх Н Редоваяп отдежнн е аельского холйсгва СшА, Батория, Иллинойс и ей присвоен номер МВВ1 8057.
Культурально-морфологическтю признаки ептамма атгэртощусез cattl eye leRR l 8057.
Морфотклтая. Спорофоры являтется плотными спиралями, встречавшимися в вида бокавых и кожчных ветвей на воздушноье мнцелин. Споры зллипссндальные до цилиндрических, 0,9 х 1,2 мкм,; с целибат до 10 ъпсм и более.
Куш турапьтыз признаки.
Ахар из томатной пасты и Овсяной муки. Вать. тативньй рОст переменныйу дьпхевато коричжвый плоский, пространственный, воздупптьй мицелийорхидея с белым, растворимого пигмента нет
Arap Чапека. Вегетативный рост бесцветттый, плоский, пространственный. Воздушный мицелий редкий, розовато-бельй, растворимого пигмента нет.
Агар яичного альбумина. Вегетативный рост рыжвато-коричневый со следами серо- орхидеййа576967 го, плоский, пространственный. Воздушный мицелий — орхидея со светлыми тенями орхидеи и белого, растворимого пигмента нет.
Агар глицероля аспаргина. Вегетативный рост переменно рымавато-коричневый со следами серорозового, плоский, пространственный, Воздушный мицелий - орхидея с белым. Растворимого пигмента нет.
Агар пелтон-железодрожжевого Экстракта. Вегетатнвный рост рыжевато коткчневый, воздушного ькцелия нет, растворимый пигмент слегка коричневатый, меланин не усваивает, На 8 не образует.
Литательньй а ар. Вегетативньтй рост светлый рыжевато-коричневый, воздушного мицелия нет, растворимого нигмента нет. и
Агар питательного крахмала. Вегетативньй рост
КРЕМОВь>ьй ДО РЫжЕВато-КОРИЧИЕВОГО> ВОЗДУЦЖОГО мицелия нет, растворимьй пигмент Отсутствуе7.
Крахмал гидролизует умеренно.
Еитательиьгй желатиновый 8 sp. >>егета-. >,-;Г Й
PGC7 КБЕЫОВЫй> ВОЗД)ЧУЖОГО ММЦЕЛИЯ ЛЕТ. >>>ЕЛ»7»IJJJ> разж ьохаЕ 7 ь>ьщ> т«Е >>>т>О
=:>ОГ«ЖЮ Уела "123 ГГП>ЭКОЭУ> ТЙИ."..ТО>ь,, "МЕ:3. т > АД-у > 4 ) 3Ь>-«""О"т т -т >т"«т>ОЗ» ут т = > ъ> гт
ЗУ ОЗХаооз : т- »" тьери> ь " »О- Ы Зт>>т> >.>" Г>«т>О "«ь
ЕНОЗИТО>Л, ЛаКТОЭу, ра Ь»ИБОЗу, p>ir«JJIQ3% ь >,,лературо:," роста« т> т>
cJJI 28 С, прл темлературе »7 C iiJQGT;;JJ>;ì JJJ>ú6, Ни траты восстаноз ливае7, Лнтибиоща< >яенаьппьиь> попуььчю>7 л м",зоцтзсае -О
Яэробной -т»ерше аиз 1 лодходяпзей пег>теr þ -.>
gGJJJ>JGJJ СрЕдюь В >>Е„yп,"I уа >1ЫХ уСЛО",т-1;-, «Ер-:.„ " т>;. кул>чц>яю Оргагг>>>р а>> Я7 r BDTGA«igcss c3 >> 7 l >>>1 «, Срсда CJ3
МОМ. zfJ;S >.От., Я „ - «>;,",»НЬТЕ» »QISPi —:-;т«., ;Qsiт,:,>;,".;.:;»ТО. ., иль=озу, с«а" :р»зу, -.силозу,.мззппт ;..;-. -. . ра:.=;;
17 H+ .GHJ JBp> +J >
» ь>.".»>тьттзьат> р;т->т-"«л, т; т>>>«peó"àöà>»ã т«1ту ь И -.>О", Я j ОТДЕЛИ О ОИ Ю СО» ИЛУ В "«а »ВСТЗЕ >С">Ж >т>>>КОВ а>Сд д,".уцт> >ьЕМОГО ь>Гу рппат т. >П7,-1,",, Л, Чьд ",>3>> ре. Количество >>Улевож составуиат тра=.. Is/>IG .! —".3%
ОТ >. ЯЯ)«>Я.
>>> К>ЗЧ>>Е>СТВФ Н >О ПЙ>К2 > ЗОТИ ЫО- "Г б Т ; ЖХ .> Ь" ".ЦР УП ЗатЬ> XR J>0 ä «Д>СТВОР>тт>>>Ь тт,:>> >>И тыл ть .—,,:- «>> -;:
ТОМ@трам Гььк;7.-">. „-- ;7, ьГ> П»Н аЗО ИтОЛЬц:;, ничества 0,2 — О% Q B" cs водной : «.;.
Йрйменмют питательиьм неоргаиичеюАпе cQJIJ>I, коTQpbJC JgbBT HJJTpRH> Катлй, аММОННЙ, KRJH>igHM, фОС>рат, сульфат, хлорид, кароонат, можно также включить
С аадм МвтаЛЛОВ> НаприМЕр КобаЛЬтаь МаГ>>ь>я> >- т">>> и марганца, 55
Ферментацню проводят НрН 2О-37 для JIGJrJJ. чения онтимальиых результатов — при 22 — ЗО С, рН мтвмльиой среды 6,Π— 8,0.
Фаументацию осутцествляют в глубинных усло. виях. Ю
Незначительную ферментацию антибиотика проводят IvfreM инокуляции питательной среды антибиотиком-продуцентом н после переноса в средупродуцент ферментацию проводят при постоянной температуре около 24 С в Tewme нескольких дней.
Сосуд с посевом встряхивают при постоянной комнатной теьшературе (28 С) в Тече>ие двух дней илн до получения удовлетворительного роста и некоторые из полученных вновь культур ислоль> зуют для инокуляции, второй стадии посева нпи среды- нродуцента. ,Йля получению больших количеств актчбнотча ферментатпю провогят в баках, сягбже-с:-:— .ых смесиТЕЛЕМ И СРЕДС">ВаМИ> ДПЯ аЗР>>от«ВВР»>тт, G,>я>>7 >»ной среды. Йитательную среду получагзт. в баке:;
СГЕРИЛ>>У>ОТ НаГРфиаь>ИЕ>>> ЛР." Т >>П; — Π— Ут- »О ло "2О C. Ирн охлаждеыи сте", 1=.>".Зова.а."; е "-,.-,ду
ПргпниаЮт ПрЕГСЗарИТЕ>П>Ьь.О ПВОро П:. : ãL>-:. ".Ьза .
