Способ определения трипсинингибирующей активности семян бобовых и злаковых культур

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Рестгублик >967418 (61) Допол н ител ьное к а вт. с вид- ву— (22) Заявлено 13.05.80 (21) 2923931/30-15 с присоединением заявки №вЂ” (23) Приоритет— (51) М. Кл.

А 01 Н 1/04

А 01 G 7/00

Гасударственный кемлтет

Опубликовано 23.10.82. Бюллетень № 39 (53) УДК 631.52:

: 581.6 (088.8) пе делам лзебретений и еткрмтий

Дата опубликования описания 28.10.82 )

В.В.С (72) Авторы изобретения аянова, Л. С. Павлова и А. И. Брон теин г

Отдел генетики растений АН Молдавской С( c ) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТРИПСИНИНГИБИРУЮЩЕЛ

АКТИВНОСТИ СЕМЯН БОБОВЫХ И З,ЛАКОВЫХ КУ,ЛЬТУР, 1

Изобретение относится к селекции растений и к прикладной ботанике и может быть использовано в сельском хозяйстве.

Известно, что качество зерна определяется не только содержанием в нем белков, незаменимых аминокислот, углеводородов, 5 минеральных веществ, но в значительной мере наличием в.семенах антипитательных компонентов, влияющих на усвояемость растительных белков организмом животного и человека. К антипитательным веществам относятся, в частности, и ингибиторы протеаз, например, ингибиторы трипсина, которые инактивируются протеолитическую активность ферментов пищеварительного тракта, наруШают усвояемость белков организмом. 15

Ингибиторы трипсина составляют особую группу растительных белков, способных образовывать с трипсином устойчивые комплексы, угнетающие активность фермента. Они широко распространены в растительном мире и составляют значительную часть суммарного белка семян важнейших сельскохозяйственных культур.

Наиболее эффективным путем уменьшения содержания ингибиторов трипсина в семянах является селекция сортов, свободных от ингибиторов или содержащих их в минимальных количествах.

Известен способ определения трипсинингибирующей активности семян бобовых по скорости гидролиза белкового или синтетического субстратов (1) .

Однако способ очень трудоемок.

Известен также способ определения трипсинингибирующей активности семян бобовых и,злаковых культур, включающий измельчение семян, экстрагирование раствором хлористого натрия, инкубирование экстракта на фотопленке, покрытой белковым веществом в присутствии трипсина и последующий учет результатов реакции.

Белки ингибитора подвергают электрофорезу в агаровом геле, содержащих казеин.

После чего казеин гидролизуют раствором трипсина. Казеиновый субстрат, защищенный от гидролиза присутствием ингибитора, проявляется при окрашивании белковым красителем в виде голубых пятен, по которым судят о присутствии ингибитора (2).

Способ также трудоемок и низкопроизводителен, так как он предполагает обязательную процедуру очистки от балластных

967418 ной, проявленной и фиксированной фотопленки и инкубируют 8 — 12 мин при 25 С.

После чего пленку промывают в дистиллированной воде и высушивают на воздухе.

Отбор генотипов по указанному признаку производят путем сравнения степени прозрачности гидролизованных зон желатинового слоя фотопленки остаточным количеством трипсина (после ингибирования экстрактами семян) исследуемого материала и контрольных образцов. Трипсинингибирующую активность оценивают в баллах по степени

55 з;:, о .:: .:. ::.ор .„х;рр-,кций, для чего г, .: . ложные приемы о.: . .„.:.:. зь:.оаливание, диализ, лио. 4 до . . лительная процед" ра под .:стэатя (ягао >вой ге ь с каи проведение опыта в тсчение оков еше способ требует наличия специального электрофоретического оборудования и значительного количества испытуемого материала — все это не позволяет обнаруживать ингибиторы трнпсина в части от1О дельных семян при сохранении их жизнеспособности.

Целью изобретения является сохранение жизнеспособности исследуемых семян и упрощение самого процесса.

Указанная цель достигается тем, что трипсин используют в концентрации 0,17—

023% для,экстракта из семян бобовых и

0,02 — 0,03% для экстракта из семян злаков, причем инкубирование экстракта проводят на фотопленке, предварительно экспонированной, проявленной и фиксированной, для покрытия ее в качестве белкового вещества используют желатину, и процесс инкубирования ведут для экстракта из семян бобовых в течение 8 — 12 мин, а для экстракта из семян злаков в течение 18 — 22 мин, при этом учет реакции осуществляют по степени прочности образующихся на желатине гидролизованных зон на фотопленке в сравнении иссл-дуемых семян с семянами эталонного сорта.

Пример /. Отбор проводят на селекцион- ЗО но-генетическом материале сои (500 образцов) коллекции Отдела генетики расте,ний АН Молдавской СССР, включающий ..:;;"т, линии, отдельные растения. Средняя врооа материала выполнена по общепринятой .етодике.

Навеску средней пробы семян сои, измельченной в электрической мельнице до размера частиц муки 0,1 мм, экстрагируют 0,1—

0,3 М раствором хлористого натрия в соотношении 1:75 (г/мл) в течение не менее 1 ч.

