Способ получения урокиназы

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

Н ПАТЕНТУ (б1) дополнительный к патенту (22) Заявлено 23. 05.?9 (21) 2767757/28-13 (23) Приоритет - (32) 24. 05. 78 (31) 909137 (331 США

Опубликовано 07.05.825юллетень № 17

Дата опубликования описания 09. 05. 82

Сова Советских

Соцмалмстмческмх

Ресвубямк ((()927126 (5l) М. Кл. ф

С 12 М 9/72 фмударвтвгнньй квмктвт

ceca ао делам язвбрвтвнкй в открытка (53) УЙК615 779.

° 94(088.8) Иностранцы

Мау-бнг-Куо, Маргрет Джин Ринтс (СНА) и Дх(озеф .Фидер;, .? .....: . и (72) Авторн изобретения ?, .

Иностранная фирма

"Монсанто Компани" (Tl) Заявитель (США) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ УРОКИНАЗЫ

Изобретение относится к химикофармацевтической промышленности и касается получения лекарственных препаратов.

Известен способ получения урокиназы путем культивирования культуры почечной ткани в жидкой питательной среде в присутствии аминокислоты с последующим выделением целевого продукта (1g.

Однако известный способ не обеспе" чивает высокого выхода целевого продукта.

Цель изобретения - повышение выхода урокиназы. l5

Указанная цель достигается тем, что при осуществлении способа гюлучения урокиназы путем культивирования культуры почечной ткани в жидкой питательной среде в присутствии амино" ра кислоты с последующим выделением целевого продукта культивирование ведут в присутствии 0,3-0,53 фенилаланина.

Сг(особ осуществляют следующим об" разом. 25

Почечные клетки выращивают в соответствующей питательной среде в сосудах для тканевых культур при 35-3?РС до слияния клеток. Среда 199 является типичной, подходящей средой роста.

Можно также испольэовать модифицированную среду Евдо по 0оЙЬесео, среду 5 А по МсСоу, среду MB 752/1 гю

Maymouth и другие общепринятые среды для тканевых культур. Во время роста культуральную среду укрепляют сывороткой млекопитающих, например сывороткой эмбриона крупного рогатого скота, в количестве 5"15т, по обьему. среды.

После слияния клеток их промывают физиологическим раствором, например буферным рассолом, и затем промывную жидкость заменяют консервирующим веществом.

Можно использовать водную питательную среду, которая является необходимой для сохранения почечных клеток и для гюлучения урокиназы. Эта среда содержит гидролизат белка моло6 4

Анализ урокиназы производят путем двухступенчатого метода с помощью йодированной фибрином плитки. В первой стадии урокиназа действует на плазминоген с образованием плазмина, So второй стадии плазмин гидролизует радиоактивномеченый сгущенный фибриноген (фибрин) с выделением фибринопептидов в раствор, измеренных гамма счетчиком. Активность урокиназы затем относят пропорционально к радиоактивности, выделенной в раствор. Единицу активности урокиназы определяют как количество энзима, который гидролиэует один мгк фибрина за час.

Пример 2. Нормальные первичные клетки почки человеческого эмбриона культивируют до слияния в колбах

Т-75, как описано в примере 1, также промывают в стерильном соляном растворе и удаляют 90 мл консервирующего вещества, фенилаланин добавляют в каждую колбу. Среду пополняют свежей средой, которую добавляют в колбу объемом 30 мл каждые трое суток. По истечение девятисуточного культивирования в фенилаланине среду удаляют, клетки промывают несколько раз и определяют содержание ДНК и титры урокиназы как в примере 1. В данном примере консервирующее вещество состоит из 13,75 г/л среды гидролизата лактальбумина, 2,2 г/л йаНСО g и 0,1 вес.Ф

Д-глюкозы. Аминокислоту и/или человеческий сывороточный альбумин (ЧСА) добавляют в основное консервирующее вещество для получения желательной конечной концентрации (a вес.4).