КуЛЬ>ТVpJ>J. Пт»О) уЦЕЯ>«>«ЗЗТЕЪ"; pi>J:..::.:". т> т С
ДЛ т «J ТЕЧЕЬ>«Е > —: >-". ";,>>.„>=-,Е>,,-.е;-.. >>,перез >/р т D ÀI>«> оно 2- ". т родя> ь>>>, = .ЗО««га> ь «> «> = >> 4 орпь»«И > Ы.
G р»
>: Г - " -". --".. < — -- = .; - °" --": i ,У
Рие 48 i:sc. цаь J>>ЫJÕ ЯС;тЕ>Л>И ь>т Ьтт>3>ьь>ЕТ ьт-:. у Н т —;,, Ит ь> Еьу .тьа ме яяфпье, Его Ь „>Эльз>О И>ЗО>т, оиатЬ В Кал СТВЕ -ЗИ77»„-«3;ТЕ., РИИНОГО ПДФПаРапа ДБЯ 3РйЧВМИЛ >ЧЗФРЕКПЯИ В РЕЗУЛЪ. тате ьаранзний граВ4полоаютельиымн M Грамотрица. тельньпьв4 бакте ЯЯми, например> JJpQTJJS >1арь> 7
loQGccus аогепа, Protsvs rAirJJbi I is, Eschorichia cGli, K1Bbsi6lls рпапптоп ае> PssGQ>QVAGABs ssrUQi JIQ58 K
Eutsrobacter с1 асае.
576967
Его можно использовать как дополнение к корму животным и как дезинфектант.
Применять в водных композициях можно в концентрации 0,1 — 100г антибиотика на 1 млн.ч. раствора для ингибирования роста вредных бактерий на медицинском и зубном оборудовании и в качестве бактерицида в промышленном масштабе, например, в водных красках для кнгибирования роста раэруп«и«ельнь«х бактерий.
Антибиот««к тиенамицин можно использовать в различнь«х фармацевтических рецептах в качестве ингредиента или в сочетании с одним илк более антибиотиками или одним или более фармаколо«и. чески активными веществамз
Антибиотик используют в форме капсул или таблеток, порошков, жидких растворов, суспензий
<.ли эликсиров. Его можно вводщь орально, топическн, внутривен««о, внутримышечно.
Таблетки и капсулы для Орального введения могут Оыть з дозировке для Одноразового г?рнме не«п-:я и могут содержать, нап1имер, связующие агенты, сироп, камедь, желатин, сорбктол, «пзагант, пьсВ%и«Бткрролч Он, налог«п«телн, напр;гмер ГлсТОЗУ, - ЗХЗР, . хансова«Ы КРЗХМап, фоофаТ - СЛЬХЦ«Я, KО б —. т 0 JI к.-.««г ? .—,"?: -. Я ; 3v р;*o«««««a . % 84 э «?: приь«ер стеарат ?.: .а «п7лэ талькр пог«нэ";кленгл«гколэ; кремнезем, дез»-".;-.граторы, например кар;-эфел
НЬ«й КОЗХ?. "«а, "Ппк СООТВРТ ТВУ«О««П«а Сыа?У аЮЩКЕ аге.т,ь«,. ««."лркмер лауркллатр««йсульфо««ат. Таблетки можно покрь«ва кзвестыэ«м методОм. Ьыш=««a смеси могут бы в ф рме водных илн ма:ля««х сусле«чэ«й, растзоров, эмульс»з«, сиропов, э«пх;,кров жт««в ниде сухого продукта д«п«растворе«пи с водой a «другяьги жидсост;п п«. Га«сне жидкие смеси могут содержать "словные добавки, например агенты получения суспенз«п«, например сорбитоловый сироп, метилцеллюлоэу, глк«козу сахарный сироп), хгелатин, гидроксиэтилце;вполозу, карбоксимет««лцеллюлозу, стеарат алюми«п«н в геле «««««« гидрогкизованные пищевь«е жиры, агент-эь«у«п га- торы - лецитин, сорбитанмоноолеат или каме«в неводные носитеги, которые могут вклнипь п«пцевые масла, ю«пример миндальное масло, фракционированное кокосовое масло, масляные зфирь«, пропилепгликоль или этиловый спирт, презерванты, например метил илн пропил л-гидроксибензоаты или сорбиновую кислоту, Суппозитории должны содержать достаточное ко«п«честзо основ, например масло какао и«п«другие глицериды.
Композиции для инъекций могут быть в одноразовых дозах в ампулах или в дозах для многоразового использования с дополнительными агентами- консервантами.
Композиции могут быть в виде суспензий, Оастворов, эмульсий в масле или водных носителях.
Композиции могут быть также в виде порошка или жидких спреев или ингалянтов, лепешек или, полосканий для горла.
*c:QÛQQQ... «Е СНОД ЬЮЛЕ ль .1„ .= . ? А :* ь) . ..: ?.,! . 4О2»у .,? « «?ь. ь «(. . с л) О1ъы1 нов. Поглченный«злыт можно Очистить и ««Оу-.««ы мтода, —. О.Г о«П(ОГгить ЪсД д«О ОМ ц5г Т1. У О т
Ровлр&ио? О "Фщ Г С „-,---«« Э . 41Г.;«=.- члч "Т?:ч дроку,<акнз раствор",. а« .тибиотк«;а, «с«пимер
4 4« -?- . с.ванного фе О-., д ц. ч. ;- -акогQ, бул,опа
ПГ: 5 тгp 3 r O»Qi "." "ОД ржа« г О ЛУЧ Ю Кэтс«очог Гь е«п.у«э -т «?; -сиц1 О«;.р-?«Ого т«?па в «чг?«тс-., иато =.. 73ОЛ7?пе«п - ; апсорбат затем эл«оеруют ««ОГ
М ход а««м э,дса«О:«.g и. тример е-ж цм водкьР w" ргд«п«ом. лоать« ".î èpaþò во фракции, рам«ер уран«пп«aaa-«c««t QT размера коло««кл. Затем О жст ку заверниют. последовательньгми нроцессами со . следу =.тр«ья«хроматографнчес«сиьп«средаын: анко««ообм:«пп «е смолы -«п«а полисткролтриметиламмо«п«я„ка«?«О««ообме«пп«е смолы типа полнстнролсутпфоната, гелепрон««цаеьть«е смолы и полимер«« «е абсорб «ггы. Биозкт«твность злх тов измеряют путем пробы с применением Staphy!Qcoca!s
aureus ATCC 6538P в ка естве Орт««изма «гробь«.
