Способ мечения радиоактивным предшественником дезоксирибонуклеиновой кислоты проростков кукурузы

 

СПОСОБ МЕЧЕНИЯ РАДИОАКТИВНЫМ ПРЕДШЕСТВЕННИКОМ ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЁИI НОВОЙ КИСЛОТЫ ПРОРОСТКОВ КУКУРУЗЫ, шслючшощий гфоращивание зародышей со иштками в стерильных условиях на. минеральной среде с аденозином и радиоактивным тимидином , отличающийся тем, что, с целью повышения удельной радиоактивности дезокснрибонуклеиновой кислоты при нормальном росте растений и снижения затрат радиоактивного тимидина, перед отделением зародышей с щитками семена предварительно замач1гоают в 0,002%-ном растворе амнноптерина , высушивают я проращивают четверо суток на минеральной среде, в состав которой дополнительно вводят амнноптерин в концент (Л рации 0,OQ2% и нерадиоактивный тимтщин до концентрации 0,004%, при этом концентрация аденозина в среде составляет 0,004%. г САЭ ОО hS

„„ЯЦ„„938672

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

4(5ц 6 Ol N 33/60

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

H ABTOPCHGMY СВМДА П:"ЛЬСТВУ (21) 2930524/30-15 (22) 27.05.80 (46) 30.05.85. Бюл. Р 20 (72) В. А. Топтиков и Ю. М. Сиволап (71) Всесоюзный ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени селекционно-генетический ьщститут (S3) 581 198 (088.8) (56)- 1. Махлаева P. Ф., Тютерев С. Л.

Изучение геномов пшениц и ее диких сородичей методом молекулярной гибридизации.

ДНК-ДНК. Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции. Т. 52, в. 1, 1973, . с. 69-75.

2. Plant and Се11 Physiol, 18, и 11, 173-180, 1977 (прототип). (54) (57) СПОСОБ МЕЧЕНИЯ РАДИОАКТИВНЫМ

ПРЕДШЕСТВЕННИКОМ ДЕЗ ОКСИРИБ ОНУКЛЕИ, НОВОЙ КИСЛОТЫ ПРОРОСТКОВ КУКУРУЗЫ, включающий проращивание зародышей со щитками в стерильных условиях на, минеральной среде с аденозином и радиоактивным тнмидином,отличающийся тем,что,с целью повышения удельной радиоактивности дезоксирибонуклеиновой кислоты при нормальном росте растений и снижения затрат радиоактивного тимидина, перед отделением зародышей с щитками семена предварительно замачивают в 0,002%-ном растворе амипоптерина, высушивают и проращивают четверо суток на минеральной среде, в состав которой дополнительно вводят аминоптерин в концентрации 0,002% и нерадиоактивный тимидин до концентрации 0,004%, при эхом концентрация аденозина в среде составляет 0,004%.

938672

Изобретение относится к биохимии растений.

Мечение дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) радиоактивным изатопом и применение ДНК с радиоактивным индикатором

5 необходимо для Выполнения широкого круга исследований в физиологии, биохимии и молекулярной биологии.

Известны методы введения радиоактивной метки в ДИК in vitro, например надирова- 10 ние, метилираванне, матричный ДНК-полимеразный синтез (11. Эти методы обеспечивают высокую удельную рациоактивность препаратов ДНК, но имеют свои отрицательные особенности, заключанйщ еся в изменении, подчас значительном, структуры, степени полимерности и нативнасти меченой ДНК, что не позволяет использовать ее в тех экспериментах, где требования к вышеперечисленным характеристикам должны быть соблюдены.

