Производные s-пирролидонметил-цистеина в качестве промежуточных продуктов для синтеза цистинсодержащих пептидов

 

Союз Советских

Социалистических

Республик

ПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

<>876641

К АВТОРСКОМУ СВИ ЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 070180 (21) 2865938/23-04 (51М ©Л

С 07 0 207/27

С 07 С 103/52 с присоединением заявки ¹

Государствеииый комк,;т

СССР ио делам изобретений и открытий (23) Приоритет

«

Опубликовано 30.10.81. Бюллетень 89 40 (53) УДК 547.964.4 (088. 8) Дата опубликования описания 3010.81

Р (72) Авторы изобретения

Г. И. Ауконе, С.Я. Микста, У.О. Калей и О.С. Ilanc :,.;;ä„;.

1 ,I .с . ;Я,) «Ц ° «

«

:! 4, 1 ЛАТИН

) . «(} -:", .,, у. - М :Д« с (71) Заявитель (54) ПРОИЗВОДНЫЕ S-ПИРРОЛИДОНМЕТИЛ-gHCTEHHA

В КАЧЕСТВЕ ПРОМЕЖУТОЧНЫХ ПРОДУКТОВ

ДЛЯ СИНТЕЗА ЦИСТИНСОДЕРЖАЩИХ ПЕПТИДОВ

Изобретение относится к новым химическим соединениям, а именно к производным 5-пирролидонметил-цистеина, которые могут быть использованы в качестве исходных продуктов для синтеза цистинсодержащих пептидов, в частности необходиьих в медицине пептидных гормоновг, окситоцина, вазо.прессина и инсулина.

Из вест ны S-ацет амидометильные (5-Acm) производные цистеина f1).

S-Асе-защита легко отщепляется солями ртути в уксусной кислоте или . иодом в органических растворителях с одновременным замыканием дисуль-фидного цикла (2).

Недостатком S Àñm-защиты цистеина являются затруднения при ее введении в аминокислоту, связанные с необходимостью проведения синтеза в: 20 инертной атмосфере, значительной продолжительностью реакций (1-2 дня) протеканием побочных реакций и, вследствие этого, сравнительно низким выходом целевого продукта (52%), Кроме того при работе с S-ацетамидометильными производными цистеина возникают трудности т1ри выделении и .очистке полученных соединений из-эа одинаково хорошей растворимости ис-,, 30 ходных и конечных продуктов в воде и в органических раствортелях.

Более близкими к заявляемым по строению и химическим свойствам являются S-бензамидометильные (S-Bzm) производные цистеина.(3).

Недостатками 5-Bzm-защиты являются низкая .ее устойчивость к основаниям, применяемым в условиях пептидного синтеза и черезмерная устойчивость к действию иода в метаноле, что снижает выходы при получении пептидов, содержащих S --S-связи.

Так, с использованием 5-Bzm-цистеина синтезирован дипептид Вос-CyS (Bzm) — CyS (Bzm) ОИе с выходом 64%.

При отщеплении S-защитных групп от полученного дипептида с одновременным замыканием дисульфидного цикла действием иода в .метаноле с выходом 50% получен описанный в литературе f4 )> соответствующий циклический дисульфид Boc/CyS-CyS-ОИе (Vl). Общий выход последнего, считая на исходный гидрохлорид S-Bzm-цистеина, составляет лишь 22%, Цель изобретения J- новые производные по SH-группе цистеина,приме-: нение которых позволяет повысить выход и упростить технологический про876641 джесс получения цистинсодержащих пеп- тидов.

Поставленная цель достигается предлагаемыми производными S-пирролидонметилцистеина общей формулы ° с=о где Х - (СНВ)ВСОСО (ВОС) или НС}, Ч ОН йляи ОСН

О

-!.я М - пирролиндонметил (Pym). и

Соединения укаэанной общей формулы получают известными (4) метода. ми по схеме

ЙСЯ NH2- CH-C 0OH

1 са<-ьн

Гидрохлорид цистеина, Мол.масса

157,62

=O ; бн !.!И

СН,ОН и -оксиметилпирролидон

° НС1 3Н>- сН- СООн

СН ! " 2=1

Ридрохлорид S - Pym-цистеина

Мол.масса 254,74

voce,меон

НС1 ЯК2- СН- СООСН3 сн О

2 - H,- H, Гидрохлорид метилового эфира . S- Руа-цистеина, Мол. масса 268,76

pC >,С-оСо,С!