И р к м е р 1. Трубку с лиофилкэованнай культурой Ятгертогоусез cattle«?a QTKpa«BRI07 асег?тично и содержимое взвешивают в трубке, содержащей 0,7 мл стерильных солей Девиса следующей композиции (г) ц,5
7,0
3,0
0,1
1000 мл
Цктрат натрия
К,НРО4
КНТ Р04 (NH4),З04
Mg S04 7НЗО
Дистиллированная вода
Для закапывания в глаза илн ушн используют индивидуальные капсулы.
Дозировка введения зависит от состояния боль
Мого, веса и типа инфекции, частоты введения н
5 способа введения, при этом парентеральное введение является предпочтительным для большинства инфекций, а оральный путь — для книечных инфекций.
Орально нли жрентерально антибиотик вводят
10 в количестве 2 — 600 мг/кг в день, предпочтительно
5 — 100 мг/кг в « нь раздельнымн дозами, т.е.
3 — 4раза в день. Можно применять одноразовые дозировки, например 25, 250, 500 нли 1000 мг активного ингредиента с подходящ«п «н физиологически приемлемыми носителями или эксцнпиентами, Полученнь«й антибиотик имеет активность
50 — 400 ед/мл.
О пщ:нньл т««е««агап«цин получают путем приме «;е..п«я Й««льтра«?««и геля -крез гель полчакриламида с
paзмеОО??«пОр ис ..":тсэчаю«щ«м молекуль1 весом ОО.
3;.ее «BQ 3.
576о6
Порцию 0,2 мл этой суспензии нср-... .а=уют для прививки косяка культуры среды А (;;лкс агар) следующей композиции (г) .
Среда А
Автолизат дрожжей 10,0
Глюкоза 10,0
Фосфатный буфер 2,0
MgSO4 7НгО 0,05
Дистиллированная вода 1000 мл (pH до 6,5 применением NaOH) !
С
Фосфатный буферный раствор
КНг Р 4 91,0
NaHPO4 95,0
Дистиллированная вода 1000 мл
Для косяков добавляют агар 25,0г/л.
Привитый косяк подвергают инкубации 8 дней при 28 С и хранят при 4 С.
Порцию спор и воздушного мицелия косяка используют для прививки колбы Эрленмейера емкостью 250 мл, содержащей 50 мл среды А (без агара). Колбу с посевом встряхивают при 28 С на шейкере со скоростью 220 об/мин в течение 2 дней, в течение этого времени получают удовлетворительный рост.
15 колб Эрлейнмейера по 250 мл, каждая со. держит 40 мл среды В, прививают 1 мл на колбу культуры из колбы посева. Среда В жалеет следующую композицию (г) .
Среда В
Кукурузная ь ука 20,0 зО
Барда 10,0
Соевая мука 15
Нитрат натрия 4,0
CaCIг 2НгО 0,5
MgSO4 ° 7Нг О 0,1
CaClç 6Нг О 0,01
FeSO4 7НгО 0,01
Полигликоль 2000 0,25 об.%
Дистиллированная Нг О 1000 мл (рН доводят до 6,S 40 применением ИаОН)
15 колб с продуктом встряхивают при 28 С на шейкере со скоростью 220 об/мин в течение 3 д ей с пробами, полученными в процессе ферментациоиного цикла. В пробах применяют бульон, подверг 45 нутый центрифутированию.
Через 53 час бульоны из 13 колб сливают. Часть подвергают центрифугнрованию и опробированию.
Оставшийся бульон фильтруют, иоводят до рН 7 и 500 мл сушат при температуре ниже 0 С с получе. 50 нием 10,7 г твердого вещества. 1,5 г последнего соединяют с 25мл смеси и-бутилового спирта и воды (1:99). рИ раствора составляет 7,0. Раствор наносят на колонку 5 х 118см биотмля Р=2 (200-400 метц), которую предварительно уравно- 55 ветпнвавт смесью и-бутилового спирта и воды. Гель проявляют тем же раствором со скоростью
10ыл/мии н собирают 650 мл головного погона с
75фракциями, 20мл каждая. Поток злюента на прввляют записывающим дифференциал ько1м
8 сел-актометром Мекке. Каждую фракцию опроби. р";т на антнбактерийную акгсзность, Ткенамицин обнаружен во фракциях 34 — 40 с максимумом во фракции 37. 10 мл фракции 37 сушат при темт;ературе ниже 0 С с получением 2,0мл твердого вещества. Последнее соединяют с 5 мл воды для пробы. Пластины -" пробой подвергают инкубацни в течение ночи при 28 С, Пелу или следующие реэульта ты.
Концентрация, мг/мл Раэмес =-oa;, .м, к
Staphyicсссс;.s aureus
АТСС «538 F
80 30
40 25
20 21
10 17
Пример 2. Открывают асептически трубку с лиофнлиэованной культурой Streptomyces cattleya и содержимое взвешивают в 0,8 мл стерильных солей Девиса композиции примера 1.
Суспензию используют для инокуляции четырех косяков среды А (плюс агар) с композицией., приведенной в примере 1.
Привитые косяки подвергают инкубации в течео ние недели при 28 С и затем храня= при 4 С.
Порцию спор и воздушного мицелия одного иэ косяков используют для прививки в колбе Эрленмейера емкостью 250мл = посевом, содержащей
& ..:=" А. Колб; ..:;а. ч встряхивают при 28 С со скоростью 220 об/мин в течение 2 дней, затем получают удовлетворительный рост.
Ислольэуют 15 колб Эрленмейера емкостью по
250 мл, каждую с 40 мл среды В. Каждую колбу прививают 1 мл культуры из колбы посева. Колбы в." =и эют нри 28 С со скоростью 220 об/мнн на шейкере в течение 3 дней с пробами, выполненными в процессе ферментационного цикла. В пробах применяют плавающий бульон, прошедший центрифугирование. Получают следующие результаты:
Возраст, час 48 53 72 рН 6.7 6,4 5,5
Активность к Staphylococcus
aureus ATGC 6538Р, .размер зоны, мм 38 40 38
Через 53 час бульоны нэ 13 колб собирают н фильтруют. рН порции фильтрата в 400 мл доводят дс 4,8 разбавленным НС! н его адсорбируют на
140 ьц; Ловекс 50 х 2Na при скорости 14мл/мин.
