Способ получения производных иммуноглобулина

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик (11) 57 8892

К ПАТЕНТУ (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 06.03.75 (21) 2116226/04 (23) Приоритет — (32) 08.03.74 (31) 26341/74 (33) Япония (43) Опубликовано 30,10.77. Бюллетень Яо 40 (45) Дата опубликовании описания,29.12.77 (5i) M. K . С07 6 7/00

ФА 61 К 39/00

Государственный номнтвт

Совета Министров СССР но долом нэооротоний и отнрытнй (53) УДК 547.962.4.07 (088.8) (72} Авторы изобретения

Иностранцы

Кацухнко Томибе, Ясухнко Масухо, Кимихико 1т(ацузава, Са ато Исимото, Казуо Сатаке и Цунео Ватанабе, (Япония)

Иностранная фирма

"Течдзин Лимитед" (Япония) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОИЗВОДНЫХ ИММУНОГЛОБУЛИНА

Настоящее изобретение относится к спосоЩ получения производных иммуноглобулина, которые могут иметь ценное терапевтическое значение и найти широкое применение в медицине н в ветеринарии.

В литературе описаны различные производные иммуноглобулина, обладающие высокой биологической активностью. Так, было предложено для изготовления препаратов иммуноглобулина, прояв-. ляющих пониженную. нежелательную реакцию при внутривенной инъекции, селективно. расщеплять межцепочечные дисульфидные связи с последующим S - алкилированием образующихся тнольных групп. Однако продукт представляет собой 8алкилированиый полипептид, имеющий потенциальную QHscHocIb из-за возможнос и появления новой антнгенности.

В литературе описан способ получения производного иммуноглобулина, в котором расщеплены и подвергнуты сульфитолизу межцепочные дисульфидные связи, Метод заключается в обработке иммуноглобулина сульфитом натрия в присутствии ионов двухвалентной меди. Препараты, полученные таким .способом, имеют ряд существенных недостатков: образующиеся полипептиды содержат, ионы двухвалентной меди, которые крайне трудно или вообще невозможно удалить из продукта; — такие препараты имеют сильно пониженную а антигенсвязывающую активность, хотя и обладают желательной низкой антикомплементарной активностью;

s полученных таким образом препаратах изменена или разрушена их исходная конформация, как зто подтверждается данными измерения оптической активности; — продукт является термически нестабильным я проявляет склонность к образованию агрегатов; — продукт проявляет нежелательные физиоло.

13 гические свойства, когда его используют для внут ривенной инъекции.

В литературе отсутствуют сведения о способе получения препаратов иммуноглобулина, в которых подвергнуты расщеплению и сульфитолиэу

30 межцепочечные дисульфиднме связи и которые йе содержат посторонние примеси, такие, как ионы двухвалентной меди.

Указанные недостатки устраняются при использовании описываемого способа получения произ35 водных иммуттоглобулина, не содержащих ионов

578892 двухвалентной меди, при котором селективно расщепляются межцепочечные дисульфндные связи, соединяющие две тяжелые полипептидные цепи (Н- цепи) и две легкие полипептидные цепи (L.öåïì) в иммуноглобулнне, или, кроме указанных межцепочечных дисульфидных связей, расщеп. ляется часть внутрнцепочечных дисульфидных связей, а подвергнутые расщеплению дисульфндные группы подвергаются дальше сульфитолизу. Полученные таким способом производные иммуноглобулина имеют пониженную антикомплементарную активность н сохраняют высокую антительную активность в организме животных в течение длительного периода.

Способ получения укаэанных препаратов заключается в том, что нативиый иммуноглобулин вводят во взаимодействие в водной. среде с соедиие)шем (а), способным давать тетратионат-анионы, и соединением (б), способным давать сульфитанионы, чтобы лодаергнуть расщеплению от 3 до 5 межцепочечных дисульфидных связей, или меж- и внутрнцепочечных дисульфидных связей нативного иммуноглобулнна с последующим S - -сульфонировацием (— S — SOal!) образующихся тиольных остатков.

