Способ получения биомассы
ОП ИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕН Ия
К llATEHTV
Союз Советских
Социалистических
Республик (11) 57 8901 (б1) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 15.02.73 (21) 1886507/13 (23} Приоритет — (32} 16. 02. 72 (51) М. Кл.
С 12 Ъ 13/06
Гасударственный камнтет
Саветв Мннистрав СССР на делам нзааретеннй н аткрнтнй (33) Великобритания (31) 7074/72 (53) УДК
637.127.3 (088.8) (43) Опубликовано 30.1(177. Бюллетень №40 (45) Дата опубликования описания 15,11.77 (72) Авторы изобретения
Иностранцы
Патрик Гоулд (Великобритания)>
Фрэнсиз Моран (Ирландия) и Филип Альберт Майерс (Великобритания) 1
l
Иностранная фирма
3 ДЗЕ Бритиш Петролеум Компани Лимитед (В ели кобрит ани я ) (7I) Заявитель (54 ) СПОСОБ ПОЛуЧБНИ Я EHOMACCbl
Изобретение относится к микробиологической промышленности.
Наиболее близким к описываемому изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ получения биомассы, заключающийся в непрерывном культивировании метанутилизирующих микроорганизмов в жидкой питательной среде, содержащей ассимилируемые источники азота и минеральные соли, в присутствии метановоздушной смеси. При этом связанный азот находится в жидкой питательной среде в виде аммонийных или нитратных солей (11 .
Недостатком известного способа является использование связанного азота в избыточном количестве, превышающем колиЧество, необходимое для .потребления микроорганизмов, что токсично для микроорганизмов, утилизирующих азот и метан.
Цель изобретения — частичная замена связанного азота в форме аммонийных или нитратных солей молекулярным азотом атмосферы или полное исключение иэ среды связанного азота.
Для этого по предлагаемому способу в качестве метанутилиэирующих микро" организмов используют мнкроорганизмее2 из рода Mehhgkococcus, обладающие способностью фиксировать атмосферный азот, в жидкой питательной среде, при этом количество связанного азота в пи5 тательной среде регулируют таким образом,чтобы его уровень в среде в процессе выращивания был меньше того количества, которое содержится в:готовой биомассе.
10 из рода Ме&цГососст>в нспольэуют вид сорьаЕо1из
Биомассу по предлагаемому способу получают путем непрерывного выращивания культуры микроорганизмов нэ рода
15 Ме(йфососсиз вида соры8оМь, утилизирующих метан и атмосферный азот в жидкой питательной среде.
Питательная среда содержнт мннераль20 ные соли, источник связанного азота в форме аммонийных илн ннтратных солей, кроме:тбго> в нее подают катано-воэдущнуя;айат ..При этом связанный. азот может, быть :цолностью исключен нэ сос25 тана: питательной среды нлн его количество должно составлять 95-99% от количества азота, содержащегося в гото.вой биомассе.
Метано-воздушная смесь содержит, 30 об.Ът метан 10-50 (предпочтнтельно 12".-- >8901
-25); ки л рв>д 10, 5 -1 8, 9 (1>рецпо:тительно 16-=) 7); азот -..0-72: та смес.-: M .., IIBT QLITb Обогащена чисTED@ Ii >III но1>о > Yai i . В li < 1е1" 1в e Il ст Q Культивирование мик1>оорганизм >в и .>онодят lip!i понышенно» давлении, и пример, при 3-4 атм, рП пи атс.льной среды поддерживают 4t5 8>0, Гlредп Зч"и тельно 5.5-7,0, для чего используют щелочь, на>. ример, едкий 1!a Тр. Температура среды н процессе выращивания находится н пред -лах от 20 д:> 60 С преимущестненно от 35 до 50ОC. 16 Оптимальные условия выращивания обеспечинаются при рН 6,5 и температуре 45 С. Удельные скорости разбавления составляют от 0,1 до 0,35 ч - при выходе биомассы ст О, 1 до 10 г/л. Согласно изобретению биомасса мо.>кет быть получена в дне стадии. В первой стадии (стадия подготовки культуры) выращивают микроорганизмы, утилизирующие молекулярный aýñ>T и ме- @ тан, н жидкой Нтательйой среде, содержащей минеральные соли,.