Адсорбат промывают 200 мл деиониэированной воды и элюируют 2 -ным пиридином в воде, собирая
6 х 70 мл фракций. рН фракций доводят до 7,0
Пробы брали иа всех фракциях.
Пробы указывают на 45%-ную активность элюатов.
Элюатную фракцию сушат лри температуре ниже 0 С с получением 117 мг твердьпс веществ, Последние растворяют в 1,5 мл смеси и-бутилового спирта и воды (1:99) . Раствор наносят на слой биогеля Р=2 1,4х81,5 см, который предварительно уравновешивают смесью и-бутилового спирта ч во576967
5,0
G,01
11 (смачив ающал Основа)- 15,0
Барда 10,0
Хлопковая С1>еда (фарма медия)
СС4з 6НзО
Свc 3 (посл- рагули рованкя р1= .) 3,0
Полит/ик оль 2000 0,25%
Ватопровод>ия вода 1000 мл (pH доводят до 70
iO применением NaOH)
Температуру в баке доводят до 24 С в течение .120час. Добавляют не более 1% дополнительного пеногасктеля полкгликоля 2000. Проводят акпИактарийные пробы. б
400 л бульона фильтруют на пресс-фильтра н добавляют 1,2 г натриевой соли (этнланцннитрнло) татрауксуснок кислоты к фильтрату Фильт т охлаждают до 6 С, доводят рН до 4,0 Ф3,2 и поддар>хивают ВрН 6 С. Холодный фкльтрат адсорбирую= на 38 л Довакс SGx4j»)aа 20 — 50 меш, при скорос»
4 л/ QQi. А сорбат промь ают 40 мл даноинэн ваннот"; а эдьт, элюкруют «>%- ным водным г-,„п г; а. лом B ",,1 г д -;.;у= fy«, 19 г-: ау рая,обит -„а . о д, бко»/тэт,й B-:,нбвд. тасийныа пробы локазь23аю"* что элюат фракций 2 и 3 содар»лт 22% акпгвносн .
ТрН фракции coGHpaIQT, концентрируюT go 3,8 л к
/доводят рН до /. 3,8 л полученного выше кон;автpaIR к.сорбцпугт на 2,5 л Довекс (смола хлоридиого цикла) прк скорости 200 мл/мкн. Смолу 30 злюируют дакокизированной водой в том же коллчаства. Фракции собирают и кажду-ю доводят дс рН 7,0. Пробы показьааают 75%-ную биоаклимость во фрзкщтвтх : 8 тк фракшщ собирают и фи —, руют. 3 л порции этого фильтрата сушат при танюг:э.
pa=> pe кижа 0 С, пол;чают 1О,5 г твердых веш с активно.-.ть-э 70 ед/мл.
4 г еь1с1/шанного при тампаpa ВВ>Ке 0 твердого веществ соединяют с 50 мл 0,1 М 2,6луткшпацетатного буфера. Раствор с рН 5,3 наносят .р ю колонку, получившую следующим образом.
2,5 л Довекса 50х8 (200=400 меш) смоль водородного цикла преобразуют в 2,6 - лутклуя;вый тдкл. Смолу уравновепивают c S обы:мам колонки 2,6 - лутидинацататного буфера, 0,1 М, 45 рН6,3. Размеры уравнсвешенной смолы в слое
5х114 сьь Колонку проявляют буфером (0,1 M) со скоростью 14 мл/мкн.
Поток элюакта калравляют залисываюппям дкф. фаран: аль-rani рафрактором Меккоматик. Про са ляют до получения 220 фракций ло 20 мл каждая, Каждую сле лощую фракцию от 44 до 142 опробируют при разбавленки 1:50. Биоактквность наблюдае ся во фракциях 78 — 136, максимальная во фракциях 92 — 94, Фракции 82 — 116 отбирают и 55 собирают с получением 70G мл раствора. Раствор разделяют на две порции 350мл и сушат при температуре ниже 0 С.
Одну порцию высрпаннык веществ растворяют в 2,6 - луткдинацетатном буфера, 0,1 М, рН 7,0. 60
l2
Раствор 27 мл наносят на колокку биогеля Р-2 (200 — 400 меш) Sx108 см, которую предварительно уравновешивают буфером (0,1 М). Гель затем проявляют буфером при скорости 10 мл/мин.
ПОтОк злюента направляют записываюЩИМ дифференциальным рафрактометром Иаккоматмк.
Проявлежю продол»ают до получения 105 фракций (20 мл каждая), фракции собираю-. Каждую фра=цню 5 — 90 Опробируют п1ж разбявлаиии 1:50. Проба показывает пик биоактивности во фракциях
67 — 75, максимум в 70 ч 71. Фракции 68 — 75 собирают с полу я>кием объема 162 ма. К 145 ми собранной фракции добавляит 3 мл (рН 7,0) буфера фосфатв BBTpHR и расТ3ор концентрируют ДО 9 ьЯь
Концентрат с содер»аннам 78% обц1аго биоактивного материала наносят BB колонку биогеяя Р-2, сушат при теьавратура якие 0 С с полущнием
185 ьп. Оставп>неся 1 мл фракций 68-75 с".час
Ye . >a шпке 0 С C BQ iг9 мя
ТВер п веществ с акт вностью 105»> ад/мг, П р к м е р 5. Трубку с лпофгизлзанно4 "зк>Ь - « ру» Ят », . О О.ц. а -Зт » а .. Ь ВЗБ,-.Т
4 — = =, у - л ":. :=в»-."" "-г и""1 - ч р
1»» р»у ъ«-"«р pe q1 g>, -.тэ гр ; ".г« ",r рНМер 1.
Нноку>ворованные косяки по рерыют ижуоацик в течение кедели прк 28 С к затем хранят
ВрН 4
10 мл среды A асаптнчно иеран-,-сят ж Од —:ч косяков споры H воз /Ежа ьжце>тай яомбжатат и су;;., .э.—.;э . =, мл последней пспользуьэт для ыо.
