Способ получения азотсодержащего полисахарида, промотирующего чувствительность к лекарствам у бактерий, устойчивых к антибиотикам

 

ИФТбитНО.тОКИВЧеи 1 библиотек Б

Союз Советскик

Социалистически к

Республик

ОП СА Е

ИЗОБРЕТЕНИЯ!!793408

К ПАТЕНТУ (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 12.04.78 (21)2602548/28-13 (5 ) М. Кл. (32) 13. 04. 77 (33) Япония (23) Приоритет (31) 41513

С 12 D 13/04

А 61 К 31/715

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий

Опубликовано 3Q12,80, Бюллетень М2 48

Дата опубликования описания 01,0181 (53) УДК 612 . 3 96 . .11(088.8) Иностранцы

Тикао Есикуми, Есио Омура, Тецуя Хотта (Япония ) (72) Авторы изобретения

Иностранная фирма

Куреха Кагаку Когио Кабусики Кайся (Япония ) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЗОТСОДЕРЖА1цЕГО

ПОЛИСАХАРИДА, ПРОМОТИРУЮЩЕГО

ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ К ЛЕКАРСТВАМ

У БАКТЕРИИ, УСТОЙЧИВЫХ К АНТИБИОТИКАМ

Азотсодержащий полисахарид, полученный вышеописанным способом, обладает следующими свойствами. физико-химические с.войства.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается получения препаратов, пролонгирующих деиствия лекарственных средств.

Предлагаемыи препарат новый и спо- 5 соб его получення в научно-технической и патентной литературе не описан.

Целью изобретения является получение азотсодержащего полисахарида, промотирующего чувствительность к 1О лекарствам у бактерий, устойчивых к антибиотикам.

Эта цель достигается тем, что штамм СМ -105 Coriolus ч ersicolor (Fr)

Que! или штамм СМ-151 Corio1us hirstus 5 (Гг) чое! выращивают в питательной среде, отделяют мицелий, высушивают его и измельчают и экстрагируют горячим водным растворителем.

Кроме того, в качестве водного 2Р растворителя используют 0,1 н раствор гидроокиси натрия.

Способ осуществляют следующим образом.

Мицелии базидиальных грибов, при- 25 надлежащих к виду Сосiо lus, которые используют в качестве исходного материала для экстракции, могут быть получены как е..тес:говенным путем, так и пос реп твом и.:к; отв.нного культи- 3О вирования. В случае искусственного культивирования грибов путем использования жидких сред в качестве ис— ходного материала для последующей экстракции используют все продукты культивирования, включая не только продуцируемый мицелий, но также элюат в жидкой среде после культивирования.

Полученный исходный материал экстрагируют водным растворителем и экстракт подвергают затем последовательной обработке, такой как фильтрация, нейтрализация, концентрирование фильтрата, диализ, обессоливание и т.д., с целью удаления из этого экстракта низкомолекулярных веществ (с молекулярным весом ниже 5000 ), после чего конечный раствор высушивают с целью получения порошкообразного вещества. Полученное таким образом порошкообразное вещество представляет собой азотсодержащий полисахарид и может быть использовано в качестве активного компонента.

793408

Вещество представляет собой порошкообразный и коричневый по цвету материал, который не имеет определенной температуры плавления и карбонизуется при сильном нагревании. Оно не растворяется в органических растворителях, таких как пиридин, хлороформ, бензол, гексан и т.д., но растворяется в воде.

Инфракрасный спектр этого вещества характеризуется наличием полос поглощения в области 3600-3200 см

2920-2900 см, 1660-1610 см, 1460 см, 1410 см, 1360 см " 1230 см ", 1150 см

1080 см", 1060-990 см, 925 см, 890 см ", 840 см, 755 см и 705 см

Таким образом, в ИК-спектре азотсодержащего полисахарида имеется полоса поглощения в области 890 см характерная для -связей глюкана в сахаридной части молекулы, и другая по- 20 лоса поглощения в области 840 см характерная для b,-связей глюкана.

Элементарный анализ азотсодержащего полисахарида показывает .следующий состав вещества: содержание угле- 25 рода от 42 до 46Ъ, содержание водорода от 5,3 до 7,0Ъ и содержание азота от 0,5 до 8,0Ъ. Все остальное по балансу приходится на долю кислорода.

Оптическое вращение азотсодержаще— го полисахарида, определенное стандартным методом и выраженное через величину удельного. оптического вращения А р варьируется от 0 до 50О .

