Способ определения субстрата или фер-ментативной активности b биологическомматериале
Всесо»оз» «» я и иС ЁЖ-и4 .
Союз Советских
Социалистических
Республик
{»»»797592
К ПАТЕИТУ (6») Дополнительный к патенту (51)М. Кл.з
С 12 Я 1/26 (22) Заявлено 06.05. 77 (2») 2481956/28-13 (23) Приоритет - (32) 09 ° 06 ° 76 (31) .Р 26 25 834 . 4 (33) ФРГ
Государственный комитет
СССР по делам изобретеннй н открытий
Опубликовано 15.0181.Бюллетень М 2 (53) УДК 6 12. 015 . 1 (088.8) Дата опубликования описания 1701,81
Иностранцы
Иозеф Даннингер, Ульферт-Денеке, Гунтер Ланг, Герхард М хал и Петер Решлау (И Г) (72) Авторы изобретения
Иностранная фирма
"Берингер Маннхайм ГМБХ" (71) Заявитель (ФРГ) (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУБСТРАТА ИЛИ ФЕРМЕНТАТИВНОИ
АКТИВНОСТИ В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ
Изобретение относится к биохимии, в частности к способам определения субстрата или ферментативной активности.
Известен способ определения субстрата или ферментативной активности в биологическом материале путем проведения окислительно-восстановительной реакции |1) .
Однако известный способ не позволяет провести точные определения, поскольку в биологическом материале имеются другие восстановительные вещества, которые создают помехи. Наиболее часто встречается аскорбиновая кислота, которая нарушает течение окислительно-восстановительных реакций с использованием НоОо образуюшего фермента, тетразолия или фенола.
Цель изобретения — повышение точности способа определения.
Поставленная цель достигается тем, что в реакционную смесь вносят аскор-25 батоксидаэу в Количестве 100 Ео/мл исходной смеси, а учет реакции ведут по образованию окрашенного продукта.
Кроме того, для получения окрашенного продукта аскорбатоксидаэу вводят одновременно или с НоОо. образуюшим ферментом, или с солью тетраэолия или же с феьолом.
Используемую аскорбатоксидазу можно получить иэ Zucchini (Cucurbuta реро »»»edullosa).
Предпочитаемыми методами для предлагаемого способа являются определение глюкозы с пероксидаэой или глюкозаоксидаэой и о-дианизидином или
2,2-азино-ди-3 -этилбензтиазс инсульфонатом (ABTS), определение глюкозы по методу гексокинаэы глюкоза-6-фосфатдегидрогеназы), обнаружение мочевой кислоты посредством фенола, аминоантипирина, пероксидаэы и уриказы, определение тироэина или пирокатехина посредством SMBTH (4-метил-б-калийсульфонил-бензтиазолонгидразона(2)) и тирозиназы или дифенолокси дазы.
Пример 1. Определение глюкозы с о.-дианизидином, пероксидазой, (POD) и глюкоэаоксидазой (GOD), изм ренное в фотометре, с длиной волны
432 нм, с температурой измерения
25оС (см. табл.1).
Кювета 1 соответствует ненарушенному измерению (нет аскорбиновой кислоты). Кюветы 2 и 3 показывают, 797592
Таблица 1
2,5 2,5
0,1 0,1
0,05 0,05
2,5
2,5
2,5 о-Дианизидин,, 0,5%
0,1
0,1
0,1
0,05
0 05
0,05
POD, О, 18% что 0,00573 или 0,000573% аскорбата практически полностью тормозят тест до 41,5%,кюветы 4 и 5-пок зывают полное устранение нарушения этих концентраций аскорбата добавкой по
0,0003% аскорбатоксидазы.
Пример 2..Обнаружение глюкозы с 2,2,-азино-ди(З-этил-бензтиазолинсульфонатом(6) ) (ASTS), РОЗ и ЯОЭ в фотометре, с длиной волны 432 ни, с температурой измерения 250С (см. табл. 2 .
Кювета 1 соответствует ненарушенному измерению (нет аскорбата). Кюветы 2 и 3 показывают, что 0,000573% или 0,0000573 мол.% аскорбата полностью тормозят тест до 2,1%.
Кюветы 4 и 5 показывают полное устранение нарушения этих концентраций аскорбата добавкой ro 0,ОООЗЪ аскорбатоксидазы.
Пример 3. Обнаружение моче- 26 вой кислоты посредством фенола, аминоантипирина, РО0 и урикаэы на аналитическом автомате (Aute Ana1уzar).