Известен также способ мечения радиоактивным предшественником дезоксирибонуклеиновая кислоты праростков растений, включающий проращиванне зародышей со щитками в стерильных условиях на минеральной среде с адснозинам и радиоактивным тимидином (21. Однако при проращивании не удается получить высокомеченые препараты

ДНК высших растений. Это связано со значительным пулом цредшественникав синтеза ДНК в семенах, перераспределением их из запасающих органов в развивающийся зародьпн и интенсивным эндогенным синтезом нуклеотидов. Для получения in чйа более высокамечень1х препаратов ДНК высших растений необходимо повышать концентрацию радиоактивного предшественника в среде и/или использовать препараты с высокой удельной радиоактивностью, что

40 связано с увеличением затрат на радиоактивные вещества, повышением общей радиоактивности на рабочем месте и усилением радиоактивного облучения всего растительного объекта.

4$

Целью изобретения является повышение удельной радиоактивности дезоксирибонук, леиновой кислоты при нормальном росте растений и снижение затрат радиоактивного тимидина, 50

Цель достигается тем, что перед отделением зародышей с;.,итками семена предварительно эамачивают в 0,002 -ном растворе аминоптерина, высушивают и проращивают четверо суток на минеральной среде, в состав которой дополнительно вводят аминоптерин в концентрации 0002%, и иерадиоактивный тимицин до концентрации 0,004%, при этом концентрация алеиозина в среде составляет

0,004%.

Суть способа заключается в том, что осуществляется большее включение радиаактивнога экзогенного предшественника в ДНК за счет блокировки энлогенного синтеза предшественника. Введение в минеральную среду для прорашивания растений аминоптерина в качестве ингибитора подавляет синтез в клетках тимидинмонофасфата, что создает тимидиновый "дефицит", Это позволяет добиться большего включения радио\ активно о экзогенного предшественника ДНК (тимндина) без увеличения концентрации последнего в среде.

Проведено изучение включения н-тимицина в ДНК проростков кукурузы in vivo.

Семена кукурузы замачивают в растворе аминоптерина 20 мкг/мл 6 — 8 ч, отделяют зародыши со щитком и высушивают под вентилятором.

Зародыши са щитком стерилизуют и выращивают в асептических условиях в чашках Петри (или стаканах) при 26 — 28 С на среде, содержащей, вес.%:

КС1

KNO3

NaHqPOq

Са(ИО)

Иа,ЯО

М930+

Аденозин

Тимидин

0,068

0 0135

0 0125

0,02

0,02

0,0095

0,004

0,004 (Н-тимилин добав3 ляется до концентрации 0,2 тС1/мл;

Н-тимиднн, В/0

"Изотоп", 12,7

Ci/мм)

0,002

Аминоптерин

По окончании инкубацин срезают побеги и корешки, из которых ДНК выделяют стандартным методом. Количество экстрагированной ДНК и ее чистоту определяют спектрофотометрически. Радноактивност1 препарата

ДНК измеряют на жидкостном сцинтилляционном счетчике. Результаты выражают в значениях удельной радиоактивности ДНК— импульсах/мин/мкг.

Сравнивают радиоактивность ДНК из про. ростков, выращенных иэ семян, и зародышей с щитком на среде без ингибитора эндогенного синтеза предшественника ДНК (аминоптерина) и из прорасткав, выращенных из зародышей с щитком на среле с аминоптерином (предложенный способ). Исследования провелены во временной линамнке.

3 938672 4

Проращивание по предложенному способу сов/мин/мкг, пророспсов из зароды пей с пе вызывает изменения характера динамики щитком, выращенных на cpeqe без синтеза ДНК в растении. Максимальный уро- аминоптерина -- 6 600 имп/м щ/мкг, ДНК вень включения радиоактивного предшествен- проростков из семян 4 100 (4 суток проника наблюдается и четвертым суткам прора- ч ращивания) ("эффективность счета 6%). . щивания. Предложенный способ мечения позволяет значительно увеличить включение В табл. 1 показано влияние срока прораяН-тиьшдина в ДНК. Удельная радиоактив- щивания растений на удельную радиоактивность ДНК проростков, выращенных заявляе- ность ДНК в пророспсах кукурузы мым способом, составила 12 000 импуль- 10 (имп/мин/мкг). Таблица 1