Аэотсодержащий полисахарид дает положительную реакцию с фенолсерной кислотой, положительную реакцию — с антронсерной кислотой и положительную реакцию с нингидрином. Тот факт, что это вещество дает положительные 40 цветные реакции с указанными реагентами, является свидетельством того, что активное вещество включает в своем составе сахаридную и белковую часть, т.е. является гликопротеином. 45

Для определения углеводного состава азотсодержащего полисахарида образец вещества гидролизуют метанольным раствором хлористоводородной (соляной ) кислоты и, после триметилсилили- 5 рования известным методом, анализируют гидролизат — методом газо-жидкостной хроматографии. Результаты анализа показали, что полисахарид состоит в основном из глюкозы, а также содержит маннозу, галактозу, 55 ксилозу и фукозу. Аминокислотный анализ белковой части азотсодержащего по лисахарида позволил определить, что белковая часть вещества включает в своем составе аспарагиновую кислоту, gp треонин, серии, глутаминовую кислоту, пролин, глицин, алании, цистин, валин, метионин, изолейцин, лейцин, тирозин, триптофаи, фенилаланин, лизин, гистидин и аргинин.Основная 65 доля среди этих аминокислот приходится на аспарагиновую кислоту, треонин, глутаминовую кислоту, глицин, аланин, валин и лейцин. Суммарная доля этих аминокислот от общего аминокислотного состава составляет более 70Ъ.

Исследование азотсодержащего поли сахарида методом. ядерного магнитного ,резонанса проводят с целью определе- ния отношения между углеводной (сахаридной) и белковой частями в указанном веществе, а также для, уточнения типа связей в углеводной части этого вещества.

Спектр протонного магнитного резонанса (ЯМР-спектр) образца азотсодержащего полисахарида снимают на

ЯМР-спектрометре с напряженностью магнитного поля в 100 мегагерц, используя в качестве растворителя тяжелую воду, а в качестве внутреннего стандарта 2,2-диметил-2-силанопентан-5-сульфонат. В спектре ЯМР исследуемого вещества имеются полосы поглощения в области 0,9 0,2-1,2+g,2 миллионных долей, 2,0+0,2 миллионных долей, 4,5+0,2 миллионных долей, 4,7 0,2 5,0 0,2 миллионных долей и 5,4 0,2 миллионных долей соответственно, в спектре видна также широкая полоса поглощения в области 3,4-4,4 миллионных долей. Белковая компонента вещества изучена, исходя из допущения, что область от 0,5 до 2,5 миллионных долей

;связана с интенсивностью сигналов

: ротонов белковой части образца, а область от 2,5 до 6,0 миллионных долей связана с интенсивностью сигналов протонов углеводной (сахаридной) части образца. При этом доля белковой части была оценена менее чем в 40Ъ. Исходя из того, что область. от 4,4 до 4,9 миллионных долей связана с ф-связями в сахаридной части образца, а область от 4,9 до 5,4 миллионных долей связана с А-связями, удалось определить, что их отношение, т.е. отношение числа -связей к числу -связей в полисахаридной части гликопротеина варьируется от 85/15 до 40/60.

Молекулярный вес аэотсодержащего полисахарида, измеренный методом ультрацентрифугирования, варьируют для различных образцов исследуемого вещества в диапащоне от 5000 до 300000

Испытания азотсодержащего полисахарида на острую токсичность проводят на мышах линии ICR-3CL, имеющих возраст от 4 до 5 недель и весящих от 21 до 24 граммов, и на крысах линии Донриу, имеющих возраст от 4 до 5 недель и весящих от 100 до 150 граммов. Азотсодержащий полисахарид растворяют в физиологическом солевом растворе и вводят животным внутривенно, подкожно, внутрибрюшинно и

793408 перорально. Общие симптомы воздействия вещества на подопытных животных, гибель животных и изменение их веса наблюдают в течение 7 дней, после чего животных забивают и проводят аутопсию (вскрытие трупов ). В результате проведенных испытаний не было зафиксировано ни одного случая гибели животных, ни на крысах, ни на мышах, даже при введении им самой вы- . сокой дозы из тех, что показаны на приведенной ниже таблице 1.

В табл. 1 представлены вводимые дозы азотсодер>кащего полисахарида.

