Способ индикации

 

Союз Советскик

Социалистическим

Республик

П"

О ИСААКИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

oi> 71244 II. К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт, саид-ву— (22) Заявлено 31,0778 (21) 2651252/28-13 (51)М. Кл. с присоединением заявки ¹â€” (23) Приоритет

С 12 К 1/04

Государственный комитет

СССР но делам изобретений и открытий

Опубликовано 3001.80. Бюллетень Йо 4

Дата опубликован и я оп и свми я 3 Q01,8 0 (53) УДК 576 8.

° 093.1(088 ° 8) С.В.Прозоровский, И,С.Байжомартов, О.Г.Стеценко, Г.В.Ярема, Л.П.Царевский и С.Д.Иржанов (72) Авторы изобретения

Научно-исследовательский ордена Трудового Красного Знамени институт эпидемиологии и микробиологии им.акад.Н.Ф.Гамалеи и Казахский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии (71) Заявители (54) СПОСОБ ИНДИКАЦИИ ИУСОР1iАБМА PNEUNONIAE

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для ускоренной диагностики NycopIasma pneumoniae. 5

Известен способ индикации NycopIasma pneumoniae в смывах путем иммунофлюоресцентного исследования маз" ков (1) .

Однако известный способ позволяет выявить возбудитель лишь у 50-75% больных с инфекцией NycopIasma

pneumoniae.

Целью изобретения является повышение эффективности способа.

«15

Эта цель достигается тем, что смывами заражают эксплантаты трахеи цыплят, обработанные стафилококковым токсином, культивируют их в питательной среде при температуре 33-37 С в течение 3-5 дней и затем готовят мазки-отпечатки.

П р н м е р . От больных пневмониями производят забор носоглоточных или бронхиальных смывов с помощью сухих стериальных ватных тампонов и помещают их в пенициллиновые флаконы, содержащие по 2 мл среды 199 с 0,5% желатины н пенициллин

1000 ед/мл. В .лаборатории тампоны со смывами тщательно отжимают пастеровской пипеткой и полученную мутно.ватую жидкость отсасывают в другие стерильные флаконы. Не позднее 1 ч после забора материала должно быть проведено заражение эксплантатов трахеи.

Для приготовления эксплантатов используют ткань трахеи 3-10-дневных цыплят, которых выращивают в условиях термостата иэ развивакщихся куринных эмбрионов. После извлечения трахею тщательно отмявают от крови в чашках Петри раствором Хенкса с пенициллином 200 ед/мл. Затем в свежей чашке Петри для получения кольцевндных Фрагментов трахеи проводят разрез .лезвием бритвы но межхрящевым промежуткам. Кольца трахеи дополнительно отмывают в растворе

Хенкса. Их ткани трахеи одного цыпленка готовят обычно 24 трахеальных кольца. Фрагменты трахеи в количестве трех колец помещают в пенициллиновый флакон, содержащий

1 мл среды 199; проводят. пипетированне с целью промывания просвета трахеальных колец. После удаления среды из флакона вводят 0,1 мл с

71244.1

Формула изобретения

Составитель С.Малютина

Техред О.Легеза Коррек тор М. Шароши

Редактор 3. Ходок Ойа

Заказ 10028/8 ТиРаж 522 Подп исное

ЦИНИПИ Ресударственного комитета СССР, Пс депам изобретений и открытий

113035, Москва, К-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, r.

Ужгород, ул . Проектная, 4 стафилококков ого токсина (исходнып гемолитический титр 1:1á00) в разведении 1: 32 - 1: б 4 (разведение производят в среде 199); оптимальная концентрация токсина, не обладаю- щая цитотоксическим действием,. опре- делена путем титрования в культуре клеток куриных фибробластов, за-. раженных эталонным штаммом я,pneumo-.

niae, Контакт ткани трахеи и токсина дают в течение 15-20 мин. Далее 1О не отсасывая токсин, во флаконы вносят 0,2-0,3 мл носоглоточного или бронхиального смыва больных. Инфицирование эксплантатов проводят путем непосредственного контакта ткани трахеи и смыва в течение 30 мин. На один исследуемый материал берут 2 .флакона с эксплантатами трахеи. По истечении времени контакта во флаконы наливают 1 мл питательной среды, состоящей иэ среды 199 с 2Ъ нормальной лошадиной сыворотки без консерванта и 10% дрожжевого экстракта.

Зараженные эксплантаты трахеи инкубируют,при 35+2 С. Спустя 3-5 суток после культивирования инфицированных экеплантатов из них готовят мазкиотпечатки путем прикладывания слизистой трахеи на поверхность обезжиренных предметных стекол (с каждого кольца трахеи снимают по 3 отпечат- ЗО ка) . Далее препараты высушивают, фиксируют в смеси Никифорова в течение

10-15 мин. После фиксации препараты исследуют непрямым методом иммунофлюоресценции по Кунсу с использованием гипериммунной кроличьей сыворотки против М.pneumoniae с титром

1:320 и выше: на препараты с отпе-. чатками, помещенные во влажную камеру .(чашки Петри) наносят 1 каплю иммунной сыворотки и инкубируют их при температуре 37"C в течение 30 мин.

После этого препараты отмывают в двух сменах забуференного физиологического раствора (рН 7,2) и споласкивают дистиллированной водой. На слегка подсушенный препарат наносят каплю антикроличьей флюоресциирующей сыворотки осла, разведенную до рабочего титра 1 ° 8 (используют меЧеную Флюоресциинизотиоционатом (ФИТЦ) сыворотку) . После 20-минутной инкубации во влажной камере при

3i С препараты отмывают в течение

-УО

30 мин в физиологическом растворе (pH 7,2), затем водой и просматривают после просушки и нанесения глицерина в люминесцентном микроскопе МЛ-2 или

ЛЮМАМ в падающем свете.

Предлагаемый способ более чувствительный и позволяет выявиТь возбудитель у больных в 2-4 раза чаще, Чем известный способ. Так, при исследовании мазков, приготовленных непосредственно из смывов больных, антиген М.pneumoniae выявлен лишь у 2 иэ 27 больных, а при исследовании мазков-отпечатков чз зараженных смывами эксплантатов трахеи дополнительно еще у б больных. Известный способ выявляет антиген

М.pneumoniae только у двух, а предлагаемый способ - у всех четырех больных с нарастанием титра специфических антител и дополнительно у четырех больных без сероконверсии к М.pneumoniae. Поэтому использование предлагаемого способа выявления обеспечивает по сравнению с известным способом более высокий процент обнаружения M,pneumoniae у больных.

Способ индикации Мусор1asma pneumoniae в смывах путем иммунофлюаресцентного исследования мазков, о т л и ч .а ю шийся тем, что, с целью повышения эффективности способа, смывами заражают эксплан- . таты трахеи цыплят, обработанные стафилококковым токсином, культивируют их в питательной среде при температуре 33-37©С в течение 3-5 дней и затем готовят мазки-отпечатки.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Ж. Микробиология, 1972, Р 11, с,2 4-27,