Способ получения веществ, обладающих антипаразитарной активностью
Сфюэ Советскнк
Сфцналнстнческнк
Республнк
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ (6I} Дополнительный к патенту (22) Заявлено 180477(21) 2474802/30-15 (23) Приоритет — (32) 19.0476
< >716524 (51) М. Кл.
С 12 1) 9/14
С 12 Э 13/00
Государственный комитет
СССР ио делам изобретений н открытий (33) США (3) ) 678328 (5З) УДК 576.8 (088. 8) Опубликовано 150280 Бюллетень ¹ 6
Дата опубликования описания 180280
Иностранцы
Георг Алберс-Шонберг (Швейцария)>
Ричард Уильям Бэрг, Томас Уильям Миллер
Ормонд и ХимаН Воллик (США) (72) Авторы изобретения
Иностранная фирма Мерк Энд Ко, Инк (США) Pl) Заявитель (5 4 ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЕЩЕСТВ ОБЛАДАЮ<цИХ
АНТИПАРАЗИТАРНОЙ АКТИВНОСТЬЮ
Изобретение относится к способу втолучения веществ, обладающих актипаразитарной активностью, микробиологическим путем.
В литературе не описаны способы получения веществ, обладающих антипаразитарной активностью, путем мик-. робиологического синтеза. Согласно изобретению способ получения подобных веществ характеризуется тем, что штамм SE, eptornq Сев с(чЕтттзтt.(8 s (ц р 8165 (ATTC
31267) выращивают на питательной среде, содержащей ассимилируемые источники углерода, азота и неорганические соли в аэробных условиях а последуют им выделением из среды выращивания целевого продукта. Выращин ание ук аз а нного штамма проводят при температуре 20-40 С, pH среды 6,0-7,5 в течение 1-8 дней на среде, содержащей 0,5-5Ъ источников углерода и 0,2-6% источников азота. Целевой продукт выделяют фильтронанием среды выращивания зкстрагиронанием образовавшегося на фильтре остатка — мицелия смешинающимися с водой органическими растворителями и затем зкстрагиронавием остатка не смешивающимся с но1дой органическим растворителем.
Вещества, описываемйе здесь под общим названием С-076, получают выращиванием в контролируемых условиях ранее не описанных штампов микроорганизмов Streptornices avermitieis, которые насчитывают до восьми различных родственных соединений, описыавемтх здесь под названием
С-076 Ala, Ala, A2a, А2в, B)a, Вlн, 82а В2а. Все эти соединения обладают значительной антипараэитической активностью и могут быть получены ферментацией и извлечены почти в чистом виде.
По данным таксономических исследонанит= микроорганизм способны образовывать С-076-соединения, которые являются новым аидом рода treptomvces названного. Streptomvces avermitifis
Такая. культура, выделенная иэ почвы, н коллекции культур Марка и К Ин1<.
Роуй, Нью Джерси, была обозначеяа как МА-4680. Образец культуры, Поющий С-076, был депонир<зван н постоянной коллекции культур Отпела ферментации исследовательского ялиала
Департамента сельского хозяйства
США н Претории и получил цорялк 1н.»й
716524 номер NRRZ 8165. Образец NRRZ 8165 был также депонирован в постоянной коллекции Американской коллекции типовых культур в 123б1 Парклаун
Драйв Мериленд 20852 и получил порядковый номер ATCC 31, 267.
Морфологические и культуральние характеристики следуюшие. Морфология: спорофоры образуют спирали в виде боковых ветвей воздушного мицелия.
Спирали компактные, но делаются более откритыми по мере старения культуры. Споры - цепочками не более чем в 15 спор, обычно имеют сферическую или овальную форму (при увеличении в 970 раз). Спорообразование наблюдается в araoe с овсяной му кой, с глицерином- аспарагином, с солями, крахмалом и с яичным альбумином, Поверхность спор гладкая.
Агар с овсяной мукой: обратная сторона — темно-коричневая. Воздушный мицелий: порошковый коричневатo-серый (41i)"",(обоз.начения»" номера цвета взяти из
Condor Barman Humean, 1%6, 4-th СЖ10т
CWteiner ot America, Chicago, Э0. смешанный с белым.
Растворимый пигмент: коричневый
Яапек Докс агар (сахароза-нитрат) .
Вегетативный рост: плохой, бесцветный.
Воздушный мицелийг скудный, серов атый .
Растворимый пигмент: сероватокоричневый светлого тона.
Яично-альбуминный агар: вегетативный рост умеренный, светло-серовато-желтовато-коричневый (В ge), смешанный с белым, Растворимый пигмент: светло-серов ато-коричневый .
Глицерино-аспарагиновый агар, веге-. . тативный рост: обратная сторона желтовато-коричневая, Воздушный мицелий: порошковый коричневато-серый (41i), смешанный с белым.
Растворимый пигмент: светлый, желтовато-коричневый.
Неорганические соли — крахмал.
Вегетативный рост: обратная сторона серовато-желтовато-коричневая.
Воздушный мицелий: порошковый, светлый, коричневато-серый (41i)"", по краям более темно-коричневатосерый (41i )»".
Растворимый пигмент: светложелтовато-коричневый .
Агар с дрожжевым экстрактом-декстровой-соли.
Вегетативний рост: обратная сторона темно-коричневая.
Воздушный мицелий: умеренный, коричневато-белый.
Растворимый пи гмент: коричневый, Агар с пентоно-железо-дрожжевым экстрактом, Вегетативный рост: темно-коричневый.
Воздушный мицелий: нет.
Растворимый пигмент: от темнокоричневого до черного, Миланин: положительная реакция.
Выделение Н S; положительная рей (p акция.
Агар с дрожжевым экстрактом мальтэкстрактом.
Вегетативный рост: обратная сторона темно-коричневая.
Воздушный мицелий: умеренный, коричневато-белый.
Растворимый пигмент: коричневый.
Питательный агар.
Вегетативный рост: коричневый.
Воздушный мицелий: скудный, сероватый.
Растворимый пигмент: светло-коричневый, Питательный крахмальный агар. .
Вегетативный рост: коричневый.
25 Воздушный мицелий: скудный, серовато-белый.
Растворимый пигмент-: светло-коричневый.
ЗО Гидролиз крахмала: хороший.
Картофельная масса.
Вегетативный рост: коричневый, Воздушный мицелий: коричневый, смешанный с серовато-белым.
35 Сыворотка крови Лефлера.
Вегетативный рост: сероватокоричневый.
Воздушный мицелий: нет.
Растворимый пигмент: некторое потемнение среди.
Разжижение: нет.
