Способ количественного определения зеараленона в тканях животных

 

Союз Советских

Социалистических

Республик

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ р >726479 (61) Дополнительное к авт, свид-ву(22) Заявлено 290777 (21) 2522203/23-04 с присоединением заявки №вЂ” (23) Приоритет—

Опубликовано 05.0480. кзллетеиь № 13 (51)М. Кл.

G 01 N 31/08

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий (53) УДК 54 3 . 54 4 (088.8) Дата опубликования описания 07.0480 (72) Авторы изобретения

В. В ° Ермаков и Н. A. Костюнина

Всесоюзный научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии

/ (71) Заявитель (54 ) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

ЗЕАРАЛЕНОНА В ТКАНЯХ ЖИВОТНЫХ

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам количественного определения микотоксина Ф-2-зеараленона(лактона б-(10-окси-5

-б-оксо-транс-1-ундеценил) 8 -резорциновой кислоты) в тканях животных.

Известен способ определения микотоксинов в кормах, заключающийся.в обработке анализируемой пробы хлоро- 10 формом с последующей обработкой хлороформного слоя гексаном и бензолом,.дальнейшей очисткой на колонке, заполненной силикагелем, и хромато-графированием остатка в тонком слое силикагеля (1).

Таким способом невозможно определить зеараленон.

К предлагаемому способу наиболее 2() близок способ количественного определения зеараленона в тканях животных, заключающийся в обработке анализируемой пробы хлороформом, очистке полученного раствора на колонке, запол- 25 ненной силикагелем, с последующим элюированием зеараленона смесью бензола и ацетона, концентрировании элюата с хроматографированием концент рата в тонком слое силикагеля (2). 3() Недостатками такого способа являются низкие чувствительность(0,5 мг/кг)и избирательность определения.

Целью изобретения является повышение избирательности и чувствительности определения.

Цель достигается способом количественного определения зеараленона в тканях животных, заключающимся в обработке анализируемой пробы ацетоном, очистке полученного раствора на колонке, заполненной окисью алюминия, с элюированием зеараленона смесью ацетона и воды, взятых в объемном соотношении 8,9-9,05:0,95-1,1, концентрировании элюата и хроматографировании концентрата в тонком слое силикагеля с последующей обработкой тонкослойной хроматограммы п-нитрофенилдиазоний тетрафторборатом.

Отличием предлагаемого способа является использование в качестве органического растворителя ацетона, качестве адсорбента окиси алюминия, троведение элюирования смесью ацетона и воды, взятых в объемном соотношении 8,9-9,05:0,95-1,1 и,последующая обработка тонкослойной хроматог726479 граммы и-нитрофенилдиазоний тетрафторборатом.

П р и и е р . Для определения зеараленона 10. r гомогенизированного образца (мышечная ткань, печень,почки кровь па ло еский материал) 5 вносят в колбу емкостью 250 мл. Затем в нее вливают 60 мл ацетона и встряхивают на шуттель-аппарате в течение

2 ч. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр в колбу с притертой пробкой. Извлечение токсина повторяют, используя еще 60 мл ацетона. Объединенный экстракт переносят в фарфоровую чашку Р 13 и выпаривают на кипящей водяной бане досуха. Получен(15 ный остаток очищают от коэкстрактив ных веществ на колонке окиси алюминия

П степени активности для хроматографирования.

Колонку для хроматографирования готовят следующим образом. 20

В нижнюю часть колонки помещают тампон ваты высотой -1 см, затем вносят 5 г окиси алюминия и промывают колонку 20 мл ацетона квалификации о.с.ч.,х.ч. или после дистилляции. р5

Остаток в чашке после выпаривания элюата.растворяют в 20 мл ацетона и вносят в колонку. После того, как экстракт опустится до верхнего .края столбика адсорбента, через колонку пропускают 150 мл чистого ацетона и затем 50 мл ацетона, содержащего 1% воды. Токсин элюируют 50 мл смеси ацетон-дистиллированная вода (9:1 по объему). Элюат собирают в чашку

Р 10 и выпаривают на водяной бане досуха. Остаток в чашке растворяют в 30 мл ацетона и фильтруют через бумажный фильтр в чистую фарфоровую чашку Р 10. Фильтрат выпаривают на водяной бане досуха.

