Способ определения хемилюминесценции плазмы и сыворотки крови

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ.

< >940062

Сеюз Соаетсник

Сециалистичеснив

Реснубнин

{б! ) Дополнительное к авт. санд-ву (22)Заявлено 17.11.80 (21) 3005040/28-13 с присоединением заявки,1е (23) Приоритет (51 ) М. Кл.

601 N ЗЗ/16 фвудврспаивй квакает

CCCP ав даем взебрвтеквй в етк мтвй

Опубликовано 30.06.82. Бюллетень М 24 (53) УД К 611.41 (088.8) Дата опубликования описания 03.07.82

Ю. М. Лопухин, Ю. А. Владимиров, М. Н. Молодекков;

Г. И. Клебанов, В. И. Сергиенко н М. П. шерстнев (72) Авторы изобретения

2-ой Московский ордена Ленина государственный медицинский институт им. Н. И. Пирогова (7!) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ

ПЛАЗМЫ И СЫВОРОТКИ КРОВИ

Изобретение относится к медицине, а именно к способам диагностики различных заболеваний.

Известен способ определения хемилюминесценции плазмы и сыворотки крови путем добавления двухвалентного железа и регистрации вспышки свечения f 11 .

Однако известный способ недостаточно точен вследствие наличия в образцах крови в различной степени выраженного гем Опиэа е

Йель изобретении - повышение точности метода путем устранения влияния гюмолиза, .

Поставленная цель достигается тем, юто при осуществлении способа опредеЭения хемилюминесценции плазмы и сыЬоропси крови путем добавления двухваМентного железа и регистрации вспышки свечения, сыворотку или плазму крови 20 пре аварительн о обрабатывают растворами.

Фтористого кальщся и кристаллического репарина и выделяют липопротеиды низкой плотности.

Способ осуществляют следующим образом.

Образпы плазмы и сыворотки крови предварительно обрабатывают О, 1-4,0 мл 0,05 - 0,8%-ного раствора хлористого кальция и 0,01-0,8 мл О, 1- 10%-ного раствора гепарина в зависимости от вида животного с последующим выделением липопротеидов низкой плотности.

Пример 1. Берут сыворотку крови в количестве 0,2 мл (донор мужчина

26 лет), добавляют 2 мл 0,28 /-ного раствора хлористого кальция и 0,04 мл

1%-ного раствора кристаллического геларина. Полученный раствор инкубируют в течение 4 мин, и затем центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин. Супернатант удаляют, к осадку прибавляют 1 мл 0,85%ного раствора хлористого натрия и помещают в кювету хемилюминесцентной установки для исследования. К полученной суспензии липопротеидов низкой плотности добавляют 8 мл 120 мМ фосфатного

Таким образом, для регистрации хемилюминесценции плазмы и сыворотки крови оптимальными условиями для человека являются 0,2 мл сыворотки крови, 2 мл

0,28%-ного раствора хлористого кальция и 0,04 мл 1% ного раствора гепарина.

Для сыворотки крови кролика оптималь ными условиями экспериментально выбрано 0,2 мл сыворотки крови, 2 мл 0,28%3 94006 буфера, рН 7,4, и 1 мл 25 мМ раствора двухвалентного железа.

Возникает вспышка хемилюминесценции. Оптическая плотность при 440 нм составляет 0,28 (для исходной сыворот» ки крови). Параметры вспышки,инициированной двухвалентным, железом хемилюми» несценции 0,2 мл сыворотки крови равны

S 4422, 5 усл. ед., 5 17,5 усл. ед., 4 25 с, Н 11 усл, ед., соответственно хемилюминесценция липопротеидов низкой плотности иэ 0,2 мл сыворотки крови: 5 205,5 усл. ед., 27 усл. ед., $ 50 с, Н 26 усл,ед.

После искусственно вызванного гипотонического гемолиза оптическая плотность сыворотки крови увеличилась до 2,25.

Параметры вспышки инициированной двухвалентным железом хемилюнесценции

0,2 мл сыворотки изменились следующим

Образом (в скобках процентное выраже- 20 ние относительно исходных значений):

28,5 усл. ед (67%), Ь 15,5 усл.ед. (89%), 4 60 с (240%), Н 9 усл. ед. (82%), соответственно хемилюминесценция липопротеидов низкой плотности из 5

0,2 мл сыворотки крови: S 119 усл. ед. (80%), % 24 усл. ед. (89%), 40 с (80%), Н 19,5 усл. ед. (75%).

Пример 2. Берут сыворотку крови больного первичным билиарным цирро- з© зом печени (мужчина 29 лет), к 0,2 мл которой добавляют 2 мл 0,28%-ного раствора хлористого кальция и 0,04 мл 1%-ного раствора кристаллическо о гепарина.