в присутствии источника связанного азота, аммонийных или нитратных солей метана н качестве источника углерода и газа, 30 содержащего свободный кислород. При этом концентрация клеток микроорганизмов составляет от i до 30 г/л. На второй стадии приготонленную культуру непрерывно выращивают в жид- 35 кой питательной среде, содержащей минеральные соли, источник связанного азота, н присутствии метана и газа, содержащего свободный кислород и молекулярный азот. Количество связанно-,щ I о азота должно быть меньше того количества, которое- содержится в готовой биомассе. Связанный азот может быть вообще исключен из состава питательной среды, В стадии подготовки выращивание микроорганизмов можно осуществлять как периодически, так и непрерывно. При непрерывной работе удельная скорость разбавления должна быть значительно меньше, чем максимальная удельная скорость роста микроорганизмов, а концентрация св.яэанного азота — несколько больше: требуюЩейся для обеспе- чения потребления азота мйкроорганизмами — от;.2 до,1.00 Мг/л Исходной культурой для инокулирования в стадии подготовки может быть культура микроорганизма, утилизирующего азот и метан например культуt Ю ра на косом срезе arapa. Ферментатор можно также инокулировать пробами веществ, содержащих микроорганизмы, например почвы или грязи. Если в качестве инокулятора используют пробы вещества, содер>кащего мик- 6ф роорганизмы, то подготовку культуры ведут в две стадии, на первой из которы < из вещества выделяют микроорганизмы, утилизирующие молекулярный азот и метан, а на второй — увеличиBaIoT концентрацию клеток указанных микроорганизмов до концентрации, необходимой в продукционной стадии. Лучший источник азота н этой стадии— нитрат или аммиак. Пробы вещества, содержащего микроорганизмы, можно добавлять в непрерывно действу>ащую обогатительную систему. Предпочтительным является обогащение н. непрерыннодействующем ферментаторе., содержащем любую вышеописанную жидкую.пйтательную среду с источником азота a ниде нитратных солей, при условиях, -сйбсоф@твующих размножению утилиэирующих молекулярный азот и метан микроорганизмов. . Скорость разбавления должна быть значительно ниже ожидаемой максимальной скорости роста микроорганизмов. Оптимальная рабочая температура более 40 >С, скорость разбавления О, 65-0,15 ч. Пример. I. Стадия подготовки культуры. 500 мл шлама, содержащего метан грязи из отстойника, добавляют с интервалами в течение 5 дней в аэрируемый ферментатор с 5 л жидкой питательной среды следующего состава, мг/л: КН,РО„ 1600 М НРО>,-12Н О 2928 Ма МО 1180 VERSO, 7Н,О 80 РеЬО>, 7Н О 14 СО(1 10 ) > 11 Нг0 25 CuSOI, 5Н,О 4 ZnS0I, 7Н О 0,34 /йпЯ) Н О 0,30 йа М О>, 2НрО 0,24 Дистиллйронанной водой доводят о объем до 1 л. Температура 45 С, скорость разбавления 0,084 ч, скорость мешалки ферментатора 1000 об/мин, рН 6,75 создают добавлением 0,5 н. раствора едкого натра. В ферментатор подают со скоростью 20 об/ч газовую смесь, состоящую иэ 33 об.% метана, 64 об.% воздуха и 3 об.% двуокиси углерода. Через 7 дней работы при указанных условиях концентрация клеток бактериальной популяции достигает 1,0 г сухого веса на 1 л. Из этой популяции выделяют один штамм бактерий, утилизирующих молекулярный азот и метан; присутствуют в ней и другие типы бактерий, не утилизирующих метан. Соотношение клеток бактерий, утилизирующих метан и молекулярный азот, и клеток бактерий другого типа составляет 90-95% (по количеству) . Бактерии, утилиэирующие метан и азот, представляют собой капсулооб578901 288 F000 64,000 158,000 204,000 286,000 240,000 219,000 О, 330 2,040 О, 330 63, 700 286s000 157,700 разные кокки с диаметром 1, 1-1, 4 мкм, неспособные утилизировать глюкозу. На твердой среде, приготонленной путем добавления 1 нес./об. агара к ферментационной среде, после инкубиронания и течение 10 дней при 45 С н атмосфере метан-воздух (50/50 по объему) колонии имеют следующую морфологию .. Диаметр 1 мм, белые, гладкие, округленные. По этим характеристикам они сходны c hhethgtococcuc сорвино us, но н отличие от них они утилиэируют молекулярный азот (как источник азота), метанол и не образуют цист или остаточных стадий. Стадия развития культуры. Бактерии, утилизирующие азот и метан, полученные в фазе выделения, выращивают при 45 С Н 5,0 л питательной среды следующего состава, мг/л: КН|РО 937, 5 М,НРО„ 2Н,О 787, 5 М ЬОр 7 Н 0 562,5 Н 5О 706,0 СаСРр (безводный) 112,5 Ре5О, Н,о 42,7 йа 50ц(безводный) 225,0 Cu50q 5Н О 20,5 A Nci gMgOi, 2 Н О Мпбо НО 1,7 соС02 бН О 0,5 Вода До1л Скорость разбавления О, 18, скорость перемешинания 3000 об/мин-. Культивирование осуществляют при подаче метано-воздушной смеСи, содержащей 18,2 об.