Способ подготовки образца дляэлектронно- микроскопическихисследований ризосферы корнейвысших растений

 

.::7-:. ;, г, О П Й (. - А Н И Е

ИЗОБРЕТЕНИЯ (и) 79407

ыюо Советеких

Социалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 24.07.79 (21) 2786401/30-15 с присоединением заявки № (23) Приоритет (43) Опубликовано 07.01.81. Бюллетень № 1 (45) Дата опубликования описания 07.01.81 (51) M. Кл.в

С 12М 1/00

Государственный комитет

СССР ио делам изобретений и открытий (53) УДК 631.427.22 (088.8) (72) Автор изобретения

С. О. Суетин (71) Заявитель

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов

АН СССР (54) СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ОБРАЗЦА ДЛЯ ЭЛЕКТРОННОМИКРОСКОПИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ РИЗОСФЕРЫ

КОРНЕЙ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ

Изобретение предназначено для подготовки образцов для электронномикроскопических исследований и может быть использовано в научно-исследовательской практике при изучении взаимоотношений микроорганизмов, почвы и растений.

В настоящее время известны различные способы изучения прикорневой микрофлоры растений и среди них важное место занимает микроскопирование (1), Известен также способ подготовки растительных образцов для электронномикроскопических исследований заключающийся в следующем: ткани растения разрезают на кусочки, фиксируют в сосуде, дегидратируют, помещают в заливочный материал, с помощью микротома изготавливают ультратонкие срезы и исследуют на электронном микроскопе (2).

Недостатком этих способов является то, что при извлечении и последующей подготовке образца нарушается сохранность ризосферы корня.

Целью изобретения является обеспечение сохранности пространственного расположения элементов ризосферы корней высших растений.

Сущность способа заключается в культивировании растения и находящихся в его ризосфере микроорганизмов методом гидропоники с использованием в качестве наполнителя гранулированного агара.

Цель достигается тем, что корень живого растения помещают в сосуд, представляющий собой цилиндр с дном, оттянутым в форме пастеровской пипетки и имеющим отверстие на конце.

В нижнюю часть сосуда непосредственно перед его сужением помещают тонкий слой

1р мелкопористого материала (например, марля, пенопласт), на который помещают сверху гранулированный агар, заполняющий сосуд до его середины.

С помощью перистальтического насоса

15 производят пропускание питательной среды через слой гранулированного агара для снабжения помещенного в сосуде корня, необходимого для роста растения веществами. По прошествии времени, требующегося для аклиматизации растения, вводят суспензию микроорганизмов. Новые порции питательной. среды вводят с интервалом в

1 — 3 дня в течение всего периода инкубации микроорганизмов в ризосфере, длительность которого зависит от условий опыта и может продолжаться до 30 суток и более.

Фиксирование для электронной микроскопии проводят путем последовательного пропускания через сосуд с корнем фиксаторов, 30 как это было описано выше. Затем сосуд

794075

Формула изобретения

Составитель М. Мирзаев

Техред Л. Куклина

Редактор Н. Тимонина

Корректоры: А. Галахова и Л, Орлова

Заказ 36/14 Изд. Жа 164 Тираж 530 Подписное

НПО «Поиск> Государственного комитета СССР по делам изобретений н открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2

3 разогревают до температуры 45 — 50 С и вводят в него расплавленный агар, который заполняет пространство между гранулами, При дальнейшем охлаждении происходит затвердение всего содержимого сосуда в 5 виде агарового блока, из которого затем вырезают маленькие блочки, содержащие фрагменты корня с окружающими его микроорганизмами. Регидратацию, заливку и дальнейшую обработку для электронной микроскопии производят обычным путем.

Пример. Проросток Ainus glutinosa помещают в химическую пробирку с дном, оттянутым в виде пастеровской пипетки и заполненную до середины гранулами агара, 15 находящимися на марлевом тампоне, помещенном на дно сосуда непосредственно перед его сужением. Питание растения осуществляют путем заполнения средой Крона слоя агаровых гранул с помещенным в не- 20

ro корнем растения при одновременном вытеснении воды, заполнявшей этот слой ранее, с помощью насоса, присоединенного к оттянутому дну сосуда, По истечении суток после помещения растения в сосуд, в слой гранул вводят суспензию растертых клубеньков Ainus glutinosa. После выдерживания ее в слое в течение трех часов производят очередную поливку для удаления компонентов суспензии не адсорбированных на поверхности гранул и корня. Последующие порции питательной среды вводят через каждые 24 ч до окончания опыта, который продолжается до 15 суток. Фиксирование корня с окружающей его ризосферой 35 производят путем последовательного пропускания через сосуд компонентов глютаросмиевой фиксации, после чего сосуд разогревают до температуры 45 С и заполняют слой гРанУл 2,0о/о-ным агаРом в Расплав- 40 ленном виде. После охлаждения сосуда и изъятия агарового блока из последнего вырезают маленькие блочки с фрагментами корня и ризосферы, дегидрируют их в серии спиртов, заливают в аралдит, делают ультратонкие срезы, которые затем окрашивают и исследуют на электронном микроскопе.

Предлагаемый способ позволяет получить картину ризосферы большого масштаба, что дает возможность изучать состояние микроорганизмов на значительно большем расстоянии от корня растения, а также исключает возможность каких-либо искажений в пространственном расположении элементов прикорневой зоны.

Способ подготовки образца для электронномикроскопических исследований ризосферы корней высших растений, включающий культивирование растений в присутствии суспензии микроорганизмов с последующим фиксированием, отличающийся тем, что, с целью сохранения пространственного расположения элементов ризосферы корней, растения культивируют в сосуде с гранулированным агаром, пропуская через него питательную среду, в после фиксирования вводят расплавленный агар в разогретый сосуд с последующим охлаждением сосуда.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Возняковская Ю. М. Микрофлора растений и урожай. М.— Л., «Колос», 1967.

2. Lalond М et Qnispel А. Canadiall Jurnal of Microbiology, 1977, 23, Мв 11, р. 1531 (прототип) .