В качестве соединения (а), которое допускает образование тетратионат-иона, предпочтительным является тетратноновая кислота, ее соли щелочных металлов, такие, как тетратнонат натрия, тетратионат калии, н т.д., и ее водорастворимые сони, например тетрапюнат аммония. Но могут быть использованы любые другие соединения, которые образуют тетратлопат-иоп в воде.

Примерами соединений (б), которые могут образовывать сульфит-ащгон в воде являются сернистая кислота, сульфит натрия нлн калия, бисульфнт натрия, но може1 быть использовано любое другое соединение, способное образовывать сульфит.пон в воде.

Соединение (а), которое допускает образование тетратнонат-иона в воде, действует как окислитель. Соединение (б), которое образует сульфнт-ион в воде, действует как восстановитель и агент S-сульфонирования, Молярные количества сульфит-иона н тетратионат-иона, каждые по отд.льности, должны не менее, чем в два раза, превышать количество подвергаемых расщеплению дисульфидных связей.

Концентрация этих ионов может в 100 и более раэ превышать количество подвергаемых расщеплению связей.

Предпоччительно, чтобы соединения (а} и (б), и в особенности (б), растворялись в воде или в буферном растворе перед добавлением их в реак. ционную смесь.

Способ согласно изобретению осуществляют предпочтительно при температурах, не превышающих 50 С, в частности при 10 — 50 С, хотя можно проводить, процесс и при более низких температурах. Время реакции зависит от таких факторов, 25

4S

Я как тип иммуноглобулина, концентрация реаген. тов, температура реакции и наличие денатурирующих агентов, таких как мочевина и т.д. Величина рН реакционной смеси может колебаться в пределах от 3,5 до 10, предпочтительно от 6 до 9. Порядок прибавления реагентов в реакционную систему несущественен. После реакции смесь подвергают последовательному диализу против води и подходящего буферного раствора, например 0,01 М фосфатного буфера (рН 7,4) и 2,5% глицина. Кроме того, новые производные иммуноглобулина согласно настоящему изобретению могут быть разделены на Н-цепи и L-цепи с помощью колоночной хроматографии, например с помощью колонки с Сефа. дексом g-75 в 1 М растворе пропионовой кислоты.

Применяемые в способе в качестве исходных с веществ препараты являются продажными продуктами или могут быть получены известными из литературы способами.

Целевые продукты выделяют из реакционной среды известными методами, П р н м е р 1. Соотношения условий реакции с числом расщепленных дисульфидных связей.

Условие 1.

К 51 мг человеческого, иммуноглобулина Й, Збмг Na>S0>, меченного 35S, и 22 мг Na>S40q прибавляют водный раствор О,l М трис . HCI (рН

8,2), чтобы довести обмм образца до 5 мл, который нагревают до 45 С, и реакцию проводят при указанной температуре. Немедленно после начала реакции, а затем через 30 мин, 1 ч, 2 ч, 4 ч, 7, 4 ч, н ! 0

24ч от началареакцинпроиэводят отбор по 0,5 мл смеси. Каждый из образцов смешивают с 10мл

50 o.íoão насыщенного раствора сульфата аммония при 0 С, выдерживают в течение 15 мин при 0 С.

Осадок отделяют центрифугированием. После промывания дополнительным количеством 50%-ного насыщенного раствора сульфата аммония была измерена радиоактивность осадка с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика и на основании полученного результата было .вычислено число

-S -80з Н-групп, содержащихся в осадке.

Условие 2.

Реакцию начинают как описано в условии 1, но беэ отбора проб по мере протекания реакции. Через

4 ч or начала реакции к реакционной смеси прибавляют водный 10М раствор мочевины, чтобы довести концентрацию мочевины в системе до 4М.

Спустя 5 и 6 ч после начала реакции (r.e. через 1

ы 2 ч после прибавления мочевины) отбирают по

0,5 мл реакционной смеси и обрабатывают подобно пробам в условии!, Условие 3.

Повторяют реакцию и обработку проб по уа о-. вию 1, но реакцию проводят при температуре 0 С.

Условие 4.

Повторяют реакцию и обработку проб по условию 1, но реакцию проводят при температуре 25 С.

578892

Условие 5.

Повторяют реакцию и обработку проб по условию 1, но йа, S40g 2Н, О не используют.