Дй-трет-бутилпирокарбонат (сн,},сосо-эн- сн-сооН

I 0 сн

СН2

Рос -5- Pym -цистеин Мсп.мааса

318,39 °

ГидРохлорид S - Pym-цистеина (! ) получают взаимодействием гидрохлорида цистеина и N oêñuìåòuënuððîëuдона при молярных соотношениях 1:1,1

s течение 30 мин. Выход 90%.

Синтез гидрохлорида метилового эфира 5-Руа-. истеина (I}I) проводят этерификацией (!!) в метаноле в присутствии хлористого тионила с выходом 99,6%. !

О

При взаимодействии (II) с ди-трет-бутил-пирокарбонатом в присутствии гидроокиси натрия в течение

2,5 ч получают Вос-S- Pym цистеин (IV) с выходом 98%

Проверка эффективности производных S- Pym-цистеина в синтезе цистеинсодержащих пептидов показывает, что реакция конденсации Вос-S Pym-цистеина с гидрохлоридом метилового

20 эфира S- Pym-цистеина методом смешанных ангидридов (с изобутиловым эфиром хлоругольной кислоты в присутствии N --метилморфолина) проходит с вы-.„ ходом 90%.

Отщепление S-защитных групп от полученного метилового эфира Вос-S- Pym-цистеинил-S Рув-цистеина (V) и зажкание дисульфидного цикла осуществляют действием иода в метаноле в течение 1,5 ч с выходом 92%.

Использование производных 5 - Pym-цистеина в качестве исходных продук-, тов для синтеза.цистеинсодержащих пептидов позволяет получить упомяйу-. тый выше циклический дисульфид метилового эфира Вос-цистеинил-цистеи-. на (Vl) с общим выходом 73%.

Таким обраэом, изобретение обеспечивает значительный положительный эффект. Выход цистинсодержащего ди40 пептида по сравнению с известным увеличивается на 51%, достигается значительное упрощение проведения процесса, связанное с применением устойчивых в условиях пептидного син45 теза производных 5-пирролидонметилцистеина.

Преимуществами новых соединений являются их хорошая кристаллизуемость высокие выходы, устойчивость

7 к воздействию различных реагентов, применяемых в синтезе пептйдов (действие кислот, едких щелочей, триэтиламина, аммиака, гидразингидрата), легкость и селективность отщепления

S-защитных групп иодом в метаноле. . устойчивость S- Pym-группы обусловлена наличием. в молекуле .5-и членного гетероциклического кольца пирролидона, в котором распределение электронов способствует стабилизации

40 молекулы. S- Pym-производные цистеина» белые кристаллические вещества, растворима в спиртах, этиловом эфире, уксусной кислоты, диметилформамиде, воде. Нерастворимы в эфире, петро65 лейном эфире, гексаие.

876641

Структура новых соединений подтверждена ИК-,, ПМР-спектрами, элементным анализом.

ИК-спектры сняты на спектрофотометре "Perkin-Eimer-325" в области

650-3500 см "(ННВД, Н1ООЛ).

ПМР-спектры записаны на с тектрофотометре модели R-12A (60 мГц)фирьы "Perk in- Е1mer".

Пример 1. Гидрохлорид Зпнрролидонметил-цистеина (1! ) .

К смеси 15,7 г (0,1 моль) гидрохлорида цистеина, 12,7 r (0,11 моль)

N-оксиметилпирролидона и 40 мл воды, охлажденной до 0 С, добавляют при перемешивании 15 мй концентрированной соляной кислоты и перемешивают I5 при комнатной температуре в течение

30 мин. Образовавшийся раствор выливают в смесь 450 мл изопропилового спирта и эфира (1:2 ), перемешивают до начала кристаплизации и реакцион- 20 ную смесь оставляют в холодильнике ,на 4 ч. Продукт отфильтровывают, промывают на фильтре эфиром и перекристаллизовывают из смеси метанола и эфира, Выход гидрохлорида (1)

22,95 г (90%, считая на гидрохлорид цистеина) . Т.пл.. 174-175 С, Щ П+ 4,7(с1, Н О), а(3 - 13,4 (c1, йеОН) .

Йайдено,%: С 37,70; Н 5,92;М 10,94.

Вычислено,%: С 37,72; Н 5,94;

И 11,00

Спектр ПМР (D O + CFyCOOH) д ; 8,46 (2Н м.с., N H), 4,40 (1Н,к, C H }, 3, 17 (2Н, м, C{ H), 4,52 (2Н, система АВ, 2, S-Сфй ), 3,61 (2Н, м, N C )

2, 43 (2Н, м, N СОССН ), 2,11 м.д. (2Н, м, ОСН тС)

ИК-спектр, см ф 3460 (I) N Н ), 1730 (1)СО в 5-членном цикле), 1645 (д и Н, 40 амид I ), 1515 (О и Н, аьыд 11), 1270 (d N H, амид I I I )

Пример 2, Гидрохлорид метилового .эфира S-пирролидонметил- .

