Способ качественного и количественного определения циклических нуклеотидов

 

ОЙ Ис

ИЗОБРЕТЕН И Я

К ПАТЕНТУ! 655343 баоз Советских

Социалистических

Республик (61) дополнительный к патенту (22) Заявлено 07.04.76 (21) 2343057/23-04 (23) Приоритет — (32) 08.04.75 (31) 14462/75 (33) Великобритания (43) Опубликовано 30.03.79. Бюллетень ¹ 12 (45) Дата опубликования описания 30.03.79 (51) М 1;,г

G 01T 1/161

Государственный комитет (53) УДК 543.52 (088.8) Ita делам иэобретений и открытий (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Реджинальд Монкс и Идрис Льюис Томас (Великобритания) Иностранная фирма

«Дзе Радиокемикал Сентр Лимитед» (Великобритания) (71) Заявитель (54) СПОСОБ КАЧЕСТВЕННОГО И КОЛИЧЕСТВЕННОГО

ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИКЛИЧЕСКИХ НУКЛЕОТИДОВ

Изобретение относится к области аналитической химии, а именно к способам качественного и количественного определения нуклеотидов.

Известен способ качественного и количественного определения циклических нуклеотидов в биологической жидкости, основанный на обработке определяемого циклического нуклеотида меченым специфическим к каждому нуклеотиду реагентом, выделении продукта реакции и определении количества связанного меченого реагента, причем в качестве меченого реагента используют нуклеотид, меченный фосфором 32 и углеродом 14 (1).

Недостатком этого метода является малый период полураспада фосфора 32 (14,3 суток) и низкая радиоактивность углерода 14.

Известен способ качественного и количественного определения циклических нуклеотидов в биологической жидкости, основанный на обработке определяемого циклического нуклеотида меченым реагентом, выделении продукта реакции и определении количества связанного меченого реагента, причем в качестве меченого реагента используют нуклеотид, меченный тритием (2).

Недостатком этого метода является его длительность и сложность, так как тритий является источником бета-излучения.

Целью предлагаемого изобретения является сокращение времени анализа и упрощение способа. Поставленная цель достигается описываемым способом качественно5 ro и количественного определения циклических нуклеотидов в биологической жидкости, основанным на обработке определяемого циклического нуклеотида меченого селеном-75, специфическим к каждому нук10 леотиду реагентом, выделении продукта реакции и определении количества связанного меченого реагента.

Отличительным признаком способа является использование в качестве меченого

15 специфического реагента реагента, меченого с ел ено м-75.

Эти меченые селеном-75 производные делятся на два класса:

1) в которых пуриновое или пиримидино20 вое ядро замещено группами, содержащими селен-75 и

2) в которых 2 -о-гемисукцинат циклического нуклеотида сочетается с амином или аминокислотой, содержащей селен-75.

25 Продукты, относящиеся к первому класcv, могут быть получены путем замены атома галоида (обычно атома хлора или брома) в галоидзамещенных циклических нуклеотидах ионом селеноводорода. Образую30 щиЙся при этом селенол может быть алкилирован при помощи иодистого алкила для

655343

/ 1 о — сн о о=р OH н о/

25 носн, в

5 в

-снз о б „ нн ° о =р — он л 2 н о к

35

А2 мн., 1 тт

1 ч $ ,-Ф, 9/

A.

Ф з (3

I ф :1 б о А

А вз о з

SI(1 .

ii !

А

Eg о

П сн, Hll ++

-Ц,J о 2

А

45

55 о-с в=о

// но --о в+

60 1= — Нз; Ra= — H Rs=SeCHa, R4=

= — ОН;

2. Ri= — ОН;

R4= — ОН;

R2= — Нз; Рз = SECH>, б5 получения алкилселенопроизводного. Реакции могут быть выполнены в водной среде.

Можно также пользоваться другими вытесняющими нуклеофилами, такими как селеномочевина. Полученные таким образом соединения потенциально пригодны в качестве радиоактивных лигандов при определении аденозин-3,5 -циклического монофосфата (АМФ).

