Электротехническое устройство для определения скорости ферментативных окислительно-восстановительных реакций

 

Союз Советских

Социалистических

Республик

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 300879 (21) 2811819/18-25 (5))M. Кл. с присоединением заявки ¹

G 01 N 27/52

Государственный комитет ссср по делам изобретений и открытий (23) Приоритет—

Опубликовано 230881. Бюллетень ¹ 31

Дата опубликования описания 2 30881 (53) УДК 543.257 (088. 8) (72) Авторы изобретения

Д.М.Ивницкий, В.А.Блинов и А.В,Назаров

Самаркандский медицинский институт (71) Заявитель (5 4) ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОЕ УСТРОЙСТВО ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

СКОРОСТИ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ ОКИСЛИТЕЛЬНОВОССТАНФВИТЕЛЬНЫХ РЕАКЦИЙ

Изобретение относится к электрохимическим устройствам, используемым в энзимологии для определения скорости фермент ат ив ных реакций, з также соответствующих субстратов, ингибиторов и активаторов.

Известно электрохимическое устройство, применяемое для изучения кинетики электродных процессов (1J.

Однако оно не позволяет изучать кинетику ферментативных реакций.

Наиболее близким к предлагаемому является электрохимическое устройство для определения скорости ферментативных окислительно-восстановитель15 ных реакций, содержащее индикаторный и сравнительный электроды, соединенные с регистрирующим устройством и погруженные в электролит и фермент, Анализируемое соединение, например глюкоза или холестерин, окисляются в присутствии соответствующего фермента — оксидазы с образованием перекиси водорода. Последняя диффундирует к платиновому аноду полярографической ячейки, окисляется, при этом результирующий ток ячейки пропорционален концентрации Н О и линейно связан с количеством глюкозы или холестерина в пробе.

Полярографическая ячейка состоит из Pt-анода и Ag-катода. Между реакционной камерой и полярографической ячейкой расположена мембрана с иммобилизованным ферментом. Необходимый потенциал ячейки устанавливается с помощью источника питания 21.

Однако известное электрохимическое устройство не обеспечивает высокой чувствительности и точности.

Наличие мембраны между РеакцноннОй камерой и полярографической ячейкой существенно увеличивает постоянную времени прибора, снижает его чувствительность,выходной сигнал имеет малую мощность и для его усиления необходим соответствующий преобразователь. При измерениях возможны. погРешности в результате обратимого процесса разрушения перекиси водорода

2Н О -+ 2Н О + О

1 2

Кроме того, перед каждым определением приходится проводить дополнительную калибровку электрохимической ячейки.

Цель изобретения — повышение чувствительности определения.

857845

Поставленная цель достигается тем, что в устройстве определения скорости ферментативных окислительно-восо"ановительных реакций, содержащем индикаторный и сравнительный электроды, соединенные с регистрирующим устройством и погруженные в электролит, электроды выполнены из пористого угля с гидрофильной пропиткой и соединены посредством пористой мембраны, причем индикаторный электрод содеРжит иммобилизованный и фермент, i0 связанный с гидрофильной пропиткой из биоспецифического сорбента, торцевая часть сравнительного электрода изолирована, а электролит содержит ионы Л 15

О пределе ние с корост и ферме нт ативных окислительно-восстановительных реакций основано на деполяризации .рабочего угольного электрода гальванического элемента иодом — продуктом каталитического окисления иодид-ионов перекисью водорода. Деполяризация рабочего электрода сопровождается появлением тока во внешней цепи элемента. В зависимости от скорости изучаемой ферментативной реакции величина тока линейно изменяется от 0 до 10 мкА, что позволяет определять не только активность ферментов оксидаз, но и концентрацию соответствУющих субстратов. B качестве изме- 30 ряющего прибора используют микроамперметр или самопишущий потенциометр (гальванический элемент).

Гальванический элемент открытой частью рабочего электрода погружают 35 в анализируемый раствор, содержащий

0,1 М ацетатный буфер (pH 5,6) и

0,001 М KI. Раствор термостатируется при 37 С; Минимальный объем анализируемого раствора 1 мл. Для непрерыв- 40 ного анализа можно исполь овать специальную рабочую камерУ проточного типа.