Питательный тирозиновый агар.
Вегетативный рост:. обратная сторона от темно-коричневой до черной.
Воздушный мицелий: скудный, сероватый.
Растворимый пигмент: темно-коричневый.
Разложение тирознна: нет. усвоение углерода.
Основная среда Придгема Готтлиба
1 1Ъ источника углерода + (+
= рост, - = нет роста, в сравнении с контрольной без источника углерода) .
Глюкоза + маннитон +
Арабиноза + манноза +
Пеллюлоза — ФаАиноза +
Фруктоза + рамноза +
Лактоза + сахароза + бО Мальтоэа + ксилоза +
Иноэитол +
Питательный желатиновий агар.
Вегетативный рост: коричневый.
Воздуиный мицелий: скудный, б5 серовато-белый.
716524
Растворимый пигмент: светло-коричневый.
Разжижение желатины: хорошее.
Желатина (посев уколом).
Вегетативный рост: коричневое кольцо ° 5
Воздушный мицелий: нет.
Растворимый пигмент: зеленоватокоричневый.
Разжижение желатины: полное. агар-снятое молоко.
10 . Вегетативный рост: темно-коричневый, Воздушный мицелий: нет.
Растворимый пигмент: темно-коричневый, Гидролиз казеина: хороший.
Лакмусовое молоко, Вегетативный рост: темно-коричневое кольцо роста.
Воздушный мицелий: нет.
Цвет — темно-коричневый.
Коагуляция и/или пептонизация: полная, делается щелочной (рН 8,1).
Снятое молоко.
Вегетативный рост: темно-коричне- . вое кольцо роста. 25
Воздушный мицелий: нет.
Растворимый пигмент: темно-коричневый.
Коагуляция и/или пептонизация: полная пептонизация, делается щелоч- у() ным (рН 8).
Температура: (агар с дрожжевым экстрактом + соли):
28 С вЂ” хороший вегетативный рост и воздушный мицелир, 35
3 7 С вЂ” хор оши и ве гет ати вный ро ст
;и воздушный мицелий, 50 С вЂ” роста нет.
Потребность в кислороде: (культура уколом в агаре с. дрожжевым экстрактом + соли).
Аэробная культура.
Все определения производились через три недели при 28 С, если
Не оговорено иначе. Значения рН всех сред почти нейтральные (6,8-7,2) .45
При тщательном сравнении этих. данных с опубликованными описаниями, включая Руководство по определенной бактериологии Беркея (8 издание) известных микроорганизмов, обнару- 5Q живаются значительные различия, указывающие,что данный микроорганизм. должен бить классифицирован как новый вид, На этом основании он был назван 51гер1от сеэ очегmitit)i s . S5
С-О 76-соединения получают при фермент апии подходящей водной питательной среди штаммом Streptomvces averrniti(is в описываемых далее условиях: водные среди, применяемые для получения многих антибиотиков, являются также пригодными для данного процесса получения С-076-соединений.
Такие питательние среды содержат чсточни ки j глерода и азот а, ассимилируемые микрооргачизмами и неболь20,0
15,0 10, 0
4,0
0,5
2,5
0 1
0,01
0,01
Кукурузная мука, г
Соевая мука, r
Барда, г
Цитр ат натри я, r
СаС3 .2Н О, r
Полигликоль P 2000, мл
М СО4 ° 7Н О, r
СаС1 6Н О, г
FeSO< ° 7Н О, г
Дистиллированная вода, мл рН 6, 1000
Среда В
Р аст воримий кр а ямал, г
I .èäêoñTü от замп ки кукурузы, г
Перелоза, г
20,0
15,0
>,О шие количества неорганических солей.l
Г
Кроме того, ферментационные среды могут содержать следи металлов, необходимых для роста микроорганизма. Они обычно присутствуют в виде комплексных соединений источников углерода и азота, применяеых в качестве источника питания, но их мож)to добавлять к среде отдельно.
Такие углеводы как сахар, например декстроза, сахароза, мальтоза, лактоза, декстран, церелоза, и т.п. и крахмалы являются хорошими источниками ассимилируемого микроорганизмами углерода в питательных средах.
Количество источника углерода, применяемого в среде, частично зависит оТ количеств других компонентов среды и обычно составляет 0,5-5вес.% от количества среды и считается достаточным. Источники углерода можно применять отдельно,или их можно комбинировать в среды с другими компонентами, При образовании С-076-соединений легко ассимилируемых штаммом Streptornvces averrnitifis применяют такие различные источники азота, как дрожжевые гидролизаты, дрожжевые автоли- заты, соевая мука, гидролизаты казеина, дрожжевые экстракты, жйдкости для замочки кукурузы, кукурузная барда, мука хлопковых семян, мясные экстракты и т.п. Можно применять или один источник, азота, или в комбинации с другими соединениями в количестве 0,2-6 вес.% среды.
Из питательных неорганических
O солей, которые можно вводить в культуральные среды, можно назвать обычные сони, способные давать ионЫ Натрия, калия, магния, аммония, кальция, фосфата, сульфата, хлорида, карбоната и т.п. Вводятся в поеду также следы таких металлов, как кобальт, марганец, железо и т.п. Далее приведены примеры сред, пригопных пля выраь1ивания штаммов 5treptoittvces aver пъ66з с целью получения Г-076 соединений
Среда А.
716524
Соевая мука, г (ИИ)SO, г
Кукурузная мука, r
Соевое масло, мл
КН РО4, г
Дистйллированна я вода, мл рН 6,7
4,0
4,0
1, 0
2,5
0,3
6,0
1000
Среда С
Томатная паста, r
Овсяная мука, г
Дистиллированная вода, мл рН 6,0. 40,0
15,0
1000
Среда
Овсяная мука, г
Томатная паста, г
Дистиллированная вода, мл рН 5,5
20., 0
20,0
1000
Среда Е
Декстроз а, r
Пептон (фирьи ДИАко
Лабор атори з Детройт ), г
Дрожжевой автолиэат, г (Ардамин оН Анимы
Ист Продактс Инк, П ат ерсон )
НаСМ, г
КС3, r
FeSO4 (1 Н ), 8О„6Н2О, MgC3 - 6 Н О, г
СаС2а 2 H*O, г
Дистиллированная вода, мл рН 7,4
10,0
5 0
3,0
12 7
О, /2
0,035
5,32
0,73
1000
60 Ферментацию с применением микроорганизмов, образующих С-076-соединения,можно проводить при 20-40 С.