Продукты, относящиеся ко второму клас- >0 су, могут быть получены при взаимодействии между селенметил-L-селеноцистеином — селеном-75 и 2 -о-гемисукцинатом циклического нуклеотида в среде диметилформамнда в присутствии N-этоксикарбо- 15 нил-2-этоксидигидрохинолина (EEDQ) . Эти продукты с сопряженными связями приготовлены из 3,5 -циклического АМФ и 3,5 циклического GMP и показано их прочное связывание с антителами для этих цикли- 20 ческих нуклеотидов (1Ч и V) 4

3. Ri= — ЬеСНз, Rz= — Н; R3= — Н; Rq ——

=- — ОН;

4. R,=- — NH,; R,== — Н; R,= — Н;

R,= — ОСО-СН,СН,СО NHCHX

X(COOH)CH,SeCH,;

5. R, — ОН; R,=-H,; R,= — Н;

R,= — ОСО; СН,СН,СО. NHCH(COOH)CH,К

QSeCH,.

Изобретение позволяет использовать селен-75 для мечения циклических нуклеотидов вообще и в частности следующих групп, из которых I, II и Ш имеют наиболсе важное значение.

I. А1В1. Аденозин-3,5 -циклический фосфат (циклический АМФ), замещенный в положении 6, или 8, или 2 . Например:

8-метилселеноциклический АМФ, полученный из 8-бромциклического АМФ и метилселенида натрия;

6 - метилселенопуринрибозидциклический фосфат, полученный из 6-хлорпуринрибозидциклического фосфата и метилселеноцистеамина.

II. А1Вз. Цистидин-3,5 -циклический фосфат, замещенный в положении 2, или 4, или 2, Ш. AiB . Гуанозин-3,5 -циклический фосфат (циклический СМФ), замещенный в положении 2, 6, или 8, или 2 . Например:

8-метилселеноциклический 6МФ, полученный из 8-бромциклического 6МФ и селеномочевины;

2-метилселеноинозин - 3,5 - циклический фосфат (циклический JMP), полученный из

2-хлорциклического JMP и метилселенида натрия;

2-амино-6 - метилселенопуринрибозидциклический фосфат, полученный из 2-амино6-хлорпуринрибозидциклического фосфата и метилселенида натрия;

N (2 - метилселеноэтил) - циклический

GMP, полученный из 2-хлорциклического

3МР и метилселеноцистемина.

IV. AiB4. Уридин-3,5 -циклический фосфат, замещенный в положении 2, или 4, или 2 .

V. АзВз. Тимидин-3,5 -циклический фосфат, замещенный в положении 2 или 4.

VI. А Вз. Инозин-3,5 -циклический фосфат (циклический JMC, замещенный в положении 2, 6, 8 или 2 .

В этих примерах, заместителями у пуринового или пиримидинового кольца являются либо селено-(С1 — С4) -алкильные или(С1 — С4) - алкилселено - (С1 — С4) - алкиламиногруппы; заместители у кольца рибозы описываются формулой — OCO.СНз СНз.CONH К $ейз, где Ri представляет собой алкиленовые группы C> — С4, которые могут нести на себе группу — СООН, а

R> представляет собой алкильную группу

С1 — С4.

655343

Атомы селена содержат искусственно созданную высокую долю селена 75.

Получение 8-метилселеноаденозин — 3,5 циклического монофосфата — селена-75.

Водный раствор кислого селенида натрия — селена-75 готовят путем прибавления воды (1 мл) к смеси красного селена — селена-75 (0,011 м атом; 300 мкюри;

27 кюри/м . атом) и боргидрида натрия (1,6 мг; 0,042 ммоль).

Смссь перемешивают при комнатной температуре в атмосфере азота до тех пор, пока весь селен не растворится. Избыток боргидрида натрия разрушают путем нагревания раствора в течение 5 мин при 100 С.

К раствору кислого селенида натрия — селена-75 прибавляют 8-бромаденозин-3,5 циклический монофосфат (5,2 мг;

0,013 ммоль) в воде (1- мл) и смесь перемешивают в течение 3,5 ч при 90 — 95 С.