Полученный раствор инкубируют 4 мин и затем центрифугируют 5 мин при

3000 об/мин.

Супернатант удаляют, к осадку добавляют 1 мл 0,85%-ного раствора хлористого натрия и помещают в кювету хемюпоЙинесцентной установки, куда добавляют также 8 мл 120 мМ фосфатного буфера рН 7,4. К полученной суспензии липопротеидов низкой плотности добавляют 1 мл

25 мМ раствора двухвалентного железа (ГЮГО,(. 7 Н О}. Возникает вспышка, лемилюминесценции. Оптическая плотность сыворотки крови при.440 нм составляет

0,13. Параметры вспышки инициированной двухвалентным железом хемилюминес50 ти .Иции 1 мл сыворотки крови равны:

5 9 усл. ед., h 15 усл. ед., 4 175 с;

Н 3. усл. ед, соответственно хемилюмииесценция липопротеидов низкой плотности иэ 0,2 мл сыворотки крови:,5 26,5усл. ед., h 4,5усл. .ед.., .4 335 5 сс, Н 8 усл. ед, После искусственно вызванного гипо тонического гемолиза оптическая плот. ность сыворотки крови увеличилась до 2,34

2 ф

Параметры вспыпжи инициированной двухвалентным железом хемилюминесценции 1 мл сыворотки крови изменились следующим образом: S 5,5 (,61%), Ь 9,5 (63%) т, 190 с (109%), Н 1,5 усл. ед. (50%), соответственно хемилюминесцен-. ция липопротеидов низкой плотности из

0,2 мл сыворотки крови: 6 22 усл. ед. (83%), Ь 5,5 усл.ед. (122%), 4 40с (1 1 4%), Н 7 усл, ед. (88%) ., Пример 3. Берут сыворотку крс1 ви беспородного. кролика массой 3,4 кг.

К 0,2 мл сыворотки крови кролика добалвяют 2 мл 0,28 ного раствора хлористого кальция и 0,2 мл 1%-ного раствора кристаллического гепарина. Полученный раствор инкубируют 4 мин и затем центрифугируют 5 мин при 3000 Об/мин.

Супернатант удаляют, к осадку добавляют

l мл 0,85%-ного раствора хлористого натрия и помещают в кювету хемилюминесцентной установки, куда добавляют

8 мл 20 мМ фосфатного буфера рН 7,4.

K полученной суспензии липопротеидов низкой плотности добавляют 1 мл 25 мМ раствора двухвалентиого железа (Г6604 7 Н О) - возникает вспышка хеми поминесценции. Оптическая плотность сыворотки крови при 440 нм составляет 0,29. Параметры вспышки инициированной двухвапентным железом хемилюминесцении 0,2 мл сыворотки крови равны: 45,5 усл. ед., 6 усл. ед., 4 45 с, Н 9 усл. ед., соОтветственно хемилюминесценции липопротеидов низкой плотности из 0,2 мл сыворотки крови: 5 24,5 усл, ед., И 3,5 усл. ед., + 80 с Н 6 усл. ед. После искуственно вызванного гипотонического гемолиза оптическая плотность сыворотки крови увеличилась до 1, 12.

Параметры вспышки инициированной двухвалентным жвлезом хемилюминесценции 0,2 мл сыворотки крови изменились следующим образом: S 0 усл.ед., Ь Зусл. ед. (50%), 4 Ос, Н О, соответственно хемилюминесценция липопротеидов низкой

ПЛО:ности из 0,2 мл сыворотки крови:

24 усл. ед. (98%), 4 3 усл. ед. (86%), + 80 с (100%), Н 5 усл, ед. (83%).

5 940062 6 ного раствора хлористого кальция, 0,2мл страции вспышки свечении, о т л и

1%-ного рас твора гепарина. ч а ю ш и и с я тем, что, с целью поПредлагаемый способ позволяет новы вышения точности метода путем устренсить точность регистрации хемилюминес- ния влияния гемолиза, сыворотку или ценции сыворотки крови и плазмы челове- s плазму крови предварительно обрабачыка и экспериментальных животных при вают растворами хлористого кальция и различной степени гемолиза и определить кристаллического гепарина и выделяют состояние перекисного окисления липцдов липопротеиды низкой плотности. в организме больного.

Формула изобретения

Составитель Ю. Алмазов

Редактор С. Юско Техред М.Гергель Корректор Л. Бокшан

Заказ 46 59/66 Тираж 887 Подписное

ВНИИПИ Государственного. комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Способ определения хемилюминесценции плазмы и сыворотки крови путем до- 1$ бавления двухвалентного железа и региИсточники информации, принятые во внимание при експертизе

1. Владимиров Ю. А. и др. Хемипюминесценция сыворотки крови в присутствии солей двухвалентного желми. Вопросы медицинской химии. 1976,. М 2, с. 216223.