-цистеина (Ilk)..

К 48 мл метанола, охлажденно го

О до -15 С, при интенсивном перемешивании прибавляют по каплям 2,2 мп хлористого тионила, затем добавляют

6 г (0,024 моль) гидрохлорида S-пирролидонметил-цистеина (1 ) и полученный раствор перемешивают при 45 С о

4 ч, после чего растворитель отгоняют в вакууме досуха. Остаток перекристаллизовывают из смеси метанов и эфира и сушат в вакууме над едким 55 кали. Получают 6,27 г (I!1) (99,6% считая на 1). Т.пл. 70-72 С, faL 3 >

-5, 2 (c1, МеОН }.

Найдено,%: С 40,17, Н 6,25,й 10,37

С9Н,!6М gOg "Ci ° . 6{)

Вычислено,%: С 40,22, Н 6,38, и 10,42.

Спектр ПМР (С P COOH) д: 8,4 (2Н, м,с. М;Н), 4,6 1Н, м, ФН), 4,86 (1Н, д, -СН-й }, 4,45 (2Н, к, 65

СООСН ),:: 3,82 (2H, т N CHg) 3 40 (2Н, М4 СРй2), 2,88 (2Н, м, СОСН ), 2,35 (2Н, м, С-CH -C) 1,40 м.д, (>ЗН, т, CH9), ИК-спектр, сМ ; 3420 (O NH);

1730 (11CO в 5 членном цикле); 1640 (д NH амид 1}; 1520 (д МИ амид 1!);

1270 (0 NH амид 111); 1745 (V СО сл. эфир) .

Пример 3. и -трет»бутоксикарзонил-S- nuððoëuäîuìåòèë-цистеин (М.

10,2 r (0,04 моль)Гидрохлорида

S ïuððoëuäîíìårèë-цистеина (11) растворяют при перемешивании в 80 мл 1 н. раствора едкого натра, и приливают раствор 12 г (0,055 моль)ди-трет-бу= тилпнрокарбоната в 40 мя трет-бутилового спирта. Раствор нагревают при 45 в течение 5 мии, а затем пео ремеши вають при комнатной температуре

2,5 ч. Затем реакционную смесь экстрагируют 50 мл петролинейного эфира и водный слой охлаждают до 0 С и подкисляют до рН 3-4 лимонной кислотой, Подкисленную реакционную массу насыщают хлористым натрием (20 г) и экстрагируют этилацетатом (3 1 50 мп).

Этилацетатные вытяжки промывают насыщенным раствором хлористого натрия и затем сушат над безводным сернокислым натрием. Этилацетатный раствор упаривают в вакууме и к остатку добавляют гексан. Продукт перекрнсталлизовывают нз смеси этилацетата и гексана. Выход 12,5 г (98% считая на 1), Т. пл. 113-114,(с(.! -28,3 С (c 0,5, Н О).

НайдеНо, %: С 49, 10; Н б, 97;

1 8, 72.

С1 Н2 М20

Вычислено,%: С 49,04; Н 6,97;

N 8,80.

Спектр ПМР (DNCO), 8:.6,90 (1Н, д, МН}; 4,34 (2Н, м, СНАМ); 4,01 (1Н, м, C Í); 3,37 (2H, т, С Н); 2,75 (2Н, м, NCOCHg ); 2,00 (2H, м, ССН С); 1,43 м,д. (с. С(СН ) ) g ик-спектр, см : 3330 (1)МН); 1725 (О CO в 5 членном цикле); 1695 (МСО уретан); 1640 (д NH амип I), 1530 (д МН амид 11); 1265 (дйН амид 111), П р н м е р 4. Метиловый эфир

N-трет-бутоксикарбонил-S-пирролидон

-метил-цистеинил-S-пирролидонметил-цистеина (Ч). о

К охлажденному до -15 - 20 С раствору 1,27 г (4 ммоль)М-трет-бутоксикарбоннл-S-пнрролидонметил-L-цистеина в 5 мл диметилформамида прикалывают при перемешнванни 0,44 мл (4 ммоль)

N-метилморфолина и затем 0,52 мл (4 ммоль) изобутилового эфира хлоругольной кислоты. Через 10 мин добавляют охлажденную смесь 1,075 г (4 ммоль) гидрохлорида метилового эфира S-пирролидонметил-L-цистеина и 0,44 мл (4 ммоль) М-метилморфоли876641

Формула изобретения

Х -йН- Н-СО-М

СН, 5-сн2-N /

О где Х - (CH5)9COCO (Boc) или HCI

Y — ОН или ОСНОВ, -СН -Н 1

-пирролидонметил-(Руа), 0 о

s качестве промежуточных продуктов синтеза цистинсодержащих пептидов.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент США 9 3560521, кл. 260-326,3, опублик. 1971.

