Способ получения модулятора циклонуклеотидзависимых протеинкиназ

 

>878294

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕПЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 17.03.80 (21) 2851239/28-13 с присоединением заявки— (23) Приоритет— (43) Опубликовано 07.11.81. Бюллетень ¹ 41 (45) Дата опубликования описания 07.11.81 (51) М Кч з А 61 К 35(34

Государственный комитет

СССР по долам изобретений и открытий (53) УДК 663.53 (088.8) (72) Авторы язобр етен ия

Н. Х. Мехтиев, С. Т. Садыхов, С. Н. Баба-заде и Н. С. Сафаров

t

1 с

1 (71) Заявитель

Научный центр биологических исследований

АН Азербайджанской CCP (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОДУЛЯТОРА

ЦИКЛОНУКЛЕОТИД вЂ” ЗАВИСИМЫХ ПРОТЕИНКИНАЗ

Изобретение относится к области биохимии и может быть применено для получениях белковых модуляторов ферментов.

Известен способ получения модулятора циклонуклеотид — зависимых протеинкиназ путем гомогенизации хвостовых мышц омара, тепловой обработки супернатанта, осаждения надосадочной жидкости трихлоруксусной кислотой, двухкратного осаждения сульфатом аммония с последующей хроматографией на диэтиламиноэтилсефадексе и гель-фильтрацией.

Однако известный способ является трудоемким и длительным.

Цель изобретения — упрощение способа и расширение сырьевой базы.

Поставленная цель достигается тем, что гомогенизации подвергают хвостовые мышцы креветок, после центрифугирования полученный раствор подвергают тепловой обработке, повторно центрифугируют, осаждают надосадочную жидкость трихлоруксусной кислотой, двухкратно осаждают сульфатом аммония с последующей хроматографией на диэтиламиноэтилсефадексе и гель-фильтрацией.

Способ осуществляют следующим обобразом.

Гомогенизацию 500 г; хвостовой мышцы креветки проводят в 4 мМ нейтрализованной этилендпамминтетрауксусной кислоте в соотношении один объем ткани на пять объемов раствора.

Гомогенат центрпфугируют прп 6000 д в течение 30 мин. Избавившись от осадка центрифугированием, супернатант кипятят

15 мпн. прп непрерывном перемешивании.

После охлаждения на льду раствор центрифугируют при 3000 д в течение 20 мин, отделяют осадок, раствор пропускают через ватный фильтр. К отфильтрованному раствору добавляют по каплям при интенсивном перемешивании 50%-ную трихлоруксусную кислоту в соотношении 1 объем кислоты на 9 объемов раствора.

Смесь центрифугируют при 6000 д

15 мин. Осадок собирают, суспензируют и холодной дистиллированной воде, рН ра. створа доводят до 7,5 5н. NaOH. Получен20 ный раствор диалпзуют против дистилли. рованной воды с двухкратной сменой воды в течен .å 18 ч.

Модулятор, полученный на этой стадии„ называется грубым модулятором.

25 К дпалпзованному раствору добавляют кристаллический сульфат аммония 10 г. на

100 мл. раствора. Раствор центрифугируют прп 6000 д 30 минут. К супернатанту добавляют сульфат аммония до конечной концентрации 40 г на 100 мл. раствора.

878294

Формула изобретения

Составитель В. Брусиловская

Техред Л. Орлова Корректор С. Файн

Редактор И. Марголис

Заказ 1322/1032 Изд. М 548 Тираж 694 Подписное

НПО «Поиск» Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Тип. Харьк. фил. пред. «Патент»

После 30 мпн. псремешигания раствор центрифугируют прп 6000 д 30 мин. Осадок растворяют в 5 мМ калий-фосфатном буфере и диализуют против того же буфера в соотношении 1: 100;. ухкратной 5 сменой буфера в течение 18 ч.

На колонку с диэтиламнпоэтил-сефадексом А-50, уравновешенную 5 мМ калий-фосфатным буфером с рН 7,0, nanîсят диализованный материал из предьцу- 10 щей стадии. Колонку промывают !00 мМ калий-фосфатным буфером с рН 7,0. Модулятор вымывают из колонки 300 мМ калий-фосфатным буфером с рН 7,0, затем полученный препарат модулятора кон- 15 центрируют путем, добавления к раствору сульфата аммония из расчета 40 г. сульфата аммония на 100 мл раствора. Раствор центрифугируют при G00 д, осадок собирают и диализуют протйв 5 мМ калий-фос- 20 фатного буфера в соотношении 1: 100 в течение 12 ч. Диализованный раствор наносят на колонку с диэтнламиноэтил-сефадексом Г-200 (2,5Х 100 см), уравновешанную 5 мМ калий-фосфатным буфером 25 рН 7,0. Модуляторы вымывают тем же буфером. Из 500 r. хвостовой ткани кревстки получили 24 мг. модулятора.

Предлагаемый способ расширяет сырьевую базу и позволяет упростить технологию получения модулятора ферментов.

Способ получения модулятора циклонуклеотид — зависимых протеинкиназ путем гомогенизации животного сырья, тепловой обработки, центрифугирования, осаждения надосадочной жидкости трихлоруксусной кислотой, двухкратного осаждения сульфатом аммония с последующей хроматографией и фильтрацией, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью упрощения способа и расширения сырьевой базы, в качестве источника сырья используют хвостовые мышцы креветок и хроматографию проводят на диэтиламиноэтилсефадексе с последующей гель-фильтрацией.

Источник информации, принятый во внимание при экспертизе:

1. Г. Е. Donnelly et oil «Protein Kiriase

Modulator from Lobster Ta!1 Muscle», Jourпаl of Biological Chemistry, voh 248, Bal<.1гпоге USA, 1973, р. 190 — 198,