Полученный после выпаривания растворителя остаток в чашке растворяют в 1 мл бензола и полностью в 2-3 приема наносят на пластинку силуфола микропипеткой, используя струю горя чего воздуха. Одновременно готовят свидетели т.е. наносят на пластинку

10; 20; 30; 50 и 100 мкл раствора зеараленона в бензоле, что соответс. вует 1;2;3;5 и 10 мкг зеараленона, и выпаривают растворитель ° Образцы наносят на пластинку в следующей последовательности: 1 повторность, свидетели, 2 повторность. Размер пятен не должен превышать 0,5 см.

Места нанесения проб располагают на расстоянии 1,5-2 см от нижнего и боковых краев пластинки и друг от друга. В камеру для хроматографирования вносят 100 мл смеси гексана и диэтилового эфира (в соотношении 60

1:3 по объему) и через 20 мин помещают.пластинку в вертикальном положении.

ПосЛе того как растворитель поднимется на высоту 10-12 см, пластинку вынимают, отмечают фронт растворите- 65 ля и помещают в сушильный шкаф на о

3 мин при 105 С. Затем пластинку опрыскивают- свежеприготовленным

0,05Ъ-ным раствором прочного красного

Ж в 50%-ном этаноле и снова помещают в сушильный шкаф при этой же температу на 5-7 мин.

Зеараленон проявляется в виде ярко желтого пятна на белом фоне с

R 0,47 + 0,01. Количество токсина в пробе определяют, сравнивая интенсивность окраски иплощадь пятен свидетеля и образца. В случае, если содержание микотоксина в пробе превышает 10 мкг, то получают хроматограмму стандартов большей концентрации (10-20 мкг). Концентрацию Ф-2 в образце рассчитывают по формуле:

Х

P где Х вЂ” содерл;ание зеараленона в. исследуемой пробе, мг/кг;

A — количество токсина в навеске, мкг;

P — вес пробы, r..

Чувствительность определения зеараленона в органах и тканях животных при навеске 10 r составляет

100 мкг/кг (0,1 мг/кг). Абсолютная чувствительность обнаружения стандартного вещества в тонком слое силикагеля (силуфола) составляет

0,25 мкг.

Степень извлечения зеараленбна зависит от.соотношения между массой образца и объемом органического растворителя, а также от времени экст ракции. Если 10 г пробы встряхивать в течение 2 ч с 60 мл ацетона, то извлечение. Ф-2 составляет 454.3%.

Увеличение времени экстракций повышает выход токсина только на 5-7%.

Двукратная обработка проб ацетоном порциями по 60 мл повышает извлечение зеараленона до 75-80%, а при дальнейшей экстракции выход токсина возрастает незначительно (до 82-85%).

Причем аналогичная обработка проб хлороформом приводит к извлечению не более 60% токсина.

Установлено, "что зеараленон прочно удерживается на колонке окиси алюминия. Применение силикагеля было малоэффективным из-за мешающего влияния коэкстрактивных веществ и слабой адсорбции зеараленона. При этом значительную роль играет элюент.

Так, при десорбции зеараленона смесью ацетона и уксусной кислоты происходит разложение токсина и вывь:вание большого количества мешающих анализу веществ. Элюирование ацетоном с добавкой гидроксида натрия также приводит к одновременной десорбции коэкстрактивных веществ. Наиболее приемлемым элюентом является смесь ацетона и дистиллированной воды в со726479 фоне пластинки наблюдают ярко желтые компактные, не обесцвечивающиеся при хранении хроматограммы пятна вещества без мешакщего влияния коэкстрактивных веществ. Интенсивность окраски пятен возрастает в интервале

0,25-20 мкг, а минимально определяемое количество микотоксина в тонком слое силикагеля оказывается равным:

0,25 мкг. Чувствительность обнаружения зеараленона в тканях животных достигает 100мкг/кг, что в 5 раз выше по сравнению с известным способом.