Удельная радиоактивность ДНК в проростках кукурузы (иь1п/мин/мкг1 при различных сроках выраццшания

Время выращивания

Удельная радиоактивность

ДНК в проростках, выращенных на среде с аминоптерином Н-тимидинэ

0,2 mCi/ìë

2400 11.300 8.200

300

300

Удельная радиоактивность

ЛНК s проростках, выращенных на среде бьз аминоптерина Н-тимидинэ

0,2 mCi/мл

2200 5.900 5.600

200 200

Таблица 2

Время выращивания

1 2 4 7 сутки с ОК суток суток

На среде с аминоптерином (заявляемый способ)

5,60

5,59 3,44

5,74

На среде без аминоптерина (прототип) 4,75

345

3,68 3,30

Как видно из табл. 2, при заявляемом способе мечения наблюдается более высокая эффективность использования экэогенного радиоактивного предшественника. Она Bhfp;l)KBcTcR более высоким процентом включения радиоактивной метки в кислотонерасчворнмуто

1 г

Как видно иэ табл. 1, при использовании одного и того же количества радиоактивного тимидина по заявленному способу мечения по- лучается ДНК с более высокой удельной радиоактивностью, причем эффект

35 повышения удельной активности проявляется заметнее после вторых суток инкубацни и наиболее выражен на четвертые сутки.

Для получения ДНК с удельной радиоактивностью 11300 нмп/мин. мкг, которая достига- 0 ется по заявленному методу к четвертым суткам выращивания, известным способом требуется либо вдвое увеличить концентрацию .. радиоактивного предшественника, либо применять в той же концентрации предшественник с соответственно увеличенной удельной активностью, в общем требуется увеличить общую радиоактивность предшественника.

Процент включения радиоактивного предшественника в кислотонерастворимую фракцию нроростков от общей радиоактивности, поглощенной проростками, представлен в табл. 2, 938672

Вннннне составе среды на вес нроростков рестенна

ГL TTI TT.Тебннaà Э

1 .2 3 4 5 б 7 8 9 1О

0,002 0,0îг

0,002

0,004 0,002 о,оог

О,004

0,002 0,004 0,002 0,002 0,002

0,001

0,002 тнмндна, вес.gь

0,008

0,004

0,004

0,002

0,008

0,004

Вес.1 нроростне (%) 100

48 45

56 47

71

9) 59

Техред Ж.Кастелевич Корректор А. Зимокосов

Редактор О, Юркова

Заказ 2906/6 Тираж 897 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

l13035, Москва, Ж-35, Рау1иская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 фракцию проростков, содержащую ДНК, от тобщей радиоактивности, поглощенной пророст ками.

Из табл. I видно также, что максимальная радиоактивность ДНК отмечается нри выращивании проростков в течение четырех суток, В этих экспериментах подбирался состав среды, содержащей основные ингредиенты(аминоптерин-ингибитор эндогенного синтеза предшественника ДНК; тимидин и аденоэин) в таких соотношениях, при которых рост йроростков не отличался бы от контроля.

Иэ табл. 3 видно, что увеличиватьконцентрацию аминоптерина в среде более 0,002 вес.% (вариант Р 2) нецелесообразно, так как при этом сохраняется и высокая эффективность включения в ДИК поглощенной проростками радиоактивной метки (табл.2).

Для уточнения состава интредиентов среды

5 проведены предварительные эксперименты, ре. зультаты которых приведены в табл. 3. мннсрелънее среде + емнноптернн е добевкн более высокие концентрации аминоптерина (вариант Р 3) не вызь вают заметного увеличения ингибирования роста. Кроме того, оптимальной средой, содержац(ей аминоптерин, при выращивании на которой рост проростков практически не отличается от контроля, яв.ляется среда варианта У 9, в которой кон- ° центрация аминоцтерина составляет 0,002 вес.%, тимидина — 0,004 вес.%, и аденоэина — 0,004 вес.%.