Принцип теста; Мочевая кислота +
+ O + H + Н О 2 Н Од + 2,4-дихлорфенал + + 4-аминоантипирин — хинодный краситель + 2 Н О Изготовление растворов. Реактив аскорбатоксмддэы. 9 600 мп З© бидистиллированиой воды растворяется содержимое флакона 1. Добавка О,З мл Вг Ц-35. Затем смесь выдерживается в темном флаконе приблизительно щж 40С четыре недели,при 25оС одну не-9 делю. Реактив уриказы. В 800 ил биднс тиллированной воды растворяется содержимое флакона 2. Добавка 2,0 мп 8rij-35. Затем смесь выдерживается в темном флаконе приблизительно нри 49 4 оС четыре недели, приблизительно при 25ОС одну неделю. Концентрация растворов. 0,63% фосфатного буферного раствора, рН 5,6. g$ О, 35% трис/лимонной кислоты, рН 8,9, уриказы ) 0,001%, Р00 yi 0,000015%, 0,05% 2,4-дихлорфенола, 0,08% 4-аминоантйпирина. Пример 4 ° Обнаружение глюкозы с НК/Я 6Р-ОА, МАРР, (NT и диа-, l Фосфатный буферный раствор, рН 7,01, 1,368% форазой в фортометре. Измеряемая длина волны 492 нм, температура инкубацин 25оС (см. табл. 3) . Кювета 1 соответствует ненарушенному измерению. Кювета 2 показывает, что 0 0000573% аскорбата может тормозить тест на 34% кювета 3 пока1 зывает, что 0,0003% аскорбатоксидазы полностью устраняет это нарушение. П р и и е р 5. Определение глутамата посредствои диафоразы в фотоиетре. Измеряемля длина волны 492 нм, температура 25оС(см. табл. 4). Кювета 1 соответствует ненарушенному измерению. Кюветы 2 и 3 показывают, что 0,0029Ъ нли 0,00029Ъ аскорбата тормозят тест на 7003 или на 100%. Кюветы 4 и 5 показывают полное устранение этого нарушения добавкой 0,00006Ъ аскорбатоксидазы. П р и и е р 6. Определение тнрозина с 3-метил-6-калийсульфонил-бензтиазолон-гидраэоном-(2)(SNBTH) и тнрозиназой в фотометре, измеряемая длина волны 492 ни, измеряемая температура 25оС (си, табл. 5) . Кювета 1 соответствует ненарушенному измерению, в кювете 2 0,00573 аскорбата снижает теоретическую величину на 35%, в кювете 3 это нарушение полностью устраняется добавкой О,ООЗЪ аскорбатоксндазы. Пример 7. Определение нирокатехина с SNBTH и дифенол-оксидаэой(см. табл. 6) . Кювета 1 соответствует ненарушенному измерению, В кювете 20,011453 аскорбата снижают теоретическую величину на 47%, это нарушение полностью устраняется в кювете 3 добавкой 0,0003% аскорбатоксидаэы. Полученный способ позволяет полностью устранить вызванные ошибки наличием аскорбиновой кислоты при проведении окислительно-восстановительных реакций. 797592 Продолжение табл. 1 вета Компоненты Раствор глюкозы, 0,172% 0,03 0,03 0,03 О „03 0,03 Раствор аскорбиновой кислоты 0,1 0,01 0,1 Оф01 0,02 0,11 — . 0,09 0,12 Вода 0,02 . 0,02 Аскорбатоксидаза 500 ед./мл, 0,054 Инкубация 1 мин при 25оС, считывание Е, затем начинается реакция с G0D О,ОЗЗЗЪ 0,1 0,1 0,1 0,1 Инкубация 30 мин при 25оС,считывание Е .,вычисление из Е -Е =6E 0,541 0,010 0,31б 0,540 0,543 ДЕ Таблица 2 Фосфатный буферный раствор, рН 5,6 1,3609% 2,75 2,75 2,75 0,05 0 05 0,02 0,02 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 Раствор аскорбиновой кислоты, 1 ммоль 0,1 0,01 0,1 0,01 0,02 0,11 — 0,09 0,12 0,02 0,02 Инкубация 1 мин при 25 C,ñ÷èòûâàíèå Е, начало реакции с 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 600 0,0333% Инкубация 30 мин при 25оС считывание Е, вычисление из Е -Е, = д Е 0,505 0,000 0,40 0,502 0,504 ABTS 2,74% POD, 0,25% Раствор глюкозы, 0,0172% Вода Аскорбатоксидата,005% 0,05 0,02 2,75 2,75 0,05 0,05 0,02 О 