Для получения -оптимальных результатов наиболее целесообразно проводить эти ферментации при температурах
24-30 С. Наиболее предпочтительны температуры 27-28ОC. рН питательной среды, пригодной для получения С-076 соединений, можно менять в пределах 45
5,0-9,0 предпочтительно 6,0-7,5.
Ферментации в небольших количествах удобно проводить в колбе в стерильных условиях, заражая питательную среду спорами или вегетатив- 50 ними клетками штамма St ornvces aver-, mitipis образующего С-076 — соединения
Колбу затыкают ватой и выдерживают при постоян ной температуре 2 8 С и вэбалтывании в течение 3-10 дней. 55
При работе с большими количествами ферментацию рекомендуется пооводить в сосуде, снабженном мешалкой и устройством для аэрирования питательной средь1. Питательную среду готовят в сосуде, стерилизуют и затем заряжают источником вегетативного клеточного материала штамма Streptomvces averritiQis образую его С-076соединения. Ферментацню продолжают
1-8 дней при перемешивачии и/или аэрировании питательной среды при температуре 24-37 С, скорости перемешивания95-125 об/мин и при подаче воздуха 1,8-18 м1/мин.
Получаемые lto изобретению новые вещества, называемые здесь С-076веществами, находятся r;,o окончании ферментации главным образом в мицелии и могут быть извлечены и отделены, как описано выше. Выделяют четыре главных и четыре второстепенных компонента C-07б-соединениг, образуемых
Ягефотусеэ averrriНбв . Идентифицировано восемь различных соединений С-076, Ala, Аlв, А2а, А2в, Вlа, В1в, 82а В2в, Главные компоненты обозначены )буквой а, второстепенные буквой в . Структурные различия между соединениями а и в должны быть одинаковыми для каждой из четырех пар, Как и следовало ожидать, даже главные С-076-соединения не образуются в одинаковых количествах при описанных здесь условиях ферментации. Так, Al соединения составляют
20-30 вес.% от общего количества получающегося комплекса С-076, соединения А2 составляют 1-20 вес.%., соединения Bl и В2 каждое 25-35%. Весовое соотношение ряда соединений а к ряду соединений в равно
85-15 - 99:1.
Отделение соединений С-076 от всей Ферментационной массы и извлечение индивидуальных компонентов . производится экстракцией растворителем и хроматограйнческим фракционированием различными хроматографическими методами и с различными системами растворителей.
С-076-соединения слабо растворяются в воде и хорошо в органических растворителях. Это свойство используют для извлечения их из ферментационной среды. Так, по одному способу извлечения всю ферментацион. ную массу отфильтровывают и водный фильтрат выбрасывают. Затем отжатый влажный фильтровальный остаток мицелия экстрагируют подходящим растворителем. Хотя и можно применять любой органический растворитель, лучше применять растворитель, смешивающийся с водой, например ацетон, метанол, этанол и т.д. Для достижения макси.мального извлечения рекомендуется многократная зкстракция. Растворителем извлекаются активные компоненты
С-076, а также вещества, не обладающие антипаразитической активностью соединения С-076.
Если растворитель смешивается с водой, то воду также удаляют из влажного мицелия.Экстрагированный мицелий можно отбросить. Экстракты упарнваот для удаления органического растворителя и экстракцию повторяют несколько раз с другим растворителем. Если
716524
А1в А2а
А2в
1 . >o +38, 3 "+2 +55,7 i2 +68,5 т2 +48,8 +2 Оптическое вращение (С=0,87) (С =1, 06) (С =1,64) Иолекулярная масса (определена масс-спект.— рометрически) 858 890 876 872 872 904 890 886 Ультрафиоле- 237 товый спектр (28;700. 4, 458) 237 (29; 120; 4, 464) 237 (27;580; 4, 441) 237 (28:800; 4,459) 243 (31, 850; 4, 503) 243 (30,590; 4, 486) 243 (31 740," 4, 501) 243 икр аах ° 243 (31,275; 4, 495) 252 (20,5101 4, 431) 252 (20,060; 4, 302) 252 (20, 425; 4, 310) 252 (20.290; 4,307) примеси соединений ряда в. Ряды а и в различаются только числом д -СН в. низкоалкильном заместителе и эта 60 азница не связана с хромофором. ультрафиолетовое поглошен разница ние в первую очередь характеризует степень и природу ненасышенности в слединеОптические вращения определяют, нии. о и поля именяя стандартные методы и Ультрафиолетовые спектральные данные были получены с помощью ульфиолетового спектрометра Кери, ах в модель 15 в метанольных р аствоюах кварцевых ячейках, плошадью 1 см Мотя ультрафиолетовое поглощение представлено как поглощение ряда по глошеа, фактически оно является по нием соединений ряда а, д р сп ер>кащих при первой экстракции применяют с г=1 шивающийся с водой растворитель, то при второй экстракции предпочтительнее применять не смешивающийся с водой растворитель, например хлороформ, хлористый метилен, четыреххлористый углерод, этилацетат, метилэтилкетон, метилизобутилкетон и т.п. Полученные экстракты высушивают и концентрируют обычными методами ° Получают остатки, содержащие C-076-соединения с примесями других соединений. Затем эту фракцию хроматографируют для отделения активных. С-076-соединений от прочего материала и также для выделения индивидуальчых С-076-соадинений. хроматографируют на колонке с применением таких сред, как силикагель, окись алюминия, гели декстрана и т.