Результаты реакций при вышеупомянутых условиях 1,2,3,4и 5 представлены в табл. l.

Число расщепленных дисульфидных связей соотве гствует половине числа — S— - SOa Н- групп.

Иэ результатов, представленных в табл. 1, можно сделать следующий вывод. Если предлагаемый способ осуществляется в присутствии тетратионата и сульфита натрия при 45 С при условии 1, то через

0,5 ч расщепляются приблизительно 3 дисульфидных связи. Число расщепленных связей достигает в среднем примерно 4,5 в ходе реакции от 1 до 7 ч и примерно 5,2через 24ч от начала реакции. Если реакцию проводят при условии 4, то число расщепленных дисульфидных связей уменьшается и дости. гает в среднем примерно 4,3 после 24 ч реакщии.

Если реакцию проводят при условии 3, то среднее число расщепленных дисульфидных связей еще более уменьшается. В отсутствие тетратионата натрия (условие 5) расщепление дисульфидных связей не ускоряется.

Если в реакционную смесь добавляют мочевину (условие 2), то среднее число расщепленных дисульфидиых связей после прибавления мочевины быстро увеличивается.

Пример 2. Сравнение качества и физических свойств препаратов при использовании в качестве окислителя Nag S40s или Со

Условие 1.

К 2,0 г вышеуказанного человеческого иммуноглобулина О, 1 42 r 1ча $0з и 086 r йа2840 2Н О прибавляют водный 0,1 М раствор

° трис-HCI (рН 8,2), чтобы довестн объем смеси до

200 мл. Реакцию проводят при температуре 45 С, Немедленно после начала реакции н далее через

30 мии, 1 ч, 2 ч и 4 ч отбирают каждый раз по 15 мл реакционной смеси..бпсле пятого отбора пробы немедленно к остатку вкакционной смеси прибавляют 10М раствор мочевины, чтобы довести концентрацию мочевнны в смеси до 4 М, и продолжают проведение реакции.

Через 5 и 6 ч после начала реакции. (т.е. через 1 и 2 ч после прибавления мочевины) отбирают по

22,5 мл реакционной смеси, к пробам прибавляют

22,5 мл охлажденного льдом насыщенного раствора сульфата аммония, после чего выдерживают в течение 30 мин при 0 С. Осадок отделяют центрифугированием, промывают 50%.ным раствором сульфата аммония и подвергают диализу в течение 24 ч против буферного солевого раствора прн рН 7,4.

После диалиэа каждого из образцов отбирают тре. буемое для проведения анализа количество, разбавляют буферным солевым раствором при рН 7,4, содержащим 2,5% глицина, а затем анализируют.

Условие 2.

Повторяют реакцию и обработку проб по уело. вию1, эа исключением того, что Май S Oa ° 2НаО заменяют нв 50 мг CuSO ° 5НэО н реакцию завер. шают к концу четвертого часа. Полученные таким образом растворы проиэво)шых иммунопнЖу.шн» подвергают следующим испытаниям и измерсцинм.

a) Сопоставление времени реак1ши и числа -S— SOq H групп.

Число — S — SO3 Н-групп в образцах, окислснных тетратионатом Na, S40, 2Н10), представлено на фиг. 1, совместно с подобными данными, полученными при условиях! и 2 примера J. Данные дня образцов, которые были подвергнуты реакции и обработаны при идентичных условиях 1 примера 1, но при замене Na, S406 ° 2Н20 на 50 мг CuS04>

° 5H O, также представлены на фиг. 1.

6) Сопоставление времени реакции и антикомплементной активности по вышеуказанному методу, приведены на фиг. 2.

На фиг. 2 представлены также ан гикомплементные активности образцов, окисленных ионами

СФ по условию 2, Иэ фиг. 2 можно заключи гл, что антикомплементные активности всех образцов уменьшены приблизительно до 30% после 30 мин or начала реакции. в) Сопоставление времени реакции и титра противодифтерийной композиции.

Образец, использованный выше в пункте (б), был подвергнут трехкратному анализу лпя определения его титра против дифтерии,с помощью указанного выше метода, Усредненные значения представлены на фиг. 3, Иэ графика можно сделать заключение, что образцы, окисленные ионами Cu

1щ показывают титр не более, чем 0,3 м.е. уже посл

30 мин от начала реакции.. г) Сопоставление времени реакции и величины оптического вращения.

