Патент ссср 826247

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) ЗаЯвлено иД3879 (21) 2811946/28-13 (51) М с присоединением заявки М

G 01 N 33/84

Государственный комитет

С С С"Р ио делам изобретений. и открытий (23) Приоритет (53) УДК,612. 12. 1 (088.8) Опубликовано 300481. Бюллетень 89 16

Дата опубликования описания 3Q0481

3

-о g., i„

В.К. Козлов, Р;А. Маркосян и Л.В. Фил тМа--.„--,, ЬИБ;:;j,: -::; ° (72). Авторы изобретения (71) 3а яв итель

Всесоюзный кардиологический научный центр

Академии медицинских наук СССР (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ KHCJIOTHOCTH

ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ГРАНУЛ

ТРОМБОЦИТОВ

Изобретение относится к области медицины, а именно к цитологическим исследованиям, и может быть использовано для оцЕнки свойств внутриклеточ5 ных гранул.

Известен способ определения кислотности внутриклеточных гранул тромбоцитов путем выделения клеток с последующей их отмывкой и инкубацией в забуференной среде (1 j. .Однако при известном способе возможно повреждение гранул органелл в процессе выделения, способ плохо воспроизводим и не обеспечивает высокой точности. 15

Цель изобретения — повышение точности способа.

Поставленная цель достигается путем выделения клеток, с последующей их отмывкой и инкубацией в забуференной среде, при зтом клетки инкубируют в среде, содержащей 3.10 N катионного флюоресцентного красителя до полного насыщения гранул индикатором, далее рН среды снижают и фиксируют рН среды, при котором перестает выделяться краситель из гранул, и по его величине определяют кислотность внутриклеточных гранул тромбоцитов.

2 !

Пример . Проводит определение внутреннего рН серотониновых гранул (5-НТ органелл) кровяных пластинок кролика. Для этого кровь получают пункцией сердца и стабилизируют в соотношении 9:1 кислым цитратом натрия (0,085 N цитрата натрия и 0,065 М лимонной кислоты).

Посредством центрифугирования получают обогащенную тромбоцитами плазму. Затем клетки осаждают в течение

40 мин при 2000 об/мин и ресуспензируют в специально подобранной среде следующего состава: на 250 мп раствора бе1зут 0,658г ИаС1; 0 949 г цитрата .натрия, 0,451 r глюкозы, 0,433 r RgSO< -, 0,092 г СаС1, 50 мп (.0,1 М) фосфатного буфера (рй 7,4) и 750 ед. гепарина.

К клеточной суспензии добавляют

3 ° 10 N акридинового оранжевого и инкубируют 15 мин К 2 мп суспензии, содержащей 400-800 тыс.кл/муз добавляют 6 мп физиологического раствора. Для измерения флуоресценции смеси используют флуориметр, рН определяют злектрометрически. Добавляют по 15 мп 0,1 н. раствора

НС1 и через каждые 2 мин определяют флуоресценцию и рН раствора.

82б247

Формула изобретения

Составитель С. Малютина

Редактор Е. Дичинская Техред A.Лч Корректор М. Коста

Заказ 2368/33 Уираж 967 Подписное

ВНИИПЯ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035 Москва, X-35, Раушская наб., д.4/5

Филиал ППП Патент, z Óæãîpîä, ул.Проектная, 4

На чертеже представлены графики зависимости интенсивности флуоресценции от рН среды.

После достижения определенной величины рН взвеси дальнейшего роста флуоресценции не наблнщается (кривая 1). Определемюе таким способОм значение рН.серотониновых гранул тромбоцитов кролика колеблетоя в пределах 5,2-5,8. При измерений одного и того же образца разница определений не превышает 0,05 ед. РН., Инкубация суспензия отмытых

5-HT органелл кровяных пластинок с серотанином и NH@Ci приводит к защелачиванию их матрикса.

Предлагаемым способом оценивают рН данных гранул у нативных клеток после воздействия 154р N серотонина (кривая 2) и 15 m М НН4С! (кривая 3).

ПолучеНные результаты совпадают с данными, полученными на суспензии 26 отмытых 5-Нт органелл. .Предлагаемый-способ позволяет с высокой степенью точности оценивать внутреннийррН серотониновых гранул нативных, неразрушенных 25 тромбоцитов. Метод прост. его результаты не зависят и широких пределах от концентрации клеток в суспензии. точность способа может быть повышена при снижении количест- ву ва добавляемой кислоты (т.е. уменьшение скачков внешнего рН) и работе с концентрированными суспензиями. Способ может найти широкое применение при диагностике тромбастений, связанных с нарушениями функций серотониновых гранул пластинок.

Способ определения кислотности внутриклеточных гранул тромбоцитов путем выделения клеток с последующей их отмывкой и инкубацией в забуференной среде, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения точности способа, клетки инкубируют в среде, содержащей 3-10 М катионного флюоресцентного красителя до .полного насыщения гранул индикатором, далее рН среды снижают и фиксируют рН среды,при котором перестает выделяться краситель из гранул и по его величине определяют кислотность внутриклеточных гранул тромбоцитов.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе, 1. R,G. Johnson, А. Scarja, L.Salganicoff. The lntenal pH of lsolated .

Sегоtonine Containing granules of

Pig Рlateles. — J. В1оl. Chem.,7061, 1978, р. 253.