Способ получения ингибиторов трипсина

 

(6() Дополнительное к авт. свил-ву— (24 наив I"-Ио 1703.76 (2т) 2335740/28-13 с прйсоелииеиием заивни ¹ (23) Приоритет— (51) М. Кл.

С 12О13/00

Государственный комитет

СССР по делам изобретений н открытий

Опубликовано 300479.Бюллетеиь РЙ 16 (Я) ggg615739.6 (088.82

Дата опубликовании описании 309479 й.М.Безбородов, Н.A.Андреева и Д.Н.Черменский

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов академии.наук СССР (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНГИБИТОРОВ TPHIICHHA

Изобретение относится к медицинской промышленности и касается получения ингибиторов тринсина, которые могут найти применение в медицинских исследованиях.

Известен способ получения ингибиторов трипсина путем выращивания культуры родуцента на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с последующим выделением целевого продукта из фильтрата культуральной жидкости 111 .

Однако продуценты, синтезирующие ингибиторы трипсина, используемые в известном способе, являются дефицитными.

Целью изобретения является упрощение способа.

Эта цель достигается тем, что в качестве продуцента используют актиномицеты фиолетовой группы: АС(,)пОптцсе@ vioFaceue con f incog 2476 или

АС1лаоя цсеб v (о расеи б vic inua

1074, ACtinOmqCee janthinuS, 118, Actinomyces мо0огозеив 25 или Acti-.

nomyces viola tua 1205.

Способ поясняется следующими примерами.

Н р и м е р 1. Цродуцент Act.

janthinus 118 выращивают s течение двух суток в колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих по 100 мл посевной среды, на роторных качалках,180- 200 об/мин) при температуре

28+1сс.

Состав среды (г/л): крахмал картофельный - 10, дрожжевой экстракт10 мл, кукурузный экстракт — 10, Ма С8 - 2, О, рй 6,8-7,2. Затем посевной материал в количестве 10% переносят в колбы со 100 мл среды и культивирование продолжают еще 48 час на среде следующего состава (2/л): бульон Хоттингера - 30 мл, пептон5, глюкоза — 10, МаСС - 5, рн 6,87т2.

По истечение указанного срока фильтрат культуральной жидкости испытывают на ингибирующую активность по отношению к трипсину. Фильтрат (0,1 мл) подавляет протеолитическую активность трипсина на.70%.

Биомассу удаляют фильтрованием на воронке Бюхнера, в фильтрат вносят сульфат аммония до 20Ъ-ного насыщения. После нескольких час стояния при температуре 4 С раствор о центрифугируют при 5000 с в течение

3 659 10 мин., неактивный осадок отбрасынают, а раствор ннонь насыщают сульфатом до 0,4 и, оставляют на ночь при температуре 4 С. Отделенный центрифугиронанием осадок содержал нсю ингибирующую актинность. Ингибирующук активность выражают н % ингиби- 5 ронания активности трипсина и определяют следующим образом.

Контроль 9 1: и пробирки нно,<-. последонательно 0,2 мл раствора трип->0 сина (рабочий раствор содержит

0,1 мг/мл), 0,7 мл 0,1 М раствора боратного буфера рН 7,4 и 1 мл 2Ъ-ного Раствора каэеина н том же буферЕ, после чего инкубируют н течелие

30 мин при температуре 37 С.

Контроль 2: н пробирки внОсят последовательно 0,2 мл растнора трипсина, 0,7 мл боратного буфера, 0,1мл раствора ингибитора, 2 мл 103-ного ЯО раствора трихлоруксусной кислоты и

1 мл 2%-ного раствора каэеина.