На фиг. 4 представлены результаты измерения

35 оптической активности тех же образцов, которые быть использованы выше в пункте (6) для иэмере ° ния антикомплементнои активности (концентрация белка 2,5%) . Иэ представленных результатов можно сделать заключение, что присутствие иона двува.

4О лентной меди в реакционной смеси вызывает постеленную денатурацию по мере протекания реакции и что присутствие мочевины содействует денатурацни, о чем свидетельствует заметное изменение оптической активности.

В данном случае оптическое вращение измерено при 25 С в 1 см кювете. д) Сопоставление времени реакции и мутности после термообработки, Те же образцы, которые использованы для

5о измерения антикомплементной активности в пункте (6), были подвергнуты термообработке на воздухе в течение 4 ч при 50 С, при концентрации

2,5%, Результаты представлены на фиг. 5. Как видно мэ фиг. 5, присутствие даже очень незначительного количества ионов двувалентной меди вызывает ухудшение термостабильности и содействует тен. денции к агрегации. е) Сопоставление времени реакции и содержа ния меди. ьО На фиг. б представлены результаты определения содержания ионов двувалентной,меди с помошн

578892 >0

4Q

60 атомно-здсорбционно>о анализа в тех же образцах, которые были использованы в пункте (б) для измерения антикомплементной активности. Из приведенных результатов можнЬ сделать заключение, что когда применяют ионы двувалентной меди, то промьваиие. и диализ образца не приводят к удалению ионов двувалентной меди, ж) Разделение Н-цепей и L-цепей.

Тот >,е самый образец вместе с образцом, отобранным после двухчасовой реакции в условии 1 примера 2, подвергают диализу в течение 24 ч против 1 н. раствора пропионовой кислоты, содержащего 6 М мочевину, и подвергают колоночной хроматографии (Сефадекс G 200, колонка диаметром 1,5 см и длиной 80см), уравновешенной указанным вьш>е водным раствором. Результаты представлены на фиг. 7, Первый пик слева одной н той же кривой соответствует Н2 L2-целям, которые не подверглись разделению, второй пик соответствует Н-цепям, а третий пик — L-öåïÿì. Диаграмма элюции свидетельствует о том, что образец может быть разделен на Н.цепи и L-цепи.

Резюмируя результаты > представленные на фиг. I — 7, можно сделать следующие выводь .

I) Из результатов опьпа по условию 1 в примере 1 следует, что, когда предлагаемый способ осуществляют в присутствии тетратионат- и сульфит-ионов, то при любой продолжительности времени реакции в пределах or 1 до 4 ч среднее число расщепленных дисульфидных связей составляет примерно 4, 5, а образующиеся атомы среды подвергаются S сульфонированию (среднее число S-cym°, фонатных групп составляет примерно 9) с образованием S-сульфонированного иммуноглобулина (фиг. 1), который можно разделить на Н-цепи и

1-цепи с помощью, например, хроматографии на колонке с Сефадексом 6 200 (фиг. 7) . Такое производное имеет, в основном, одинаковую с нативным иммуноглобулином оптическую активность (фнг, 4).

Из вышеприведенных результатов можно с уверенностью предположить, что новое производное иммуиоглобулина образуется главным образом путем расщепления только межцепочечных дисульфидных связей нативного иммуноглобулина с последующим S-сульфонированием образующихся тиольных групп, учитывая тот факт, что число межцепочечных дисульфидных связей в нативном иммуноглобулине составляет в среднем 4,5.

Такое производное нммуноглозулина имеет антикомплементную активность, пониженную приблизительно до 10% tto сравнению с нативным иммуио. глобулином (фиг. 2), но проявляет титр против дифтерии не меньший, чем нативный иммуноглобулин, как это следует иэ приблизительно равной антиген-связывающей активности. lb показано на фиг. 3, при концентрации 10 вес.% производное иммуноглобулина сохраняет по крайней мере

l,0 м.а./мл антиген. связьвающей активности.