Т а б л и ц а 1

15

Мыши Внутривенныи 1300 1300

Подкожный 5000 5000 20

Внутрибрюшинный 5000 5000

Пероральный 20000 20000

Внутривенный 600 б00

Крысы

Подкожный 5000 5000

Внутрибрюшинный 5000 5000

Пероральный 20000 20000

К числу антибиотиков, которые проявляют свое действие против резистентных к лекаРственных пРепаРатам бактерий в комбинации с азотсодержащим полисахаридом, относятся антибиотики, выделенные из плесеней, плесневых грибов, бактерий, актиномицетов и других микроорганизмов. Типичные примеры таких антибиотиков пере†40 числены ниже:

Пенициллин "6"(ниже он сокращенно обозначен как P5)

Стрептомицин (БМ)

Канамицин (KN) 45

Хлорамфеникол (СР)

Тетрациклин (TC)

Эритромицин (EM)

Аминобензилпенициллин (АВРС)

Цефалоридин (CE)

Колистин (CE k)

Эффект, вызываемый азотсодержащим полисахаридом, состоит в промотировании (стимулировании) чувствительности к лекарствам у следующих резистентных к лекарственным препаратам (антибиотикам ) бактерий:

Еsche ri сЫ а col i

Streptococcus faeca1i s

Stcephylococcus aureus

Еntегоbacter aегоgenes d0

Salmonella enteritides

Shigella Sonnei

Klebsiella pncu omae

Ptoreus mirai>i!is

Pseudomonas a.iuginosa 65

Действие азотсодержащего поли сахарида по стимулированию чувствительности к лекарствам у резистентных к антибиотикам штаммов бактерий подтверждено следующим образом.

Резистентные к антибиотикам штаммы бактерий получены с помощью метода, описанного ниже, при выращивании культуры в градиентной чашке (в чашке Петри с концентрационным градиентом соответствующего антибиотика ).

Чашки Петри с агаровой средой и с концентрационным градиентом лекарс венного вещества в диапазоне от 10 до 100 микрограмм/мл подготавливают надлежащим образом и используют для инокуляции бактерий каждого штамма методами штриховой разводки или мазка. Эти чашки инкубируют при 37 С в о течение нескольких дней и колонии бактерий, сформировавшиеся в области высокой концентрации антибиотика, от деляют и снова инокулируют аналогичным образом в другие чашки. Подобную операцию повторяют несколько раз с целью получения бактериальных штам мов, резистентных к соответствующим лекарственным веществам (антибиотикам ).

31екарственную чувствительность штаммов, резистентных к антибиотикам, и первоначальных штаммов тех же бактерий (чувствительных штаммов ) сравнивают путем нахождения минималь ной ингибирующей концентрации, т.е. минимальной концентрации соответству щего лекарственного соелинения, инги бирующей рост бактерий :«иже эта величина сокращенно обозна ена как

МИК) .

Выли приготовлены двойные разбавленные системы каждого лекарства, которые смешивают с агаровой средой для вливаний с целью подготовки ча— шек с агаровой средой. Затем отбирают петелькой образец каждого штамма, который культивируют при 37ОС на

Трипто-соевом бульоне в течение 18 ч и наносят мазком на каждую чашку.

После культивирования в течение 18 ч при температуре 37 С в каждой чашке проверяют степень роста инокулированного бактериального штамма.

Для того, чтобы увидеть, насколько изменяется минимальная ингибирующая концентрация (МИК) для каждого реэистентного штамма при комбинированном использовании полисахарида и соответствующих антибиотиков (тех, которые перестали действовать на определенные бактериальные штаммы), проводят процедуру, аналогичную вышеописанной, с тем исключением, что в системы добавляют, с целью получения соответствующих комбинаций, от

10 до 1000 микрограммов/мл азотсодержащего полисахарида, и величину

МИК определяют в соответствии с вы793408 шеупомянутым методом, основанном на использовании чашек с агаровой сре дой и концентрационным градиентом антибиотиков.

При этом наблюдается отчетливо выраженный эффект — величина минимальной ингибирующей концентрации (МИК ) уменьшалась в результате прибавления аэотсодержащего полисахарида по крайней мере на половину по сравнению с уровнем, который фиксировался до прибавления, или даже еще ниже. Количество прибавляемого азотсодержащего полисахарида составляет более 10 микрограммов/мл, а в предпочтительном варианте — более

100 микрограммов/мл. Величину рН среды поддерживают при этом на уровне 7,2-0,1 с тем, чтобы на определяемую величину МИК не оказывало влияние рН среды. Кроме того, используя метод культивирования в условиях разбавления агаровой среды, аэотсодержащий полисахарид сам по себе не обладает антибактериальной активностью против бактериальных штаммов, отобранных для проведения испытаний.