Реакционную смесь обрабатывают иодистым метилом (0,5 мл), дитиотрентолом (5 мг) и карбонатом натрия (10 мг) и перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч. После этого смесь упаривают при пониженном давлении до небольшого объема, целевой продукт выделяют и очищают методом препаративной тонкослойной хроматографии в двух системах:

1) 1 мм силикагель («Мерк 60» PF>q4) н-бутанол, уксусная кислота, вода (60:15:

:25) и 2) 1 мм целлюлоза (Авицель) и-бутанол, уксусная кислота, вода (60:15:25).

Еолее быстро перемещающийся компонент с двумя радиоактивными полосами поглощения в ультрафиолетовой области спектра в системе 1 подвергнут повторному хроматографированию в системе 2. После авторадиографии пластинки медленнее перемещающийся из двух компонентов, полученный в системе 2, экстрагирован водой для получения 11 мкюри 8-метилселеноаденозин-3,5 -циклического монофосфата — селен а-75. . чкс. 287 нм (е.„„<, 16300) . Идентичность продукта подтверждена сравнением с чистым, нерадиоактивным 8-метилселеноциклическим АМР в шести хроматографических системах.

Получение 8 - метилселеногуанозин-3,5 циклического монофосфата — селена-75.

Водный раствор кислого селенида натрия — селена-75 готовят путем прибавления воды (1 мл) к смеси красного селена (0,016 м атом; 421 мкюри; 26,2 мкюри/м . . атом) и боргидрида натрия (1,5 мг;

0,039 ммоль). Смесь перемешивают при комнатной температуре в атмосфере азота до полного растворения селена. Иодид

5-метилизотиоурония (3,8 мг; 0,017 ммоль) в воде (0,5 мл) продувают азотом и прибавляют к раствору кислого селенида натрия — селена-75, Реакционную смесь нагревают в течение 2 ч прп 90 С. Анализ реакционной смеси по прошествии этого перио5

65 да времени указал на наличие одного радиоактивного компонента с величиной

R 0,60, дополняющего красный селен — селен-75. Раствор лиофилизируют и остаток экстрагируют ацетоном (2 мл). Раствор в ацетоне выпаривают досуха для получения селеномочевины — селена-75 (157 мкюри;

6,0X10 — ммоль), которую хранят в твердом состоянии при температуре †1 С до момента ее использования.

К селеномочевине — селену-75 (6,0Х

X10 — ммоль) прибавляют 8-бромгуанозин-3,5 -циклический монофосфат (свободная кислота; 3,2 мг: 7,5X10 — ммоль) в безводном метаноле (1 мл) и смесь нагревают при температуре кипения с обратным холодильником в течение 8 мин, затем охлаждают. К реакционной смеси поочередно прибавляют метилат натрия (1,2 мг) в метаноле (220 мкл) и иодистый метил (10 мкл) в метаноле (250 мкл), реакционную смесь перемешивают в течение 3 ч при комнатной температуре. Раствор выпаривают досуха и остаток очищают методом тонкослойной хроматографии с применением системы из 1 мм целлюлозы авицель на пластинке (94 /о -ный водный бутанол, 44О/о-ная водная пропионовая кислота, 1: 1).

Главный радиоактивный компонент после определения его местоположения удаляют с пластипки и экстрагируют водой. Продукт (8,8 мкюри) хранят при температуре — 140 С. Установлено, что радиохимическая степень его чистоты составляет 96 /о, о но он содержит не радиоактивные примеси, поглощающие в ультра-фиолетовой области спектра. Часть продукта (0,3 мкюри) помещают в колонку сефадокса (20X1 см) и элюируют 0,1 М раствором бикарбоната аммония. Главную радиоактивную фракцию, не содержащую нерадиоактивных примесей, поглощающих в ультрафиолетовой области спектра, собирают и выпаривают досуха.

После выпаривания с водой для удаления бикарбоната аммония получают 8-метилселеногуанозин-3,5 - циклический монофосфат — селен-75 (0,22 мкюри) . Этот продукт связывает антитела, возникающие против циклического бМФ-2-сукцинил-BSA.

Сочетание 2 -О - сукцпнилгуанозин - 3,5циклического монофосфата и селенометилL-селеноцистеина — селена-75.