2) Те S-сульфони1>о»а»»ые лроизво)шые иммуноглобулина, которые образуя>тся расщеплением менее или более, чем 4,5 дисульфидных связей нативного иммуноглобулина, имеют до некоторой степени меньшее понижение их антикомплементарной активности и имеют худшую антиген-связывающую активность ло сравнению с таковыми предпочтительного производного иммун<>глобулина, описанного выше в пункте (1) (фиг. 2 и 3) .

3) Если тетратионат ион в качестве окислителя заменяется на ион двувалентной меди, то получающиеся производные иммуноглобулина содержат ионы двувалентной меди, концентрация которых имеет тенденцию к увеличению по мере увеличения времени реакции (фиг. 6). Кроме того, с увеличением времени реакции увеличивается число расщеп.ленных дисульфидных связей нативного иммуноглобулина (фиг. 1) и поэтому трудно получить целевое стабильное производное иммуноглобулина с количеством расщепленных дисульфидных связей равных приблизительно 4,5.

Кроме того, производные иммуноглобулина, полученные с использованием ионов двувалентной меди, имеют пониженную антикомплементарную активность (фиг. 2), но одновременно заметно уменьшается их противодифтерийный титр по сравнению с титром нативного иммуноглобулина. Таким образом, сильно уменьшается нх антиген-связьвающая активность .(фиг. 3). С другой стороны, такие производные иммуноглобулина проявляют отличную от нативного иммуноглобулина оптическую активность, что свидетельствует о наличии о структурных изменений белка.

4) Подобные изменения оптического вращения наблюдаются также у производных иммуноглобулина, полученных согласно предлагаемому способу, когда в ходе проведения реакции в реакционную смесь добавляют мочевину. llo этой причине рекомендуется, чтобы в реакционной среде отсутствовали мочевина, гуанидин и подобные им соединения.

Пример 3, Селективное расщепление межцепочных дисульфидных связей.

2 мл водного раствора, содержащего 20мг человеческого иммуноглобулина 1,80 мг S

-Naj SOg (8,22 10 имп/мин на 1 моль) и 40 мг йа,$406 ° 2Н О, доводят до рН 7,2 с помощью уксусной кислоты и проводят реакцию при 39 С в течение 2ч. Далее реакционную смесь подвергают диализу против 5л воды в течение 24ч. Затем медленно прибавляют в систему мочевину и пропионовую кислоту до конечной концентрации 4 М и

=t н. соответственно. Отбирают для хроматографического разделения 0,1 мл раствора. Диаграмма злюции представлена на фиг. 8. Остаток реакционной смеси подвергают хроматографии, используя колонку с Сефадексом 6 200 (диаметром 1,5 см и длиной 100см), уравновешенной l н раствором пропионовой кислоты, содержащим 4 M.мочевияы.

Радиоактивность образцов определена c помощью жидкого сцинтилляционного счетчика л иэ.

578892

10 мерением оптической плотности при 280 нм (ODa a o) каждой фракции. Результаты представлены на фиг. 8.

Пример 4. Фракционирование тяжелых и легких цепей.

К водному раствору, содержащему 100 мг человеческого у-глобулина g, прибавляют 0,4 г Na> SOa н 0,2 г Naq $40< ° 2Н О и рН системы доводят до

9,0 с помощью l и ЯС1, после чего подвергают реакции при комнатной температуре в течение 48 ч.

После реакции незначительное количество нерастворимого вещества, образующегося s системе, удаляют центрнфугнрованием. Затеи реакционную смесь подвергают диализу против 2,5 л воды при

5 С в течение 15 ч и далее против 2,5 л водного раствора 1 н. пропионовой кислоты при 5 С в течение 28 ч. Диализат подвергают хроматографии, используя колонку с Сефадексом G ?5 (диаметром

3,5 см н длиной 111 см), уравновешенной 1 н. раствором пролионовой кислоты. Диаграмма элюции представлена на фиг. 9. На кривой наблюдается трн пика, которые, как подтверждается порядком уьеличивающегося молекулярного веса; соответствуют нерасфракционированиому $- сульфонированному иммуноглобулину, S- сульфонированныи Н- цепям и

S-сульфонированным 1=цепям. Идентификацию осуществляют иммунологическими методами, такими, как метод Оухтерлони и иммуно-электрофорез, а.также химическими методами, такими как аминокислотный анализ, определение содержания гекоэы и т.д.