Терапевтический тест по воздействию на инфекционные заболевания проводят следующим образом. Подопытной мыши вводят внутрибрюшинно, с целью заражения, 1х108 клеток лекарственнорезистентных бактерий. Через 1-3 ч после этого мышам вводят либо внутрибрюшинно, либо перорально от 10 до 1000 миллиграммов на килограмм веса тела мыши соответствующего лекарства и от 1 до 10 миллиграмм мов/кг азотсодержащего полисахарида.

Наблюдение за подопытными животными продолжают в течение 7 дней после введения с целью изучения их выживаемости и оценки эффективности действия азотсодержащего полисахарида.

Выло обнаружено, что эффективная доза вещества настоящего изобретения в предпочтительном варианте состав— ляет более 10 мг/кг при внутрибрюшинном введении, и более 100 мг на килограмм при пероральном введении.

Это было выше, чем 40%.

Азотсодержащий полисахарид способен усиливать терапевтический (лечебный) эффект лекарственных препаратов не толькр в опытах in vitro„HQ также и в химиотерапии инфекционных заболеваний, т.е. в опытах 1и vivo с рядом резистентных штаммов болезнетворных бактерий.

Азотсодержащий полисахарид проявляет также черезвычайно низкую острую токсичность и может вводитЬся в организм различными путями, в частности посредством внутрибрюшинных инъекций, путем подкожного введения, пероральным путем и ректальным путем (через прямую кишку). Таким образом, аэотсодержащий полисахарид может быть смешан с антибиотиком при, 5

1Î

60 проведении курса лечения этим лекарственным препаратом или же может вводиться в организм отдельно.

Когда азотсодержащий полисахарид предполагается вводить пероральным путем и его оформляют в виде таблеток, гранул, порошков, капсул и других лекарственных форм для перорального введения, рецептура любого такого препарата может содержать различные добавки того типа, которые обычно используются при получении лекарственных препаратов и, в частности связующий агент, эксципиент (воспринимающее средство), смазывающее вещество (замасливатель), дезинтегрирующий агент, смачивающий агент и т.д. Когда азотсодержащий полисахарид используется в виде жидкости для перорального введения, он может быть приготовлен в виде жидкого лекарственного средства для внутреннего применения, такого, например, как взбалтываемая микс— тура, суспензия, эмульсия, сироп и т.д., или же может быть получен в виде сухого продукта, который подвергается растворению непосредственно перед использованием. Такие жидкие препараты могут также содержать в своем составе различные добавки и/или консерванты того типа, который обычно используется при получении лекарственных препаратов. Растворы для инъекций могут содержать в качестве добавок вещества-стабилизаторы, буферные (забуферивающие1 вещества, консерванты, вещества для создания изотоничности раствора и т.п. Такие растворы для инъекций могут быть расфасованы в ампулы однократного использования, рассчитанные на введение определенной дозы активного ингредиента за один раз или во флаконы, содержащие не одну, а несколько доз препарата. Кроме того, вышеупомянутые композиции (рецептуры ) .логут выпускаться в виде водного раствора и или суспензии, а также в виде раствора или эмульсии в масляном или водном разбавителе при условии, что активный компонент может быть в виде порошка, который растворяется в таком разбавителе, например, в стерилизованной непирогенной воде, непосредственно перед использованием. В случае, когда полисахарид используется в виде мази или средства для втирания, он может содержать соответствующую масляную или жировую основу, эмульсивную основу, водорастворимую основу,.консервант и другие подобные вещества и/или добавки.

Пример 1. Приготавливают жидкую питательную среду следующего состава, r:

Пептон 5

Дрожжевой экстракт 3

КН1РО 0,3

К НРОс 0,3

793408

QS 0„

0,3

До 1 литра

Глюкоза

Вода рН:6,0

Аликвоту этой среды объемом 150 миллилитров вводят в каждую из 100 конических колб емкостью 1 литр, и после закупорки каждой колбы ватной пробкой жидкую среду подвергают стерилизации в течение 30 мин при 120ОС и затем вносят в каждую колбу (инокулируют ) посевной материал — отдельно культивированнный на скошенном агаре. мицелий базодиомицета Coriolus versicolor (.), T MM Quel СМ-105, после. чего осуществляют стационарную этого сухого продукта измельчают и экстрагируют 0,1 н раствором гидроокиси натрия при температуре 95-98О С, при обычном давлении, в течение 3 ч, используя для этой цели экстрактор из нержавеющеи стали. Полученный таким образом щелочныи экстракт нейтрализуют, подвергают фильтрации и полученный фильтрат концентрируют затем до остаточного объема, равного

500 миллилитрам. Этот концентрированный раствор помещают затем в целлофановый мешочек и подвергают диализу против проточной воды в течение 90 ч.