п. и элюирование производят или различными растворителями и/или 20 комбинацией двух или более раствори телей, взятых в различных соотно шениях. жидкостную хроматографию применяют для открытия С-076-соединений и жидкостную хроматографию высокого давления можно применять для выделе ния очищенных фракций, содержащих одно или более соединении. Аналогично храматографию в тонком слое можно применять для обнаружения и выделения индивидуальных С-076-соединени . Присутствие активных С-076-соединений определяется испытанием различных хроматографических фракций на антипаразитическую активность и также спектральными характеристиками этих соединений, Спектральные и другие физико-химические характеристики индивидуальных С-076-соединений приведены в табл.1, Эти соединения хорошо растворимы в больщинстве обычных органических растворителей и обладают минимальной растворимостью в воде. 1" а б л и ц а ! 716524 Таблица 2 Ala(0,6 мл 16%) 15,1 27,5 20,3 13,0 19,9 18,4 12,0 16,4 17,7 (ЗС) 35,2 39,7 56,4 45,7 40,5 34,3 30,6 36,6 67 3 68 2 76,1 74,9 (2С) 57,7 (2С) 69,4 (2С) 77,0 95,0 78,3 . 79,4 95,8 82,0 (2С) 80,6 77,5 119,7 124,9 135,2 136,0 (2С) 118 4 98,5 127,8 136, 0 139,9, 173, 8 136, 6 136, 1 A2g(0,6 мл 16%) 13, 8. 15,1 35,8 11 8 27,3 20,3 18,4 19,9 17,7 12,4 40,8 41,2 45,7 39,8 36,5 35,3 (ЗС) 34,3 68,2 67,3, 67,7 70,8 69,9 (ЗС) 57,7 ) (2С) 56 4 79,4 94,9 81,8 80,6 (2С) 78) 3 77,6 77,0 76 1 118,4 119,7 136,6 124, 9 135, 7 117,7 173,7 99,7 97, б. 137,6 140,0 B1a(0, 3 мт.„16%) 12i0 27,5 20,2 19,9 18,4, 17,7 16,4 15, 1 12,9 56, 4(ZC) 78,3 118к 1 45,7 40,5 39, 8. 36,6 35,2 30,6 34,3 (ЗС) 68, 62 (2С) 76, 1. 75,0 95, 8. (2С) 68,4 67,8 67,3 98,5 95,0 82,0 (2С) 80,5 (2С) 79,4 (2С) 136, 2 137,9, 127,9 135,2, 124,8 120, 4 173,6 118, 4, 1.39, 7, В2в (О, б мл 16%) 20,2 27, 3 18, 4; 19,9 12,4 1ь,б риметр,еАсса. Фактор концентрации (с) дается как количество соединения в данном растворителе, выраженное в процентах.. Данные ЯМР-спектра 13С для С-076 Ala, A2a:В la и В2в приведены в табл. 2. Спектры получены с помоцью спектрометра ядерного магнитного резонанса. Вариант модели CET-20 в дейтерированном хлороформном растворителе при 13,8 15,1 . 17,7 применении тетраметилснлана в каче"тв- внутреннего стандарта, Обьем раствора и концентрации образцов указаны в кажцоч случае с последующими химическими сдвигами относительно тетраметилсилана для каждого соединения, данными в частях на миллион. Химические сдвиги даются для отдельного атома углерода, если не оговорено иначе, в скобках после химического сдр ига, 716524 13 Продолжeние . табл, 2 62 (0,6 мл 16Ъ) 35,2 35,8 36,5 45,8 41,2 40,8, 39,8 68,3 (ЗС) 34,4 67, 3 67,7 (2СО) 70,9 69,9 (3С) 56,4 (2С) 98,6 94,9 81,8 (2С) (2С) 80, 5 120, 4 124, 8 79, 4. 73,3, 117,7, 173,5 76,1 99,7, (2С) 135,7 . )38,0 118,0 139, 8 Н0 30 и где пунктирная линия указывает простую или двойную связь; R — окси35 группа, которая присутствует только тогда, котда пунктирная линия указывает на простую связь, R — бутил или пропил и R -метокси- или оксиз группа, CH -ССН, С Н3 -ОС Н, -ОСН1 Бу ил Двойная связь Двойная связь А1а А lв -OH А2а -ОН А2в --ОН Двойная связь Двойная связь Bla -OH B la -ОН В2а -ОН -ОН В2в Характеристики масс- спектральныХ пиков восьми С-076-соединений приво,— дятся в табл.3, В первой строке таб- 20 лицы представлено отношение массы к заряду. (м/е) молекулярного иона каждого соответствующего соединения и остальные циАры дают отношение массы: к заряду главных фрагментов каждого соединения. Отношения масс к заряду находяшихся в одном горизонтальном ряду, указывают аналогичные фрагмен.,ты каждого соединения. ,Основываясь на экспериментальных данных, исследованиях и измерениях, :описанных здесь, считается, что С-076-соединения должны иметь следуюшую структурную формулу: Ri где R- P - ) -олендроз ил- f -1-олеандрозид структуры Индивидуальные соединения, входяшие в эту структурную Формулу поиводятся ниже: Пропил Бутил Пропил Бутил Пропил Бутил Пропил 716524 lá Новые соединения>полученные по изобретению, имеют значительную паразитицидную активность, как антигельминты, инсектициды и акарициды, у(ля животных и в сельском хозяйстве, Как готовые препараты эти соединения можно назначить внутрь, например в виде капсуль, больших пилюль или таблеток в виде жидких обильных доз антигельминтов для млекопитающих, Такие .отдельные дозы могут широко изменяться по общему весу и содержанию антипаразитического агента в зависимости от таких факторов, как паразит, подлежащий уничтожению, силы и типа инфекции и веса тела животного, Применять предлагаемые соединения можно или как очищенные индивидуальные С-076-компоненты, или в виде примесей двух или трех индивидуальных компонентов, поэтому нет необходимости тщательно разделять различные С-076-соединения, полученные после очистки ферментационной среды, Обычно для предупреждения переносимых паразитами забОлеваний приМеняЮт смесь, содержащую два или более С-076-соединений, но без примесей других соединений. Такая смесьобычно содержит C-076-соединения в произвольных соотношениях, но все они обладают значительной активностью. Антипаразитическая активность может быть точно определена. В частности, необяз тельно отделять компоненты в от родственного компонента в . Такие соединения отличаются только длиной 25-ой боковой цепи. Разделение таких родственных соединений обычно не производится, так как соединение в присутствует лишь в виде примеси. С-076-соединения при добавлении к корму животных можно использовать в виде жмыхов мицелия Аерментацион25 55 бО Соедин ени я, в ксторнх R 1 — бутил (соединения ряда а ) и соответствующие соединения, в которых B — пропил (соединения ряда в ) ведут себя одинаково в большинстве процессов извлечения, например при экстракции растворителем. В каждой паре соединений а и в соединение а находится в больщем количестве и обычно составляет 85-993 смеси соединений t|y и в . Присутствие пропиловых соединений подтверждается - 10 ,масс-спектрами соединений, где пики представляют собой Фрагменты, содержащие бутильную группу, имеют парные пики с массой на 14 единиц (или одну -СН ) меньше. В дополнение следует отметить, что для отделения компонентов Вlв от компонентов Ala применяли жидкостную хроматогграйию высокого давления и масс-спектр такого Аlв-соединения подтверждался масс-спектромет-20 рией высокого разрешения (см.