Раствор 2 -О-сукцинилциклического 6МФ (0,45 мг; 1,0 ммоль) и N-этоксикарбонил-2этоксидигидрохинолина (0.7 мг) в безводном диметилформамиде (75 мкл) прибавляют к раствору селенометил-L-селеноцистеина — селена-75 (16,1 мкюри); 1 ммоль) и триэтиламина (5 мкл) в диметилформамиде (100 мкл). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре. Методом тонкослойной хроматографии с использованием системы целлюлозы авицель (н-бутанол, уксусная кислота, вода 60:15:

655343

Связанный циклический АМФ, мечены селеном-75, у

38,8

29,7

26,7

2l,4

16,6

10,6

Доза циклического АМР, пнкомоль

0

4

16

7

:25) установлено присутствие двух основных радиоактивных компонентов: селенометил-L-селеноцистеина — селена-75 с величиной К 0,63, а метилселеноцистеинового селен-75-производного с сопряженными связями 2 -О-сукцинилциклического 6МФ с величиной R< 0,40. Продукт конденсации

Rf 0,40) выделен методом препаративной тонкослойной хроматографии с применением целлюлозы авицель и указанной выше системы элюентов. Получен продукт с активностью 0,7 мкюри.

Получение диселенида — селена-75: бис6,6 -(пуринрибозид-3,5 -циклического монофосфата) .

Раствор 6 - хлорпуринрибозид-3,5 -циклического монофосфата (5,0 мг; 0,012 ммоль) и кислого селенида натрия — селена-75 (0,06 ммоль) в воде (2 мл) нагревают в атмосфере азота в течение 2 ч. Реакционную смесь вносят в колонку сефадекса ДЕЛЕ (15K 1 см) и элюируют 0,1 М раствором дикарбоната аммония (500 мл), 0,2 М (500 мл) и наконец 0,3 М раствором бикарбоната аммония (500 мл). Главную фракцию, обладающую радиоактивностью и поглощающую в ультрафиолетовой области спектра, собирают и выпаривают досуха.

При повторных выпариваниях с водой удаляют остаточный бикарбонат аммония.

Продукт, представляющий собой диселенид — селен-75 бис-6,6 - (пуринрибозид-3,5 циклического монофосфата) дает спектр поглощения в ультрафиолетовой области с

Хм,к, 287 нм. После восстановления диселенида при помощи дитиотрентола (10 мг) в 1 M буферном растворе трис с величиной рН 7,5 (5 мл) изменения в спектре поглощения в ультрафиолетовой области указывают на характеристическое поглощение

6-селенопурина с i „;, 345 нм.

Получение 6-метилселенопуринрибозид3,5 -циклического монофосфата — селена-75.

Иодистый метил (0,15 мл) и дитиотретиол (12 мг) прибавляют к раствору диселенида — селена - 75 бис - 6,6 - (пуринрибозид - 3,5 - циклического монофосфата) (3,7 мкмоль; 20 мккюри) в 1 М буферном растворе трис с величиной рН 7,5 (5 мл), смесь тщательно перемешивают в течение

1 ч. Раствор вносят в колонку сефадекса

ДЕАЕ (15Х2 см) и после этого колонку элюируют 0,2 М раствором бикарбоната аммония. Главную фракцию, поглощающую в ультрафиолетовой области спектра и обладающую радиоактивностью, собирают и выпаривают досуха; повторные выпаривания с водой служат для удаления остаточного бикарбоната аммония. Выход 6-метилселенопуринрибозид-3,5 — циклического монофосфата — селена-75 соответствует

27 мккюри.

Хм,:н, 231 мм, 304 нм (рН 7). Один компонент обнаружен методом хроматографии на целлюлозе PEJ с 0,2 M раствором бикарбоната аммония.

Пример 1. Типовая характеристика чувствительности к дозе излучения при определении циклического AMP с применением 8-метилселеноаденозин — 3,5 -циклического монофосфата — селена-75.

Стандартные растворы циклического

АМФ, содержащие 1, 2, 4 и 8 пикомоль в

50 ммоль буферного раствора трис/ЭДТА, (4 ммоль), рН 7,5 (50 мкл) вносят пипеткой в пробирки при 2 — -4 С. Буферный раствор вносят также в пробирки с общей дозой, контрольной дозой и нулевой дозой соответственно, 150, 150 и 50 мкл, также при 2 — 4 С. В каькдую пробирку прибавляют 8-метилселеноциклический AMC — сслен-75 (3 пикомоль); удельная активность около 22 кюри/ммоль в 50 мкл буферного раствора.