Полученный диализат концентрируют при пониженном давлении и концентрированный раствор подвергают затем распылительной сушке, в результате. которой получают 19,5 г порошкообразного продукта. 40

Для изучения свойств этого порошкообразного продукта небольшую его порцию подвергают элементарному анализу с использованием С, Н, N-анализатора (CHN-COCORDER), в результате чего найдено, что в состав вещества

45 входит 42,1Ъ углерода, 6,0% водорода и 5,8% азота. Определение удельного оптического вращения образца полученного продукта производят для 0,25%ного водного раствора этого вещества с использованием поляриметра "JJANAKO-OR-50". Измерения показали, что удельное оптическое вращение этого продукта равняется +12 .

Для того, чтобы узнать углеводный (сахаридный ) состав этого продукта, образец весом 10 миллиграммов прибавляют к 3%-ному метанольному раствору хлористоводородной кислоты и

55 метанолиз проводят в течение 16 ч при 0 температуре 1004С. После нейтрализации соляной кислоты карбонатом серебра реакционную смесь профильтровывают при комнатной температуре и полученный фильтрат сначала кон65 культивацию инокулята в течение

20-дневного периода при температуре в диапазоне от 25 до 27 С. Полученный таким образом культуральный шламм (бульон) высушивают в барабанной сушилке, в результате чего получают 20

451 грамм сухого продукта. 150 граммов центрируют, а затем упаривают досуха.

Полученный при этом твердый продукт растворяют в 0,5 миллилитрах пиридина, к раствору прибавляют 0,2 миллилитра гексаметилдисилазана и 0 3 милI

1 лилитра триметилхлорсилана и реакционную смесь оставляют стоять при комнатной температуре в течение

30 мин для завершения реакции триметилсилилирования. Продукт растворяют затем в хлороформе, и после отмывки избытка реагента и дегидратации фильтрат упаривают досуха. Затем этот продукт растворяют в четыреххлористом углероде и подвергают анализу методом газо-жидкостной хроматографии. ГЖХ-анализ показал, что продукт состоит из 70,5% глюкозы, 3,8% галактозы, 10,3% маннозы, 5,4% ксилозы и 10,0Ъ фукозы.

Для определения аминокислотного состава белковой части порошкообразного продукта его образец подвергают аминокислотному анализу в соответствии со стандартным методом Мура и Итейна. В результате аминокислотного анализа получают следующий состав: 15Ъ аспарагиновой кислоты, 8% треонина, 6Ъ серина, 14% глутаминовой кислоты, 4Ъ пролина, 8% глицина, 10Ъ аланина, 4Ъ изолейцина, 6Ъ лейцина, 1Ъ тирозина, 4% фанилаланина, 2Ъ триптофана, 2% лизина, 3% аргинина, 4% 1Ъ н -глюкозамина, а также следы гистидина.

Для исследования продукта методом

ЯМР-спектроскопии в качестве растворителя используют тяжелую воду, а в качестве внутреннего стандарта 2,2-диметил-2-силанопентан-5-сульфонат, причем для устранения любого возможного влияния на результаты анализа остаточного количества легкой воды, содержащегося в тяжелой воде, используют величины, которые подверглись коррекции, проделанной на основе предполагаемой кривой Лоренца. В этих условиях отношение доли углеводной части вещества к его белковой части было определено, исходя из допущения, что поглощение в области 0,5-2,5 миллионных долей обусловлено протонами белковой части продукта, тогда как поглощение в области от 2,5 до 6,0 миллионных долей относится к протонам углеводной (сахаридной ) части продукта. Полученное отношение углеводной части к белковой равно 89:11.

Кроме того, полоса поглощения 4,14,9 миллионных долей связана с ф-связями сахаридной части, а полоса поглощения в области 4,9-6,0 миллионных долей связана с д -связями сахарида, анализируя ЯМР-спектр продукта, определяют также отношение доли. -связей к доле А-связей в полисахаридной части продукта. Это отношение (б/А ) равно 65:35.

793408

Продолжение табл. 2

Бактерии я инрост

Нный

Entегоbacter КМ

aегоgenes

3, 1 100

6,3 100 С

Salmonella ente 1tldls CP

0,8

12,5

100(1,6

ТС

12,5

100<

ЕМ

3,1

Shige11a sonnei KM

Klebsiella

pneumoniae

PC 6,3 100(. М 1,6 100

CP 0,8 25

1,6 25

12,5 100С

ЕМ

0,8 25

12,5 200

Pseudomonas aeru- CL ,g1ПОЬд

Бактерии н40

Величины минимальной ингибирующей концентрации (МИК) пенициллина (PC) вычислены, исходя из допущения, что

1,667 E (единицы ) = 1 мг.