7 3/" я „и. ; с ? л ц а;=О»оо ъ (. т--."=Ф »" пяа %Р . »
co + l э?> Я»пах 500 л сэ з О1-О" с и ь.всл .
А л» .,.Г - эт прк з со ск постью 60 Об ьп,":» ша апе в теча хка «.8 тас
Ф.ЧХ:ЪT/ »У Е» КО б - % K. Ж "ЬЗ Р. $5з. инок 6;.яшы бака емкостью 19ь л е«е@Ожеватошай
А стьл, сод р?хащего 1О» »;л среды А. аьптературу Б бака доводят до 23 С. пезамеппваит сэ жорос,ъю
1500б/мин, пропуская поток воздуха в течение
14 час, Паногаситель — Ьсапгл коль ЗХВ - cvo зуют в количестве на более 1/а. оН BmeB«BeTся следуюпнпя Образом:
Зозраст, час О, 12 24 рК 63 66 5
35 л культуры из бака посева к"пользуют для инокуля@п фаомента амкостыа 56 л -нз»чар» жаваюгцей стали, содапжащаго 46 л с»>ацы 2» colviпозиции примера 4. о, Процесc проводят ВрН 24 С ВрЕ скоростB Вермашивания 95 o6/ìBB в тачение 120 час, Пеногаситель — полигжколь 2000 добавляют в когл ества не более 1,1%.
400 л бульона фильтруют через фильтр-пресс и порошок для фкльтровыия добавляют к 1,2 г (зтклендинитрило) - тетрауксусной кислоты, к фильтрату добавляют соль натрия. Фильтрат охлаждают дс 6 С, доводят до рН 4,0 i 0,2 и выдерживают
Среда С
Кукурузная мука
Барда
Соевая мука
CaClg 2НгО
М9$04 7Нг0
- CoCI ã 6Нг 0
FeSO4 7НгО
CACO
Полигликоль 2000
Дистиллированная вода (рН доводили до 6,5
HpHMGHGHMeM NaOH)
Три колбы встряхивают при 28 С со скоростью
220 об/мин на шейкере в течение 72 час. Бульоны соединяют и часть центрифутируют для пробы.
Собранный бульон имеет рН 7,4, антибактерийная проба с применением плавающего центрифугованного бульона — 43 мм.
Бульон фильтруют, рН фильтрата доводят до 4,0 разбавлением HCI. 3000 мл адсорбируют на
300 мл Довекс 50x2Na при 30 мл/мин. Адсорбат промывают 300 мл деионизированной воды и элюируют Ж-ным пиридином, собирая 8x?50 мл фракций, рН фракций доводят до 7,0. Элюат фракций 2 и 3 (300 мл) соединяют и с содержанием 48% общего биоактивного материала наносят на колонку Довекс 50х2 Na.
280 мл порции соединенных фракций элюата с рН7,0, полученного вьппе, пропускают через ко20,0 г
10,0 !
5,0
0,5
0,1
0,01
0,01
4,0
0,25 об %
10000 мл ды. Гель проявляют смесью и-бутилового спирта и воды при скорости 1 мл/мин и собирают 2 мл фракций, Поток элюента направляют записывающим рефрак. тометром Меккоматик. Фракции опробируют на антибактерийную активность разбавлением 1:20.
Биоактивный пик наблюдали на фракциях 44-53.
Фракции 46 — 49 и половина фракции 50 собирают.
1 мл образца последних фракций снова опробируют и остаток сушат при температуре ниже О С с выходом 4,2 мг частично очищенного антибиотика.
Пример 3. Трубку с лиофилизованной культурой открывают асептично и содержимое взвешивают в 0,8 мл стерильных солей Девиса композиции примера 1.
Суспензию используют для инокуляции четырех косяков среды А (плюс агар) композиции, указанной в примере 1.
Привитые косяки подвергают инкубации в течение недели при 28 С и хранят при 4 С. Порцию спор и воздушного мицелия одного из косяков используют для прививки трех колб Эрленмейера (250 мл) с перегородками, каждая содержит 50 мл среды А. Три колбы с посевом встряхивают при
28 С на шейкере со скоростью 220 об/мин в течение
1 дня, получают удовлетворительный рост.
12 колб Эрленмейе fe (2000 мл), каждая содержащая 250 мл среды С, прививают 7 мл суспензии, полученной с аптечным собиранием содержания
3 колб с посевом. Среда С имеет следующую композицию (ч.):
Среда Е
Церелоза
Кукурузная жидкость
25,0 лонку (40 мл) смоляного цикла. Смолу промывают 160 мл деионизированной воды. Элюент и промытые фракции собирают с получением 440 мл раствора. Раствор доводят до рН 8,2 разбавлением гндроокисью натрия, концентрируют при пониженном давлении до300 мл, доводят до рН 7Ä0 разбаво ченным KCI и сушат при температуре ниже 0 С с получением 189 мл твердых веществ, которые растворяют в смеси и-оутилов ого спирта и воды (1:99) .
25 мл раствора наносят на колонку биогеля Р= (200 — 400 меш), который предварительно уравно. вешивают смесью и-6ynmosoro спирта и воды. Гель проявляют и- бутиловым спиртом со скоростью
6,7 мл/мин. Поток элюента налравляют записы16 вающим дифференциалън» м рефрактометром Меккоматик. 500 мл головного погона соединяют с фракциями (20 мл каждой). Каждую фракцию опробируют на антибактерийную активность при разбавлении 1:25. Биоактивность наблюдают во фрак20 циях 37 — 42, максимум во фракции 39. Фракции
38 — 41 общим объемом 80мл собирают. Раствор концентрируют до 10мл при рН7,0 и сушат при температуре ниже 0 C. Твердое вещество (13,5 мг) имеет сравнительную силу в шесть раз больше, чем
25 образец на биогеле р =2 колонки в пробе с дисковой диффузией на Staphylococcus aureus.
Пример 4. Трубку с лиофилизованной культурой Streptomyces са+0еуа открывают септически и содержимое взвешивают в 0,8 мл сте30 рильных солей Девиса компоэишги примера 1.
Эту суспензию используют для прививки четырех косяков среды А (плюс агар) композиции примера 1.
Привитые косяки подвергают инкубации в тече35 ние недели при 28 С и затем хранят при 4 С.
10 мл среды A асептически переносят на один иэ косяков, споры и воздушный мицелий помещают в суспенэию.