Исследуемый субстрат-глюкоза, диффундирует из анализируемого раствора к поверхности рабочего электрода, на котором происходит окисление субстрата под действием иммобилизованнбй глюкозооксидазы до перекиси водорода.

Последняя в присутствии иммобилизованной .пероксидазы . окисляет иодид-ионы до молекулярного иода.

Образовавшийся иод электровосстанавливается на рабочем электроде. При этом во внешней цепи элемента появляется ток, непрерывно регистрируемый ,микроамперметром. Изменение тока в электродной системе линейно зависит от скорости ферментативной реакции и, 60 следовательно, от концентрации определяемого субстрата.

Ферментативные и электрохимические процессы, протекающие на поверхности угольных электродов гальванического 65 элемента можно выразить следующими ре а кци я ми:

C + 0 — - — — П + Н 0 фермент оксидаза 2

Н Ох+ 2Л + 2Н+

3+2HO

t где С вЂ” субстрат;

П вЂ” продукт ферментативной реакции.

На рабочем электроде происходит электровосстановление иода, на вспомогательном электроде осуществляется процесс окисления активного угля.

На чертеже изображен гальванический элемент.

Гальванический элемент содержит угольные пористые рабочий 1 и вспомогательный 2 электроды, разделенные пористой мембраной 3, например пористым стеклом или пористой керамикой. Оба электрода помещены в корпус

4 так, что только часть рабочего электрода остается непокрытой корпусом. Эта часть электрода погружается в анализирУемый раствор. Концы рабочего и вспомогательного электролов соединены с микроамперметром 5.

Для получения пористых угольных электродов используется смесь следующего состава: угольный порошок, растворимая в воде соль, например ггаС1, гидрофильный материал, который выбирается из числа биоспецифических сорбентов с учетом природы используемого фермента, например .KN-целлюлоза, связующее, например эпоксидная смола.

Полученная смесь тщательно перемешивается до однородной массы, прессуется в прессформе под небольшим давлением (60-70 кг/сгл ), затем высушивается при комнатной температуре до полного затвердевания смолы и погружается в дистиллированную воду для растворения и вымывания солевых включений (йаС1) и, следовательно, образования пористости.

Рабочий электрод получают пУтем иммобилизации фермента на поверхности гидрофильного материала. включенного в пористый угольный электрод. Для определения глюкозы рабочий электрод содержит в качестве биоспецифического сорбента КМ-целлюлозу с иммобилизо— ванными на ее поверхности путем адсорбции в 0,1 М ацетатном буферномрастворе (рН 5,6) глюкозооксидазой и пероксидазой.

Для работы элемента в гальваническом режиме в качестве вспомогательного электрола используется пористый угольный электрод, который обеспечивает рабочемУ электродУ потенциал (0,205 в отн. Ag/AgCI), соответствующий площадке предельного тока электровосстановления иоца.

Предлагаемый гальванический элемент может быть использован в качестве топливного элемента, ферментного электрода для исси;.лсвания

857845

Формула изобретения

Составитель И. Рогаль

Техред A. Бабинец Корректор М. Коста

Редактор О. Малец

Тираж 90 7 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35. Раушская наб., д. 4/5

Заказ 7232/72

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4 ферментативных окислительно-восстановительных реакций, а также для количественного определения различных соединений, в ходе ферментативного превращения которых образуется перекись водорода.

Электрохимическое устройство для

Iопределения скорости Ферментативных окислительно-восстановительных реакций,. содержащее индикаторный и сравнительный электроды, соединенные с регистрируюшим устройством и погруженные в электролит и Фермент, о т л и ч а ю щ е е с я тем, что, с целью повышения чувствительности, электроды выполнены из пористого чгля с гидрофильной пропиткой и соединены посредством пористой .мембраны, причем индикаторный электрод содержит иммобилизованный фермент, связанный с гипрофильной пропиткой из биоспецифического сорбента, торцевая часть сравнительного электрода изолирована, а электролит содержит ионы Л

Источники инФормации, принятые во внимание при экспертизе

1. Антропов Л.И. Теоретическая электрохимия, M., 1965, с. 238.