02 79Уг 9) Т а с и и ii 3 Компо Кюветд Фосфатный буферный раствор, рН 7,5, 1,36% 1,7 1,7 1,7 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,01 0,01 Аскорбатоксидаза, 0,00035% 0,03 0,04 0,03 Вода Инкубация 3 мин при 25 С, считывание Е на ало реакции с НК/G6P-DH-раствор по 0,14% 0,05 0,05 0,05 Ннкубация 15 мин, считывание Е, вычисление из E -E> = Ь E 0,234 0,307 0,230 Таблица 4 Фосфатный буферный раствор рН 5,6, 0,14% 1,30 1,20 1,29 0,1 0,1 0,1 0,1 0,01 Инкубация 3 мин при 25ОС, затем раствор набирается пипеткой в отдельные кюветы 3,7 TRA 1,0 1,0 1,0 0,68 NA0-раствор 0,5 Р ас твор ди афор азы О, 2 0,2 0,2 0,2 0,05 0,05 0 05 0,05 О, 0. i 0,05 0,8 с он NADP INT по 0,1% Диафораза 5 E/ìë, 0,1% Раствор глюкозы, 0,005% Раствор аскорбата 0,17% Раствор глутамата, 0,02% Раствор аскорбата, 0,086% Аскорбатоксидаза, 0,01% Калийфосфатный буферный раствор рН 8,6 с 1,5%. тритона-Х-100 1,18 1,27 0,1 0,1 0,1 0,01 0,02 0,02 1,0 1,0 0,2 0,2 0,05 0,05 0,05 0,05 797592 Продолжение табл. 4 Кювета Компоненты Считывание Е, начало реакции с 0,05 0,05 0,05 1 Т вЂ” раствор 0,2 0,05 0,05 Инкубация 15 мин при 25 С, считывание Е вычисление из Е -Z, = d Е о Таблица 5 Фосфатный буферный, раствор рН 5,2, 3,44 2,77 2,77 2,77 0,05 0,05 0,05 SMBTH 0,1 мол, за Раствор аскорбиновой кислоты, 0,172% 0,1 0 1 0,02 Вода Аскорбатоксидаза 500 Е/мл 0,05% 0,02 0,05 0,05 0,05 Тироэиназа, 0,2 Инкубация 1 мин при 25ОС считывание Е>, начало реакции с 0,036% тирозин 0 05 0,05 0,05 Инкубация 1 час при 25ОС считывание Е, вычисление из Е>-E„ = AE 1t113 0,728 1,100 ЬЕ Т а б л и ц а 6. Фосфорный буферный раствор, рН 5 2, 3,4% 2,68 2,70.2,80 0,05 0,05 0i05 0,10 0,10 0,10 0,1, 0 i 3. 0,02 SMBTE1 0,1, З,ОЪ . Пирокатехин, 0,0056% Раствор аскорбата 20 ммоль Аскорбатоксидаза 500 Е/мл 0 184 1г560 0ñ 380 Ог186 О ° 182 В! . 4Г". а °:- ° ° t з ° Е ЕР,Е 9» "Е Ре, ь. р р" "" " " 1675 92 Продолжение табл. > Кювета Компоненты Инкубация 1 мин при 25 СР считывание Е, начало реакции с дефенолоксидаэа, 0,23 0,05 0,05 0 05 Инкубация 17 мин при 25 С считывание Е, вычисление из Е -Е = ЬЕ О IR 1 ЬЕ 0,890 0,485 Г,896 Формула изобретения Составитель Морозова T д . сталош Ко екто И. Муска Редактор Заказ 982 539 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035 Москва Ж-35 Ра сная наб., д. 4 5 Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4 1 ° Способ определения субстрата или ферментативной активности в биологическом материале путем проведения окислительно-восстановительной реакции, отличающийся тем,что, с целью повышения точности способа, в реакционную смесь вносят аскорбатоксидаэу в количестве 100 Eg/ìë исходной смеси, а учет реакции ведут по образованию окрашенного продукта. 2. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что для получения окрашенного продукта аскорбатоксидазу вводят одновременно с Н Оаобразукщим ферментом. 3. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что для получения окрашенного продукта аскорбатоксн2О даэу вводят одновременно с солью тетразолия. 4. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что для получения окрашенного продукта аскорбатоксидаэу вводят одновременно с фенолом. 5. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что используют аскорбатоксидазу иэ zucchini (Cucurbuta pepo medullos.à). 30, Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. В !ochemiса1 Сорреr Рroceedings Иагкi292en И.Ч. 1965, с. 305-337.