3,3 мл суспензии используют для инокуляции
40 2л перегороженной колбы Эрленмейера с 500мл среды А. Эту колбу с посевом встряхивают при
28 C на шейкере со скоростью 160 об/мин в течение
48 час, получают удовлетворительный рост.
Культуру из этой колбы с посевом используют
45 для прививки. 8 баке емкостью 190 л из нержавеющей стали, содержащем 160 мл среды А, проводят процесс при 28 С при перемешивании со скоростью
? 50 об/мин в течение 24 час. Пеногаситель полиглнкот
2000 используют в количестве не более 1%. рН изменяется следующим образом, Возраст, час 0 12 24 рН 6,4 4,4 0,3
43л культуры в этом баке используют для инокуляции 756 л ферментера из нержавеющей сгали, содержащего 467 л среды Е следующей компо. зиции (г):
576967
14!
3 при 6 С. Холодный фильтрат адсорбируют на 38 л
Довекса 50х4 Na (20 — 50 меш) при скорости
4 л/мин. Адсорбат элюируют 2%-ным водным пиридином и три фракции (по 19 л каждая) собирают и опробируют. Пробы показывают 27%-ную биоактивность во фракциях 2 и 3. Элюат фракций 2 и 3 собирают, концентрируют до 3,7 л н доводят рН до 7.
В 3,7 л концентрата элюата доводят рН до 7,4 и адсорбируют со скоростью 200 мл/мин. Смолу злюируют деинизированной водой с той же скоростью, фракции собирают, доводят рН до 7,0. Фракцию 4 (4 л), содержащую 50% активности в концентрате, фильтруют через фильтр Миллипор 0,45мкм. Светлый фильтрат высушивают при температуре ниже
0" С с получением ? 2,4 г твердого вещества с активностью 270 ед/мг.
4г высушенных при температуре ниже 0 С твердых веществ соединяют с 2,6 - лутидинацетатным буфером, 0,1 М, рН 6,3. Раствор (50 мл) дово. дят до рН 6,3 добавлением уксусной кислоты, наносят на колонку Довекс 50х8 2,6 - лутидинового цикла смолу (200 — 400 меш), которую предварительно уравновешивают буфером (0,1 М), Смолу проявляют тем же буфером, 0,1 М, рН6,3, при скорости 14 мл/мнн.
Поток элюента направляют записывающим дифференциальным рефрактометром Мекк оматик.
Проявление продолжают до получения 150 фракций (20 мл каждая). Другие фракции 72 — 150 опробируют при разбавленин 1:50. Единственный биоакгивный пик во фракциях 76 — 148, максимум во фракциях 92-102. Фракции 86 — 113 собирают с получением 580 мл раствора, содержащего 71% биоактивности при нанесении на колонку Довекс 50х8.
Этот раствор подвергают сушке прн температуре ниже 0 С. Полученный раствор растворяют в 2,6лутидинацегатном буфере, 0,1 М, рН 7,0, с получением 25 мл. Раствор наносят на слой биогеля Р-2 (200-400 меш), который предварительно уравновешивают буфером (0,1 М) . Гель проявляют тем же буфером при скорости 9мл/мии. Поток элюента направляют записывающим дифференциальным рефрактометром Меккоматнк. Проявление продолжают до получения 105 фракций (по 20 мл каждая). Каждую фракцию 65 — 80 опробируют при разбавлении 1: 200. Наблюдают биоактивиый пик во фракциях 67 — 76. Фракции 70 — 72 собирают и высушивают при температуре ниже 0 С с получением
16,0 мл раствора с активностью 13,800 ед/мг. Фракции 69,73 и 74 собирают и высушивают при температуре ниже 0 С с получением 20,2мг с активностью 5,200 ед/мг.
16 r высушенных прн температуре ниже 0 С веществ растворяют в 2,6 - лутидинацетатном буфе ре, 0,?,М, с получением 10 ми. Раствор наносят иа слой биогеля Р-2 (200 400 меш) 5x?08 см, который йредварительно уравновешивают тем же буфером. Гель проявляют буфером при .скорости
9мл/мни. Поток элюеита направляют записывающим дифференциальным рефрактометром Меккома гик. Проявляют до получения 105 фракций (каждая по 20 мл) . Каждую фракцию 65 — 80 апробируют при разбавленнн 1; 200.
Биоактивный цик наблюдают во фракциях
67-75. Фракции 68-72 собирают и высушивают при температуре ниже 0 С с получением 9,1 мг с активностью 15,000 ед/мг.
Пример 6. Трубку с лиофилиэованной культурой Streptomycea cattleya открывают асептическн и содержимое взвешивают в 50 мл стерильной среды А (с компоэнцнеи примера?), находящейся в перегороженной колбе Эрленмейера емкостью 250 мл.
Инокулированную колбу встряхивают при 28 С со скоростью 220об/мнн в течение 48час. 40мл бульона асепгично смешивают с 20%-ным стерильным гликолем. 2 мл полученной смеси пипеткой закапывают в стерильную ампулу, затем mopusвают и хранят на паровой. фазе холодильника с жидким азотом.
Замороженное содержимое ампул используют для кнокуляции перегороженной колбы Эрленмейера (250 мл), содержащей 50 мл среды А; Колбу с
25 посевом встряхивают цри 28 С со скоростью
160 об/мин в течение 24 час.
Порцию 10 мл из этой колбы с культурой используют для инокуляцни перегороженных колб
Эрленмейера (2 л каждая), содержащих 500 мл
30 среды А. Эти колбы с посевом встряхивают со скоростью с 160 об/мин при 28 С в течение 24 час.
Порцию 100 мл содержимого этих колб используют для инокуляции ферментера из нержавеющей стали (756 л), содержащего 467 я среды А. Бак подвергают обработке при 28 С со скоростью
130 об/мин в течение 24 час. Полиглнколь 2000 используют в качестве ценогасителя в количестве не более 0,1%.
453 я культуры используют для инокуляции
40 ферментера (5670 л) из нержавеющей стали, содержащего 4082 л среды Е композиции примера 4.
Процесс проводят при 24 С при скорости вращения 70 об/мин в течение 144 час.
Пеногаситель (полиглнколь 2000) добавляют ие
4„более 0,1%. Пробы проводят с использованием плавающего центрифугированного бульона. Пробы иа дисковую диффузию проводят с применением фильтровальной бумаги.
4,082 л ферме1пационного бульона фильтруют.