Из результатов, предстаьленных на фиг,8 и 9. можно сделать следующие выводы. ! ) Так как первый пик на фиг. 9 соответствует нерасфракционированному S-сульфоиированному иммуноглобулину, второй пик соответствует

S-сульфонированным Н-цепям, а третий пнк — S.сульфонированным 1=цепям, согласно иммунологическим и химическим методам анализа, то логично сделать вывод, что подобным образом три пика на фиг. 8 (слева направо) могут быть отнесены к нерасфракционированному S-сульфонированному нммуноглобулину, S-сульфоннрованным Н-цепям и

S-сульфонированным 1=цепям соответственно.

Различия между хроматограммами обусловлены присутствием мочевины в системе первого исследованного образца.

2) Из количества белка в 1:цепях, образующих третий .пик (фиг. 8), вычислена малярная концентрация, а иэ моляр1гьй концентрации и величин радиоактивности найдено, что 1=цепи, образующие третий пик содержит 0 8 803 Н группу Таким же образом было вычислено число 8-$0э Н групп в Н-цепях второго пика, которое составлкпь 3, 4. В нерасфракциьннроваиньм S-сульфонированном иммуньглобулинв их число равно 8,8, а в смеси до фракцноннрован я па хуоматографической колонке — 8,6. Н-цепь и 1:цепь связаны одной дисульфидпой связью, тогда как между двумя Н-цепяме суйэаствует в среднем 2,5 днсульфндных связей.

Следовательно, человеческий иммуноглобулин содержит в среднем 4,5 дисульфидных связей (межцепочечных).

3) Согласно хроматограмме представленной на фиг. 8 большая часть $-сульфонированного иммуноглобулина, содержащего в среднем 8,6 $-SO H I групп, разделяются на Н-цепи и 1.-цепи. Поэтому можно предположить, что расщеплению подвергаются в основном межцепочечные дисульфидные связи, тогда как внутрицепочечные цисульфидные связи остаются, в основном, неизменными.

Пример 5. 133 мл человеческого у-глобули- .

Hà J. растворяют в 1667 мл фосфатного буфера (рН

8,2), содержащего 2,5% глицина. К раствору прибавляют 7,0 г Na> $0з, растворенного в 100 мл того же буфера, и 4,4г Na, $ 0 ° 2H O, растворенного в 100 мл того же буфера, и проводят реакцию при

45 С в течение 3 ч. Реакционную смесь подвергают диализу в течение 6 ч против 20 л буферного соле2е вого раствора, состоящего из натриевой соли, ис. пользуя химический стакан фирмы Dow Chemicals и ультрафильтр типа в/HF V — 1. Добавляемую извне жидкость для диализа заменяют через каждые 2 ч.

Диализат концентрируют до объема 180 мл с по25 мощью того же фильтра и затем к диализату прибавляют 50 r глицина.

Раствор отфильтровывают в стерильных условиях через мембрану с диаметром пор 0,25 мк, сливают в бутылочки объемом 10мл по 5мл в

М каждую и лиофилизуют, Ангикомплементная ак. тивность CH,О стерильного раствора при 50 o.íîé концентрации составляет 4,3%. о

Пример 6. Сравнение активности антител по отношению к антигенам в опытах с использованием ээ Naq $ 0 или Си> в качестве окислителя.

Условие 1, К 67 мл человеческого у-глобулина 7,1 r йа $0з и 0,43 г Naq $40 ° 2Н О прибавляют 0,1 М трис-HCl буферный раствор содержащий 2,5% гли4Ь цика, чтобы довести общий объем смеси до 1,0л.

После трехчасовой реакции при 45 С реакционную жидкость подвергают диализу, используя химический стакан фирмы Dow Chemical и ультрафнльтр типа в(НРЧ вЂ” 1, и диализат концентрируют до

45 объема 200 мл, отфильтровывают в стерильных условиях через 0,25 мк -фильтр Seltz, лиофилнзуют, добавляют 2,5 г глицина и разбавляют водой до 5,0% ного раствора.

