Способ получения моноклонального иммуноглобулина

 

(72) Авторы изобретения

В. Г. Пухальская, Т. N. Шелепова, B. В. Лебедев, О. В. Перелы|ина и С. A. Прокофьев (71) Заявитель

Второй Московский ордена Ленина государственный медицинский институт им. H. И. Пирогова (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА

Изобретение относится к области медицины, в частности к иммунологии, и может быть использовано для приготовления препаратов иммуноглобулина высокой степени очистки.

Известен способ получения моноклонального иммуноглобулина путем культивирования плаэмоцитома на питательной среде с последующим удалением продуцента иэ культуральной жидкости и очистки целевого продукта (11. .l0

По известному способу опухоль извлекают из организма животного, освобождают от стромальных элементов, разделяют на мелкие фрагменты (порядка 1 ммЗ).

Полученную массу промывают изотоническим солевым раствором, помешают в медленно вращающийся культиватор, добавляют среду, содержащую L -аминокислоты, 0,5% овальбумина, набор витаминов, пенициллин, канамицин в стандартном растворе Хэнкса. На 100 мл среды вносят 50-150 мг опухолевой массы. Увеличение концентрации плаэмоцитомной массы приводит к быстрой гибели клеток.

Культуру фрагментов солидной плазмацитомы инкубируют B течение 24-48 час при З7 С. После окончания процесса ayah тивирования клеточную массу удаляют путем центрифугирования при 18000 в течение 20 мин. Супернатант, свободный от клеточных элементов, диализуют для освобождения от низкомолекулярных продуктов: аминокислот, витаминов и солей.

Раствор лиофильно высушивают и расворяют сухой остаток в 0,1 мл физиологического раствора. Полученный образец содержит многоканальный иммуноглобулин, овальбумин и продукты распавшихся клеток. Выход моноклонального иммуноглобулина определяют аналитическими методами, например методом радиоиммуно электрофореза, чувствительность которого составляет 1 мкг, причем при использовании 0,1 мл концентрата общее содержание моноклонального иммуноглобулина в исходной среде не превышает нескольких микрограммов, 3 6867

Основным недостатком известного способа является низкий выход моноклонельного иммуноглобулина.

Длительное культивирование фрагментов солидной опухоли требует внесения в среду поддерживающих белков сыворотки крови, например овальбумина, что требует при выделении целевого продукта сложной и многократной очистки от сывороточных белков. Механическое разрушение солид- 10 ной опухоли до ее фрагментов сопровождается гибелью части клеток. В культуре из разрушенных клеток выделяются протеолитические энзимы, которые переваривают часть секретируемого иммуноглобу- 15 лина, Это сопровождается уменьшением выхода и снижением качества специфи» ческого белка - иммуноглобулина. Кроме того, культивирование клеток или фра1 ментов плазмацитомы невозможно в обыч- 20 ных микробиологических средах без добавления поддержива1ощих белков и витаминов. Внесение последних усложняет технику НОлучения монОклональных иммунО глобулинов, а также делает ее дороже.

Белью изобретения является увеличение вь1хода и повышение иммунохимической чистОть1 препарата». . Это достигается тем, что при предлагаемом способе получения моноклонального иммуноглобулина путем культивирования,плазмоцитома на питательной среде с последующим удалением продуцента из культуральнОЙ жидкОсти и Очистки целево

ГО прОдуК ra плазмОцитом вместе с фиб-"

35 розной капсулой и предлежащими тканями культивируют в условиях аэрации в течение 6-8 час.

Способ осушествлчют следу1ощим обра40 зом, ДЛИ НОЛуЧЕПия МОНОКЛО 1аЛЬНОго ИММ7 ноглобулина используют культуру цельной солидной опухоли (плазмоцитома), выделенной вместе с О. 1ужающей ее фиброз45

НоА капсулой и предлежащим участком ткани. В качестве питательной среды используют обычную микробиологическую среду, например среду 199., Опухоль инкубируют в среде в течеиие 6-8 час

50 при 37ОС и и условиях аэрации карбогеном и затем удаля1от.

В среде остаются иммуноглобулины или их полипептидные цепи, при этом выход

55 целевого продукта составляет 120-150 мг иммупоглобулина или 30-40 мг свободных полипентпдных цепей при инкубации 6 г

СОЛИДНОЙ ПЛаэмоцнтоМЫ, Пример 1 Мышиные солидные плазмоцитомы линии МОРС-21 и МОРС-406, секретирующие иммуноглобулин классов 5 и Л соответственно размером

2х2 см (около 4-6 г весом) осторожно вылущивают из ткани животного вместе с фиброзной капсулой и прилежащим участком брюшины и промывают в физиологическом растворе. Опухоль помещают в сосуд, содержащий 100 мл среды 199..