табл.3) ной среды. Поскольку мицелий достаточно активный и уров ен ь акти вности мицелия можно определить, его можно добавлять непосредственно к корму животных ° Пример l. Среда 1 Томатная паста 20 г/л Дрожжи 10 г/л Крахмал модифицированный, 20 г/л СоСЙ - 6Н О Полигликоль 2000 Дистиллированная вода рН 7,2-7,4 5 г/л О, 321 мл/л Дост аточное количество Стадия A, . 50 мл среды 1, помещенной в колбу Эрленмайера емкостью 250 мп, инокулируют з амороженной ампулой 5treptomvсез ove .ттнН6 МА 46 80, Колбу инкубируют при 28 С при вращении взбалтывателя со скоростью 160 об/мин по кругу диаметром 50 мм в течение 24 ч. Стадия В. 500 мл среды 1, содержащейся в двухлитровой колбе Эрленмайера, инокулируют 10 мл содержимого колбы стадии А. Среду инкубируют при 28 С IIpH вращении вэбалтывателя co скоросстью 150 об/мин по кругу диаметром 50 мм в течение 24 ч, Стадия С. В бродильный чан иэ нержавеющей стали емкостью 189 л заливают 160 л среды 2 и добавляют 500 мп посевного материала, полученного на стадии В. о Чан инкубируют при 28 С при вращающейся со скоростью 150 об/мин мешалке в течение 24 и скоростью аэрирования 2,7 м /мин. Среда 2. Декстроз а, г/л 1 Крахмал кукурузный, 10 г/л Мясной экстракт, г/л 3 . Автолизированные др ожж и, г/л NgSO . 7Н О, г/л, О, 05 Ma HPO, г/л 0, 10 К,РО, r/ë О, 182 Сасо, г/л 0,5 Дистиллированная До ст ат очное вода рН 7, 0-7, 2 количество Стадия Д. В бродильный чан из нержавеющей стали емкостью 756 л заливают 457 л среды б и добавляют 43 л материала прививки, полученного по стадии С. Чан инкубироваЛи при 28 C при перемешивании и скорости вращения мешалки 114 об/мин и аэрировани r при скорости потока воздуха — 9 м /мин. Стадия 3. Крахмал продажный, CPC, r Модифицированный (фирмы CPC Корп, г 40,0 Барда, r 7,0 17 1.8 716524 Автолизированные дрожжи (фирмы Ист продактс инк), г СоС Е< 6Н О, мг Дис тиллиров ан н ая нода, мл рН 7 3 5,0 1000 Фракцию С-076 Bl хроматограФируют на 2 силикагелевых пластинках (как указано выше) гек саном, содержащим 15Ъ изопропанола и получают 55 мл почти чистого С-076 В1. ЯМР- спектр этого образца приведен в табл.2. Пример 2. Ферментацию, описанную н примере 1, повторяют дважды и обе среды объединяют. Ферментационную среду обрабатывают так, как описано н примере 2, полу ая 3, 3 л первоначального хлороАормпого экстракта, который содержит 60 мг/л всех твердых веществ и по данным хро ла1 тографии в тонком ело 0, 5Ъ mr- л; нений С-076. Стадия Е. По окончании этого всю культуральную среду отфильтровывают и оставшийся на фильтре жмых, содержащий С-076 ,соединения, промывают водой. Затем его взмучивают в 120 л ацетона в течение 30 мин, отфильтровывают и промывают 30 л ацетона. Ацетоновые экстракты объединяют и выпаривают при пониженном давлении до объема 40 л. 15 Разбавленной соляной кислотой рН концентрата доводят до 4,0. Концентрат экстрагируют 3 раза произвольными количествами хлороформа. Хлороформные экстракты высушивают пропускани- Э1 ем через слой инфузорной земли (СаперСел). Объединенные экстракты концентрируют при пониженном давлении до 4 л. Хлороформный концентрат филь.труют и загружают в колонку, заполненную 2,9 кг силикагеля в хлороформе. Колонку элюируют хлороФормом, собирая восемь фракций по 3,5 л каждая. Затем колонку элюируют смесью .хлороформ: метанол-(49:1), собирая еще восемь фракций по 3,5 л (Фракции 9-16). Фракцию 3. упаривают досуха и получают 76 г маслянистого нещества, содержащего главным образом С-076-соединения. 97Ъ этого продукта растворяют в 685 мл хлористого метилена и хроматографируют на 600 г кремнекислоты, Колонку (диаметр 7,3 мм, длина 36см) проявляют 7,5 л смеси хлористого метилена и бензола (7:3) и затем"О 2,26 л смеси хлористый метилен бенэол-7:3 с добавкой 5Ъ иэопропанола. Фракция, элюированная смесью хлористо го метилена с бензолом с добавкой 5Ъ изопропанола,имеет четко окрашенную 45 полосу и содержит фактически весь материал С-076, как это было определено хроматографией в тонком слое (см.пример 5). Эту фракцию объемом (500 мл) упаривают и снова хрома- 5() тографируют на 105 r кремнекислоты (диаметр колонки 3,7 см, длина 18 см) в хлористом метилене. Колонку проявляют тремя порциями хлористого метилена по 100 мл, содержащего у 4,10 и 20Ъ эфира. )(альнейшее элюирование хлористым метиленом с содержанием 20Ъ эфира дает 2 окрашенных полосы. Фракция между двумя полосами фактически содержит весь С-076-ма60 териал, как это установлено с помощью хроматогра ни в толк эм слое, Фракцию, содержащую С-076, хроматографируют на 59 г коемнекислоты ;(диаметр колонки 3,7 cv, длина 11 см) в хлористом могилеве. Колонку промывают хлористым метиленом, содержащим 10Ъ эфира, В начале элюирования отбирают фракции по 70 мл и затем отбирают 26 фракций по 5-6 мл. Фракции 3-26 объединяют и получают 1,35 r материала, его анализируют хроматографией в тонком слое (силикагелевые пластинки Аналтак G F 254, проявленные хлористым метиленом, содержащим 5Ъ изопропанола, Веществом, имеющим Rf 0,28 является С-076 Аl. Колонку элюируют хлористым метиленом, содержащим 20Ъ эфира (200 мл), затем хлористым метиленом, содержащим 50Ъ эфира (800 мл), Получают небольшое количество смеси С-076 Al и А2 