В опытную пробу вносят 0,2 мл раствора трипсина, 0,7 .мл боратного буфера и 0,1 мл раствора ингибитора, смесь встряхивают и оставляют на

15 мин при комнатной температуре. По истечении этого времени н пробирки вносят 1,0 мл 2%-ного раствора каэеи-, на и инкубируют как и контроль М 1

30 мин при температуре 370С. После термостатиронания н пробирки с контролем М 1 и н опытные пробы вносят по 2 мл 10Ъ-ного раствора трихлоруксусной кислоты, н контроль М 1 добавляют 0,1 мл раствора ингибитора, встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 1.час. Осадки белкон отфильтровывают, н фильтрате измеряют поглощение на спектрофотометре при 3 =- 280 нм. Отношение разницы н поглощении контроля Р 1 и опыта к разнице н поглощении между контролем Р 1 и контролем 9 2, выраженное н процентах, есть единица ингибиронания активности трипсина. 45

Осадок, полученный после осаждения сульфатом аммония, Растворяют н минимальном количестне 0,005 М раствора трис-НСВ буфера",рН 7,4 и после диализа проводят гель-хроматографию на колонке с сефадексом Ц = 75. Выход активного материала контролируют измерением ингибирующей активности.

В результате гель-хроматографии получают дна пика, обладающие ингибирующей актинностью. По скорости выхода из колонки активный материал имеет молекулярный йес 10-20 и

60-80 тысяч. Каждый из пиков сорби- 60 руют на ДЕьЕ -I целлюлозе, ураннонешенной 0,005 М -трис-HCE буфером, рН 7,4 и хроматографируют н градиенте NaCC (0-1,0 М) .Фракции,проянляю, щие ингибирующую ак тин ность, собирают 65

610 4 и после диалиэа протин ноды лиофилиэируют.

Пример 2. Культуру актиномицетаTаe GTносящегося к фиолетоной группе Act. v a0aceus continue

2476 выращивают н услониях„укаэанных н примере l. Фильтрат культуральной жидкости, обладающий ингибирующей активностью, осаждают ацетоном при РН 5,0. Осадок отделяют центрифугиронанием, диализуют протин

0,05 М К-фосфатного буфера, рН -7,5 и сорбируют на ДЕЬЕ-целлюлозе. Колонку промывают тем же буфером до выхода активного пика и затем хроматографируют и градиенте КС1 (0,-0,8 М) до выхода второго пика, обладающего ингибирующей актинностью. Оба пика концентрируют, известными приемами (насьпцение1 сульфатом, ультрафильтрация, осаждение ацетоном) и подвергают гель хроматографии на сефадексе Г-75. лктинные по ингибирующей способности

Фракции собирают и лиофилизируют.

Пример 3. йктйномицеты, относящиеся к фиолетоной группе., например, Act. йосасепБ 1074

Act. мпГолобе0ь 25 Act. viola tug

1205, культивируют н условиях, описанных н примере 1. По истечении

72 часов Фильтрат культуральной жидкости испытывают на ингибирующую актинность по отношению к трипсину.

Фильтрат культуральной жидкости (0,1 мл) н условиях опыта поданляет протеолитическую активность трипси- на на 50-70%..

Ингиьиторы трипсина имеют молекулярный нес 12-16 тысяч. Эти соединения не растворяются н органических растворителях, имеют характерный для белков УФ-спектр и по своей природе более близки природным ингибиторам трипсина, выделенным из жинотных тканей, а также из расти-, тельных объектон.

Предлагаемый способ обеспечивает расширение сырьевой базы для получения ингибиторон трипсина, тем самым упрощая его технологию получения и снижение себестоимости прейарата.

Формула изобретения . Способ получения ингибиторон трипсина путем ныращинания культуры продуцента на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с последующим ныделением целевого продукта иэ фильтрата культуральной жидкости, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью упрощения способа, н качестве продуцента используют актиномицеты

659610

Составитель С.Малютина

Техред,З.Фанта КорректорО.Билак

Редактор Н.Грязнова

Заказ 2120/6 Тираж 525 Подписное

IlHHHtlH Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035с Москва, Ж-35с Раушская наб с д.4с 5

Филиал ППП Патент, r.Óæãîðîä, ул.Проектная,4 б фиолетовой группы: 4с irtorngces viofaceue сопбпн6 2476 или Actinomiicee vioсаeeus viainuS 1074,Ас0пот сев 1oя hinus

118, Ас.лпотусев . vioforoeeus 25 или AetinornLjcee vio Ea tus 1205.

Источникй информации, принятые во внимание при зкспертиэе

1Umezawa H.Enzyme inhibi1огs of

microbial origin,Tokyo University of

Tokyo Ргеве, 1972.