% метана и 18,:6 об.% воздуха. рН 6,5 поддерживают при помощи NaOH и регулируют добавлением Подача азота в виде аммиака, мг/л ч Выделено азота в виде протеина, мг/л ч Потери азота в ферментаторе в вице аммиака в отработанной среде, из расчета наличия 2 мг/л ионов аммония, мг/л.ч Чистое поглощение микроорганизмами азота, подаваемого в ферментатор в виде аммиака, мг/л ч 1,0%-ного раствора МоОН. Азот s ниле 1,1 н. гидроокиси аммония подают в ферментатор при постепенно возрастающей скорости для поддержания концентрации клеток 13 г ""óõñãî вас- на 1 л. Избыток концентрации ионов авиона- н питательной среде определяют нэне:.:— ным колориметрическим способом н, робах го 10 мл бульона через каждые 5 мин. Избыток ионов аммония в ср".де поддерживают на уровне 5-10 мг/л р=-..-. гулированием скорости подачи гидр эс киси аммония н ферментатор. После достижения концентрации клеток 13,7 г с,— хого веса на 1 л культивированн=. пго" 15 должают еще 24 ч. На этом этапе скорость подачи гидроокиси аммония н ",ерментатор поддерживается постоянной. Скорость працуцирования бактерк;льных клеток составляет 13,7i0,18 г (cvхсй вес) на. 1 л в 1 ч. Выход no i;=-..ãàну, т.е. вес клеток, продуциронанн- х на единицу веса метана, подаваемог.-. н ферментатор, составляет 0,63. Выход по кислороду — 0,23. 25 л . Стадия получения готîâ го продукта. Подачу в ферментатор гидрсокнси аммония снижают в три стадии: на 30%, на 65%, на 100%. Во всех случаях ферментация восстанавливается чеЗ0 реэ несколько часов при более низкой концентрации клеток и необнаружннаемой низкой концентрации ионов аммония в среде. В таблице приведены данные, полу35 ченные при установившейся непрерывкой работе на каждой стадии при избытке иона аьмония в среде (5-16 мг/л), а также данные контрольного опыта (получение бисмасс по известному спосо40 бу) ° 578901 Продолжение табл. Способ получения биомассы Показатель, единица измерения предлагаемый по стадиям известный Удельная скорость разбавления, ч О, 174 10,840 О, 179 9,910 О, 180 13,760 0,176 11,760 Концентрация клеток, г/л Продуцирование клеток, г/л.ч 2,470 1, 770 1, 890 2,070 Концентрация ионов аммония в бульоне, мг/л 12,000 Прибор с пределом чувствительности 2 мг/л не обнаруживает ионов аммония Суммарное содержание азота в клетках,Ъ на сухое вещество 11,600 11,500 ll 600 11,600 Содержание готовой биомассы в клетках,В на сухое вещество (количество азота, помноженное на 6,25) 71,900 72,500 72,500 72,500 Формула изобретения Составитель В.Матвеева Техред . 3. Фанта Корректор И. Гоксич Редактор Н.Хубларова Эаказ 3838/709 Тираж 541 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 1. Способ получения биомассы путем непрерывного культивирования метанутилизирующих микроорганизмов в жидкой питательной среде, содержащей ассимилируемые источники азота и минеральные соли, при подаче метано-воздушной смеси, отличающийся тем, что, с целью частичной заменй связанного азота в форме аммонийных или нитратных солей мрлекулярным азотом атмосФеры или полного исключения из среды связанного азота, в качестве 45 метанутнлнзирующих микроорганизмов используют микроорганизмы Hs рода Ме0чфососыз, обладающие способностью фиксировать атмосферный азот при этом количество связанного agora в питательной среде регулируют таким образом, чтобы его уровень.в среде в процессе выращивания был меньше того количества, которое содержится в готовой биомассе. 2. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что из рода Ме йфософ ц,у используют вид eapsueatus . И ст очники информации, прин ятые в о внимание при экспертизе: 1. Патент Великобритании Р 1150401 кл. С б F 1969 °