и нсе остальное количество С-076 А2. Вес С-076 А2 800 мг, При дальнейшем элюировании хлористым метиленом, содержащим 5Ъ изопропанола, получают 135 мг С-076 Bl Разделение производят по ультрафиолетовому поглощению элюата. С-076 Bl u А2 имеют очень близкие величины и на силикагелевых пластинках хроматограмм в тонком слое (аналтак G F 254) и хлористом метилене с 5Ъ изопропанола. Рднако оба компонента ясно различимы на тех же пластинках, проявленных гексаном, содержавшим 10Ъ изопропанола. Всю фракцию С-076 А1 наносят на 14 силикагелевых пластйнок (аналтак СТ 254, 20 х 20 см, толщина 500 мкм) . Пластинки проявляют гексаном с 10Ъ изопропанола. Полосу, содержащую С-076 Al удаляют с пластинок, экс- . трагируют эфиром и снова наносят на б пластинок и 5 раз проянляют гексаном, содержащим 5Ъ изопропанола. -076 Al удаляют с пластинок, снова хроматографируют, проявляют чистым эфиром и получают 270 мг почти чистого С-076 Al ИК- и ЯМп-спектры этого образца приведены в табл.2, Фракцию С-076 А2 хроматограФируют на 10 силикагелевых пластинках (аналтак HF 254), проявляют 5 раз ,гексаном, содержащим 15Ъ изопропано ла и получают 265 мг почти чистого С-076 А2, ИК- и ЯМР-спектры образца этого вещества приведены в табл.2. l9 716524 3 л этогс хлороформного раствора хроматографируют на 2400 г силикагеля (Девидсон, сорт 62) н хлороформе.Колонку (.9,5х122 см) проявляют восемью пооциями по 3800 мл хлороформа (фракции 1-3), затем восемью порциями по 3800 мл смеси хлороформ: метанол-49:1 (фракция 9-16) . Индивидуальные фракции анализируют хроматографией в тонком слое (силикагелевые пластинки Кванта/Грамм 01Г), поо- 0 явленные хлороформом: метанолом =19:1. Каждую из фракций 9-11, 12-13 и 14 выпаривают досуха. и получают 6,63 r твердых веществ, содержащих С-076А компоненты,но фракциях 9-11 24,9 г твердых веществ, содержащих С-076В компоненты, но фракциях 2-13 и 4,7 г твердых веществ, содержащих -076B-компоненты во фракции 14. Фракции 12-14 объединяют (29,62г), растворяют в 100 мл хлористого мети- 20 лена и хроматографируют на 400 r силикагеля (Девидсон, сорт 62) в хлористом метилене. Колонку элюируют 1500 мл смеси хлористый метилен: 2-пропанол-99:1, 1500 мл смеси хло- Я5 ристый метилен: 2-.пропанол-49:1, 2000 мл смеси хлористый метилен: 2-пропанол-19: 1 и 1000 мл смеси хлористый метилен: 2-пропанол-9:1. 2,56 r вещества, выделенного из элюа- () та объемом 5500 мл, и 5,09 r, выделенного из элюста объемом 60006500 мл, растворяют в 25 мл хлористого метилена и хроматографируют на 60 г силикагеля в гексане. Собирают головные фракции из 70 мл гексана и 100 мл смеси гексан: диэтиловый эфир-„4:1 и затем колонку проявляют 600 мл сме си гексан: диэтиловый эфир=l:4, отбирая фракции IIo 20 мл и затем элю- 40 ируя 700 мл эфира и отбирая фракции по 100 мл. Из элюатов объемом 400600 мл получают 1,035 г твердых веществ, содержащих Bl-компоненты С-076у иэ объемов 600-1000 мл полу- 45 чают 0,881 г твердых веществ, содержащих смесь компонентов Bl,B2= аС-076, и из объемов 1100-1500 мл получают 0,381 г твердых веществ, содержащих В2-компоненты С-076. 5() Смесь компонентов Bl и В2 затем растворяют н 4,2 мл смеси метанол: вода=4:1 и хроматографируют на Порасиле С18 (Бонданак 37-75 мкм в том же растворителе. Из обратнофазной колонки высокого давления (сначала элюируются более полярные компоненты) размером 1,2 м х 16 мм элюируют вещество со скоростью 800 мл/ч и отбирают фракции по 21, 3 мл, Приcóòñòâèå компонентов С-076 подтверждается наблюдением УФ-поглощения фракций. С-076 В2 несом 137 мг извле-" кают во фракциях 24-37 и С-076 Bl весом 195,4 г но фракциях 51-70. Затем каждый образец отдельно хроматоt графируют на колонках, заполненных 4 г силикагеля (Денидсон, сорт 62) в хлористом метилене. Колонки элюируют 35 мл смеси хлористый Ieтилен: метанол=9:l. Последние 20 мл элюата из каждой колонки собирают, выпаривают досуха и получают 155,8 мг С-076 В2 и 90 мг С-076 Bl. Затем 50 мл С-076 Bl и 100 мл С-076 В2 храматографируют на препаратинных силикагеленых пластинках (Аналтак HF 254) извлекают гексаном, содержащим 12% изопропанола с последующим извлечением эфиром и получают почти чистые С-076 Bl и С-076 В2. Пример 3. 50 мл среды, находящейся в колбе Эрленмэйера емкостью 25 мл, состава, нес.Ъ: Лактоза 2,0 Барда 1,5 Автолизированные 0,5 дрожжи рН перед стерилизацией 7,0 было инокулировано содержимым замороженной ампулы streptornvces aveI"vniti(Iis MA 4848 и инкубировано во вращающемся взбалтывателе при 28 С в течение 24 ч при скорости вращения 150 об/мин. 10 мл этой ферментационной среды используют для инокуляции такой же среды в двухлитровой колбе Эрленмейера. Ферментационная среда инкубировалась при 28 С 24 ч при 50 об/мин во вращающемся взбалтывателе. Все эти среды затем применяют для инокулирования 467 л соеды в бродильном чане емкостью 756 л состава,вес.Ъ: Лактоза 2,0 Барда 1,5 Автолизированные 0,5 дрожжи Полигликоль 2000 мл,л. 0,32 рН перед стерилизацией 7,0 Ферментационную среду инкубируют при 28 С 40 ч пропусканием воздуха (9 мз/мин) при перемешинании со скоростью 130 об/мин. 2 30 л этой среды используют для инокулирования находящейся н бродильном чане иэ нержавеющей стали емкостью 5760 л среды следующего состава, вес.Ъ: Декстроз а 4,5, Пептонизированное молоко Антолизиронанные дрожжи 0,25 Поли гликоль, мл/л 2,5 рН перед стерилизацией 7,0 Ферментацию продолжают 144 ч при 26 С путем пропускания воздуха — 49 м /мм и перемешивании со rwnpocтью вращения мещалки 120 об/мин. Ферментационную среду отфильтровывают, фильтровальиый жмых мицелия проминают 550 л воды и Аильтрат и .