Во все пробирки, за исключением контрольных вносят связывающий белок (экстракт из мышц быка) в 100 мкл буферного раствора. Содержимое пробирок смешивают вращательным движением в течение примерно 5 с, а затем их выдерживают в тсчение 3 ч при 2 — 4 С. Во все пробирки, за исключением общей дозы вводят суспензию древесного угля в воде (100 мкл) и после перемешивания вращательным движением в течение примерно 5 е содержимое пробирок немедленно центрифугируют для осаждения древесного угля. Из верхнего прозрачного слоя каждой пробирки отбирают пробы по 200 мкл, как и из пробирки с общей дозой и отсчитывают на гаммасчетчике.

Результаты представлены ниже.

Пример 2. Типовая характеристика чувствительности к дозе излучения при определении циклического (лМФ с применением 8-метилселеногуанозин-3,5 - циклического монофосфата-Se 75.

Стандартные растворы циклического

6МФ, содержащие 0,25; 0,5; 1,0; 2; 4; 8 и

1600 пикомоль в 100 мкл буферного раствора на 50 ммоль трис/ЕДТА (4 ммоль) с рН 7,5 вносят пипеткой в пробирки, выдерживавшиеся при 2 — 4 С, концентрация в

16000 пикомоль на 100 мкл использована для определения неспецифической связи. В пробирку вносят также 100 мкл буферного раствора для определения отсчета для нулевой дозы. В каждую пробирку прибавля655343

10 ют 8-метилселеноциклический GMC — селен-75 (0,25 пикомоль, удельная активность около 24 кюри/ммоль) в 50 мкл буферного раствора. Антитело сыворотки (против циклического бМФ-2 -сукцинилВ$А) в 50 мкл буферного раствора вводят после этого во все пробирки. Содержимое пробирок быстро перемешивают вращательным движением и выдерживают в течение

3 ч при 2 — 4 С. Во все пробирки прибавляют по 1 мл водного раствооа сульфата аммония (насьпценного на 60%) при 2 — 4 С и пробирки после перемешивания их содержимого выдерживают в течение 5 мин при 2 — 4 С и затем центрифугируют. После декантирования верхнего прозрачного слоя жидкости и удаления приставшей жидкости осадки используют для проведения отсчета на гамма-счетчике. Для получения отсчета для общей дозы пользуются 0,25 пикомоль

8 - метилселеноциклического — (лМФ вЂ” селена-75 (удельная активность около 24 кюри/ммоль в 50 мкл буферного раствора).

Полученные результаты приведены ниже.

Связанный

Доза циклического GNC мечен ы и с ел еном-75, о;

45,3

33,7

27,8

22,3

14,0

9,3

6,5

0,25

0,5

1,0

2,0

4,0

8,0

Пример 3. Типовая характеристика чувствительности к дозе излучения при определении циклического бМФ с применением селенометил-L-селеноцистеинового— селен - 75- производного с сопряженными двойными связями 2 -О-сукцинилциклического GMP.

Стандартные растворы, циклического

GMC>, содержащие 5, 10, 24, 40, 80 и

16000 пикомоль в 100 мкл буферного раствора из 50 ммоль трис/ЭДТА (4 ммоль) с величиной рН 7,5, вносят пипеткой в пробирки, выдерживавшиеся при 2 — 4 С. Концентрация в 16000 пикомоль на 100 мкл использована для определения неспецифической связи. В одну из пробирок вносят

100 мкл буферного раствора для определения отсчета, соответствующего нулевой дозе. В каждую пробирку вносят селенометил-L - селеноцистеинового — селен-75-производного с сопряженными двойными связями 2 -О - сукцинилциклического бМФ (0,59 пикомоль, удельная активность около

16,1 кюри/м моль) в 50 м кл буферного р аствора. Антитело сыворотки (против циклического СзМФ 2 -сукцинил-BSA) в 50 мкл буферного раствора вводили во все пробирки. Содержимое пробирок быстро перемешивают вращательным движением и выдер10

30

65 живают в течение 3 ч при 2 — 4 С. Во все пробирки вводят по 1 мл водного раствора сульфата аммония (насыщенного на 60%) при 2 — 4 С и после перемешивания, пробирки выдерживают в течение 5 мин при

2 — 4 С и содержимое центрифугируют.