При облучении хроматограмм, полученных по предлагаемому способу, УФ-светом (256 нм) не наблюдают флуоресцирующих пятен, за исключением зон, соответствующих Ф-2, в то время как при. экспозиции к УФ-свету (256 нм) хроматограмм, полученных по известному способу, проявляется множество пятен, флуоресцирующих голубым, синим и зеленым цветом, а идентификация зеараленона становится невозможной. При этом свидетель-зеараленон после вторичного облучения не флуоресцирует.

Преимущества способа согласно изобретению по сравнению с известным приведены в таблице. !

Обнаружено зеараленона, мг/кг известным

В - способом

Исследуемый объект и его масса несено зеара ленона, мг/кг по собственной люминесценции

Мышечная ткань кролика, 10 г

0 05

Не обнаружен

То .же !

Следы

0,07

0,35

0,80

0,10

0 50

1,00

То же

0,04

0,80

То же ! ! !

Не обнаружен Не обнаружен Не обнаружен

Печень кролика, 10 r

0 05

0,07 .0 35

0,80

То же

То же

0,10

0,50

1 00

То же

0,40

0,80

Следы

Почки кролика, 10г

То же

Не обнаружен Не обнаружен Не обнаружен

0 05

То же! !

Следы +

0,07

0,40

0,80

0,10

0 50

1,00

То же

0 50

1,00 полученного раствора на,колонке, заполненной адсорбентом, с последующим элюированием зеараленона, концентрированием элюата и хроматографированием концентрата в тонком слое, о т отношении 8, 9-9, 05: О, 95-1, 1. При меньшем содержании воды в ацетоне десорбции Ф-2 практически не происходит, или она очень слабая, а при высоком соотношении между ацетоном и водой на результаты анализа влияют коэкстрактивные вещества.

Масса адсорбента в колонке оказывает действие на адсорбцию токсина и других соединений. Испытаны колонки с 2, 3, 5, 7 и 10 г окиси алюминия. Наилучшие результаты по степени десорбции Ф-2 и удерживания примесей получены с массой адсорбента, равной 5 г.

С целью избирательного определения зеараленона испытаны различные реакции с образованием окрашенных комплексов. Установлено, что Ф-2 проявляет свойства фенола, вступая в реакции сочетания с 4-аминоантипирином, 20 диазореактивами, реагирует с реактивом Фолина-Чокальтеу. Однако чувствительность обнаружения Ф-2 посредством 4-аминоантипирина и реактива

Фолина-l1oKBJlbTe+ Не ll1le eT 3-5 MKl .25

Ф-2 наиболее четко проявляется диазореактивом -п-нитрофенилдиазоний. тетрафторборатом. При этом на белом

Формула изобретения

Способ количественного определения зеараленона в тканях животных пу- . тем обработки анализируемой пробы органическим растворителем, очистки 65 предлагаемым способом по собствен- по реакции ной люминес- диазосочетаценции ния

Не обнаружен Не обнаружен

726479

Составитель Л. Соломен цева, Редактор 3. Бородкина Техред О.Легеэа КорректоР Г. Назарова

Заказ 648/35 Тйрак 1019 Подписное цНИиПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Разыская наб., д. 4/5

МФй.йийкФМжй г 4Ф ф ф и М" В

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4: л и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения избирательности и чувстви телесности определения, . в качестве органического растворителя используют ацетон, в качестве адсорбентаокись алюминия и элюирование проводят смесью ацетона и воды, взятых в

5 объемном соотношении 8,9-9,05:0,95-1,1, с последующей обработкой тонкослойной хроматограммы п-нитрофен илдиаэоний тетрафторборатом.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР

9 389446, кл. С 01 N 31/08, 1973, опублик.

2. R. W. Eppley, Screeming method

for F-2, aflatoxins and „ochgatoxin, Association office Analytical

Chemiв э, vol 51, 9 1, р. 74, 1968 (прототип).