Условие 2..

Повторяют реакцию н обработку пь условию 1, .нь изменяют температуру (25 С) и время реакции (24«).

Условие 3.

Повторяют реакцию и ьбработку пь условию.1, иЬ Иаг$40а ° 2НэО заменяют па 0,16r Си80а

«5Яа О.

Растворы производных иммуньглобулина, пь. лученные 1то условиям1-3, были испытаны на проявление ими антнтельной активности к раэличбб

i ным антигенам. Результаты представлены в табл. 2

578892

Из данных, представленных в таблице 2, можно сделать следующие выводы:

1) Если используют тетратионат (условие 1), то дифтерийный титр S-сульфонированного иммуноглобулина эквивалентен титру нативиого нммуноглобулина, но если используют ион двувалентной меди (условие 3), то производное иммуноглобулина почти не проявляет активности.

2j Ошосительно титра кори S-сульфонированный иммуноглобулин, который был окислен тетратнонатом (условия 1 и 2), сохраняет более чем 60% титра нативного иммуноглобулина. Производное иммуноглобулина, окисленное ионом двухвалеитifoA меди (условие 3), имеет значительно более низкую активность (менее чем 30%) . Из этих данных следует, что понижение антнтельной активности при использовании иона двухвалентной меди более значительно, чем при использовании тетратноната.

Пример 7. Испытание S -сульфонированного глобулина в животном организме MB антикомпле. ментарную активность.

Человеческий S -сульфонированный иммуно. глобулин получают также, как и в условии 1 примера 6.

3 мл 5%-ного буферного солевого раствора, содержащего 2,5% глицина (рН 7,4), 3 мл буферного солевого раствора без добавок (для контроля) н

l мл 15%-ного необработанного человеческого иммуноглобулина 1 в буферном солевом растворе, содержащем 2,5% глицнна, также для контроля, Вводят внутривенно самкам морских свинок с живым весом 200 — 300r и реакцию организма на

Ф, уровень сывороточного комплемента определяют с помощью сывороток по 1,0мл каждая, извлеченных пункцией сердца при определенных интервалах.

Результаты представлены на фиг. 10, откуда следует, что наблюдается резкое понижение уровня сывороточного комплемента после внутрнвенной инъекции необработанного человеческого иммуноглобулина, которое отсутствует при подобном введении человеческого S -сульфонированного иммуноглобулнна. У морских свинок после инъекции необработанного иммуноглобулина время от времени наблюдается также дпожь, которая отсутствует у животных, которым вводили внутривенно

S - сульфони ров анный иммуноглобулин.

Пример 8. Стойкость кроличьего 8-сульфойнрованного иммуноглобулина в живом организме н повторное образование дисульфидных, связей. а) Получение кроличьего анти БСА-ДНФ антитеЛа:

Бычий сывороточный альбумин (БСА) реагирует с динитрофторфенолом с образованием соединения, которое в дальнейшем будет обозначаться сокращенно SCA — ДНФ. БСА-ДНФ вводят кроликам (вид новозеландский белый, 4 ) через их подушечки на лапке ног вместе с полным стимуля. тором Фрейнда. На 30-1 день после иньекции отбирают кровь у кроликов иэ коронарной артерии.

Полученную антисыворотку обрабатывают по известному способу путем осаждения 45%-иым раствором сульфата аммония и получают кроличий анти

БСА-ДНФ и ммуноглобулин. б) Получение образцов:

Условие 1.

Анти БСА — ДНФ иммуноглобулии гидролизуют о при 37 С в течение 24ч вместес 1 вес.%пепсинапо отношению к иммуноглобулину. Гидролиэат годвергают хроматографии на колонке с Сефадексом

G 150 и получают остаток 0 (ас ) q.

Условие 2.

250 мг анти БСА — ДНФ иммуноглобулина, 180 мг Na> SO3 и 79 мг Na>S40< ° 2НгО растворе ряют в 25 мл 0,1 М трис — HCI содержащего 2,5% глицина (pH 8,2), н проводят реакцию при 37 С в течение 4 ч. Реакционную смесь подвергают диазщзу в течение 24 ч против буферного солевого раствора (рН 7,4). э5 Получают кроличий S -сульфонированный иммуноглобулин.