После декантации верхнего прозрачного слоя жидкости и з даления приставшей жидкости осадки используют для проведения отсчета для общей дозы используют

0,5 пикомоль селенометил-L-селеноцистенового производного с сопряженными двойными связями 2 -О-сукцинилциклического

6МФ в 50 мкл буферного раствора.

Полученные результаты аналогичны приведенным в примере 2 и представлены ниже.

Связанны и

Доза циклического, и и пикомоль меченый сезеиоч 75 у, 0 24,5

5 17,3

10 16,7

20 11,8

40 8,3

80 6,1

Пример 4. Оценка 6-метилселенопуринрибозид-3,5 - циклического монофосфата — селена-75 при использовании его в качестве радиоактивного лиганда при анализе насыщенности циклического АМФ.

Вследствие низкой удельной активности б-метилселенопуринрибозид - 3,5 -циклического монофосфата — селена-75, его способность к образованию связи исследована путем применения соединения селена-75 в качестве конкурирующего ингибитора при связывании тритиированного циклического

АМФ со связывающим белком.

6-Метилселенопуринрибозид — 3,5 -циклической монофосфат — селен-75 (удельная активность 6,65 мкюри/ммоль) растворяют в буферном растворе трис/ЭДТА для пол чения растворов с концентрацией

1156 пикомоль, 105 пикомоль и 9,6 пикомоль в аликвотной пробе 50 мкл. При нормальном испытании 100 мкл связывающего белка выдерживают вместе с тритиированным циклическим АМФ (0,9 пикомоль) и немеченым циклическим AMP (стандартные и испытуемые растворы). Связанный и свободный меченый циклический АМФ разделяют путем поглощения свободного циклического АМФ на древесном угле и активность связанного вещества определяют путем проведения отсчета для пробы верхнего прозрачного раствора. Для определения активности селенового аналога сначала определяют связывание при нулевой дозе, т. е. IlðîlIåíò трптиированного циклического АМФ, связываемого без немеченого циклического АМФ или селенового аналога. Эту величину затем сравнивают со свя655343

Формула изобретения

Связанный меченый тритием циклический

АМФ, у, Эквивалент циклического

АМФ (пикомоль), 50 мкл

Селеновый аналог, пикомоль/50 мкл

1,156

9,6

54,5

0,42

0,96

5,06

161

69,7

12,2

Составитель В. Гладков

Техред Н. Строганова

Редактор Л. Герасимова

Корректор Л, Орлова

Заказ 312/19 Изд. № 231 Тираж 705 Подписное

НПО Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография. пр. Сапунова. 2 зыванием тритиированного циклического

АМФ в присутствии четырех различных доз селенового аналога. На основании полученных результатов можно вычислить количества немеченого циклического АМФ, кото- 5 рые вызвали бы снижение степени связывания, равное тому, которое вызывается селеновым аналогом.

Результаты, приведенные в таблице, показывают, что 9,6 пикомоль 6-метилселено- 10 пуринрибозид-3,5 - циклического монофоафата вызывают такое же вытеснение тритиированного циклического АМФ, как и

12,2 пикомоль циклического АМФ, т, е., что при применяемых концентрациях оба 15 эти соединения обладают весьма сходной способностью к связыванию.

Способ качественного и количественного определения циклических нуклеотидов, основанный на обработке определяемого циклического нуклеотида меченым специфическим к каждому нуклеотиду реагентом, выделении продукта реакции и определении количества связанного меченого реагента, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и сокращения времени анализа, в качестве меченого специфического реагента используют реагент, меченный селеном-75.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Qobagashi К., Fang V. S., «А sample

and competitive protein — binding assay for

cyclic GMP», Biochemical and Biophysical

Research Communications, Vol., 67, 1975, р.р. 493 — 500.

2. Gilman А. G. «А protein binding assay

for adenosine 3 5 -cyclic monophosphate», Procudings of the National Academy of

sciences, USA, Vol. 67, 1970, р. р. 305 — 312.