Ж Фильтрат охлаждают до 6 С, доводят рН до 4,5М 2 и поддерживают при 6 С. Холодный фильтрат адсорбируют. Адсорбат промывают 480 л денонизнрованной воды и элюируют 2%-ным водным пирндином прн скоросттт 24 я/мин и три фракции 300Ä 520
?? и 240 л собирают и апробируют прн рН 7,0. Пробы показывают, что злюат фракций содержит 4, 16 к
6% (соответственно) биоактивности прн нанесения на колонку Довекс 90х4 Na.
Элюат фракции2 концентрируют до 48д и й?? доводят рН до 7.
576967
1(48 л ко щентрата доводят до рН 7,3 и адсорбируют на 76л,Новекс 1х2 (50 — 100 меш) смолой хлоридного цикла при скорости 76 л/мыль Смолу элюируют деионизировммой водой при той же скорости. Собирают 4 фракция, две по 48, орду 70 и одну 48 л, Фракции доводят до рН 7. Пробы показывают, что 68% исходной биоактивности присутствует во фракция 70 л, Зту фракжпо кокцентри. руют дд 8 л при рН 7,0 и фильтруют с применв кием фчльтра Милгьипор 0,45 мкм. Фильтрат высушивают при температуре ниже 0 С с получением
99 r продукта активностью 310 ед/кг.
10 г высушенного при температуре ниже О С твердого вещества соединяют с 2,6 - лутидинацетатным буфером, 0,1 М, рН 6,3. Раствор 125 мя дово. дят до рН6,3 уксусной кислотой и наносят на колонку, которую предварительно уравновешивают буфером и проявляют буфером {0,1 М) нри mo. рости 25 мл/мин. Каждую пьтвартую фрпаппв от 36 до 192 опробяруют при разбавлении 1:200. Биоактнность проявляется Во фракталх 56 — 192, максимум во ооак:*гнях 92 — 96, Фраки пи 80 — 36 -="Ойъраяп, добавляют 590 мл деионизировашюй воды, получают !760 мл. Собранный разбавлен.п рас.вор содержит 62% исхолзюй биоактивности, его наносят на колонку Довекс 50х8, сушат при темгюратуре ниже 0 С.
Высушенные при температуре нилоэ 0 = тверДЫЕ ПЕЩ: Ства 1ьс "ЬьЬVЬЬ)iЬОТ В 6 ЛУТИДИнаЦЕ Ьатяп буфере, О,l М, рН7,0. Раствор 27 ил наносят на колонку биогеля Р-2 (200 — 400 меш), которую предгз".и:. : . урз. н =.тшгвают буфером (О,! М) .
Гель проявляют тем к буфером цри скорости
10 мл/мин.
Лоток элюента направляют запясываюцьььм шьфференциальньм рефрактоматром Кеккоматик. Jtoлучвют 105 фракций (по 20 мл каждая), их -обирают. Каждую фракцию 70 — 93 опробируют прн разбавлении 1:300. Биоактивность обнаружжают во фракциях 73 — 82, максимум во фракциях 77 и 73. Фракции 75-80 выеуыивмот п1и температуре ниже О С с полу юлием 90 мл антибисаика со средней активностью 10,000 ед/мг. 90 мг его соедиHIST c 4 мл буфера фосфата KRBst@tm 0 f6 t М, Зтот раствор, содержащий 596 ед гидроксилаьп.нгасжцей оптической плотности, наносят на колонку
С 90 МЛ ПрЕДВарнтЕЛЬНО ГьроМЫТОГО XA3 — 2 И ураВповешенного до использования с 180 ил буфера фосфата кальция, 0,01 М, рН7, прн 5 С. ХАД вЂ” 2 промывают последовательно пятью объемами 1 н.
NaOH, затем деионизированной водой до получения нейтрального элюента, пятью объемами 1 н. ИСь н деионизированной водой до получения мйтрапьного элюента, пятью объемами (каждого) метанола, ацетона, 0,001 М ЗДТА тетранатрия и диспшлированной воды. Перед употреблением растворители вакуумируют, Далее образец наносят на колонку с двумя порциями фосфатного буфера по 2мл. Колонку
l0
I6
"ь.""ь проявляьоь прп э С буфером при скорост.ь потока
2 ..ьл/мин. 4 v&i фрактп и элюата собирают. Фракции, полученные после СО мл элюата, собирают н при получении 253 мл концентрируют на вращающемся устройства в вакууме и ниже 10 С до объема 6 мл.
Этот pacrttop, содер>хаший 436 ел. гидроксиламингасящей GJITmec «GA плотности, наносят на коJIG диаметром 1,7 см с 90 мл ХАД вЂ” 2ь предварительно промьпай, как указано вымя, и уравновепаьнной пря 5 С дистпллировььшьой водо!. Образец промьпьают двумя порциями по 2 л дистиллированной воды, Колонку проявляют г:стиллированной водой со скоростью 2 мл/ьаи, 4 мл фракшй злюата собирают, Фракщги, полужшгыье после 100 м эжоата, собирают, 151 мл концентрируют на вращающемся вьшарном устройстве до объема 2,73 мл и раствор лиоьь> пызируют до псатучевмя 6,49 мл тненамищ4на. Фракщы, полужщъы ьюжп» ь 52 ыл и
345 мл 6»tpatitт ч кгэнль»р»оируют pa Вдтнь«ьз»ьлце 1„
CJt ВЫТИРНОМ уетройСТВЕ дс ООЪЕЬГ 3ь34 МЛ Г
ЛиофИЛМЗИруЮТ ДО ПОП»ьЧЕЬИя 1 1.5;:; ЖУЯ оп<а. Зти фракция содержзь-; в c6» eь-: 369 ед гл:; и 3ксйлдьпьнга я3»% .эптьическон льэьь и«
-axo 5 1 раза оьйльеьппР% ьь«те «ь»Г по " r e» э " . Т m - --1»-. иат31жилом нанесеьпы ": ив перв"-»- з М ..— :. ч "«ь ку полу»ают at «çåoñ÷ú 3 1,000 ед/мг Оикгроь-"=тт. рический анализ ооразца продукта пьоказьгвае ь
Е1 -253 при и:мерэнии в фосфатом буфарз, ОН 7, прь яч.
П р „M е JJ 7, Порцию 10 г твердого вегдества (99 ) @з Дпвеьc 1 JI2 р » »т Ой еьэедГь е»
;ППОТ С 2,6 - ЛутъдниацвтаТЬПаъь ОуфЕрОМ, .,..., рН 6,3. Pact ор 125 мл доводят до р11 6„З птя-.
