Способ контроля биосинтеза белка в растворе

 

Союз Советских

Социалистических

Республик

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН Ия

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

894574 (6l ) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 04.01.80 (2! ) 2866548/30-15 с присоединением заявки РЙ (23 ) П рнорн тет

Опубликовано 30,12,81. Бюллетень № 48

Вата опубликования описания 30.12.81 (5I)M. Кл, G 01 М 33/48

G 01 М 27/00

Гавударствевкый квмнтет

СССР аа аелви изобретений к аткрыткй,(53) УД К 546, 963..3 (088.8) (72) Автор изобретения

Ю. В. Сафрошкнн (7() заявитель (54) СПОСОБ КОНТРОЛЯ БИОСИНТЕЗА БЕЛКА В РАСТВОРЕ

Изобретение относится к молекулярной биологии и биохимии и может быть использовано для исследования внеклеточно.го биосинтеза в растворе либо в установках для получения пептидов и белков,а также в иммунологии и фармацевтике при разработках и проверке активности рибосомных вакцин.

Известен способ контроля бисси нтеза белка в клетке путем специальной обработки фиксированных (мертвых) клеточных

1О препаратов, обработки их срезов пепсином и оценки функциональной активности рибосом до фиксации по остаточному количеству PHK и белка 11 j.

Недостаток известного способа состоит в малой оперативности вследствие длительной подготовки клеточных препаратов и сложных процедур морфофотометрии исследуемых и контрольных препаратов, что

20 создает большие (много часов, до суток) задержки между взятием препаратов и итоговым определением биосинтеза. Данный способ, кроме того, неприменим для контроля внеклеточного биосинтеза белка в растворе.

Uemü изобретения - ускорение контроля биосинтеза.

Указанная цель достигается тем, что оценку функциональных свойств рибосомных комплексов (отдельных рибосом, их агрегатов друг с другом с PHK и пептидом) проводят в емкости, разделенной изолирующей перегородкой с микроканалом 0,1-0,2 мкм на рабочую и вспомогательную секции, причем в рабочую секцию помешают белоксинтезнрующую систему с рибосомными комплексами, а во вспомогательную - буферный раствор, через микроканал пропускают ионный ток 10

10.- А с одновременным определением параметров модуляционных компонентов на» пряжения между секциями, по которым судят о биосинтезе белков в рабочей секции.

На чертеже представлена схема осуществления предлагаемого способа. з 89

В рабочую кювету 1 исследовательской установки с заземляюшим электродом 2 помещается буферный раствор с многокомпонентной белоксинтезируюшей системой, в том числе со взвешенными рибосомными комплексами, пассивными 3 и работаюшими 4. Микроканал. 5, в изолирующей перегородке 6 является единственным гидравлическим и электрическим сообшением рабочего объема со вспомогательной кюветой 7, имеющей измеритепьнь1й электрод 8 и содержащей такой же или несколько другой буферный раствор, но без рибосом.

Дпя осуществления способа важно, чтобы микроканал имел диаметр,0,1 мкм (не сильно превышающий собственный размер рибосом 0,02 мкм) и длину «1 мкм„ Типичное сопротивление таких каналов составляет 10 8 Ом, а собственный тепловой шум п 0,1 мВ эф. в полосе частот 010 кГц.

После у-становления гидравлического сообшепия между кюветами обеспечивают прохождение рпбосомных комплексов через канал слева направо за счет диффузии (514ф) рибосом в измерительную кювету. Затем пропускают через канал постоянный стабильный ионный ток (от внешнего источника 9) величиной

10 -10 А (для канала 0,1-0,2 мкм).

Этот ток создает на сопротивлении кана,ла разность потенциалов 0<у, которая намного (на 3-4 порядка) превышает собственный шум канала

"o= o (O,4+ 10)В», a,1ì (1)

5 реально используемых системах биосинтеза концентрация рибосом в растворе такова, что среднее расстояние между ни vBf пе меньше 1 мкм, Поэтому со сторо» ны рабочей кюветы в канал проникают лишь отдельные рибосомные частицы, их агрегаты ипи рибосом = PHK - пептидные комплексы. Ввиду значительно худшей ионной проводимости, по сравнению с раствором, они создают модуляцию сопротивления канала 5 Й 1, пропорциональную эффективному сечению частицы вмес» те со связанным с нею мопекупами растворителя (имеет место эффект частичной пробки, затрудняющей поступательное движение ионов). Это вызывает, в свою очередь, некоторую модуляцию (первого порядка) напряжения измерительного электрода О 0 К (й)

Собставенно процесс биосинтеза связан, кроме прочего, с определенными дви4574

1О

25

35

Для определения компонент второго по/ рядка (существенно меньших по величине) целесообразно задавать верхний предел (10 А) тока, ограниченный, однако, допустимыми физическими (например, нагрев) или электрохимическими влияниями тока на процессы в канале.

В ряде экспериментальных задач целесообразнее использовать средние значения тока 10 8А, позволяющие получать приемлемую величину модуляционных компонент сигнала относительно шума и одновременно пренебречь побочным воздействием тока на раствор, 55 жениями рибосомных частиц и с изменениями их формы и размеров (включая оболочку из связанного с частицей растворителя). Поэтому функционирование отдельного рибосомного комплекса в канале (т.е. присоединение очередных аминокислот к белковой цепи, если это имеет место) вызывает допопнитепьную модуляцию напряжения С1(, Ц>)(второго порядка, т.е. меньшей величины).

Компоненты полезного сигнала в виде указанных выше модуляций в смеси с шумом канала отводят электрометрическим усилителем соответствуюшей чувствительности и полосы и далее визуально ипи аппаратурно анализируют для выявления параметров (частота, величина, длительность и др.}, модуляционных компонентов.

Использование предлагаемого способа помогает ускорить контроль процесса биосинтеза в рабочей кювете, формирование различных физических (например, температура раствора) и химических (например, концентрация ионов магния Му+1) обратных воздействий на процесс биосинтеза и проверку их влияния на эффективность процесса (например, по изменению частоты прохождения функциональных рибосом в канале), а также открывает в перспективе возможность оптимизации процесса синтеза путем замкнутого автоматическо го управления, Результаты реализации способа зависят от величины тока, сечения канала, электрических свойств раствора и других факторов, как можно судить из следующих примеров.

Дпя канала 0,1 мкм малый ток 10 А, как следует из приведенных выше данных, позволяет выявить модуляционные компоненты первого порядка, вызванные прохождением отдельных рибосомных комплексов.

Способ контроля биосинтеза белка в растворе путем оценки функционального состояния рибосомных комплексов, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью ускорения контроля, оценку функци . онапьного состояния рибосомных комплексов проводят в емкости, разделенной изопируюшей перегородкой с микроканалом 0,1-0,2 мкм на рабочую и вспомогательную секции, причем в рабочую секцию помешают белкосинтезируюшую сис10

5 8945

Формула изобретения

74 6 тему с рибосомными комплексами, а во вспомогательную - буферный раствор, через микроканал пропускают ионный ток

-9 -7

10 -10 А с одновременным определением параметров модуляционных компонентов напряжения между секциями, по ко торым судят о биосинтезе белка в рабочей секции.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР № 602861, кп. Ci 01 Н 33/16, 1976.

Составитель Л. Рубинова

Редактор И. Михеева Техред 3. Фанта Корректор С. Шомак

Заказ 11477/72 Тираж 910 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4