промывные воды, отбрасывают. Фильт21 716524 Пример 5. В колонку диамет- 55 ром 20 см загружают слой 34 кг активированного глинозема и затем слой 34 кг активированного угля в хлористом метилене. Остаток из предыдущего примера растворяют в хлористом метилене доводя объем до 34 л, зали/ вают в колонку и элюируют 34 л,: хлористого метилена и эти фракции отбрасывают. В колонку подают ЗЪ-ный раствор изопропанола в хлористом метилене (20,8 л изопропанола и 660 л тровальный жмых взмучивают в течение 1 ч с 500 л ацетона и отфильтровывают. Отфильтрованный жмых промывают 150 л ацетона и 40 л воды и получают около 2000 л экстракта. Ферментацию и экстракцию повторяют в тех we количествах и получают. еще 2000 л ацетонового экстракта, который затем объединяют с первым экстрактом и упаривают до 800 л с помощью концентрированной соляной кислоты; рН концентрата устанавливают 4,7 и добавляют 800 л хлористого метилена ° Объединенные растворители перемешивают 4 ч и слои разделяют. К водному слою добавляют еще 600 л хлористого метилена и церемешивают 4 ч. Слои разделяют H каждый экстракт отдельно обрабатывают. Оба экстракта упаривают до общего объема 60 л. П р имер 4, 60 л раствора; 20 из предыдущего примера ударивают досуха в вакууме для удаления остаточного хлористого метилена и к остатку 3 раза добавляют по 60 л метанола. Конечный .объем метанольного концен- 2$ трата 36 л. Метанольный раствор выдерживают ночь и отфильтровывают. Фильтровальный жмых промывают 40 л свежего метанола и фильтраты и прорывные воды объединяют, Затем в метанольный 30 раствор добавляют 95 л этиленгликоля и 130 л гептана. Двухслойный раствор проьювают смесью 20 л этиленгликоля и 6, 3 л метанола. Спустя 5 мин после перемешивания,нижний слой от- у :деляют и объединяют с первым этиленгликоль-метаноловым экстрактом. К этому экстракту добавляют равный объем воды (около 150 л), содержащей 79 г соли на 1 л. Полученный раствор экстрагируют 150 л эфира и перемешивают в течение 5 мин. Эфирный слой промывают 75 л воды (1/2 объема), перемешивают 5 мин и слои разделяют. Этот процесс повторяют еще 2 раза (промывная вода содержит 20 r соли на 1 л). Эфирный слой упаривают в вакууме до минимального объема при температуре менее 25 С. К остатку добавляют 40 л хлористого метилена и раствор 50 выпаривают досуха. Этот процесс повторяют и конечный остаток концентрируют в вакууме досуха. хлористого метилена) и элюируют, отбирая фракции-200 л. Эти фракции упаривают в вакууме на бане, нагретой до 60 С, до объема 20 л, Затем о снижают температуру бани до 45 С, экстракт выпаривают в вакууме досуха. Остаток растворяют в 10 ч хлористого метилена, 10 ч гексана и 1 ч метанола до конечного объема 15 л, Этот раствор загружают непосредственно в колонку с Сефадексом Н-20. Пример 6. В колонку диаметром 30 см загружают 36 кг Сефадекса Н-20 и промывают смесью хлористый метилен: гексан: метанол=10:10:1. В колонку заливают .0,25 раствора С-076 и элюируют со скоростью 250 мл/мин. Отбирают две первые фракции по 20 л, которые отбрасывают и затем 20 фракций также по 20 л. Последнюю фракцию также выбра".ывают, Было найдено, что фракции 1-8 содержат С-076-соединения A- u фракции 9-10 В-соединения, 680 r этого образца растворяют в 2 л хлористого метилена, загружают в 22-литровую трехгорловув круглодонную колбу и добавляют 13,6 л метанола. Затем хлористый метилен отгоняют в вакууме, одновременно добавляя 13,6 л этилацетата. Скорость отгонки регулируют так, чтобы температура раствора была не ниже 650С. После добавления этилацетата раствор остывает при 5 С 16 ч. Кристаллы отфильтровывают и промывают 1 л холодного этиленгликоля. Затем кристаллы снова растворяют в 2 л хлористого метилена и раствор загружают в 22-литровую трехгорловую круглодонную колбу.Эту . процедуру повторяют дважды, В .первыР раз применяют по 12,5 л метанола и этиленгликоля и во второй,раз по 13,5 л. Полученные в конце кристаллы промывают 1 л холодного этиленгликоля и 1 л воды. Кристаллы растворяют в 4 л воды и высушивают фильтрованием через сульфат натрия. Бензольный раствор концентрируют до 2 л, лиофилизируют и получают 341,2 г белого порошка, состоящего на 98Ъ из С-076-Bl u 1Ъ С-076-В2. Маточные растворы после кристаллизаций объединяют и разбавляют 22 л воды. Водный раствор экстрагируют 60 л толуола и снова 15 л толуола. Толуольный экстракт затем промывают 48 л воды. Органическую фазу фильтруют для удаления остатков воды, упаривают и получают 336 г твердого материала, состоящего на 79 Ъ из С-076-В2 и на 16Ъ из С-07 В1-соединений. Пример 7. В четырех колонках, заполненных Сефадексом ." Н-20, как B примере 6, получают Фракции 1 — 8 и их объединяют. По данным, полученным с помощью жидкостноа хро716524 24 872 886, 5072 742, 4229 746 732 584 570 566 552 723 714 566 552 548, 3131 584 746 760 728 580 ю 3406 548,3136 456 р2886 305, 2 120 584 566,3265 598 552 566 442 442 456 442 456 442 456 309 323 291, 1962 323,2225 309,2070 305 291 291 305 291 305 261, 139 261 261 261 275 275 275,1292 257,1382 221, 1527 193, 1587 199, 110 1 275 257 257 257 257 257 257 257 225 239 207 221 239, 1637 225 207 179, 1429 221, 1691 197, 1542 193 197 211 179 199 199 199 199 199 199 199 матографии высокого давления, было найдено, что смесь содержит 252 r C-076 А2а, 16 r A2B, 94 г Ala u 24 г Аlв, Полученный продукт растворяют в смеси растворителей гексан: -,îëóîë: метанол =6:1:1 и загружают в колонку со Сефадексом Н-20 таких) же размеров, как в примере 2. Фракции собирают при скорости элюиронания 250 мл/мин, причем