Культуру аэрируют пропусканием газовой смеси карбогена (959o кислорода и 5% углекислого газа) и через 6-8 час кута тивирования ткань извлекают и переносят в свежий обьем исходной микробиологической среды. Процедуру культивирования опухоли повторяют 2 -3 раза. Затем культуральную среду центрифугируют при

3.0000 ф в течение 10 мин для удаления мелких фрагментов ткани и клеток. Прозрачный раствор среды содержит чистый иммуноглобулин. Для Освобождения целевого продукта От аминокислот образец подвергают ионообменной хроматографии на

ДЕ-52 целлюлозе в градиенте концентрании фосфатного буфера 0,01-0,16 М (рН 8,1). Иммуноглобулин элюируют B виде Остроконечного пика в соответствующем ему значении МОлярнОЙ конце нтра цни буферного раствора.

Образцы иммуноглобулина .анализируют электрофорезом в 7,5%-ном нолиакриламидном геле и пммуноэлектрофорезом, Иммуноглобулин дает гомогенный пик в полиакриламидном геле и образует одну дугу преципитации при иммуноэлектрофорезе. Таким образом, полученный образец иммуноглобулина иммунохимически и физически чистый. Выход иммуноглобулина

150 мг из 6 r опухоли.

Перед упаковкой образцов препараты иммуноглобулина диализуют в течение

112 час против 5 00 Об. дистиллированной воды и диофильно высушивают. Готовый продукт запаивают в ампулы и в таком виде хранят.

Пример 2. Солидную опухоль, продуцнрующу1о 3 g" A ((э Л. типа)

МОРС-315, выделяют с предлежащей тканью и помещают в микробиологический культиватор. Затем с помощью перистая тического насоса создают непрерывное протекание среды 199 со скоростью

100 мл за 6 час, Количество опухолевого материала в этом случае составляет

4-6 г. Выход моноклонального иммуноглобулина в вытекающей среде за 24 час

500-600 мг.

5 6867

Дальнейшую очистку и анализ проводят обычным способом. По иммунохимическим и физическим свойствам препарат соответствует моноклональному иммуноглобулину.

Пример 3. Солидную опухоль весом 4-6 г, продуцирующую свободные

:.легкие К-ццепи иммуноглобулина линии

МОРС-41, выделяют совместно с предлежащей брюшиной и фиброзной капсулой, промывают физиологическим раствором и помещают в сосуд, содержащий 100 мл среды 199. Культуру аэрируют газовой смесью карбогена в течение 6-8 час.

Ткань извлекают и переносят в свежий !

5 питательный раствор для повторного культивирования.

Культуральную среду фильтруют на бумажном фильтре "Ватман-4" или любом

20 другом с соответствующим ему размером пор. Прозрачный фильтрат содержит чистые К-цепи. Для освобождения от ингредиентов среды раствор подвергают хроматографии на ДЕ-целлюлозе. Свободные легкие К-цепи элюируют в виде одного компонента. Количественный выход целевого продукта — около 30 мг. По иммунохимическим свойствам данный белок соответствует К-цепям. зо

Возможно многократное, например 2-3 раза, использование того же материала, при этом количественный выход изменяется незначительно.

В случае промышленного производства 35 иммуноглобулина культивирование опухо33 пи целесообразно проводить в обтекающей солидную ппазмоцитому среде.

Предлагаемый способ получения моноклонального иммуноглобулина по сравнению с известным способом повышает выход и иммунохимическую чистоту препарата.

Препарат моноклонального иммуноглобулина, получаемый по предлагаемому способу, необходим для использования в экспериментальной и клинической медицине для диагностики миеломы и иммунодефитных состояний. Препарат может найти спрос как в нашей стране, так и за рубежом.

Формула изобретения

Способ получения моноклонального иммуноглобулина путем культивирования плазмоцитома на питательной среде с последующим удалением продуцента из культуральной жидкости и очистки целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода и повышения иммунохимической чистоты препарата, плазмоцитом вместе с фиброзной капсулой и предлежащими тканями культивируют в условиях аэрации в течение

6-8 час.

И с точ пик и и нформаци и, цр и нятые во внимание при экспертизе

1. СеЮа с r T mmunoCagq

1973, N9 2, с. 26.1-26,11

Составитель А. Бражникова редактор А. Бер Техред 3. фанта Корректор М 0 It.óïà

Заказ 5587/5 Тираж 672 Подпис ное

llНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 филиал ППП Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4