3 92712 ка, альбумин человеческой сыворотки, глюкозу и бикарбонат натрия. Кроме гидролизата белка молока, можно также использовать и другие белковые гидролизаты, такие как триптол, триптоэу, пептон и другие материалы. fl р и м е р 1. Нормальные первичные клетки почки человеческого эмбриона (ПЧЗ) центрифугируют и пересуспендируют в среду 199, содержащую <о

103 по объему сыворотки эмбриона крупного рогатого скота. Клеточную суспензию применяют для инокуляции пласт( массовых колб Фалькона емкостью 75 см =одержащих ту же среду в количествах ts достаточных для того, чтобы конечный объем культуры составил 15-?0 мл, а плотность клеток 1,5-2,0-10 клеток на мл. Колбы инкубируют при 37 С в инкубаторе с содержанием 54 СОп в воздухе. Среду в колбах меняют каждые

2-3 сут до слияния культур. Затем клетки в каждой колбе промывают 25 мл стерильного, физиологически нормаль" ного соляного раствора. 25

После удаления промывного раствора 10 мл консервирующего вещества содержат 13,65 г/л среды гидролизата лактальбумина; 2,2 г/л йаНСО, 0,1 вес.4 сывороточного альбумина че- зв лове ка; О, 1 вес. 3 Д- глюкозы и

0,5 вес.3 фенилаланина. Из консервирующего вещества отбирают пробу для титров урокиназы и его пополняют ежесуточно 10 мл того же свежего консервирующего вещества. Ilo истечении четырехсуточного .культивирования среду удаляют и клетки в каждой колбе промывают несколько раз 25 мл соляно. го раствора и затем 1 н. раствором йаОН. Анализ показывает, что содержание ДНК в клетках почки человеческого эмбриона составляет 9 мкг ДНК (10 эклеток ).

Титры урокиназы .Л 1

Общее количество

ДНК (мкг) Добавки 61 36 31 2858

13,5 7,4 4,8 298,5

22,4 11,9 11, 7 308,3

26 3 24 8 17 О 264 0

Без добавки

0,1ь ЧСА

0,1ь ЧСА + 0,33 глицин

0,13 ЧСА + 0,53 глицин

Аналогично примеру 1 активность урокиназы определяют в мл на день и мкг ДНК.

Сравнительные, данные по выходу урокиназы представлены в таблице.

Продолжение таблицы

927126 г

Титры урокиназы

Общее количество

ДНК (МКГ) Добавки число суток

3 6 9

О, 13 ЧСА + О, 33 Фенилаланин 22, 2 25,6 16,4 223,8

0,14 ЧСА + 0,53 фенилаланин 61,2 35.6 36,3 126,0

О, 33 глицин

0,53 глицин

0,33 фенилаланин

13,1 14,0 7,4 287,0

272 1095 90 2963

24,4 16, 1 10, 1 205,5

Составитель С. Малютина

Редактор А. Лежнина Техред C Мигунова. Корректор С. Шекмар

»» ° »

Заказ 3019/50 Тираж 505 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035 Москва Ж-35 Раушская наб. д. 4/5

35д -35 ч,...,.. «д» 5 Филиал Illlll Патент.",. r. Ужгород, ул. Проектная, 4

0,53 фенилаланин 46,7 27,0 19,9 118,8

° е ю

Конечное содержание ДНК в клетках в каждой колбе

Ilo истечении девятисуточного культивирования в консервирующем веществе..

Выход урокиназы, полученный куль- ткани в жидкои питательнои среде в тивированием почечных клеток при ис- >> присутствии аминокислоты с последуюпользовании повышенных количеств фе- щим выделением целевого продукта, нилаланина в консервирующем вещест- отличающийся тем, что, ве, в основном, выше, чем при ис- с целью повышения выхода урокиназы, пользовании других аминокислот гли- культивирование ведут в присутствии цина,. метионина, гистидина. Это улуч-Ж 0;3-0,5Ж ®енилаланина. шение достигается и тогда, когда число клеток (т.е. содержание ДНК) по- Йсточни ки информации, нижается. принятые во внимание при экспертизе

Формула изобретения . Способ получения урокиназы путем и 1 Патент CQA 1Р 3930945, культивирования культуры почечной кл. 195-1.7, опублик.. 1976.