первые 20 л отбра сывают. Затем элюированием получают еще две 20-литровых первичных фрак-ции, которые также отбрасывают и 50 фракций по 4 л, которые содержат С" -,076 A-соединения. Было найдено, что фракции 3-8 содержат преимущественно .Al компоненты (40,2 г Ala и 6,7 г Аlв) и фракции 29-36 С-076 А2 соединения (117,2 r A2a и 7,35 г А2в) . Фракции 9-28 содержали смесь С-076 ,Al и А2 соединений. Пример 8. Образец С-076 В1 из примера 7 весом 150 r растворяют в 3 л смеси гексан:толуол:метанол"3:1:1. Раствор пропускают через колонку с Сефадексом 1 Н-20 ,(таких же размеров, как в примере 6) отбирают фракции со скоростью 250 мл/мин. Две первые 20-литроные фракции Отбирают и отбрасывают. Отбрасывают также головную фракцию объемом 10 л. Затем собирают 30 богатых фракций объемом 2 л. Фракции 1-13 и 25-30 отбрасывают. Фракции 14-16 объединя ют, Они содержат 80 r преимущественно С-076 Вlв. Фракции 22-24 объединяют. Они со держат 6,7 г преимущественно С-076 Характеристики мас,Вlв. Фракции 17-21 содержат смесь С-076 Bla и Вlв, Фракции 17-21 объединяют, концентрируют и пропускают через колонку, заполненную Сефадексом ХН-20, пользуясь тем же РаствоРителем, Три первых фракции по 20 л отбрасывают. Затем отбирают следующие богатые фракции: 5 фракций по 2.л (фракции 1-5) 20 фракций по 1 л (Фракции 6-25) и 10 фракций по 2 л (фракции 26-35).. Фракции 1-5 отбрасывают. Фракции 16-21 содержат 13,5 r С-076 Вlв и О, 4 г С-076 В2н, фракции 22-26 содержат 44 г С-076 Bla u 0,13 Вlв, фракции 27-30 содержат 10,2 r Вlв и 0,8 С 076 Вlв. Отделение компонентов в от компонентов а производят с помощью жидкостной хроматографии высокого давления. 30 мкл смеси С-076 Bla и Аlн Яо в абсолютном метаноле, содержащей 30 мкл С-076 Аlв загружают н колонку для жидкостной хроматографии высокого давления, содержащую Сфери-Сорб 5 мкм ОДЯ (фирмы Спектра Физикс) н 25 качестве насадки, Колонку элюируют смесью метанол:вода 85115 со скоростью 15 мл/мин. Элюирование контролируют по УФ- поглощению элюата и индивидуальные компоненты собирают 3О на выходе из УФ-прибора. Извлекают 30 мкг С-076 и анализируют в массспектрометре. Масс-спектр этого образца приведен во второй колонке табл. 3, В табл.4 и 5 приводится антипаразитарная активность полученных соединений. с-спектральных пиков Таблица 3 716524 26 Продолжение табл. 3 179, 1076 179 155 169 155 179 179 145 145 145 145 145 145 145 137 137 137 137 137 137 137 127 127 127 127 127 127 113 113 113 113 113 113 113 95 95 95 87 87 87 Вид организма Обработку не производили В1 1.-676, 895, 0,1 3 96 98 95 »««к««к 96 99 94 0 05 3 98 93 100 96 96 38 0,025 3 74 49 86 11 40 В2 и -676, 89700604 0,1 3 90 0 В2 I -676, 89 700604 I I 0,05 I I 0,025 87 0 .Р fl 90 0 Al l. -676, -89 1, 99Е04 73 59 17 4 8 0 72 0,1 3.169, 1226 145,0867 137,0954 127,0754 113,0604 . 95,0496 87,04444 Таблица 4 Антипараэитарная активность очищенных С-076-соединений -:при применении их на,искусственно зараженных овцах HS= 1=76 70 442 1421 1137. 2852 4110. 193 1761.,61 99 99 99 98 95 100 -71 99 99 99 93 35 100 к«» к кю к« « « ФФ 85 99 99 99 92 94 10С 716524 Продолмение табл.4 Вид организма 90 0 0 05 3 0,025 3 18 26 0 О 27 49 85 14 0 26 0 С-076 А2 L. »676, 893-ООХОЗОф1 3 99 " 98"" 97"" 36 13 100 96 " 99 9 14 i 87 46 46 53 0 83 88 % ° 0,05 3 0,025 3 46 1 72 69 11 5 23 0 31 — Снижение количества паразитов по сравнению с контрольным образцом, вызванное обработкой Р 0,05.<0,01 <0,001 соответственно . антипаразитарная активность С-076 при испытании на искусственно зараженном крупном рогатом скоте Таблица 5 внд организма Hacmonchus рlасс1 1 ф r i ch o s t o n» qy Fus ахе1 Соедимение Доз а, Еолимг/кг чество животных Cooper ia oncophora Ocsophagastonum radiafum 3реыи Зрелые 3реI лын Зре33В 2!В7 1196 59 5753 l 9 3 709 97 99 . 99" 99 1ОО" 9 4 97 100"" 77 99 + 99 96 НА+ 9 4 69 100 10 0+» 100 83 99 х 99 49 9 4" О 100 95 99 99 99 94 92 6Э 98 99 2Ь 95 1ОО" Я 9 + 99 то 0 чь" А2 1ОО 99 96 61 3 14 1ОО" Р< О, 00 1 < О, О 1 <О, 05 соответственно. Ф -Значительное снижение эффективности по сравнению с эффективностью при обработке другимн соединениями С-76, Ж05. h — Наружное применение, Щэа ботву на производилн 0t5 3 0,025 3 96 Ostertagia озМ 1оя В оо" s 1ОО Dictuocaц8ив vivl parus 716524 30 Составитель Л Мурая Редактор Л. Емельянова Техред М.Петко Корректор С. Шекмар Заказ 9557/49 Тираж 522 Подпи сное ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб,, д.4/5 Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Формула изобретения 1. Способ получения веществ, обладающих антипаразитарной активностью, отличающийся тем, что штамм Streptomyces avermitiiis NRRZ 8165 (ATTC 31267) выращивают на пи-. тательной среде, содержащей ассимилируеьые источники углерода, азота и неорганические соли в аэробных условиях с последующим выделением из среды выращивания целевого продукта. 2. Способ по п,1, о т л и ч а юшийся тем, что выращивание указанного штамма микроорганизма проводят прн температуре 20-40 С, рН среды 6,0-7,5 в течение 1-8 дней. 3. Способ по пп.1 и 2, о т л ич а ю шийся тем, что выращивание указанного штамма микроорганизма проводят на среде, содержащей 0,55% источников углерода и 0,2-6,0% источников азота. 4. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что целевой продукт выделяют путем фильтрования среды выращивания с последующим экстрагированием образовавшегося на фильтре остатка мицелия смешивающимисй с водой органическими растворителями, выпариванием органического растворителя и экстрагированием остатка на смешивающимся с водой органическим растворителем.
