Способ определения лизосомального катионного белка лейкоцитов

 

Союз Советских

Социалистинеских

Республик

«»7ООО62 (63) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлеио1901,78 (21) 2567653/28-13 (51)М. Кл."

А 61 В 10/00

G 01 N 1/28 с присоединением заявки № Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий (23) Приоритет

Опубликовано 150 180. Бюллетень ¹2 (53) УДК 6 15, 475 (088 ° 8) Дата опубликования описания 15.01.80 (72) Авторы изобретения

А,Г.Аладатов и A.П.Вишнякова (71) Заявитель

Кубанский государственный медицинский институт им.Красной Армии (5 4) СПОСОБ ОПРЕЦЕЛЕНИЯ ЛИЗОСОМАЛЬНОГО

KATHOHHOI О БЕЛКА ЛЕЙКОЦИТОВ

Изобретение относится к области медицины и может найти применение в лабораторной практике для оценки функционального состояния лейкоцитов.

Известен способ определения лизосомального катионного белка лейкоци.тов путем приготовления мазка крови, его фиксации, окрашивания, высушивания, микроскопирования и определения количества белка по степени интенсивности окраски (1) . Однако известный способ не обеспечивает высокой точности определения, так как возможно побочное диффузное окрашивание других клеточных элементов. 15

Целью Изобретения является повышение точности путем устранения диф фузного окрашивания других клеточных элементов. эта цель достигается тем, что фик-2О сацию проводят в парах формалина концентрации 8-10% при рН 8,1-8,2, окрашивание осуществляют прочным зеленым

FSF при концентрации красителя 0,010,05 мг в 1 М трис-буфере и непосредственно по окончании его проводят ок- рашивание сафранином при концентрации

0,01-0,02%.

Способ осуществляют следующим образом. ЗО

Приготавливают равномерно тонкий мазок из небольшой капли свежевзятой капиллярной крови после прокола пальца у человека или других частей тела у животных, Высушенные на воздухе при комнатной температуре мазки помещают на подставке вертикально в эксикатор и фиксируют в..парах. 8-10Ъ-ного формалина при рН 8,1-8,2, который приготавливают из нейтрального 10%ного формалина путем добавления 0,1Н. раствора КОН в количестве„ позволяющем довести рН до 8,1-8,2. Фиксированные мазки выветривают путем высушивания на воздухе не менее 5-10 мин, после чего проводят окрашивание в течение 3-4 мин анионным красителем— прочным зеленым РЯР, в 1 М трисбуфере.при концентрации в пределах .0,01-0,05% (10-50 мг сухого вещества в 100 мл 1М трис-бефере) строго при рН 8,1-8,15, что поддерживают добавлением в раствор.,минимальных количеств (в каплях) 0,1 Н. раствора К0Н, после чего, минуя операцию промывания, проводят операцию докрашивания в течение 15 с последовательно по 5 с в трех порциях водного раствора сафронина при концентрации 0,01-

0,02%. Фиксацию, окрашивание и докра709062 шивание проводят при 20-2 4 С, Окрашенные мазки высушивают и микроскопируют под иммерсией светового микроскопа, При этом высушенные мазки хорошо сохраняют свою первоначальную окраску в течение 6 и более месяцев, что позволяет проводить повторные исследования для сравнения и контроля.

Пример ° В условиях клиники, родильного отделения, амбулаторно- 10 поли кли ни чес ко ro об служи в а ни я, в школьно-дошкольных учреждениях при предварительном врачебном осмотре и одновременном общеклиническом исследовании крови выборочно проводились ,исследования предлагаегым способом у 125 здоровых и 117 больных различными заболеваниями в возрасте от 1 дня жизни цо 40 лет, Взятие крови проводилось путем прокола пальца, а 20 у 7 больных с диагностической целью брался пунктат костного мозга путем стериальной пункции. Из крови и костного мозга готовили мазки. Высушенные мазки на годставке помещали в эк- g5 сикатор, насыщенный парами 10ti-íîão

Формалина, который добавлением 0,1 н.