К полученному экстракту ингибиторов приливают раствор трипсина 0,17 — 0,33% и трисбуфер рН 8,2 (содержащий 0,2 М NaC1) в соотношении 1:1:1 (мл). Смесь выдерживают 3 — 5 мин, одинаковые капли инкубационной смеси (0,01 — 0,03 мл) контрольных и исследуемых образцов наносят на желатиновый слой предварительно экспонированпрозрачности пятна, исходя из экспериментальных данных о том, что низкоингибиторный образец образует прозрачное пятно, среднеингибиторный — серое, высокоингибиторный — черное пятно.

В результате из 500 исследуемых образцов сои отобрано 53 с низким содержанием ингибиторов трипсина, перспективных для включения в селекционный процесс на улучшение питательной ценности зерна сои.

Пример 2. Оценку трипсинингибирующей активности единичных семян проводят на контрастных по содержанию ингибиторов трипсина 13 сортах сои, В этих опытах 20 семян каждого сорта разделяют на кожуру, соевую часть зародыша и семядоли, последние рассекают на 6 сегментов, в которых определяют трипсинингибирующую активность. В результате установлено незначительное содержание ингибиторов трипсина в кожуре (около 10% общей активности семени) и равномерное распределение их в семядоли. Соответственно отбор в этом случае производят путем отсечения участка семени для анализа как исследуемых, так и контрольных образцов из идентичных мест семядоли. Отрезанную часть семени (не менее 10 мг) взвешивают, растирают в ступице до размера частиц порядка 0,1 мм и экстрагируют. Анализ и отбор низкоингибиторных семян аналогичен процедуре, описанный в примере 1.

Семена, подвергнутые такой процедуре, пригодны для высевания и проведения дальнейших селекционных работ.

Пример 3. Отбор по признаку трипсинингибирующей активности зерновых культур проведен на селекционно-генетическом ма- . териале пшеницы (100 образцов) коллекции отдела генетики растений АН Молдавской CCP.

Для образцов пшеницы экспериментально установлены оптимальные параметры фермент-ингибирующей системы: концентрация трипсина — 0,02 — 0,03, соотношение мука: экстра гент — 1:4 (г/мл), соотношение буфер: фермент: ингибитор — 1,1:1 (мл), время инкубации фермента с субстратом

18 — 22 мин при 25 С.

Выявлены образцы пшеницы, отличающиеся низкой, средней и высокой активностью ингибиторов трипсина, и которые составляют 15,50 и 35% от общего количества исследованного материала соответственно.

Процедура анализа и отбор зерна пшеницы по признаку трипсинингибирующей активности аналогичны процедуре, описанной в примере 1.

Разработанный способ позволяет использовать малые количества испытуемого материала (вплоть до 1/10 — 1/20 части зерна) при хорошей воспроизводимости и необходимой точности, высокой производительности (100 †2 анализов в день), простоте выполнения анализа и экономном расходова967418

Формула изобретения

Составитель М. Дранишников

Техред И. Верес Корректор М. Демчик

Тираж 699 Подписное

ВНИИ ПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий! 13035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП «Патент», г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Редактор Н. Бобкова

Заказ 7195/7 нии реактивов отечественного производства, пригоден для отбора, по результатам анализа части семени с дальнейшим использованием остатка семени в селекционном процессе, позволяя, таким образом, сохранить ценный исходный и селекционный материал. Способ может быть использован дЛя скрининга большого набора селекционно-генетического материала (сорта, линии, отдельные растения, единичные семена) по признаку трансингибирующей активности и для выявления доноров низкоингибиторности, необходимых для селекции в направлении улучшения питательной ценности, усвояемости белков зерна бобовых и злаковых культур.

Способ определения трипсинингибирующей активности семян бобовых и злаковых культур, включающий измельчение семян, экстрагирование раствором хлористого натрия, инкубирование экстрактов на фотопленке, покрытой белковым веществом в присутствии трипсина и последующий учет результатов реакции, отличающийся тем, что, 6 с целью сохранения жизнеспособности семян и упрощения процесса, трипсин используют в концентрации 0,17 — 0,23% для экстракта из семян бобовых и 0,02 — 0,03% для экстракта из семян злаков, причем инкубирование экстракта проводят на фотопленке, предварительно экспонированной, проявленной и фиксированной, для покрытия ее s качестве белкового вещества используют желатину и процесс инкубирования ведут для экстракта из семян бобовых в течение 8 — 12 мин, а для экстракта из семян злаков в течение

18 — 22 мин, при этом учет реакции осуществляют по степени прозрачности образующихся на желатине гидролизованных зон на фотопленке в сравнении исследуемых семян с семенами эталонного сорта.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Бенкен Н. И., Буданова В. И. Ингибиторы трипсина в семянах фасоли. Труды по прикладной ботанике, генетике, селекции.

20 М 1976 563 67 73

2. Seidl D S et а1 Microeleqtrophoretic

method for. the detection of proteinase inhibitors. — Analyt. Biochem., 1978, 88, 2, 417—

424 (прототип).