Staphilococcus PC

aureus

CP

ТС

0,025 12,5

3,1

0,8

0,4

1,6

0,4

12,5

Для того, чтобы увидеть изменение величины минимальной ингибирующей концентрации (МИК) для соответствующих, резистентных к лекарственным у препаратам штаммов бактерий при совместном использовании предлагаемого вещества и различных антибиотиков (тех, которые использовались для выработки резистентности у бактерий), азотсодержащий полисахарид прибавляют в

60 культуральную среду в количествах от

10 до 1000 микрограммов/мл и величины МИК получают в соответствии с методом культивирования в чашках с агаровой средой. Полученные результаты

55 представлены в табл. 3. И

Streptococcus fa- TC еса1is

Escherichia со1i РС

12,5 100

3,1

1004

КМ

6,3

200

1,6

50

3,1 25

CER

3,1

ЕМ

Молекулярный вес исследуемого продукта определяют посредством ультрацентрифугирования его раствора, причем измерение проводят с использованием седиментационно-равновесного ме. тода и синтетической граничной модели (картинки). для этой цели используют интерференционную оптическую систему, причем измерения проводят в следующих условиях: концентрация образца в растворе 0,3%; растворитель

М/10 КСЙ, температура 25ОC столбик жидкости высотой 1,7 миллиметра, скорость вращения ротора 22000 об./мин продолжительность измерения 5 ч. Полученное значение среднего молекулярного веса вещества равно 100000. f5

Испытания продукта на эффективность стимулирования лекарственной чувствительности у резистентных к лекарственным препаратам бактерий, которые, в частности, приобретают ре- gg зистентность к антибиотикам, проводят следующим образом.

Образцы резистентных к лекарственным препаратам бактерий получают согласно вышеупомянутой методике культивирования бактерий в чашках с концентрационным градиентом антибиотиков в агаровои среде при использовании бактерий Staphylococcus aureus, Streptococcus faeca1is, Escherichia co1i, Salmonella enteritidis, K1ebsie11a ЗО

pneumonia1, Pseudomonas aeruginosa, Минимальные ингибирующие концентрации (МИК) антибиотиков для исходных бактерий и тех бактерий, которые приобрели резистентность (устойчивость) 35 к лекарствам, приведены в табл. 2.

Т а блица 2

Proteus mi ra- ABPC

bi l i s

Величины МИК цефалоридина (.C L ) вычислены, исходя из допущения, что

30000 E (единиц) = 1 мг.

793408

Таблица 3

1,6

6,3

CPCP

3,2

TC100

ЕМ1000 12,5

3,2

ЕМ

100

6,3

ТС

Escherichia coli

SN-resistant SN

100

1000

KN -и1000

200

12,5

50

100

ТС

6,3

100

ТС

CER

CER

12,5

10

1000 100

12,5

3,2

12,5

100

ТС

12,5

100

6,3

ТС

100

1000

6,3

CP

100

12,5

ТС

100

ТС

Shige 1 lа sonnei

КМ-resistant

12,5

1000

12,5

ABPC

200

100

1000

Вещество настоящего изобретения прибавляли в культуральную среду. "Вещество настоящего изобретения не прибавляли в культуральную сред11, Примечания.

Staphylococcus

aureus

PC-resistant

Streptococcus

faecalis

ТС-res stant

Entегоbacter

aегоgeues

КМ-resistant.

Sa1mone11а

enteritidis

CP-resistant

Klebsiella

pneumoniа1

SN-resistant

Proteus mirabilis

ABPC-resistant

Pseudomonas

aeruginosa

CL-resistant

1000pr/ssë 12,5

100 25

793408 (6

35.

II р и м е р 2. Испытания по выяв (ению терапевтического (лечебного ) воздействия на инфекционные заболева ния проводят на пяти группах самцов мышей линии ICR-ICL (каждый иэ которых весил 22 1 грамм), причем каждая группа состоит из 10 мышей, при использовании резистентного к пенициллину G штамма бактерий Strepto coccus полученного в примере 1.Этот резистентный к пенициллину С-штамм

aureus, который культивировался на

Трипто-соевой агаровой среде при температуре 37 С в течение 18 ч, суспендируют в Трипто-соевом бульоне, содержащем 5% муцина, и 0,25 миллилитра такой суспензии вводят (ино- 15 кулируют ) внутрибрюшинно каждой подопытной мыши. Заражение регулируют таким образом, чтобы каждая мышь получала в инокуляте 5х108 клеток бактерий. Через дв< часа после эа- 2О ражения (инокуляции )мышам вводят внутрибрюшинно пенициллин Q. в дозе