КОН доводили до рН вЂ” 8,1-8„2. Фиксацию мазков проводили в течение 5 мин, после чего Фиксированные мазки выветривали на воздухе в течение 5-10 мин, " .Фиксацию и последующие операции окрашивания проводили при комнатной температуре 20-24"С. Краситель. прочный зеленый FSF в количестве 50 мг сухого вещества растворяли и 100 мл 1 М трис- "

3 буфер.е с добавлением по каплям, минимальных количеств 0,1 н. КОН строго до рН 8,1. Окрашивание фиксированных и просушенных мазков проводили погру-. жением в красящий раствор на 3 мин, 40 после чего мазки без промывания погружали последовательно в три сменных раствора сайранина 0,01-о-ного, приготовленного путем растворения 10 мг сухого вещества в 100 мг дистиллиро- 45 ванной воды, докрашивание з каждой .смене раствора сафранина проводили по 5 с. Окрашенные мазки высушивали и микроскопировали под иммерсией.

В полЕ зрения обычного светового микроскопа под масляной иммерсией полученные предлагаемым способом мазки крови и костного мозга выглядят следующим образом:

55 эритроциты тусклого светло-розового цвета обычной Формы; лимйоциты и моноциты -характерной присущей им формы с хорошо выражен- 60 ной клеточной структурой с бледнорозовой цитоплазмой и ярко-розовым ядром, лишенные катионного белка; эозинофилы обычной формы, с характерным типичным ядром ярко-розового 65 цвета с большим количеством крупных гранул от темно-зеленого, преимущесгвенно фиолетового, и темно-фиолетового цвета в цитоплазме; баэофилы обычной Формы с типичным ядром розового и ярко-розового цвета со значительным количеством гранул зеленого цвета в цитоплазме; нейтрофильные лейкоциты выделяются на общем Фоне клеток по содержанию большого количества мелких и более крупных гранул от светлого до темнозеленого цвета,с хорошо выраженной структурой ядра, окрашенного в бледнорозовый цвет, в незрелых юных клетках в более насыщенные розовые тона до ярко-красного по мере их созревания.

Получение четких контрастных гранул от светло-зеленого до темно-зеленого и Фиолетового цвета на Лоне хорошо выраженной морйологической структуры ядра и клетки в целом, позволяет дать количественную характеристику содержания катионного белка. В зависимости от степени зрелости и функционального состояния лейкоцитов меняется и цветовая окраска лизосомальных гранул,определяемых количественным содержанием в них катионного белка,что позволяет группировать окрашенные. лейкоциты по различным степеням,.(О,I,II,III,IV,V) при подсчете в 100 лейкоцитах и оценивать принципом Kaplow с выведением среднеарийметического показателя, процентным отношением клеток с различной степенью, также графически ги сто гр аммой .

Предлагаемый способ обеспечивает высокую точность определения, техни- . ческую простоту и быстрое исполнение в лабораторных условиях, не требующих сложного оборудования.

Предлагаемый способ позволит улучшить диагностику, своевременно назначить правильное лечение, что значительно сократит, в среднем до 10 дней, пребывание больного в больнице.

Формула изобретения

Способ определения лизосомального катионного белка лейкоцитов путем приготовления мазка крови, его Фиксации, окрашивания, высушивания, микроскопирования и определения количества белка по степени интенсивности окраски, отличающийся тем, что, с целью повышения точности путем устранения диффузного окрашивания других клеточных элементов, фиксацию проводят. в парах формалина концентрации

8-10% при рН 8,1-8,2, окрашивание осуществляют прочным зеленым FSF прй концентрации красителя О, 01-0, 05 мг в I N трис-буфера и непосредственно

709062

Составитель С.Малютина

1ехред Н.Ковалева Корректор E.IIanrr

Редактор Л.Новожилова

Тираж 673 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Рауюская наб,, д. 4/5

«»

Заказ 10041/5

Фнлиал ППП Патент i г,ужгород, ул.Проектная,4 по окончании его проводят окрашивание сафранином при концентрации 0,01О, 02%.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Архив патологии, 38, 5, с.55-59.