Условие 3.

БСА — ДНФ иммуноглобулин используют. без дальнейшей обработки.

Э6 в) Определение скорости удаления и стойкости.

Вышеуказанные образцы приготовлены (каждый в отдельности) в виде растворов 5 o-ной концентрациии.

Испытуемые растворы вводят внутривенно

35 кроликам (вид новозеландский белый, h, образец 1 вводят трем кроликам, образец 2 — трем кроликам и "образец 3 - двум кроликам) дозой примерно 3 мл. У испытуемых животных при заранее определенных интервалах отбирают кровь и

40 извлекают из нее плазму. Анти БСА — ДНФ активность в плазме определяют реакцией пассивной гемагглютинации, при которой БСА-ДНФ фиксируется на овечьих красных кровяных клетках, с помощью глутарового альдегида и применяют ме45 тод микротнтра. Результаты представлены на фиг, 11, откуда следует, что скорость удаления иэ организма фрагментов 0 (ас ) 2 весьма высока, (через указанные в табл.3 интервалы извлекают по

0,5 мл плазмы). Радиоактивносп плазмы опреде;

50 ляют с помощью жидкостного сцинтилляционного анализа. Результаты представлены в табл. 3.

На основании полученных результатов можно предположить, что -S-$0з Н группы в S -сульфо55 нироваппом иммуноглобулине расщепляются в крови.

578892

1абяцц I

В мя акции, ч

Условие

4 5 сло Разуюцгнхся — -SO3 групп

10.4

8.9

9,0 8,9 9,4

6,1 о

10 9 l 3,3

3,4

2,9

2,5 о

l,6

7,0

4,5

4,1

5,0

4,5

0,8

0,8 о,5 о

Табпица2

Антиген

Условие реакции

Свинка (относит.) Дифтерия (единицы/мл) Краснуха (опюснт.) Корь

0,8

Вез изменения

171

6,7

1(Маг $40ф|

45 С, 3 ч).

0,8

}70

5,0

2(йаг Si Oc

25 С, 24 ч2

<0,1,$(Cu г,45 С,З ч) (2

Таблица 3

Через 15 мин — Эч

-36

7 -"34

24 — "—

9,5!

Я

0 н юе ФЪ

2,2

0,7

Формула изобретении

1. Способ тюлучення производных иммуногло. булина, отличавгщийся тем,чтосцелывполучеиия продукта, ие содержащего лонов двухвалентной меди, нативный иммутюглобулии вводит во взаимодействие в вощюй среде одновременно илн последовательно в любом порядке с соединением, способным даватв тетратианатиые итапа (а), и соединением, способным давать сульфит-ионы (б), дил расщепления 3-4,5 междапочечных или 3-5 меж- и внутрнгтепочечных дисульфидных связей

5 - иммуноглобулнна и сульфоннрования образующих. ся тнолвных групп, причем ионы тетратионата и сульфитв присутствуют в реакционной среде в молыюм количестве, тю крайней мере в лва раза превышающем количество днсульфлдных связей. которые должны быть подвергнуты расщеплению.

578892

ЯЯ08 нва/юаа .Га.

Фи а.2

2. Сйособ по и. 1, î r л ы ч а ю щ ы и с я тем, что в качестве соединений (а) применяют тетратионовую ккслоту ыли тетратионат натрия, калия ылы аммааи, а в качестве соедыыеыия (6) — сернистую кислоту, сулафыт ыатрыя, сульфит калии илн бы-. е сульфнт натрия.

3. Способ по пп. 1 и 2„o r л и ч а ю щ н и с я тем,. что соединения (а) и (6) перед щоведением реекМнмыконлламвнтнавамюиВноетв

ВОО () циы с ыммунотлобулнном растворяют в воде или в буферном растворе.

4. Способ по пи. 1-3, отл н чаю щи и ся тем, что температуру во время реакции поддер кивают и пределах 10-50 С.

5. Способ по пп. 1-4, o r я и ч а ю шийся rex, что рН во время реакции ицщерживают в пределах

3,5-10.