2,5 х 10 единиц/кг веса тела мышей и 5 х 10 Е/кг соответственно. ОдноФ временно мышам вводят внутрибрюшинно азотсодержащий полисахарид, полученный в соответствии с методикой примера 1, в дозе, равной 100 мг/кг веса тела. Обработанные таким образом мыши находятся под постоянным наблюдением каждый день в течение

7 дней после введения с целью определения выживаемости зараженных мышей. Комбинированное использование антибиотика и азотсодержащего полисахарида (NP/) может существенно улучшить лечебное действие пенициллина С за счет повышения чувствительности к пенициллину (t резистентных к нему in чivo бактерий.

Пример 3. Аналогичный тест 40 на терапевтическую эффективность в лечении инфекционных заболеваний проведен на, пяти группах самцов мышей линии ICR-10L (каждая мышка весит 22 +1 грамм, причем каждая грУппа 4 подопытных животных состоит из 10 мышей) при использовании резистентного к тетрациклину штамма E.coli u азотсодержащего полисахарида, полу50 описанной в примере 1. Для заражения каждой мышкй вводят внутрибрюшинно 0,25 мл Трипто-соевой бульонной суспензии, включающей 5% муцина, резистентных к тетрациклину бактерий, приготовленной как описано в примере 1. Инокулирование регулируют таким образом, чтобы каждая <ышка получила внутрибрюшинно 5 х 10 клеток бактерий. Через 2 ч после инокуляции мышам вводят перорально тетра- 6О циклин в дозах 80 мг/кг веса тела и

160 мг/кг соответственно. Одновременно мышам вводят пероральным путем аэотсодержащий полисахарид в дозе

100 миллиграмм/кг. Комбинированное использование азотг одержащего полисахарида и тетрациклина способно вызывать значительно более, высокий лечебный эффект, чем использование одного тетрациклина. Кроме того, поскольку практически один и тот же эффект может быть достигнут как при пероральном введении вещества, так и при внутрибрюшинном его введении, вещество может найти самое широкое применение вследствие его высокой эффективности.

Пример 4. Резистентный к пенициллину "G" штам Staphylococcus

aureus инокулируют пяти группам (по

10 мышей в группе) мышей-самцов линии

ICR-ICL, каждый иэ которых име<„т вес

22+1 грамм, с нагрузкой 5 х 10 клеток на каждую подопытную мышку, следуя методике примера 2. После этого четырем группам мышей вводят внутрибрюшинно 2,5 х 10" E/êã пенициллина

"G" и соответственно 1, 10, 100 и

1000 мг/кг азотсодержащего полисахарида (того же, что используют в примере 1). Ежедневные наблюдения за подопытными мышами велись в течение

7 дней после введения указанных препаратов.

Пример 5. Осуществляют аналогичный опыт по лечению инфекционных заболеваний с использованием б групп из самцов-мышей ICR-IСL причем каждая группа, состоящая из 10 мышей, инокулированных клетками устойчивых к тетрациклину бактерий

Е.Coli в количестве 5х100000000 клеток на мышь, с использованием <(роцедуры примера 3.

Через два часа после инокуляции вводят тетрациклин в дозе 80 мг на кг веса тела мыши с одновременным оральным введением азотсодержащего полисахарида,используемого в примере 1, в соответствующих дозах О, 10,100, 1000 и 10000 мг/кг, при этом шестая группа была контрольной. Обследование мышей проводилось ежедневно до 7-ro дня.

Пример б. Штамм CM-151 базидиомицета 0огiо1оь h!гьыtиь (фр.)

QueI (Ferm.Res.Inst. Deposit ¹ FERM-P

2711) культивируют, как в примере 1, и затем экстрагируют и очищают в соответствии с аналогичной методикой, в результате чего получают 17,5 грамма порошкообразного вещества. Свойства этого вещества следующие:

Элементарный анализ: 43,73 углерода; 6,4Ъ водорода и 5,5Ъ азота. Удельное оптическое вращение:4/0 — .

+30

Углеводный состав: 79% глюкозы, 15Ъ маннозы, 2% ксилозы, 4% галактозы и следы фукоэы.

Содержание белка в веществе. 31s,.

Отношение сахаридных связг(<(< /,():

71/29.