ПОМОПф; уКС» СКСьй К!ЗСХЕ)ТЫ, Наиоеят ИЕ- КЯ ОИЖ
7,6х142ем Довекс 50х8 В щ-".àê 2,6 - .—,т.".ьь-т.
r= . которую предварительно уравнсаешквают фор ОМ. КОЛОНКУ БТьпРЖЛЯ%Т б лдЕОСЖ (0,1 Ь« и с сор ти 35 5мгь/ай 3 6 л ь,ьььпььь"О пптт@а с;-ьбв.
patIJT и 260 фраКьщй ПО 20 МЛ К. *Ю ая. 1 Л ф ."
ЧЕтВЕртуЮ фраЬ Ю GT6 Л@194 Опребн1»уЮТ =
pa36aB JL«KHH 1:200. клоак K9HGczh обн".»»утьзаваю-. во фракциях 18 — 173, максе@ум во фракию
62 — 82. еракции 42-102 комбинируют и 640 мл деионизнрованпой Воцы добавлятот с цолучеииеь
1920мл. Соединений, разбавленнъгй раствор, содеря лТяй 63% биоактивности, z oснт Ва колонк1
Довекс 5QJtS н 238C1ittttIBBJJJT BpR темгььвратуре m О С.
ТПЕрДИЕ ае еСТВа раСТВ RQT и 2 6 Лу-п.в ьь ацетатном буфере, 0,1М, рБ7,0. Вствор 2зил наносят на колонку 5х«i 12 см биогеля Р-",; (200-400 мин), предварительно у;жвновешегпгую буфером (0,1 М). Затем гепа цроявляьот тем же буфером при скорости 10 мл/мин.
Поток элкьента направляют записываю им 1щфференьзтальным рефрактометром Мек коматик.
Проявляют до получения 125 фракций (каждая по
20 мл). Каждую фракцию 70 — 89 опробируют при разбавления 1: 300. Биоактивиость Обнарухивают
576967
18!
Формула изобретения сн,— сн(ен) 40
Составитель С. Магпотина
Техред Н . Андреячук
Корректор С. Ямалова
Редактор Е. Хорина
Закаэ 2960/704 Тираж 541 Подписное
ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам иэобретений н открытий
113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушскан наб.д.4/5
Финтил ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 во фракциях 72 — 81, максимум во фракции 77.
Фракции 75-79 высушивают при температуре ниже 0 С с получением 100,5 мл антибиотика с активностью 8,320 ед/мг.
100,5 мл твердого вещества соединяют с 4 мМ буфера фосфата кальция, 0,01 М, рН 7. Этот раствор, содержащий 692 ед гидрокапвмингасящей оптической плотности, наносят на колонку (1,7 ем диаметром) с 90 мл предварительно промытого и уравновешенного ХАД вЂ” 2 до использования с
180мл буфера фосфата кальция, 0,01М, рН7, при 5 С. ХАД-2 промывают до иакынзования по следовательно пять о объемами 1 s, йаОН, затем деионизированной водой до нейтрального элюента, пятью объемами 1н.HCI, затем деиониэароваиной водой до нейтрального элюента, пятью объемами метанола, ацетона, 0 001 М ЭДТЛ тетранатрня и затем дистиллированной водой. Вакуумнруют все растворители перед употреблением.
Затем образец наносят на колонку дважды по
2 мл порциями фосфатного буфера. Колонку проявляют при 5 C буфером при скорости 2 мл/мин.
4 мл фракций элюата собирают. Фвмсции, полученым после 109 мл элюата, собирают н после получения 309 мт снова собирают. К этому знюату добавляют 1!,53мг обра:и а ХАД вЂ” 2 очищенного акп биотика, цолученпого в примере 6, еодерлащего
185 ед гидроксиламингасящей оптической плотности.
Собранный злюат вместе с добавленным антибиотиком концентрируют в вакууме на вращающемся выпарном устройстве при температуре ниже
10 С до объема 7 мл.
Этот раствор, содержащий 720ед гидроксиламннгасящей оптической плотности, наносят нн колонку с 90 мл ХАД-2, предварительно промытой, как указано выню, и уравновешенной при 5 С.
Перед использованием образец промь|вают дважды дистиллированной водой (по 2 мл). Колонку проявляют дистиллированной водой со скоростью
2 мл/мин. 4 мл фракций элюата собирают. Фракции, полученные после 109 мл элюата, собирают и после получения 309 мл концентрируют на вращающемся выпарном устройстве до объема 10,3 мл. Этот раствор, содержащий 589 ед гндроксилаьянгасящей оптической плотности, лиофнлизуют с получением
23,6 мг антибиотика с активностью 30,140 ед/мг.
Полученный таким образом антибиотик представляет собой белое аморфное твердое вещество.
Образец его помещают в кааллярную трубку, температуру повышают со скоростью 3 С!мин, происходит разлоиание без получения жидкой фазы на следующих стадиях: размягчение при 130 — 140 С; сокращение в объеме твердого вещества до
170-174 С, где материал желтел; интеживное нарастание цвета до красновато- коричневого при
180 — 200 С; карбонизацая и остатожые следы твердого веще стра — при 205 С.
Про вй образец материала на анализе спектромурии показывает ник абсоаэбции иа 296,5 нм с
16 Е© 268,2. Эжментаруеый анализ дает с :дуницне результаты: 5,67% потерь веса ири сущке при комнатной температуре в течение 4 час в вакууме. Композиция содержит (%) 47,68 углерода, 6,22 водорода, 11,48 азота. Эти результаты совпадают с эмпиричес20 кон формулон С11Н<айз04 $(ИНз}p,zs Выл ленная элементарная композиция содержит (%)
С 47,68, Н 6,13,N 11,52, S 11,57, 0 23,1, Поляриметрнческий анализ 1 мг/мл раствора этого образца в
10 мм буфера фосфата кальция показал спецнфи25
Ю ческое оптическое вращение (а) — + 80, ИК вЂ” спектр этого образца выявил характерный пик абсорбции на 1765, 1650 — 1э 50, 2800 — 2500 и
3500-3100 см . Спектр ЯМР на 100 мГц образца этого продукта.
Способ получения антибиотика тиенамицнна формулы о т л н ч а ю шийся тем, что штамм Streptomyces
cattIeya NRRL 8057 культивируют в аэробных глубинных условиях в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с последующим выделением и очисткой целевого продукта.