2. Патент ФРГ Р 2060969, кл. 129 01 - опублик. 1971. — Арш Г.Ш., Папеуевич О.С., Микста С.Я. S -бенэамидометильные производные L-цистеина и Р-меркаптопропионовой кислоты, - ЖОХ, 1975, г.45, Р 6, с. 1384-1388.

4. Химия полипептидов. Под ред.

fI. Катсояииса. Пер. с англ., М., "Мир", 1977.

Составитель Г. Желтухкна

Редактор Л. Филь Техред А,Ач Корректорт Н. Швыдкая

ЮРФ ЮМ

Заказ 9495/29 Тираж 446 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета, СССР пс делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5 е Ю

Филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул. Проектная, 4 на в 5 мп диметилформамида и перемешивают еще 3,5 ч при -15 — 20 C. После завершения реакции смесь разбавляют водой и экстрагируют этиловым эфиром уксусной кислоты. Органический слой промывают последовательно 0,25 н. раствором бикарбоната натрия, 0,05 н, 5 серной кислотой -к насыщенным раствором хлористого натрия и сушат над безводным сульфатом натрия. Растворитель упаривают в вакууме и к остатку добавляют гексан. Полученный продукт перекристаллизовывают нэ смеси этилового эфира уксусной кислоты и гекса-. на. Выход 1,92 r (90%), т.пл..78-80 С, (с 3.В- 47,8 С (c 0,1, МеОН)..

Найдено,%: С 49,54; Н 6,94; N 10,41 15

С21 Н96 И407 5с °

Вычислено,%: С 49,61; Н 6,81, N 10,52 °

Спектр ПМР .(CD С1g): 5,4 (1Н, д, NH) g 5,26 (1Hg gg. NH5 р 4@52 (1Hg Mg gp

3,70 (1Н, м, C H)i 3,58 (ЗН, с, СООСН9); 3,02 (4Н, т, й) Н и NCHg)

2,90 (4Н, м, СРН и СРНд), 2 4 (4Н м, СН -СО и СЦ СО); 2,0 (4Н, М, С-СНу.— С и С-С -С); 1,42 м.д. (9Н, с, С(СНЭ) 5).

ИК-спектр, см: 3420 (4 N Н); 1730 (0 СО в 5 членном цикле), 1745 (QC0 сл.эфир); 1695 ()СО уретан); 1640 фКН амид 1); 1530 (д МН амид I I ), ЗО

12.70 дй Н амид 1 I I ) .

Пример 5. Циклический дисульфид метилового эфира N-трет-бутоксикарбонил-цистеинил-цистеина (VI).

К раствору 1,27 r (5 ююль) иода 35 в 50 мл метанола прикапывают в течение 30 мин раствор 0,67 r (1,25 ммоль) метилового эфира Вос-8-пиppолкдонмeтил-цкстеинил-S-пирролидонметил-цистеина (V) в 30 ьж метанола, после чего смесь перемешивают еще 40 мкн.

После охлаждения до 0 С добавляют

1 н. раствор тиосернокислого натрия о слабо-желтой окраски, смесь уна.ривают д мл, хлороформом, промывают 0,5 н. раств - 45 тиосернокислого натрия и водой, вы- =сушивают над безводным сульфатом натрия. Растворитель упаривают, остаток выкристаллизовывают при добавлении петролейного эфира. Выход после перекристаллизации из" смеси

m.ороформа и петролейного эфира

0,39 r )92%, считая на IV). Т.пл.

186-187 С,(а(Р— 67,8 (с 1, МеОН).

Общий выход 73% (на гидрохлорид цистеина) .

Найдено,%: С 42,97; Н 6,04, N 3,30

С H N>0<5

Вычислено,%г С 42,89; Н 5,99; и 8,33.

Литературные данные: T.пл. 185187О, bL D — 64,5"С (с 1,87, МеОН).

Найдено,%: С 43,13; Н 6,21;

N 8,38 3Д; Т.пл. 180-183 52).

Производные S-пирролидонметил-цистеина общей формулы