Средний молекулярный н .:: :< (>(«

793408

Формула изобретения

Составитель С. Малютина

Редакто Г. Прусова Техред N.ГоЛинка Корректор N. Шараши

Заказ 9638/69 Тираж 522

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Аминокислотный состав белковой части: 15% аспарагиновой кислоты, 9Ъ треонина, 5Ъ серина, 14% глутаминово кислоты, 6Ъ пролина, 9Ъ глицина, 9% аланина, 7Ъ валина, 1% метионина, 5Ъ изолейцина, 6% лейцина, 2% триптофана, 4% фенилаланина, 2% лизина, 3% аргинина, 2Ъ аммиака, 1Ъ глюксзамина и следовые количества цистина, тирозина и гистидина.

Полученное таким образом вещество, имеющее вышеупомянутые характеристики, используют для проведения следующего эксперимента.

По аналогии с примером 1 получают резистентный к хлорамфениколу штамм

Salmonella enteritidis. Затем 0,25 миллилитра суспензии вышеупомянутых хлорамфеникол-резистентных бактерий в Трипто-соевом бульоне (см. пример 2), включающем 5% муцина, инокулируют внутрибрюшинно пяти группам мышей (каждой мышке ), причем каждая из этих групп состоит из 10 животных. Каждой подопытной мышке вводят 1 х 10 кле6 ток. Через 25 ч после инокуляции мышам вводят внутрибрюшиннс по

50 миллиграмм/кг хлорамфеникола. Мышам другой группы помимо этого вводят перорально азотсодержащий полисахарид в дозе 500 мг/кг. В группе, где мышкам вводили один хлорамфеникол, выживаемость через 5 дней после введения составила 40Ъ, тогда как в группе, где антибиотик давали в ком- бинации с азотсодержащим полисахаридом, выживаемость оказалась на уровне

80%.

Пример 7. По методике примера 1 получают резистентный к стрептомицину штамм Klebsiella pneumonial;

0,25 миллилитра Трипто-соевого бульона (см. пример 2), содержащего 5% муцина и указанные резистентные бактерии, инокулируют внутрибрюшинно подопытным мышам, образующим 2 группы по 10 мышей в каждой, выдерживая норму порядка 1 х 10 клеток на кажВ дую мышку. Через 3 ч после этой инокуляции мышам вводят внутрибрюшинно по 100 мг/кг стрептомицина. Мышам одной группы вводят кроме того по

120 мг/кг азотсодержащего полисахарида, полученного в соответствии с методикой, описанной в примере 6, используя внутрибрюшинный путь введения. Через 6 дней после введения вы- живаемость мышей в группе, где животным вводили один стрептомицин, составила 50%, тогда как в группе, где мышам вводили стрептомицин в комбинации с полисахаридом, выживаемость оказалась намного выше (около 80%).

I1 р и м е р 8. 0,25 мл суспензии колистин-резистентных бактерий Pseudomonas aeruginesa,ê ëüòHÂHÐÎÂàHíûõ в соответствии с методикой, аналогичной описанной в примере 1, в Трипто-соевом бульоне (см. пример 2), содержащем 5Ъ муцина, инокулируют внутрибрюшинно подопытным мышам-самцам линии 1CR — ICR, каждая весом

2211 грамм, распределенным в 2 груп15 пы по 10 мышей в каждой, выдерживая норму введения 1 х 108 клеток на каждую мышку. Через 2 ч после инокуляции мышам вводят внутрибрюшинно антибиотик колистин в дозе 190 мг/кг

20 (1 микрограмм = 30 единицам ). Помимо этого мышам одной группы вводят также перорально азотсодержащий полисахарид, полученныи по методике, аналогичной описанной в примере 6, в дозе 1500 мг/

/кг. Через 6 дней после введения выживаемость мышей в группе, где им вводили один к листин, составила 40%, тогда как в группе, где колистин применялся в комбинации с предлагаемым веществом, выживаемость мышей оказалась равной 70Ъ.

Предлагаемый способ позволяет получить азотсодержащий полисахарид, промотирующий чувствительность к лекарствам у бактерий, устойчивых к антион- тикам.

1. Способ получения азотсодержа40 щего полисахарида, промотирующего чувствительность к лекарствам у бактерий,. устойчивых к антибиотикам, отличающийся тем, что штамм СМ-105 Coriolus versi color (Fг),Que1 или штамм CM-151 Corinlus

4> hirsutus (Fr) Quel выращивают в питательной среде, отделяют мицеяий, высушивают его и измельчают и экстрагируют горячим водным растворителем.

50 2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю шийся тем, что в качестве водного растворителя исгользуют 0,1 н раствор гидроокиси натрия.